CN116064640B - 一种调控水稻直链淀粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控水稻直链淀粉的方法，包括对水稻OsNAC24基因进行基因编辑。本发明通过基因编辑技术获得了水稻种子特异表达的转录因子OsNAC24的功能缺失突变体，对突变体的品质指标进行测定发现，osnac24突变体直链淀粉含量降低，垩白率降低，长宽比增加，从而极大地改善了稻米的食味品质和外观品质。
Description
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及到一种调控水稻直链淀粉的方法。
背景技术
稻米的品质决定了着消费者的选择和市场经济价值。稻米的品质指标包括碾磨加工品质，外观品质(主要是垩白和长宽比)，食味品质，营养品质等。稻米中约90％的干重成分为淀粉，淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉在稻米总淀粉中占比约0％-30％，但对稻米品质影响巨大。直链淀粉含量偏高往往导致稻米的食味品质变差，反之，直链淀粉含量偏低则大大改善稻米的食味品质。因此，近年来众多研究学者通过编辑直链淀粉合成酶编码基因OsGBSSI(Wx)来达到改良稻米品质的目的。
然而对OsGBSSI的编码区的改造往往直接造成直链淀粉含量的完全缺失，产生不透明的蜡质糯米表型，生产缺乏应用价值。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
本发明的其中一个目的是提供一种调控水稻直链淀粉的方法，通过基因编辑技术获得突变体直链淀粉含量降低，垩白率降低，长宽比增加，从而极大地改善了稻米的食味品质和外观品质。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种调控水稻直链淀粉的方法，包括，对水稻OsNAC24基因进行基因编辑。
作为本发明调控水稻直链淀粉的方法的一种优选方案，其中：所述水稻OsNAC24基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明调控水稻直链淀粉的方法的一种优选方案，其中：所述进行基因编辑，采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述水稻OsNAC24基因的sgRNA载体。
作为本发明调控水稻直链淀粉的方法的一种优选方案，其中：所述表达靶向所述水稻OsNAC24基因的sgRNA的载体可为载体SK-gRNA和/或载体pCAMBIA 1300-GN。
作为本发明调控水稻直链淀粉的方法的一种优选方案，其中：所述sgRNA的靶序列为SEQ ID NO.1的第一个外显子ATG上游第196～179位、和/或第一个外显子ATG上游第169～151位、和/或第一个外显子ATG下游第16～34位、和/或第一个外显子ATG下游第359～377位；其中，第一个外显子ATG是指如SEQ ID NO.1所示的野生型OsNAC24基因序列的第2000～2002位。
作为本发明调控水稻直链淀粉的方法的一种优选方案，其中：所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向SEQ ID NO.1的第一个外显子ATG上游第196～179位、和/或第一个外显子ATG上游第169～151位、和/或第一个外显子ATG下游第16～34位、和/或第一个外显子ATG下游第359～377位的sgRNA载体。
作为本发明调控水稻直链淀粉的方法的一种优选方案，其中：所述水稻为粳稻(Oryza sativa ssp)。
作为本发明调控水稻直链淀粉的方法的一种优选方案，其中：上述方法包括如下步骤：
在水稻OsNAC24基因选取靶位点；
根据靶位点的靶序列设计引物，合成编码gRNA的DNA分子；
构建基因编辑载体；
转化受体水稻，获得突变植株。
本发明的另一个目的是提供一种DNA分子，所述DNA分子为下述任一种：
(a1)核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的DNA分子；
(a3)核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示的DNA分子。
作为本发明DNA分子的一种优选方案，其中：SEQ ID NO.3所示的DNA分子为所述水稻OsNAC24基因(SEQ ID No.1)的移码突变，其在T1、T2和T4靶位点分别缺失了9bp、19bp和2bp；
SEQ ID No.5所示的DNA分子为所述水稻OsNAC24基因(SEQ ID No.1)的移码突变，其在T1靶位点插入1个bp T，从T2靶位点倒数第4位碱基到T4靶位点倒数第4个碱基之间有555bp的大片段缺失；
SEQ ID No.7所示的DNA分子为所述水稻OsNAC24基因(SEQ ID No.1)的移码突变，其在T1靶位点缺失2bp，从T2靶位点倒数第4个碱基到T4靶位点下游24bp缺失582bp。
本发明的另一个目的是提供一种生物材料，所述生物材料为下述任一种：
(b1)特异性靶向所述水稻OsNAC24基因的sgRNA；
(b2)特异性靶向所述靶序列的sgRNA；
(b3)编码(b1)或(b2)所述sgRNA的DNA分子；
(b4)含有(b3)所述DNA分子的表达盒；
(b5)含有(b3)所述DNA分子的重组载体、或含有(b4)所述表达盒的重组载体；
(b6)含有(b1)或(b2)所述sgRNA或(b3)所述DNA分子的重组微生物、或含有(b4)所述表达盒的重组微生物、或含有(b5)所述重组载体的重组微生物；
(b7)含有(b1)或(b2)所述sgRNA或(b3)所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有(b4)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有(b5)所述重组载体的转基因植物细胞系。
作为本发明生物材料的一种优选方案，其中：所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
作为本发明生物材料的一种优选方案，其中：所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。
作为本发明生物材料的一种优选方案，其中：所述重组载体具体可为CRISPR/Cas9打靶载体，包括中间载体SK-gRNA和/或最终载体pC1300-Cas9但不限于此。
本发明的另一个目的是提供一种制备稻米品质改善的水稻的方法，包括，
用SEQID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7所示的DNA分子替换水稻基因组DNA中的SEQ ID No.1所示的DNA分子，得到稻米品质改善的水稻。
作为本发明制备稻米品质改善的水稻的方法的一种优选方案，其中：所述改善稻米品质为下述至少一种：
(c1)直链淀粉含量降低；
(c2)垩白率下降；
(c3)垩白度下降。
本发明的另一个目的是提供所述的调控水稻直链淀粉的方法，和/或，所述的DNA分子，和/或，所述的生物材料在创制OsNAC24基因等位变异体和/或水稻育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过基因编辑技术获得了水稻种子特异表达的转录因子OsNAC24的功能缺失突变体，对突变体的品质指标进行测定发现，osnac24突变体直链淀粉含量降低，垩白率降低，长宽比增加，从而极大地改善了稻米的食味品质和外观品质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明中OsNAC24的基因骨架示意图以及3个突变体株系的示意图。其中，灰、黑、白框分别代表启动子、外显子和内含子；T1、T2、T3、T4为CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点，del为缺失位点，in为插入位点，P-F和P-R为正引物和反向引物，用于鉴定突变体。
图2为OsNAC24基因序列及突变体序列的测序结果。
图3为本发明OsNAC24突变体的鉴定和表达。其中，图3A为OsNAC24突变体的鉴定，M为DAN marker；WT为野生型；1～6指每系单株；HPT为潮霉素基因片段；图3B为OsNAC24在WT和osnac24突变体中的表达；图3C为WT和osnac24突变体7DAF胚乳总蛋白考马斯蓝染色(左)和OsNAC24蛋白WB检测(右)。
图4为本发明OsNAC24突变体的外观品质测试结果。图4A和图4B为突变体的粒长和千粒重测试结果；图4C为突变体糙米(上排)和精米(下排)的观察，使用扫描仪进行扫描拍照；图4D和图4E分别为突变体的垩白率和垩白度的测量结果。
图5为本发明野生型和突变体的糙米及横截面观察。其中，方框表示扫描电镜观察淀粉颗粒的位置。
图6为本发明OsNAC24突变体的淀粉含量及理化性质的检测结果。其中，图6A为总淀粉含量(TSC)的检测结果；图6B为表观直链淀粉含量(AAC)的检测结果；图6C为可溶性含量(SSC)的检测结果；图6D为突变体-WT胚乳支链淀粉的链长分布；图6E为淀粉的胶稠度测定结果。
图7为对比例1中OsNAC24过表达转基因植株(gD-OE)的构建示意图。
图8为对比例1中过表达转基因植株的鉴定。其中，图8A为过表达转基因植株7DAF胚乳中OsNAC24转录水平的qRT-PCR检测结果，每个样品4各生物学重复，每个重复检测3粒胚乳，以UBQ10为内参基因；图8B表示OsNAC24过表达转基因7DAF胚乳中总蛋白的SDS-PAGE电泳检测和考染(上半部分)以及OsNAC24蛋白的WB检测结果(下半部分)。
图9为对比例1中OsNAC24过表达转基因植株的成熟种子的外观品质检测结果。其中，图9A和图9B表示粒宽和千粒重检测结果，每个样品3各生物学重复，每个生物学重复检测300粒种子；图9C表示过表达转基因植株的籽粒外观和精米外观；图9D和图9E表示垩白率和垩白度的检测结果。
图10为对比例1野生型和过表达转基因植株的糙米及横截面观察。其中，方框表示扫描电镜观察淀粉颗粒的位置。
图11为对比例1中野生型和过表达转基因植株的成熟种子中表观直链淀粉含量(AAC)和总淀粉含量(TSC)的检测结果。其中，图11A表示AAC含量检测结果；图11B表示TSC含量检测结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
1.植物材料与生长条件
粳稻品种(Oryza sativa ssp)使用Nipponbare(NIP)。以粳稻NIP为遗传转化背景，构建了OsNAC24包括突变体和过表达在内的转基因植株。水田条件：在自然条件下，夏季在上海松江实验基地种植，冬季在海南陵水生长，主要用于表型分析、基因表达检测和制种。温室条件：28℃，11-h白天/13-h晚上，主要进行幼苗培养和基因表达检测。
2.质粒构建与转化
对于CRISPR/Cas9突变体构建，以野生型NIP基因组DNA为模板，野生型OsNAC24基因序列如SEQ ID NO.1所示。如图1所示，共选择了4个靶位点，T1靶位点为野生型OsNAC24基因序列第一个外显子ATG上游第196～179位；T2靶位点为野生型OsNAC24基因序列第一个外显子ATG上游第169～151位；T3靶位点为野生型OsNAC24基因序列第一个外显子ATG下游第16～34位；以及T4靶位点为野生型OsNAC24基因序列第一个外显子ATG下游第359～377位；其中，第一个外显子ATG是指如SEQ ID NO.1所示的野生型OsNAC24基因序列的第2000～2002位。
具体靶位点序列为：
T1:TCGATACTCCGCCGGTATG
T2:GGCAAAGATGAGTCAGGTG
T3:TCCTTGCCTGTCTTGCCAA
T4:CTCAGCGGCGTCAGGCTTT
根据CRISPR/Cas9系统要求，将靶位点设计成引物，交由生物公司合成，具体引物序列为：
T1-F：5’-GCCGTCGATACTCCGCCGGTATG-3’
T1-R：5’-AAACCATACCGGCGGAGTATCGA-3’
T2-F：5’-GGCAGGCAAAGATGAGTCAGGTG-3’
T2-R：5’-AAACCACCTGACTCATCTTTGCC-3’
T3-F：5’-TCAGTCCTTGCCTGTCTTGCCAA-3’
T3-R：5’-AAACTTGGCAAGACAGGCAAGGA-3’
T4-F：5’-GTTGCTCAGCGGCGTCAGGCTTT-3’
T4-R：5’-AAACAAAGCCTGACGCCGCTGAG-3’
将靶位点引物混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段后连入用Aar I酶切(Ferment公司)过的中间载体SK-gRNA中。转化得到的连接质粒进行菌落PCR阳性检测。并进行测序检测，验证是否正确。测序正确的中间载体用同尾酶系统酶切后连入用Kpn I和BamHI酶切过的最终载体pCAMBIA 1300-GN中。然后进行PCR筛选阳性菌落后测序验证。
3.遗传转化
将测序正确的重组载体质粒转入EHA105菌株，采用农杆菌介导的遗传转化方法(刘巧泉等，植物生理学报.1998)侵染受体水稻粳稻NIP愈伤。共培养3天后，在含有潮霉素的筛选培养基上培养。筛选到的抗性愈伤在预分化培养基上培养10天左右，将预分化的愈伤转至分化培养基上培养，一个月左右得到转基因T0代植株。
4.突变植株的检测与筛选
采用CTAB方法从T0代水稻叶片中快速提取基因组DNA，用于潮霉素片段检测。取T0代组培苗约1克新鲜水稻叶片剪碎后放入2ml离心管，加入钢珠经液氮冷冻后，在磨样机上粉碎，然后提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100微升超纯水中。
在潮霉素基因上设计引物进行PCR检测，最终在T2代和T3代中挑选纯合的转基因株系分析。然后取开花后7DAF的种子提取总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录为cDNA，然后对反转录的cDNA进行OsNAC24的表达水平的qRT-PCR检测，从而筛选表达量较高且稳定的过表达转基因株系，我们得到了3个突变类型不同的独立株系(命名为osnac24-1/2/3)。
检测潮霉素片段扩增引物序列分别为：
P-F：5’-TATCTGTGCCGCTTTGCACT-3’
P-R：5’-TTCACAGAAGGGTGTGCGGT-3’
OsNAC24的qRT-PCR检测引物分别为：
qRT-F：5’-TCCTTGTCTTCATCCACCGC-3’
qRT-R：5’-AGCACTGTAACCGTGAGACG-3’
对3个突变类型进行测序分析结果如图2所示，osnac24-1在第一、第二和第四靶位点分别缺失了9bp、19bp和2bp，因移码提前产生终止密码子，导致翻译产生95个氨基酸的多肽，见表1。
如图2，osnac24-2在第一个靶位点插入1个bp T，从第二个靶位点倒数第4位碱基到第四个靶位点倒数第4个碱基之间有555bp的大片段缺失；osnac24-3在第一个靶位点缺失2bp，从第二个靶位点倒数第4个碱基到第四个靶位点下游24bp缺失582bp。osnac24-2和osnac24-3都缺失了原来的起始密码子，蛋白翻译从313-315位的ATG开始，失去了N端104个氨基酸，具体参见表1。OsNAC24野生型氨基酸序列如SEQ ID NO.2。osnac24-1突变型核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；osnac24-1突变型氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。osnac24-2突变型核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；osnac24-2突变型氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示.osnac24-3突变型核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；osnac24-3突变型氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。
OsNAC24的野生型及各突变型氨基酸序列对比如表1所示。
表1
注：与野生型相同的氨基酸序列用下划线字母表示，与野生型不同的氨基酸用加粗字母表示，横线表示缺失的氨基酸。
5.SDS-PAGE分析
使用T1代植株自交分离的后代T2代及T3代纯合突变体植株分析表型，从3粒开花后7天(day after flowering，DAF)的胚乳中提取总蛋白，然后用Braford法对提取的蛋白进行定量。将每个样品的等效总蛋白(50ug)上样，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。加载相同总蛋白含量的样品被进一步用于考马斯蓝染色和Western blot检测。OsNAC24和淀粉合成酶多克隆抗体由公司(Willget biotech和Cwbio)制备，稀释倍数为：OsGBSSI、OsSSI、OsSBEI、OsSBEIIb和PhoI为1:50000，其他为1:10000。测试结果如图3所示。
如图3所示，我们在T2代中分离到不含转基因载体的纯合突变体(图3A)，消除了转基因载体的非特异性影响。qRT-PCR检测显示，突变体胚乳中几乎检测不到OsNAC24的表达(图3B)，更重要的是，通过特异抗体Western blot(WB)检测，突变体中OsNAC24的蛋白无法被检测到(图3C)。这些结果表明osnac24突变属于功能缺失型突变。
6.水稻品质分析
从大田自生长然条件下，收获开花后约50天的种子，通常水稻开花后30-50天为成熟期，将OsNAC24突变体和野生型水稻植株的成熟种子，进行脱粒，然后使用微型砻谷机进行脱壳处理。最后使用微型精米机对脱壳的糙米进行碾磨去除种皮和胚形成及精米。然后将精米分散放置于万深谷物外观品质分析仪上进行扫描分析，由软件自动统计分析计算粒长、粒宽、千粒重、垩白率和垩白度等外观指标。每个样品分析3个生物学重复，每个生物学重复分析不少于300粒种子。
测试结果如图4所示，图4A和图4B分别为突变体的粒长和千粒重增加。粒长和千粒重使用万深拷种仪进行测量，每个样品3个生物学重复，每个生物学重复测量不少于300粒种子，***P<0.001。图4C为突变体糙米(上排)和精米(下排)的观察，使用扫描仪进行扫描拍照。图4D和图4E为突变体的垩白率和垩白度的测量，使用万深谷物外观品质分析仪进行测量统计，每个样品测量3个生物学重复，每个生物学重复测量不少于300粒种子，*P<0.05,***P<0.001。
测试结果显示，osnac24突变体的粒长和千粒重显著增加，导致籽粒瘦长，而垩白率和垩白度显著降低，这极大的改善了稻米的外观品质，OsNAC24突变体成熟胚乳半透明没有垩白。
7.扫描电子显微镜观察
将成熟种子脱壳后在37℃下干燥2天。用刀在胚乳中间横切，将横切面向上固定，喷上金粉末。用扫描电镜(JSM-6360LV，JEOL)观察横切面淀粉粒。
图5为野生型和突变体的糙米及横截面观察。方框表示扫描电镜观察淀粉颗粒的位置。测试结果显示，横切面扫描电镜(SEM)显示，突变体淀粉颗粒呈规则的多边型，排列紧密，上述表型与野生型没有差异。
8.淀粉含量与理化性质检测
将成熟种子脱壳脱糙后，将脱糙后的胚乳磨成细粉，用150目筛过滤。用淀粉测定试剂盒(K-TSTA)按制造商的操作说明操作。表观直链淀粉含量(AAC)根据文献方法测定(Tan et al.(1999))。采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性糖。简单地说，取0.1g淀粉粉，用4ml 80％(v/v)乙醇在80℃下洗涤2次，40min提取可溶性糖，3000rpm离心5min收集含可溶性糖的上清，用水稀释至10ml。取0.1ml萃取液与3ml蒽酮-硫酸缓冲液混合(0.1g蒽酮溶于100ml 2M硫酸中)。测定反应溶液在620nm处的吸光度，以等体积80％不含糖的乙醇作为空白对照。用标准葡萄糖溶液得到标准曲线，然后根据线性方程计算未知样品的糖含量。确定支链的链长分布，5mg的过滤粉完全悬浮在5ml水进行淀粉糊化，煮60分钟。然后2.5ml糊化样本通过添加3.5μl异淀粉酶(1000U/μl)、125μl NaAc(600mM，pH4.4)、25μl NaN3(2％,V/V)消化24h。消化样品用氢氧化铵调整到pH 9.0，然后添加375μl NaBH(2％,m/V)。样品用真空泵干燥后，加入60μl NaOH(1M)溶解，加540μl水稀释。最后，采用ICS3000型(Dionex)的脉冲安培检测器和CarboPac PA-20柱，对制备的样品进行高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)。根据国标(GB/T 22294-2008)流程操作对胶稠度和糊化温度进行检测。
图6A、图6B、图6C分别是总淀粉含量(TSC)、表观直链淀粉含量(AAC)及可溶性含量(SSC)的检测。图6D为突变体-WT胚乳支链淀粉的链长分布。图6E为淀粉的胶稠度测定。
测试结果显示，OsNAC24突变体胚乳中淀粉的物理化学性质也发生了改变。例如，突变体支链淀粉的链长分布发生改变，聚合度(DP)为6-8和16-18的链长减少，而在DP为8-12和21-28的链长增加(图6D)。此外，osnac24胚乳中淀粉的胶稠度虽然与WT没有显著差异，但略有降低(图6E)。与WT相比，突变体胚乳总淀粉含量(TSC)和直链淀粉含量(AC)降低(图6A和图6B)，作为淀粉合成原料的可溶性糖含量(SSC)升高(图6C)。
表2显示的是OsNAC24突变体中淀粉的糊化温度的影响。使用差示扫描量热法(DSC)检测3个生物学重复，其中，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。
表2
| To(℃) | Tp(℃) | Tc(℃) | ΔH(J/g) | |
| WT | 62.25±0.26 | 69.05±0.52 | 75.70±0.14 | 6.23±0.89 |
| osnac24-1 | 63.96±0.26*** | 70.21±0.21** | 76.15±0.33* | 7.88±0.25 |
| osnac24-2 | 62.38±0.07 | 69.38±0.14 | 75.79±0.19 | 7.73±0.11 |
| osnac24-3 | 62.84±0.34 | 69.66±0.08 | 76.08±0.21 | 7.70±0.09 |
由表2可以看出，淀粉在osnnac24胚乳中的糊化温度和热焓显著升高。
上述结果表明，OsNAC24功能的缺失导致了胚乳中淀粉合成的改变，同时提升了稻米的外观品质和食味品质。
对比例1
1.植物材料与生长条件
粳稻品种(Oryza sativa ssp)使用Nipponbare(NIP)。以粳稻NIP为遗传转化背景，构建了OsNAC24过表达在内的转基因植株。水田条件：在自然条件下，夏季在上海松江实验基地种植，冬季在海南陵水生长，主要用于表型分析、基因表达检测和制种。温室条件：28℃，11-h白天/13-h晚上，主要进行幼苗培养和基因表达检测。
2.质粒构建与转化
对于过表达转基因载体构建，以野生型NIP基因组DNA为模板，设计正反向引物，进行PCR扩增，目的片段包含ATG上游约2kb的启动子区、起始密码子至终止密码子的ORF区、终止密码子下游约1kb的终止子区(如图7所示)，引物序列如下。然后将PCR产物回收并使用重组酶将目的片段克隆到转基因载体pCAMBIA1300(BamHI和HindIII双酶切)内。
OsNAC24 F:5’-CGGTACCCGGGGATCCTCCCAGCCCATGTTTCAGTAG-3’
OsNAC24 R:5’-GGCCAGTGCCAAGCTTACCTAAGGCCCATTCGTTGC-3’
3.遗传转化
将测序正确的重组载体质粒转入EHA105菌株，采用农杆菌介导的遗传转化方法(刘巧泉等，植物生理学报.1998)侵染受体水稻粳稻NIP愈伤。共培养3天后，在含有潮霉素的筛选培养基上培养。筛选到的抗性愈伤在预分化培养基上培养10天左右，将预分化的愈伤转至分化培养基上培养，一个月左右得到转基因T0代植株。
4.过表达转基因植株的检测与筛选
采用CTAB方法从T0代水稻叶片中快速提取基因组DNA，用于潮霉素片段检测。取T0代组培苗约1克新鲜水稻叶片剪碎后放入2ml离心管，加入钢珠经液氮冷冻后，在磨样机上粉碎，然后提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100微升超纯水中。
在潮霉素基因上设计引物进行PCR检测，最终在T2代和T3代中挑选纯合的转基因株系分析。然后取开花后7DAF的种子提取总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录为cDNA，然后对反转录的cDNA进行OsNAC24的表达水平的qRT-PCR检测，从而筛选表达量较高且稳定的过表达转基因株系，我们最终获得了2个独立的理想株系(命名为gD-OE-2和gD-OE-3)。
检测潮霉素片段扩增引物序列分别为：
HPT-F：5’-GCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGG-3’
HPT-R：5’-TTTCCACTATCGGCGAGTACTTC-3’
OsNAC24的qRT-PCR检测引物分别为：
qRT-F：5’-TCCTTGTCTTCATCCACCGC-3’
qRT-R：5’-AGCACTGTAACCGTGAGACG-3’
5.SDS-PAGE分析
使用T2代及T3代纯合过表达植株分析表型，从3粒开花后7天(day afterflowering，DAF)的胚乳中提取总蛋白，然后用Braford法对提取的蛋白进行定量。将每个样品的等效总蛋白(50ug)上样，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。加载相同总蛋白含量的样品被进一步Western blot检测。OsNAC24和淀粉合成酶多克隆抗体由公司(Willget biotech和Cwbio)制备，稀释倍数为1:10000。
测试结果如图8所示，我们在T1代植株自交分离的后代T2和T3代中分离到纯合转基因植株(纯合表明T3代或T4代的潮霉素不再自由分离，即所有后代植株都是潮霉素阳性)。qRT-PCR检测显示，过表达转基因胚乳中OsNAC24的表达水平显著高于野生型(图8A)，更重要的是，通过特异抗体Western blot(WB)检测，过表达转基因植株胚乳中OsNAC24的蛋白显著高于野生型(图8B)。这些结果表明转基因植株中OsNAC24过表达成功。
6.水稻品质分析
从大田自生长然条件下，收获开花后约50天的种子，通常水稻开花后30-50天为成熟期，将OsNAC24过表达转基因植株和野生型水稻植株的成熟种子进行脱粒，然后使用微型砻谷机进行脱壳处理。最后使用微型精米机对脱壳的糙米进行碾磨去除种皮和胚形成及精米。然后将精米分散放置于万深谷物外观品质分析仪上进行扫描分析，由软件自动统计分析计算粒长、粒宽、千粒重、垩白率和垩白度等外观指标。每个样品分析3个生物学重复，每个生物学重复分析不少于300粒种子。
测试结果如图9所示，图9A和图9B分别为突变体的粒宽和千粒重减小。粒宽和千粒重使用万深拷种仪进行测量，每个样品3个生物学重复，每个生物学重复测量不少于300粒种子，***P<0.001。图9C为突变体糙米(上排)和精米(下排)的观察，使用扫描仪进行扫描拍照。图9D和图9E为过表达植株种子的垩白率和垩白度的测量，使用万深谷物外观品质分析仪进行测量统计，每个样品测量3个生物学重复，每个生物学重复测量不少于300粒种子，*P<0.05,***P<0.001。
测试结果显示，OsNAC24过表达转基因植株的粒宽和千粒重显著减小，导致籽粒瘦长，而垩白率和垩白度显著增加，这使得外观品质变差(如图9所示)。
7.扫描电子显微镜观察
将成熟种子脱壳后在37℃下干燥2天。用刀在胚乳中间横切，将横切面向上固定，喷上金粉末。用扫描电镜(JSM-6360LV，JEOL)观察横切面淀粉粒。
图10为野生型和过表达转基因植株的糙米及横截面观察。方框表示扫描电镜观察淀粉颗粒的位置。测试结果显示，横切面扫描电镜(SEM)显示，过表达转基因植株淀粉颗粒显著减小，变成球状，疏松排列，与野生型紧密排列的规则多边形淀粉颗粒显著不同。
8.淀粉含量与理化性质检测
将成熟种子脱壳脱糙后，将脱糙后的胚乳磨成细粉，用150目筛过滤。用淀粉测定试剂盒(K-TSTA)按制造商的操作说明操作。表观直链淀粉含量(AAC)根据文献方法测定(Tan et al.(1999))。
图11A、图11B分别是总淀粉含量(TSC)、表观直链淀粉含量(AAC)。
测试结果显示，OsNAC24过表达转基因植株胚乳中淀粉与WT相比，总淀粉含量(TSC)略有增加，表观直链淀粉含量(AC)显著增加。
本发明发现水稻新的NAC家族转录因子成员OsNAC24参与水稻直链淀粉和支链淀粉合成。OsNAC24对直链淀粉含量具有十分强大的调节能力，osnac24功能缺失突变体中直链淀粉含量显著降低，垩白率降低，从而极大的改善了稻米的食味品质和外观品质，因此，OsNAC24及其对OsGBSSI启动子的结合元件将会成为稻米品质改良的优秀操作位点。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种调控水稻直链淀粉的方法，其特征在于：包括，对水稻OsNAC24基因进行基因编辑，使OsNAC24基因编码的蛋白功能缺失，所述水稻OsNAC24基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的调控水稻直链淀粉的方法，其特征在于：所述进行基因编辑，采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述水稻OsNAC24基因的sgRNA载体。
3. 如权利要求2所述的调控水稻直链淀粉的方法，其特征在于：所述sgRNA的靶序列为SEQ ID NO.1的第一个外显子ATG上游第197~179位、和/或第一个外显子ATG上游第169~151位、和/或第一个外显子ATG下游第16~34位、和/或第一个外显子ATG下游第359~377位；
其中，所述第一个外显子ATG为SEQ ID NO .1所示的野生型OsNAC24基因序列的第2000～2002位。
4.如权利要求1~3中任一项所述的调控水稻直链淀粉的方法，其特征在于：所述水稻为粳稻。
5.一种制备稻米品质改善的水稻的方法，其特征在于：包括，
用SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7所示的DNA分子替换水稻基因组DNA中的SEQ ID No.1所示的DNA分子，得到稻米品质改善的水稻；
所述改善稻米品质为下述至少一种：
（c1）直链淀粉含量降低；
（c2）垩白率下降；
（c3）垩白度下降。
6.权利要求1~4中任一项所述的调控水稻直链淀粉的方法在水稻育种中的应用。
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