CN103288939B

CN103288939B - 水稻OsMADS29基因在调控植物种子组织细胞退化中的应用

Info

Publication number: CN103288939B
Application number: CN201210048458.5A
Authority: CN
Inventors: 孟征; 吴凤; 杨雪莲; 杜晓秋
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2032-02-27
Also published as: CN103288939A

Abstract

本发明公开了水稻OsMADS29基因在调控植物种子组织细胞退化中的应用。水稻OsMADS29基因翻译的蛋白如序列表序列1所示，该蛋白的编码序列为序列表序列2中第1位至第780位所示的核苷酸序列。所述蛋白可用于调控目的植物的下述至少一种性状：胚珠脉管系统中的筛管和/或导管的形成、胚珠珠心突部位细胞的退化、种皮部位细胞的退化、胚乳细胞的退化。本发明在分子水平上揭示了植物细胞凋亡的调控机制及其途径，将为实现人工控制植物生长发育以及开辟植物抗病育种新途径奠定基础。此外，如果能够将植物细胞凋亡的研究与植物经济利用联系起来，将具有重要实践价值。例如，通过人为调控果实发育中细胞凋亡的调控因子，改变生长发育期，提高果实产量和品质，则将会极大地推动现代化生产的发展。

Description

水稻OsMADS29基因在调控植物种子组织细胞退化中的应用

技术领域

本发明涉及水稻OsMADS29基因在调控植物种子组织细胞退化中的应用。

背景技术

根据高等真双子叶植物花发育的ABCDE模型，经典的B类花同源异型基因特异的在花瓣和雄蕊中表达并参与这两轮器官的形成。2002年，A.Becker等人在建立B类基因的系统进化树时首先在裸子植物麻黄纲买麻藤(Gnetum gnemon)中找到了一类不同于经典B类基因的一个基因分支，这类基因主要是在雌性生殖器官中表达。鉴于其与经典的B类基因结构相似，但在表达方式和功能上却完全不同的原因，将这一类基因命名为B_sister基因。B_sister基因可能在种子植物繁殖器官的结构进化上起了非常重要的作用。

目前已有的B_sister基因研究结果都集中在高等真双子叶植物中，对于单子叶植物水稻来说，B_sister是否也在雌性生殖器官中特异表达并发挥作用尚不清楚。水稻中一共存在着3个B_sister基因，分别为OsMADS29，OsMADS30和OsMADS31，但是对于它们的功能研究至今未见报道。由于水稻是农业科学研究的模式植物，也是重要的粮食和经济作物之一，它的雌性生殖器官的发育直接影响粮食产量和国计民生，因此，对水稻种子发育的研究具有重要的理论意义和经济价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种OsMADS29蛋白的新用途。所述OsMADS29蛋白为序列表序列1所示蛋白，来源于水稻，其编码序列为序列表序列2中第1位至第780位所示的核苷酸序列。

本发明所提供的新用途为序列表序列1所示蛋白可用于调控目的植物种子细胞凋亡或调节序列表序列1所示蛋白质表达量的物质可用于调控目的植物种子细胞凋亡。

所述目的植物种子细胞凋亡表现为如下a)-d)中的至少一种：

a)胚珠脉管系统中的筛管和/或导管的形成；

b)胚珠珠心突部位细胞的退化；

c)种皮部位细胞的退化；

d)胚乳细胞的退化。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中序列表序列1所示蛋白的表达，得到与所述目的植物相比具有如下1)-4)中至少一种表型的转基因植物：

1)胚珠珠心突部位细胞不退化；

2)胚珠脉管系统中无筛管和/或导管的分化；

3)种皮部位细胞不退化；

4)胚乳细胞不退化。

所述种皮部位细胞具体可为珠心表皮细胞、内珠被细胞和/或外珠被细胞。

在上述方法中，所述降低目的植物中序列表序列1所示蛋白的表达是通过将式I所示的DNA分子导入目的植物中实现的；

(I)SEQ_正向-X-SEQ_反向；

所述SEQ_正向是序列表序列2中包括第474位至第962位的核苷酸段；

所述SEQ_反向的序列与所述SEQ_正向的序列反向互补；

所述X是所述SEQ_正向与所述SEQ_反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ_正向及所述SEQ_反向均不互补。

在上述方法中，所述SEQ_正向的核苷酸序列是序列表序列2中第474位至第962位核苷酸序列。

在上述方法中，所述式I所示的DNA片段为重组表达载体pU29i中的Spe I至KpnI之间的DNA片段。

在上述方法中，所述抑制目的植物中序列表序列1所示蛋白的编码基因的表达是通过将下述重组表达载体pU29i导入目的植物中实现的：将式II所示DNA片段沿着从Kpn I至Sac I的方向插在载体pU1301的Kpn I和Sac I位点间，得到重组表达载体pU29i；

(II)式I-Y；

所述Y是终止式I所示DNA片段转录的核苷酸序列。

在上述方法中，所述X的核苷酸序列是序列表序列3所示的核苷酸序列。

在上述方法中，所述Y的核苷酸序列是序列表序列4所示的核苷酸序列。

在上述应用或方法中，所述目的植物可为单子叶植物，所述单子叶植物具体可为水稻。

实验证明，利用序列表序列2中第474位至第962位核苷酸序列构建的RNAi重组表达载体pU29i转化水稻，与对照转化pU1301空载体相比，所获得的T₀代转基因水稻株系的OsMADS29基因表达量显著降低，胚珠珠心突部位细胞不退化，胚珠脉管系统中无筛管和/或导管的形成，种皮部位细胞不退化，胚乳细胞不退化；对OsMADS29基因的表达模式分析表明，OsMADS29基因相对特异的在受精后的胚胎中高量表达。这说明该基因在子房发育或受精后的种子或珠心细胞退化中起着重要作用。种子或珠心细胞的降解产物是胚乳细胞早期发育不可或缺的重要养分，因此，种子或珠心细胞的正常退化对种子的正常发育十分重要。本发明在一定程度的分子水平上揭示了植物细胞凋亡的调控机制及其途径，将为实现人工控制植物生长发育以及开辟植物抗病育种新途径奠定基础。此外，如果能够将植物细胞凋亡的研究与植物经济利用联系起来，将具有重要实践价值。例如，通过人为调控果实发育中细胞凋亡的调控因子，改变生长发育期，提高果实产量和品质，则将会极大地推动现代化生产的发展。

附图说明

图1为OsMADS29基因cDNA序列的酶切鉴定。其中，泳道1-5为含有OsMADS29基因cDNA序列的克隆载体经Xho I酶切所产生的片段，M为分子量标准，自上而下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，P为含有OsMADS29基因cDNA序列的克隆载体。

图2为OsMADS29基因的RNAi载体构建图。其中，A为pBJ29(-)的酶切鉴定电泳图，其中的泳道1，2，3为质粒pBJ29(-)克隆1，2，3的Sal I单酶切产物；泳道5，6，7为质粒pBJ29(-)克隆5，6，7的Pst I单酶切产物；泳道4为分子量标准D2000Plus，自上而下的条带依次为5kb、3kb、2kb、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；B为pBJ29(+/-)的酶切鉴定电泳图，其中的泳道1为pBJ29(+/-)的Pst I单酶切产物，泳道2为pBJ29(+/-)的Sal I单酶切产物，泳道3为质粒pBJ29(+/-)，泳道4为分子量标准D2000Plus，自上而下的条带依次为5kb、3kb、2kb、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；C为pU29i的酶切鉴定电泳图，其中的泳道1为pU29i经BamH I和Sac I双酶切得到的片段，泳道2为pU29i经EcoRI单酶切得到的片段，泳道3为pU29i经Pst I单酶切得到的片段，泳道4为pU29i经SalI单酶切得到的片段，泳道5的Marker为分子量标准，自上而下的条带依次为5kb，3kb，2kb，1000bp，750bp，500bp，250bp和100bp。

图3为RNAi转基因水稻株系所结种子的表型分类及组成。其中，A为种子的表型分类，第一排为正常种子，第二排为弱表型种子，第三排为强表型种子；B为各株系中不同表型种子的组成。

图4为RNAi转基因水稻株系所结种子的石蜡组织切片图。其中，A-C分别为受精后第7天的正常种子、弱表型种子及强表型种子经珠心的横切面图，标尺代表200μm；D-F分别为A-C中箭头所示部位的放大图，标尺代表50μm；G和H分别为成熟后的正常种子和弱表型种子经珠心的纵切面图，标尺代表500μm；K和L分别为G和H的画圈部位的放大图，标尺代表100μm；M和N分别为正常种子和弱表型种子的OV(胚珠维管束迹)放大图，标尺代表50μm；I和J分别为成熟的正常种子和弱表型种子中胚的纵切图，标尺代表200μm。

图5为RNAi转基因水稻株系中OsMADS29基因的相对表达水平。

图6为RNAi转基因水稻株系中OsMADS29、OsMADS30和OsMADS31基因的表达。

图7为OsMADS29基因在水稻不同组织中的RT-PCR表达分析。其中，图中各泳道分别代表的水稻组织如下：R：萌发7天的根；SD：萌发7天的幼苗；ML：成熟叶片；P1：1-5cm花序；P2：10cm花序；P3：17cm花序；P4：22cm花序；S1：受精后第1天的种子；S2：受精后第3天的种子；S3：受精后第5天的种子；S4：受精后第7天的种子；S5：受精后第9天的种子；S6：受精后第14天的种子。

图8为OsMADS29基因在水稻各轮花器官中的表达分析。其中，图中各泳道分别代表的水稻组织如下：le：外稃；pa：内稃；lo：浆片；st：雄蕊；pi：雌蕊。

图9为OsMADS29基因在水稻不同组织中的实时定量PCR分析。其中，R：萌发7天的根；SD：萌发7天的幼苗；ML：成熟叶片；P1：1-5cm花序；P3：17cm花序；P4：25cm花序；S4：受精后第7天的种子。

图10为OsMADS29基因的原位杂交。其中，A为受精前子房的纵切面，B为受精后第1天种子的纵切图，C为受精后第3天的种子纵切图，D为受精后第5天的种子纵切图，E为受精前子房的横切面，F为受精后第3天的种子横切图，G为以受精后第5天的种子为材料用正义探针进行原位杂交的结果，标尺代表50μm。

图11为RNAi转基因水稻种子的Evan’s blue染色。其中，Em代表胚；A-C分别为对照所结的受精后第15天、20天和26天的正常种子经珠心的横切片染色结果，D图为对照所结的受精后第26天的正常种子纵切面染色图；E-G分别为中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的受精后第15天、20天和26天的干瘪种子经珠心的横切片染色结果，H为中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的受精后第26天干瘪种子纵切面染色图；标尺代表500μm。

图12为RNAi转基因水稻中参与细胞程序性死亡相关基因的表达检测。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、水稻OsMADS29基因的RNAi重组表达载体构建

1.水稻OsMADS29基因的克隆

水稻OsMADS29的基因全长为4010bp，翻译成为由260个氨基酸组成的功能蛋白(命名为OsMADS29蛋白)，其氨基酸序列如序列表序列1所示。OsMADS29蛋白的编码序列如序列表序列2中第1位至第780位核苷酸序列所示。OsMADS29基因的cDNA克隆是从日本cDNA文库(网址：http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中购买的，该克隆名称(Clone name)为002-115-F04。序列分析发现含有该克隆的载体pCMVFL3(Suzuki etal.，1997)的插入片断两端包含有Xho I酶切位点，插入片断长度为1325bp，在481bp处有Xho I的单酶切位点，所以用Xho I酶切应该产生三个片断，大小分别为4kb(不含该克隆的载体)、864bp和503bp。将含有该克隆的载体转化大肠杆菌，提取质粒后用Xho I酶切鉴定，结果显示片断大小是正确的(图1)。进一步的测序分析也证明序列是完全正确的。

2.RNAi重组表达载体的构建

RNAi重组表达载体的构建过程如图2所示，具体步骤如下：

1)pBj(B/N)的构建：将pJawohI3-RNAi载体(Genbank号：AF404854)用BamHI和Not I双酶切，回收596bp的片段，该片段包含pJawohI3-RNAi载体上的内含子(intron)(其核苷酸序列如序列表序列3所示)和终止子(pA35S)(其核苷酸序列如序列表序列4所示)序列，将含有BamH I和Not I粘性末端的该片段与经过BamHI和Not I双酶切的pBluescript II SK(+)载体(Biovector008，Invitrogen)的大片段相连，构成一个重组的中间载体，命名为pBj(B/N)。

2)pBJ29(+/-)的构建：单独特异抑制OsMADS29的区段包含部分C区段和部分3’UTR序列，大小为489bp，其序列为序列表序列2中第474位至第962位的核苷酸序列。在该序列的5’端添加BamH I和Spe I的识别序列，3’端添加Hpa I和Nco I的识别序列，将得到含有该489bp的DNA片段命名为OsMADS29RNAi特异片段(即图2中的29RNAi fragment)。用Spe I和Hpa I分别对pBj(B/N)载体和OsMADS29RNAi特异片段进行双酶切，将获得的含有Spe I和Hpa I粘性末端的pBj(B/N)载体大片段和OsMADS29RNAi特异片段连接，获得OsMADS29RNAi特异片段的反向插入中间载体，命名为pBJ29(-)。pBJ29(-)鉴定正确插入后，用BamH I和Nco I同时对pBJ29(-)载体和OsMADS29RNAi特异片段进行双酶切，将获得的含有BamH I和Nco I粘性末端的pBJ29(-)载体大片段和OsMADS29RNAi特异片段连接，完成OsMADS29RNAi特异片段的正向插入，获得含有的中间载体命名为pBJ29(+/-)。

上述pBJ29(-)的酶切鉴定：分别挑取pBJ29(-)3个单克隆，进行质粒提取酶切检测。用Sal I对pBJ29(-)进行酶切检测，可得到691bp和3317bp的条带。用Pst I对pBJ29(-)进行酶切检测，可得到550bp和3323bp的条带。结果显示正确(如图2中的A所示)。

上述pBJ29(+/-)的酶切鉴定：用Pst I对pBJ29(+/-)进行酶切，可得到184bp、713bp和3380bp的条带；用Sal I对pBJ29(+/-)进行酶切检测，可得到244bp，929bp和3317bp的条带。结果显示正确(如图2中的B所示)。

3)转化载体pU29i的构建：用KpnI和SacI分别双酶切pBJ29(+/-)载体和pU1301，分别获得含有KpnI和Sac I粘性末端的1631bp目的片段和载体pU1301的大片段，将二者连接后，获得RNAi重组载体pU29i，用于转化水稻。将pU29i上的T-DNA片段命名为T-DNA-RNAi。

上述RNAi重组载体pU29i的酶切鉴定：用BamHI和Sac I对RNAi重组载体pU29i进行双酶切，可得到1561bp的片段和13419bp载体大片段；用EcoRI单酶切pU29i，可得到763bp，1421bp的片段和12796bp载体大片段；用Pst I单酶切pU29i，可得到713bp，1986bp的片段和11956bp载体大片段；用Sal I单酶切pU29i，可得到929bp和1397bp的片段及12443bp的载体大片段；结果显示正确(如图2中的C所示)。

上述pU1301载体的构建过程如下：

将载体pUbiGUSPlus(Genbank号：AY452736)用HindIII和BamHI双酶切，将得到的2016bp的DNA片段(其序列如序列表序列5中的第2位至第2017位核苷酸序列所示)经测序验证正确后，与经Hind III和BamHI双酶切后的pCAMBIA1301(Genbank号：AF234297，国际农业分子生物学应用中心，网址：www.cambia.org)大片段相连，获得载体pU1301，将pU1301上的T-DNA片段命名为T-DNA-空。

实施例2、RNAi重组载体转化水稻

1、重组农杆菌的获得

将实施例1中步骤2获得的RNAi重组载体pU29i及载体pU1301用电击法分别导入根癌农秆菌EHA105(Biovector-375，普如汀生物技术(北京)有限公司)，获得含有RNAi重组载体pU29i的重组农杆菌，命名为EHA105/pU29i，及含有载体pU1301的重组农杆菌，命名为EHA105/pU1301。

2、转基因水稻的获得

按照文献“Hiei，Y.，S.Ohta，et al.Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof the T-DNA.The Plant Journal.1994，6(2)：271-282”和“Huang，J.Q.，Z.M.Wei，et al.High Efficiency of Genetic Transformation of Rice UsingAgrobacterium Mediated Procedure.″Acta Botanica Sinica.2000，42(11)：1172-1178”中的农杆菌介导的水稻遗传转化体系，用重组农杆菌EHA105/pU29i和EHA105/pU1301分别侵染水稻中花11号(倪丕冲.水稻花培新品种——中花11号.作物品种资源，1989年04期)成熟胚诱导的愈伤组织，浸染后的愈伤组织经共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤，分化、生根、炼苗移栽，得到再生转基因水稻苗。对得到的再生转基因水稻苗经一周左右的炼苗处理后，在向室外移栽前全部按不同株系分成单株，编号并取各单株的叶片和根，按照文献“Jefferson R.A.，T A Kavanagh et al.GUS fusions：beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion markerin higher plants.The EMBO jounal.1987，6(13)：3901-3907”中的方法进行GUS染色鉴定。经GUS染色鉴定为阳性的转基因水稻单株苗移栽到温室的土壤中生长。

结果：T₀代共获得18个含T-DNA-RNAi插入片段的水稻转基因株系，命名为中花11号/RNAi株系；T₀代共获得3个含T-DNA-空插入片段的水稻转基因株系，命名为中花11号/CK。

实施例3、OsMADS29基因功能分析

一、RNAi转基因水稻株系表型观测及其OsMADS29基因的表达量分析

观察实施例2获得的18个中花11号/RNAi的T₀代转基因株系，与3个中花11号/CK的T₀代转基因株系(对照)相比，花器官形态和数目无变化，但是结实率却有显著下降。分别选取具代表性的3个中花11号/RNAi株系L5、L8和L9及1个中花11号/CK株系共4个株系进行如下观测和分析：

1、结实率统计

分别从上述4个株系内随机取3个单株，统计各单株上所结的饱满种子数、干瘪种子数及停育种子数，计算各单株的种子结实率，结果如表1所示。

种子结实率＝(饱满种子数/(饱满种子数+干瘪种子数+停育种子数))×100％。

表1.RNAi转基因株系结实率统计

2、种子及株系的表型分类

1)种子表型分类：上述3个中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的种子分如下三种表型(如图3中的A所示)：正常种子：即饱满的种子；强表型种子：即停育或败育的种子，在受精后的发育早期(即受精后第6天)就已停育；弱表型种子：即干瘪的种子，可发育成型但最终是干瘪的，且表面有凹沟式缺口。

2)株系表型分类：将上述3个中花11号/RNAi的T₀代转基因株系按其所结种子表型及其组成(如图3中的B所示)分如下三种表型：强表型株系，如表1中的株系L5，所结种子都不正常，其中有些为强表型种子，有些为弱表型种子；中等表型株系，如表1中的株系L8，所结种子中正常种子、强表型种子和弱表型种子各占一定的比例；弱表型株系，如表1中的株系L9，结实率与对照相近，只是相对于对照而言种子败育率稍大些。

步骤1-2的结果表明：与对照相比，OsMADS29基因的功能缺失影响了水稻的正常灌浆，导致受精后的子房内淀粉得不到充分积累，从而导致种子干瘪甚至雌性不育，种子结实率下降。

3、弱表型种子的测量

由于强表型种子在发育早期就已经停育，所以分别选取株系L5和L8中成熟的干瘪种子(即弱表型种子)，以中花11号/CK株系中的饱满种子(即正常种子)为对照，各株系中随机取10粒种子测量长度、宽度、厚度，随机取100粒测千粒重(重复3次)，得到的平均值结果见表2。

表2的结果显示，与对照的饱满种子相比，株系L5和L8上所结的干瘪种子由于淀粉积累失败，种子的厚度和千粒重明显降低，存在极显著差异。

表2.种子相关农艺性状的测量

注：**表示P＜0.01。

4、种子内部结构观察

为了观察RNAi转基因水稻种子内部的组织结构是否正常，按照文献“Yang J.P.Improvement of tr aditional par affin section prepar ation methods.Journal OfBiology.2006，23(1)：45-46”中的石蜡组织切片方法，观察中花11号/CK的T₀代转基因株系上的饱满种子(即正常种子)和中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上的干瘪种子(弱表型种子)和败育种子(强表型种子)的发育早期种子，即对受精后第7天的种子的经珠心的切面进行切片观察，结果如图4所示。

结果显示，与正常种子胚乳细胞中充满的淀粉粒(图4，A)相比，弱表型种子和强表型种子胚乳细胞中都没有淀粉粒的积累(图4，B和C)，这说明OsMADS29基因的表达下调导致胚乳细胞淀粉不能正常积累。

对图4中的A-C的胚珠维管束迹(OV，箭头所示位置)进行放大观察，发现正常种子能够形成由清晰的韧皮部筛管和大量木质部导管构成的脉管结构(图4，D)，而受精后第7天的中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上的弱表型种子和强表型种子的导管和筛管都没有正常分化形成(图4，E和F)，这说明OsMADS29基因的表达下调影响了淀粉合成所需营养物的运输通畅性。此外，中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上的珠心突的细胞层数也比种子要多(图4，E和F，M和N)。由于野生型种子在发育的过程中，珠心突部分的细胞是要正常退化的(如图4，D)，中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的弱表型种子及强表型种子中的珠心突部分细胞数目较多，说明OsMADS29基因的表达下调可使珠心突细胞的正常退化也受到抑制，从而使不通畅的输导通道和不退化的珠心结构一起形成了一个“异常增厚”的物理屏障，使淀粉累积所需要的营养物质运输受到抑制而无法完成灌浆过程，进而形成干瘪或停育的异常种子。此外，正常颖果成熟后果皮和种皮完全退化成角质层(图4，G和K)，而中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的干瘪种子及停育种子果皮和种皮并没有退化(图4，H和L)。中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的弱表型种子成熟胚的结构是正常的，只是比正常种子小一些(图4，I和J)。

5、Real-time PCR分析RNAi转基因水稻株系中OsMADS29基因的表达方法：分别取上述4个株系内单株上的长度为18-22cm的成熟花序，用

(Invitrogen^TM)法分别提取总RNA，经DNaseI(RNase free)(Takara)消化总RNA中的基因组DNA后，用反转录试剂盒Superscript III(Invitrogen，Carlsbad，USA)将获得的总RNA分别进行反转录得到cDNA。以该cDNA为模板，以qOsMADS29-F：5’-GATGACTCGG ATGAG GAACG-3’和qOsMADS29-R：5’-ACGAA GGTTG TCCAG CTGCT-3’为引物进行real-time PCR扩增，同时以ACTIN1基因为内参基因，ACTIN1基因的PCR引物为qACTIN1-F：5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’和qACTIN1-R：5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’。PCR结果用双Delt方法遵照说明书进行分析。

Real time PCR的反应体系(20μL)：ddH₂O 8μL，2×SYBGreen Buffer10μL，Primer Forword(10μM)0.5μL，Primer Reverse(10μM)0.5μL，cDNA模板1μL。

PCR反应条件：94℃30s；94℃10s，58℃10s，72℃20s，40个循环。

结果：如图5所示，株系L5中OsMADS29基因表达量的下降程度最大，下降了73.6％，株系L8和L9中OsMADS29基因被抑制的水平稍低一些，分别被抑制了64.7％和28.3％。

6、Real-time PCR分析OsMADS30和OsMADS31基因的表达

由于水稻中具有OsMADS29，OsMADS30和OsMADS31共三个B_sister基因，为了防止在抑制OsMADS29表达时另外两个基因也受到影响，在进行步骤5的OsMADS29表达量检测的同时，按照相同的方法，对3个中花11号/RNAi株系L5、L8和L9内各单株中的OsMADS30和OsMADS31的表达量也进行了检测。结果表明，在OsMADS29基因下调的同时，OsMADS30和OsMADS31都几乎未受到影响(图6)。这说明RNAi转基因株系表型的产生是由于OsMADS29的表达下调特异性引起的。

用于检测OsMADS30表达量的PCR引物为：

OsMADS30-F：5’CAGTG GATGA GCTCA GCCAG 3’，

OsMADS30-R：5’TCCTA CTGCT TCCAG GAAGT 3’；

用于检测OsMADS31表达量的PCR引物为：

OsMADS31-F：5’GGTGA TGACT TGGCT TCACT GAC 3’，

OsMADS31-R：5’TGGTT GCTCA GTTGC ATCCA GAC 3’。

步骤5-6的结果表明，在3个中花11号/RNAi株系L5、L8和L9及1个中花11号/CK株系中，OsMADS29基因表达水平与步骤1统计的结实率呈正相关，与步骤2的种子表型及株系表型的严重程度是相关联的；这说明OsMADS29基因在RNAi转基因株系中的表达已被成功抑制，且OsMADS29基因的表达抑制是导致上述步骤1-4的表型产生的直接原因。

结论：特异性抑制水稻中OsMADS29的表达以后，导致结实率显著下降，种子干瘪或在发育早期严重停育。经组织切片观察发现，转基因种子所结的受精后第7天的强表型种子和弱表型种子的胚乳中无淀粉粒，进一步观察种子内部结构发现，转基因种子中运输营养物质的导管和筛管系统没有正常形成，未退化的珠心突等组织也相当于形成了“增厚”的物理屏障，阻碍了淀粉合成所需要的营养物质的运输和积累，最终导致灌浆失败，种子干瘪和败育。因此，该OsMADS29基因的主要功能是通过调控相关组织细胞的正常退化来保证种子的正常发育。

二、OsMADS29基因的表达模式检测

1、为了查看OsMADS29基因是否在产生表型的部位表达，以确定该基因与表型产生的直接相关性，分别用RT-PCR、实时定量PCR和原位杂交的方法检测OsMADS29基因在野生型水稻中的表达情况，具体如下：

1)、RT-PCR分析OsMADS29基因的表达模式

方法I：将水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)品种中花11号种植于室外网棚，分别取萌发7天的根，萌发7天的幼苗、成熟叶片、长度为1-5cm花序、10-17cm花序、17-22cm花序以及受精后第1，3，5，7，9，14天的种子为材料，按照步骤一中5的方法分别提取总RNA、反转录获得cDNA、对cDNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行分析。

结果I：如图7所示，OsMADS29基因在10cm长的花序中(图7中P2)开始有微弱表达，从受精后第1天的种子(图7中S1)表达量开始上升，受精后第5天的种子(图7中S3)中表达量达到最高，随后表达量下降，表达时期直至种子的成熟阶段S6(图7)。

方法II：分别取处于抽穗未开花的水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)品种中花11号的内外稃片、浆片、雄蕊和雌蕊为材料，按照步骤一中5的方法分别提取总RNA反转录获得cDNA、对cDNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行电泳分析，其中的内参基因为APT1该基因的扩增引物为：

APT1-F：5‘ATTCA TTTTT GGTCC GCCC 3’，

APT1-R：5‘CCCAA ATAAC TCATG TGCCT AC 3’。

结果II：如图8所示，OsMADS29基因在雌蕊中特异表达(图8)。

I和II的结果表明，从表达方式来看，OsMADS29基因满足典型B_sister基因的在发育中的种子高量表达的特点。所以，OsMADS29基因是水稻中具有典型B_sister功能的基因。

2)、Real-time PCR分析OsMADS29基因的表达模式

方法：以步骤1)中方法I获得的各cDNA样品为模板，按照步骤一中5的方法进行Real-time PCR。

结果：与步骤1)的结果I相同，在受精以后的种子中表达量最高(图9)。

3)、原位杂交分析OsMADS29基因在细胞水平的表达模式

由于RT-PCR和实时定量PCR的结果显示OsMADS29基因在受精以后的种子中有显著表达，在其它器官中表达不明显，因此以受精后第1，3，5，7天的中花11号种子为材料，以序列表序列2中的第695位至965位核苷酸序列组成的DNA片段为探针，按照文献“Kouchi，H.and S.Hata.Isolation and characterization of novelnodulin cDNAs representing genes expressed at early stages of soybean noduledevelopment.Mol Gen Genet.1993，238(1-2)：106-119”的方法进行原位杂交实验，分析OsMADS29基因在细胞水平的表达模式。

结果：如图10所示，OsMADS29基因在种子的珠心和维管束迹中均有明显表达(图10中的A，B，E，F)，此外，与正义探针相比(图10G)，该基因在胚中也有表达(图10C，D)。基因表达的组织部位与基因表达缺失后产生的结构变异的部位是吻合的。

上述步骤1)-3)的结果进一步证明，OsMADS29相对特异的在受精后的胚胎中高量表达，这说明该基因在子房发育或受精后的胚胎灌浆过程中起着重要作用，其表达缺失导致的灌浆失败是RNAi转基因株系种子败育或干瘪的直接原因。

2、为了证明OsMADS29基因的功能是调控水稻种子相关组织细胞退化或凋亡的结论，本实验从Evan’s Blue组织染色和参与细胞程序性死亡相关基因的表达检测来加以验证，具体如下：

1)Evan’s Blue组织染色

方法：Evan’s Blue是一种能够将死细胞染成蓝色而活细胞不着色的染色剂。分别取中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的受精后第15天、20天和26天的干瘪种子，以中花11号/CK的T₀代转基因株系上所结的受精后第15天、20天和26天的正常种子为对照，经种子珠心取横切切片，按照文献“Young，T.，and D.Gallie.Analysis of programmed cell death in wheat endosperm reveals differences inendosperm development between cereals.Plant Molecular Biology.1999，39(5)：915-926”的方法用Evan’s Blue(货号：04913，杭州百通生物技术有限公司)进行染色。

结果：如图11所示，对照种子在受精后第15天的时候胚乳细胞就由于程序性死亡而被染成明显的蓝色(图11中的A)，而同样15天的中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的干瘪种子却不着色(图11中的E)。在此后20天(图11中的B、F)和26天(图11中的C、G)的种子中，中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的干瘪种子的着色一直滞后于对照，同时也能看到干瘪种子中未退化的珠心突部位细胞一直未被染色(图11中的F圆圈所示位置)。这在细胞水平上说明中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结干瘪种子中的胚乳、种皮及珠心突等组织中的细胞程序性死亡受到了一定程度的抑制。

2)参与细胞程序性死亡相关基因的表达检测

为了进一步在分子水平上验证OsM4DS29与细胞死亡的关系，本实验选取了三类已经被证明促进细胞死亡的基因，以正常种子中的表达量做对照，来检测其在中花11号/RNAi的T₀代转基因株系种子中的表达量。其中，VPE基因(vacuolar processingenzyme genes)是通过液泡破裂导致的细胞死亡的一类基因，VADC(voltage-dependentanion channel)是通过线粒体损伤导致细胞死亡的一类基因，PBZ基因(probenazole-inducible gene)是真菌侵染等抗逆诱导细胞死亡途径中的一类重要基因。

方法：分别取中花11号/RNAi的T₀代转基因株系L5及中花11号/CK的T₀代转基因株系的受精后第五天的种子，按照步骤一中5的方法分别提取总RNA、反转录获得cDNA后，对cDNA进行Real time PCR扩增，扩增的目的基因、内参基因及其引物如表3所示，相对表达量结果如图12所示。

表3.参与细胞程序性死亡相关基因的Real time PGR引物序列

图12的结果表明，中花11号/RNAi的T₀代转基因株系中只有VPE表达量显著下降(图12)。这说明OsMADS29基因是通过液泡途径参与细胞凋亡进而调控种子的正常发育。

结论：OsMADS29是水稻中的B_sister基因成员之一，它主要在受精后发育过程中的种子尤其是其珠心结构及其脉管系统中高量表达。实验证明，该基因的表达被抑制后，种子中母体组织的正常退化受到抑制，从而形成类似于加厚的物理屏障，使营养物质运输不畅，从而导致水稻灌浆失败、种子败育或干瘪，结实率大大下降。说明OsMADS29在水稻种子细胞凋亡过程中起着重要的正调控作用。