CN117487959B - 一种与印度南瓜侧枝数量相关基因连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种与印度南瓜侧枝数量相关基因连锁的分子标记及应用，属于分子标记技术领域。本发明与印度南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记InDel258和/或InDel266位于印度南瓜第1号染色体上，并提供了扩增分子标记InDel258和InDel266的引物对。本发明以标记InDel258和Indel266进行性状准确度的鉴定，F2群体509株中基因型和表型的吻合度为89.55％，有利于实现精准育种。本发明的侧枝数量（多/少）性状紧密连锁的分子标记具有易于检测、扩增产物稳定、特异性高的特点，可简便、快速地应用于印度南瓜育种实践及品种鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及一种与印度南瓜侧枝数量相关基因连锁的分子标记及应用。
背景技术
印度南瓜属于葫芦科（Cucurbitaceae）南瓜属（Cucurbita）一年生蔓生草本植物，在世界范围内被广泛种植，是我国重要的瓜类作物之一。南瓜属作物生长势强，经常会产生侧枝，南瓜属植物的侧枝性状主要体现在主蔓（主茎）各节位侧枝数上，按照主蔓上的侧枝数可分为多侧枝、少侧枝和无侧枝。过多的侧枝不仅改变植株营养分配状态，增加田间整枝劳动量，在一定程度上会降低主蔓的座果率，同时，较多较长的侧枝还会增加枝条密度，导致通风不良，极易发生病害。少或无侧枝类型是南瓜育种的主要目标，少或无侧枝南瓜适于密植栽培，减少田间整枝劳动力，可提高单位面积产量。在黄瓜、西瓜和甜瓜等葫芦科作物中，相继报道了少侧枝或无侧枝等相关的紧密连锁标记和图位克隆基因，但印度南瓜（Cucurbita maxima）的育种起步晚，与侧枝标记开发与定位等相关的报道较少。因此，进行印度南瓜侧枝数量相关紧密连锁标记的开发适合于密植栽培和简约化栽培的要求，且对于构建分子辅助选择育种体系、种质资源的改良、新品种选育等具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与印度南瓜侧枝数量相关基因连锁的分子标记及应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种与印度南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记为InDel258或InDel266，
所述分子标记位于印度南瓜第1号染色体上。
优选的，所述与印度南瓜侧枝数量相关的基因为CmaLB1.1基因。
本发明还提供了扩增所述的分子标记的引物对，扩增分子标记InDel258的引物对如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；扩增分子标记InDel266的引物对如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
本发明还提供了一种印度南瓜侧枝数量性状的鉴定方法，包括如下步骤：
1）待测印度南瓜基因组DNA的提取；
2）以步骤1）中所提取基因组DNA为模板，利用所述的分子标记的引物对进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序；
3）根据步骤2）的电泳条带和/或测序结果进行判定。
优选的，步骤3）中所述判定的标准为：
对于分子标记InDel258，PCR扩增得到SEQ ID NO.29所示的条带时，印度南瓜为少侧枝或无侧枝类型；PCR扩增得到SEQ ID NO.30所示的条带或者既得到SEQ ID NO.29所示的条带又得到SEQ ID NO.30所示的条带时，印度南瓜为多侧枝类型；
所述SEQ ID NO.29所示的条带的长度为233bp；
所述SEQ ID NO.30所示的条带的长度为213bp；
对于分子标记InDel266，PCR扩增得到SEQ ID NO.31所示的条带时，印度南瓜为少侧枝或无侧枝类型；PCR扩增得到SEQ ID NO.32所示的条带或者既得到SEQ ID NO.31所示的条带又得到SEQ ID NO.32所示的条带时，印度南瓜为多侧枝类型；
所述SEQ ID NO.31所示的条带的长度为212bp；
所述SEQ ID NO.31所示的条带的长度为202bp。
本发明还提供了所述的分子标记或所述的引物对在印度南瓜育种中的应用。
本发明还提供了所述的分子标记或所述的引物对在鉴定或辅助鉴定印度南瓜主蔓侧枝数量性状中的应用。
本发明还提供了所述的分子标记或所述的引物对在定位控制印度南瓜侧枝数量的相关基因中的应用。
本发明还提供了一种用于鉴定印度南瓜侧枝数量的试剂盒，包括所述的引物对中任意一对或两对。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明获得了两个与印度南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记InDel258或Indel266，标记InDel258和基因的遗传距离为0.9 cM，标记Indel266和基因的遗传距离为0.4 cM，利用这一结果，可为最终实现与印度南瓜侧枝数量相关基因CmaLB1.1的克隆奠定基础，进而为揭示侧枝形成的调控机制提供新的基因资源和理论依据，有利于南瓜侧枝性状的精准育种。
（2）以标记InDel258和Indel266进行性状准确度的鉴定，F2群体509株中基因型和表型的吻合度为89.55％，有利于实现精准育种。
（3）使用与侧枝数量（多/少）性状紧密连锁的分子标记在苗期进行筛选，有助于加速育种效率，节省成本。
（4）本发明的侧枝数量（多/少）性状紧密连锁的分子标记具有易于检测、扩增产物稳定、特异性高的特点，可简便、快速地应用于印度南瓜育种实践及品种鉴定。
附图说明
图1是InDel-index关联值在染色体上的分布图（其中，横坐标为染色体名称，上图是隐性混池的InDel-index值的分布图；中图是显性混池的InDel-index值的分布图；下图是ΔInDel-index值的分布图）；
图2是利用JoinMAP4.0制作的遗传连锁图谱；
图3是分子标记InDel258在亲本、F1和F2群体中的验证图（其中，泳道1为marker，2000bp；泳道2为P1(98-2)读为“1”隐性，泳道3为P2(312-1)读为“2”显性，泳道4为F1读为“3”显性，其它泳道为50株F2群体，读胶参考P1、P2、F1来读带，无条带或无法确定读为“-”，亲本、F1及F2群体中多侧枝单株表型读为“2”，少侧枝或无侧枝单株表型读为“1”）；
图4是分子标记InDel266在亲本、F1和F2群体中的验证图（其中，泳道1为marker，2000bp；泳道2为P1(98-2)读为“1”隐性，泳道3为P2(312-1)读为“2”显性，泳道4为F1读为“3”显性，其它泳道为50株F2群体，读胶参考P1、P2、F1来读带，无条带或无法确定读为“-”，亲本、F1及F2群体中多侧枝单株表型读为“2”，少侧枝或无侧枝单株表型读为“1”）。
具体实施方式
本发明提供了一种与印度南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记为InDel258或InDel266，所述分子标记位于印度南瓜第1号染色体上。所述与印度南瓜侧枝数量相关的基因为CmaLB1.1基因。
本发明还提供了扩增所述的分子标记的引物对，扩增分子标记InDel258的引物对如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；扩增分子标记InDel266的引物对如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
本发明还提供了一种印度南瓜侧枝数量性状的鉴定方法，包括如下步骤：
1）待测印度南瓜基因组DNA的提取；
2）以步骤1）中所提取基因组DNA为模板，利用所述的分子标记的引物对进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序；
3）根据步骤2）的电泳条带和/或测序结果进行判定。
在本发明中，步骤3）中所述判定的标准为：
对于分子标记InDel258，PCR扩增得到SEQ ID NO.29所示的条带时，印度南瓜为少侧枝或无侧枝类型；PCR扩增得到SEQ ID NO.30所示的条带或者既得到SEQ ID NO.29所示的条带又得到SEQ ID NO.30所示的条带时，印度南瓜为多侧枝类型；
所述SEQ ID NO.29所示的条带的长度为233bp；
所述SEQ ID NO.30所示的条带的长度为213bp；
对于分子标记InDel266，PCR扩增得到SEQ ID NO.31所示的条带时，印度南瓜为少侧枝或无侧枝类型；PCR扩增得到SEQ ID NO.32所示的条带或者既得到SEQ ID NO.31所示的条带又得到SEQ ID NO.32所示的条带时，印度南瓜为多侧枝类型；
所述SEQ ID NO.31所示的条带的长度为212bp；
所述SEQ ID NO.32所示的条带的长度为202bp。
本发明还提供了所述的分子标记或所述的引物对在印度南瓜育种中的应用。
本发明还提供了所述的分子标记或所述的引物对在鉴定或辅助鉴定印度南瓜主蔓侧枝数量性状中的应用。
本发明还提供了所述的分子标记或所述的引物对在定位控制印度南瓜侧枝数量的相关基因中的应用。
本发明还提供了一种用于鉴定印度南瓜侧枝数量的试剂盒，包括所述的引物对中任意一对或两对。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
遗传分离群体的构建：
选取印度南瓜材料“312-1”和“98-2”（王超杰,王云莉,徐文龙等.籽用和肉用印度南瓜果实发育过程中淀粉合成途径相关基因的表达分析[J].中国蔬菜,2019,(07):36-42.DOI:10.19928/j.cnki.1000-6346.2019.07.009），对其的侧枝数目多少进行田间鉴定，结果显示，98-2为无侧枝或少侧枝，312-1为多侧枝。
2019年春季以多侧枝印度南瓜“312-1”为母本，以无侧枝或少侧枝印度南瓜“98-2”为父本，进行杂交，获取F1(312×98)，F1为多侧枝。
F1自交后获得F2代，然后对509株F2分离群体进行表型鉴定和遗传分析。
实验结果：如表1所示。结果显示98-2为无侧枝或少侧枝，312-1为多侧枝，F1表型和亲本312-1吻合，且F2群体中多侧枝和少侧枝（或无侧枝）的分离比例为3:1。
表1印度南瓜P1(98-2)×P2(312-1)的F2群体侧枝多少遗传规律分析
由以上结果表明：多侧枝为单基因控制的显性性状，并将该基因命名为CmaLB1.1。
实施例2
印度南瓜遗传图谱构建和侧枝多少的初步定位：
1、印度南瓜基因组DNA的提取
使用CTAB法提取印度南瓜亲本及F2群体基因组DNA，提取的单株DNA用于遗传图谱的构建及分析。
2、遗传图谱的构建和分析
利用在F2分离群体中随机选择的30株无侧枝和30株多侧枝单株构建无侧枝池和多侧枝池利用Illumina HiSeq进行基因组重测序，通过BSA-Seq分析方法将候选基因定位于1号染色体2.06 Mb的区间内，共有336个基因，InDel-index关联值在染色体上的分布如图1所示。
将509株F2群体利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型，将其基因型与田间统计表型进行对比、分析、统计、转换制作遗传图谱。选用InDel164、InDel184、InDel204、InDel228、InDel237、InDel242、InDel258、InDel266、InDel270、InDel278、InDel327、InDel338、InDel340、InDel406标记进行图谱的构建和分析，使用QTL Icimapping软件初步定位CmaLB1.1基因。
结果表明：CmaLB1.1基因位于标记InDel258和InDel266之间(图2)，标记InDel258和CmaLB1.1基因的遗传距离为0.9cM，标记InDel266和CmaLB1.1基因的遗传距离为0.4cM。
实施例3
与CmaLB1.1基因紧密连锁标记的引物设计：
根据标记所在的位置，以上下游150bp核苷酸序列为模板，提取序列到primer5中，设计InDel引物，分子标记InDel164、InDel184、InDel204、InDel228、InDel237、InDel242、InDel258、InDel266、InDel270、InDel278、InDel327、InDel338、InDel340、InDel406扩增长度分别是248bp、289bp、292bp、232bp、268bp、204bp、233bp、212bp、205bp、240bp、253bp、223bp、169bp、219bp。
标记InDel164的引物序列为：
F：GGGTTCCCAATTTGTATGCT（SEQ ID NO.1）；
R：ATGGGTTTGCTATGGTTCTG（SEQ ID NO.2）；
标记InDel184的引物序列为：
F：GTCAGTCATAAAGAAGTTGCC（SEQ ID NO.3）；
R：CTTCCTTTAGTTATTTTCCGT（SEQ ID NO.4）；
标记InDel 204的引物序列为：
F：TACAAACGGTATCAAAGTCAGA（SEQ ID NO.5）；
R：AGGGCAATAAACGGGTAA（SEQ ID NO.6）；
标记InDel228的引物序列为：
F：CATGGCTACTAATCTAGCATTCAAC（SEQ ID NO.7）；
R：CTCCAATCTATCTCACAATCTACTCC（SEQ ID NO.8）；
标记InDel237的引物序列为：
F：GGTATGACTATGATCGCATGTTAG（SEQ ID NO.9）；
R：CCTCAGGTTCGTAAGTTATCTCA（SEQ ID NO.10）；
标记InDel242的引物序列为：
F：GTGTGTATTGAGGGGAGGTTTCT（SEQ ID NO.11）；
R：CCACCCAGTTCCCAGCAA（SEQ ID NO.12）；
标记InDel258的引物序列为：
F：CTTGGCATCCATTTGTAACA（SEQ ID NO.13）；
R：CTCACATCTATGGAGAGACTATTC（SEQ ID NO.14）；
标记InDel266的引物序列为：
F：GCCATGATGACCTCCTACT（SEQ ID NO.15）；
R：ATTGACCCACTCCAAACAC（SEQ ID NO.16）；
标记InDel270的引物序列为：
F：GCCCTTGCTGGTGTTGTA（SEQ ID NO.17）；
R：AAGCCTTTCCAAATGGTTCA（SEQ ID NO.18）；
标记InDel278的引物序列为：
F：GGACAGGCAAGCTCGTAA（SEQ ID NO.19）；
R：GCACTGGAACTACAGGCAC（SEQ ID NO.20）；
标记InDel327的引物序列为：
F：GTTGGAGCGGAAACAGAA（SEQ ID NO.21）；
R：CATACCACCATCAACCTCAT（SEQ ID NO.22）；
标记InDel338的引物序列为：
F：GGTGAGTGGTGGAAGTCTGA（SEQ ID NO.23）；
R：TGGCAACTATCGGTAATACAAT（SEQ ID NO.24）；
标记InDel340的引物序列为：
F：TTCTTCCTCCCTTGTCGA（SEQ ID NO.25）；
R：GTAGTGGGCTTGAGTCGTT（SEQ ID NO.26）；
标记InDel406的引物序列为：
F：TGAGAAGGTGGGACGCTAT（SEQ ID NO.27）；
R：TCGGTCGTGAGGGCAGT（SEQ ID NO.28）；
其中，InDel258和InDel266与CmaLB1.1基因遗传距离最近，所以选择InDel258和InDel266为最佳分子标记。
以InDel258和InDel266为分子标记，利用上述InDel258和InDel266的引物对进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和测序。
PCR扩增的反应体系如下：DNA模版0.5μL，rTaq-Mix8.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，总体系10μL。
扩增程序：94℃4min；94℃30s；64℃30s；72℃40s，35个循环；72℃5min，降温至4℃。
实验结果：CmaLB1.1基因紧密连锁的分子标记InDel258扩增出如SEQ ID NO.29所示的序列，长度为233bp。其中标记InDel258在无侧枝或少侧枝单株中扩增出233bp(SEQ IDNO.29所示)的单一条带，在多侧枝单株中扩增出213bp(SEQ ID NO.30所示)的单一条带或233bp和213bp双条带。
如图3所示，泳道1为P1(98-2)读为“1”隐性，泳道2为P2(312-1)读为“2”显性，泳道3为F1读为“3”显性；亲本P2(312-1)相对于P1(98-2)有20bp的缺失导致双亲的条带存在差异。
SEQ ID NO.29的序列：CTTGGCATCCATTTGTAACATGATCACGTTACTCACTCCTCACTTTTAAGAGTGAAGACAATCCCCACAGACCAATATGAGTCCTTCCAACATTTTTGTCCTCGTTCACATGCATACCAGGAAAATTGACCATAAAGTTGTTATGGTTGGATGATAAAAGTCTGACTAATTTAGGGAATGATCATGAGGATCATGAGTTTATAATCAAAGAATAGTCTCTCCATAGATGTGAG；共233bp。
SEQ ID NO.30的序列：CTTGGCATCCATTTGTAACATGATCACGTTACTCACTCCTCACTTTTAGAGTGAAGACAATCCCCACAGACCAATATGAGTCCTTCCAACATTTTTGTCCTCGTTCACATGCATACCAGGAAAATTGACCATAAAGTTGTTATGGTTGGATGATAAAAGTCTGACTAATTTAGGGAATTTATAATCAAAGAATAGTCTCTCCATAGATGTGAG；共213bp。
与CmaLB1.1基因紧密连锁的分子标记InDel266扩增出如SEQ ID NO.31所示的序列，长度为212bp。其中标记InDel266在无/少侧枝中扩增出212bp(SEQ ID NO.31所示)的单一条带，在多侧枝中扩增出202bp(SEQ ID NO.32所示)的单一条带或212bp和202bp双条带。
如图4所示，泳道1为P1(98-2)读为“1”隐性，泳道2为P2(312-1)读为“2”显性，泳道3为F1读为“3”显性；亲本P2(312-1)相对于P1(98-2)有10bp的缺失导致双亲的条带存在差异。
SEQ ID NO.31的序列：GCCATGATGACCTCCTACTTAGGATTTAATACCTTACGAGTTACATTGGCATCTAGTAGGTCAGAAGTATCCTAGGAGAATAGTTGAGGTGCGTGCAAGTGAACCTCAACACTCATGAACGTAAAAATAAAATGTCGTGGAAACTAGATATGGAATCTAACCGATACTAGATTTCATCACTATAGCTATAATTGTGTTTGGAGTGGGTCAAT，共212bp。
SEQ ID NO.32的序列：GCCATGATGACCTCCTACTTAGGATTTAATACCTTACGAGTTACATTGGCATCGAAGTATCCTAGGAGAATAGTTGAGGTGCGTGCAAGTGAACCTCAACACTCATGAACGTAAAAATAAAATGTCGTGGAAACTAGATATGGAATCTAACCGATACTAGATTTCATCACTATAGCTATAATTGTGTTTGGAGTGGGTCAAT，共202bp。
上述的InDel分子标记稳定性高、重复性好，将在印度南瓜侧枝多少相关基因分子标记辅助育种体系的构建中起到关键作用。
实施例4
分子标记在亲本和后代分离群体中的检测：
以亲本“312-1”、“98-2”、F1和F2的DNA为模板，用InDel258和InDel266分子标记分别进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系和扩增程序同实施例3。
实验结果：分别见图3、图4。
为了进一步获得表型和基因型共分离的标记，增加标记的准确性，利用标记InDel258和InDel266对F2群体进行了PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测。
结果表明：CmaLB1.1位于InDel258和InDel266两个分子标记之间。
由以上实施例可知，本发明获得的两个与印度南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记InDel258或Indel266具有易于检测、扩增产物稳定、特异性高的特点，能够实现印度南瓜的精准育种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.扩增与印度南瓜侧枝数量相关基因紧密连锁的分子标记InDel258或InDel266的引物对，其特征在于，扩增分子标记InDel258的引物对如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；扩增分子标记InDel266的引物对如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；
所述分子标记位于印度南瓜第1号染色体上；
所述与印度南瓜侧枝数量相关的基因为CmaLB1.1基因。
2.一种印度南瓜侧枝数量性状的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)待测印度南瓜基因组DNA的提取；
2)以步骤1)中所提取基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的分子标记的引物对进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序；
3)根据步骤2)的电泳条带和/或测序结果进行判定；
所述判定的标准为：
对于分子标记InDel258，PCR扩增得到SEQ ID NO.29所示的条带时，印度南瓜为少侧枝或无侧枝类型；PCR扩增得到SEQ ID NO.30所示的条带或者既得到SEQ ID NO.29所示的条带又得到SEQ ID NO.30所示的条带时，印度南瓜为多侧枝类型；
所述SEQ ID NO.29所示的条带的长度为233bp；
所述SEQ ID NO.30所示的条带的长度为213bp；
对于分子标记InDel266，PCR扩增得到SEQ ID NO.31所示的条带时，印度南瓜为少侧枝或无侧枝类型；PCR扩增得到SEQ ID NO.32所示的条带或者既得到SEQ ID NO.31所示的条带又得到SEQ ID NO.32所示的条带时，印度南瓜为多侧枝类型；
所述SEQ ID NO.31所示的条带的长度为212bp；
所述SEQ ID NO.32所示的条带的长度为202bp。
3.权利要求1所述的引物对在鉴定或辅助鉴定印度南瓜主蔓侧枝数量性状中的应用。
4.权利要求1所述的引物对在定位控制印度南瓜侧枝数量的相关基因中的应用。
5.一种用于鉴定印度南瓜侧枝数量的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对中任意一对或两对。
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