CN112553363B - 一种与甜玉米种子活力性状紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

一种与甜玉米种子活力性状紧密连锁的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种与甜玉米种子活力性状紧密连锁的分子标记及应用。所述玉米1号染色体中Zm00001d027504基因第6个外显子上包含三个SNP标记，分别为标记S1_6908324、标记S1_6908332和标记S1_6908437，3’UTR区域含有第四个SNP标记‑标记S1_6907721，标记S1_6908324、标记S1_6908332和标记S1_6908437的物理位置分别为6908324、6908332和6908437，标记S1_6907721的物理位置为6907721。本发明发现了上述四个分子标记，为提高玉米种子活力育种提供了一条新的途径。

Description

一种与甜玉米种子活力性状紧密连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种与甜玉米种子活力性状紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
甜玉米是玉米属的一个亚种，起源于美洲大陆，是一种集粮、果、蔬、饲于一体的经济型作物，人类种植和食用甜玉米已有100多年的历史。甜玉米鲜穗可直接上市或加工，乳熟时籽粒中富含蛋白质、水溶性多糖、多种游离氨基酸和维生素，具有较高的营养价值、加工价值和经济价值。随着人们生活水平的提高，甜玉米也迎来了更多的消费者。美国是世界上开展甜玉米育种研究最早的国家，早在1828年，美国人索布就发表了关于甜玉米研究的第1篇论文，1836年诺埃斯·达林培育出了第1个甜玉米品种达林早熟。而我国对甜玉米的研究起步较晚，直到1968年，才由中国农业大学培育出了首个甜玉米品种北京白砂糖。从20世纪90年代至今，随着我国经济的发展、人民生活水平的提高以及甜玉米加工产品的出现，对甜玉米的需求量与种质资源遗传多样性的需求不断提高，但是，由于我国不是甜玉米的起源中心，很多材料依赖于从美国、泰国等海外引进，甜玉米的亲缘关系比较近，类型较单一，从而严重影响了我国甜玉米育种的进一步发展。因此，对甜玉米的遗传多样性进行研究尤其重要。
近几年来，分子标记技术发展迅速，作为新的手段和方法已被用于检测玉米的遗传多样性，主要包括限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，简称RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，简称RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，简称AFLP)、简单重复序列(simple sequence repeat，简称SSR)、单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，简称SNP)等分子标记技术。其中单个碱基变异的SNP作为第3代分子标记，具有密度高、分布广等优势，在水稻、玉米等植物性状标记分析、遗传图谱构建及遗传多样性分析等方面有广阔的应用前景。
甜玉米作为一种特用玉米，因其优质、可口、营养健康而深受广大消费者喜爱。甜玉米的形成与籽粒的淀粉合成代谢息息相关，在籽粒中的葡萄糖淀粉合成过程中，由于一个或者几个基因的突变，可能会造成淀粉合成受阻，葡萄糖等其他糖类物质积累等情形，然而，种子出苗率和种子淀粉含量成正相关，与糖分含量成负相关，从而导致甜玉米比普通玉米出苗率低，苗势弱，这种现象在超甜玉米上表现更为突出，因此，提高甜玉米种子活力是育种家最关心最迫切希望解决的问题，然而关于甜玉米种子活力的遗传基础研究甚少，更未见种子活力相关基因克隆的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种与甜玉米种子活力性状紧密连锁的分子标记和应用，本发明分子标记的开发为高活力玉米分子辅助育种提供了一种可行的途径。
本发明的第一目的是提供了一种与甜玉米种子活力性状紧密连锁的分子标记，为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：玉米1号染色体中Zm00001d027504基因第6个外显子上包含三个SNP标记，分别为标记S1_6908324、标记S1_6908332和标记S1_6908437，所述Zm00001d027504基因3’UTR区域含有第四个SNP标记，所述第四个SNP标记为标记S1_6907721，所述标记S1_6908324、标记S1_6908332和标记S1_6908437的物理位置分别为6908324、6908332和6908437，所述标记S1_6907721的物理位置为6907721；扩增各分子标记的引物如下：
标记S1_6908324的引物序列分别为SEQ ID NO:1～3所示；
标记S1_6908332的引物序列分别为SEQ ID NO:4～6所示；
标记S1_6908437的引物序列分别为SEQ ID NO:7～9所示；
标记S1_6907721的引物序列分别为SEQ ID NO:10～12所示。
本发明发明人经过大量研究及试验发现，首先发现了Zm00001d027504基因第6个外显子上三个SNP位点引起了氨基酸变异，开发出了扩增标记S1_6908324、标记S1_6908332、标记S1_6908437和标记S1_6907721引物，可以用于筛选高活力种子的材料，缩短育种进程。
作为本发明所述分子标记的优选实施方式，利用SEQ ID NO:1～3扩增出大小为60bp的含标记S1_6908324的特征条带，其中，标记S1_6908324的核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示；
利用SEQ ID NO:4～6扩增出大小为76bp的含标记S1_6908332的特征条带，其中，标记S1_6908332的核苷酸序列为SEQ ID NO:14所示；
利用SEQ ID NO:7～9扩增出大小为84bp的含标记S1_6908437的特征条带，其中，标记S1_6908437的核苷酸序列为SEQ ID NO:15所示；
利用SEQ ID NO:10～12扩增出大小为66bp的含标记S1_6907721的特征条带，其中，标记S1_6907721的核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示。
作为本发明所述分子标记的优选实施方式，所述标记S1_6908324物理位置为6908324处的碱基为T；所述标记S1_6908332物理位置为6908332处的碱基为G；所述标记S1_6908437物理位置为6908437处的碱基为T；所述标记S1_6907721物理位置为6907721处的碱基为T。
本发明的第二目的是提供了上述分子标记在筛选甜玉米种子活力中的应用。
本发明的第三目的是提供了上述分子标记在提高种子活力性状中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述应用包括以下步骤：
S1.提取待测植株的基因组DNA；
S2.以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增上述分子标记的引物，进行PCR扩增反应；
S3.检测PCR扩增产物；
其中，所述分子标记的引物序列如上述所示。
本发明的第四目的是提供了上述分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过全基因组关联分析在玉米1号染色体上发现1个候选基因(Zm00001d027504基因)，Zm00001d027504基因第6个外显子上三个SNP位点引起了氨基酸变异，这三个SNP位点均和种子发芽势显著相关，在3’UTR区域也存在一个SNP位点和种子发芽势显著相关，针对四个SNP位点开发出了扩增标记S1_6908324、标记S1_6908332、标记S1_6908437和标记S1_6907721的引物，可以用于筛选高活力种子的材料，缩短育种进程。本发明的分子标记能够作为有效的遗传标记应用于分子标记辅助选择，提高甜玉米的种子活力。
附图说明
图1为种子发芽势全基因组关联分析结果曼哈顿图；
图2为种子发芽势全基因组关联分析结果Q-Q Plot图；
图3为标记S1_6908324在关联群体的基因型分型图及表型图；
图4为标记S1_6908332在关联群体的基因型分型图及表型图；
图5为标记S1_6908437在关联群体的基因型分型图及表型图；
图6为标记S1_6907721在关联群体的基因型分型图及表型图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例中，若未特别指明，实施例按照常规实验条件所实施。
实施例1
1.实验材料：收集了295份来自中国、美国、泰国等地的温带热带甜玉米自交系，构成了全基因组关联分析的关联群体(广东省农业科学院作物研究所提供)，该群体具有丰富的遗传多样性。
样本来源如表1所示。
表1
Figure BDA0002829962650000041
Figure BDA0002829962650000051
Figure BDA0002829962650000061
Figure BDA0002829962650000071
Figure BDA0002829962650000081
Figure BDA0002829962650000091
Figure BDA0002829962650000101
Figure BDA0002829962650000111
Figure BDA0002829962650000121
2.田间试验设计：2017年种植于广州大丰基地，采用完全随机区组设计，设置两个重复，株距0.25米，每行10株左右，施肥、浇水、除草等田间管理措施均按照当地正常水平进行管理，生理成熟后收获，自然晾干。
3.关联群体表型鉴定：待晒干后，每个自交系选取3-5个大小均匀的果穗混合脱粒装袋，取30粒均匀一致的种子用2％的次氯酸钠消毒15分钟，自来水下冲洗至无味后置于发芽盒内，加水，1天以后，每天统计材料的发芽种子数，发芽标准为种子长出根，并且芽长≥1cm，至7天后结束调查；
发芽势(GE)＝发芽试验播种第4d的发芽种子数/供试种子数×100％；
发芽率(GP)＝发芽试验播种第8d的发芽种子数/供试种子数×100％；
发芽指数(GI)＝∑Gt/Dt，式中Dt为相应的发芽天数，Gt为与Dt相对应的不同时间的发芽数，计算得出种子发芽势(见图1)、种子发芽率，发芽指数等种子活力性状。两次重复最终取均值为表型性状。通过方差分析表明，种子发芽势、种子发芽率以及种子发芽指数这3个性状的表型变异在基因型间均达到极显著水平，表明表型变异主要由遗传因素控制(表1)。
表1 295份群体中种子活力的表型变异和相关分析
Figure BDA0002829962650000122
Figure BDA0002829962650000131
实施例2、SNP位点筛选及目标基因定位
全基因组关联分析：通过对关联群体进行重测序分析，共获得了980万个高质量的SNP位点，结合关联群体的980万个SNP、群体结构、亲缘关系以及种子活力相关性状，用TASSEL中的MLM模型进行全基因组关联分析，在全基因组显著水平下(P≤1×10-6)，在1号染色体上发现1个候选基因(Zm00001d027504)(其核苷酸序列来源于gramene网站，位置在1:6907596-6912220)，该基因编码一个三磷酸核苷，该基因的第6个外显子上存在三个非同义突变的SNP位点，其中一个SNP位点(命名为标记S1_6908324)和种子发芽势显著相关(p＝5.19216E-08)，可以解释11.9％的表型变异，其它两个SNP位点(分别命名为标记S1_6908332和标记S1_6908437)也和种子发芽势相关，但不显著，分别解释8.9％和9.3％的表型变异，此外，在该基因的3’UTR区域也存在一个SNP位点(命名为标记S1_6907721)和种子发芽势显著相关(p＝3.31E-07)，可以解释10.4％的表型变异。
标记S1_6908324的核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示；标记S1_6908332的核苷酸序列为SEQ ID NO:14所示；标记S1_6908437的核苷酸序列为SEQ ID NO:15所示；标记S1_6907721的核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示。
实施例3、Zm00001d027504基因的分子标记引物设计
针对标记S1_6908324、标记S1_6908332、标记S1_6908437及标记S1_6907721，设计等位基因特异性KASP引物进行扩增和检测，在SNP位置左侧选取19-21个碱基为标记的F1和F2引物，取该SNP变异位点处一个碱基为F1引物，另一个碱基为F2引物，分别接上两个接头，SNP右侧40-100bp位置处选取19-22个碱基为R引物，从而通过荧光检测平台达到检测不同SNP基因型的目的。
标记S1_6908324的引物序列如下：
Ph1F1:gaaggtgaccaagttcatgctTTGTGCCTCCGCCCGTACATGCC(SEQ ID NO:1)
Ph1F2:gaaggtcggagtcaacggattTTGTGCCTCCGCCCGTACATGCT(SEQ ID NO:2)
Ph1R:CATGAAGTCCTTCGTCAGAGC(SEQ ID NO:3)
标记S1_6908332的引物序列如下：
Ph2F1:gaaggtgaccaagttcatgctTTCGTCAGAGCTGTTCTCGT(SEQ ID NO:4)
Ph2F2:gaaggtcggagtcaacggattTTCGTCAGAGCTGTTCTCGC(SEQ ID NO:5)
Ph2R:ACTCTGACATGGTGGCGTTG(SEQ ID NO:6)
标记S1_6908437的引物序列如下：
Ph3F1:gaaggtgaccaagttcatgctCAGGAGAACAAGCCCATGC(SEQ ID NO:7)
Ph3F2:gaaggtcggagtcaacggattCAGGAGAACAAGCCCATGA(SEQ ID NO:8)
Ph3R:ATCGTCCATGTCGCCGTCGT(SEQ ID NO:9)
标记S1_6907721的引物序列如下：
Ph4F1:gaaggtgaccaagttcatgctTTGTGAACGGTGTTGCATTG(SEQ ID NO:10)
Ph4F2:gaaggtcggagtcaacggattTTGTGAACGGTGTTGCATTA(SEQ ID NO:11)
Ph4R:ATTCAGCATTCTTCCACACG(SEQ ID NO:12)
用设计的引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为：
DNA模板 5μl
master mix 5μl
primer mix 0.14μl。
PCR扩增反应程序见表2所示：
表2 PCR反应程序
Figure BDA0002829962650000141
Figure BDA0002829962650000151
其中DNA模板来源于在甜玉米自然群体挑选44份表型差异的自交系。
结果显示：参照图3，针对SNP(标记S1_6908324)位点，采用荧光检测平台对产物进行分型，产物荧光信号分别为HEX(对应碱基为TT)和FAM(对应碱基为CC)，基因型TT和基因型CC的表型数据存在显著性差异。
参照图4，针对SNP(标记S1_6908332)位点，采用荧光检测平台对产物进行分型，产物荧光信号分别为HEX(对应碱基为GG)和FAM(对应碱基为AA)，基因型GG和基因型AA的表型数据存在显著性差异。
参照图5，针对SNP(标记S1_6908437)位点，采用荧光检测平台对产物进行分型，产物荧光信号分别为HEX(对应碱基为TT)和FAM(对应碱基为GG)，基因型TT和基因型GG的表型数据存在显著性差异。
参照图6，针对SNP(标记S1_6907721)位点，采用荧光检测平台对产物进行分型，产物荧光信号分别为HEX(对应碱基为TT)和FAM(对应碱基为CC)，基因型TT和基因型CC的表型数据存在显著性差异。
上述结果说明利用本发明提供的分子标记S1_6908324、S1_6908332、S1_6908437和S1_6907721能够作为有效的遗传标记应用于分子标记辅助选择，提高甜玉米的种子活力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院作物研究所
<120> 一种与甜玉米种子活力性状紧密连锁的分子标记及应用
<130> 2020.12.02
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> Ph1F1
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tttgtgcctc cgcccgtaca tgcc 44
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> Ph1F2
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tttgtgcctc cgcccgtaca tgct 44
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Ph1R
<400> 3
catgaagtcc ttcgtcagag c 21
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Ph2F1
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tttcgtcaga gctgttctcg t 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> Ph2F2
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tttcgtcaga gctgttctcg c 41
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<212> DNA
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<211> 40
<212> DNA
<213> Ph3F2
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<211> 20
<212> DNA
<213> Ph3R
<400> 9
atcgtccatg tcgccgtcgt 20
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> Ph4F1
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tttgtgaacg gtgttgcatt g 41
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> Ph4F2
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tttgtgaacg gtgttgcatt a 41
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Ph4R
<400> 12
attcagcatt cttccacacg 20
<210> 13
<211> 101
<212> DNA
<213> 标记S1_6908324的核苷酸序列
<400> 13
atacagatca ccccatgaag tccttcgtca gagctgttct cgtcgtcgcc ggcatgtacg 60
ggcggaggca caaccctggc aacgccacca tgtcagagtg c 101
<210> 14
<211> 107
<212> DNA
<213> 标记S1_6908332的核苷酸序列
<400> 14
catggacgat acagatcacc ccatgaagtc cttcgtcaga gctgttctcg tcgtcgccgg 60
catgtacggg cggaggcaca accctggcaa cgccaccatg tcagagt 107
<210> 15
<211> 115
<212> DNA
<213> 标记S1_6908437的核苷酸序列
<400> 15
atgagttctg atcagagaac ctctcgcaga accaggagaa caagcccatg ctgaagaggg 60
gcgcgccgag acaagtcctg tcctggacga gcaggacgac ggcgacatgg acgat 115
<210> 16
<211> 101
<212> DNA
<213> 标记S1_6907721的核苷酸序列
<400> 16
tttttctgcc tcttttgggt gcttgccggg tttgtgaacg gtgttgcatt ggcgagtgag 60
atatgtaact atgcttgcgt gtggaagaat gctgaattta c 101

Claims (5)

1.一种与甜玉米种子活力性状紧密连锁的分子标记，其特征在于，玉米1号染色体中Zm00001d027504基因第6个外显子上包含三个SNP标记，分别为标记S1_6908324，物理位置为6908324bp，核苷酸多态性为C/T；标记S1_6908332，物理位置为6908332bp，核苷酸多态性为A/G；标记S1_6908437，物理位置为6908437bp，核苷酸多态性为G/T；Zm00001d027504基因3’UTR区域含有第四个SNP标记-标记S1_6907721，物理位置为6907721bp，核苷酸多态性为C/T；
扩增各分子标记的引物如下：
标记S1_6908324的引物序列分别为SEQ ID NO:1～3所示；
标记S1_6908332的引物序列分别为SEQ ID NO:4～6所示；
标记S1_6908437的引物序列分别为SEQ ID NO:7～9所示；
标记S1_6907721的引物序列分别为SEQ ID NO:10～12所示；
所述标记S1_6908324物理位置为6908324bp处的碱基为T；所述标记S1_6908332物理位置为6908332bp处的碱基为G；所述标记S1_6908437物理位置为6908437bp处的碱基为T；所述标记S1_6907721物理位置为6907721bp处的碱基为T。
2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，利用SEQ ID NO:1～3扩增出大小为60bp的含标记S1_6908324的特征条带，其中，标记S1_6908324的核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示；
利用SEQ ID NO: 4～6扩增出大小为76bp的含标记S1_6908332的特征条带，其中，标记S1_6908332的核苷酸序列为SEQ ID NO:14所示；
利用SEQ ID NO:7～9扩增出大小为84bp的含标记S1_6908437的特征条带，其中，标记S1_6908437的核苷酸序列为SEQ ID NO:15所示；
利用SEQ ID NO:10～12扩增出大小为66bp的含标记S1_6907721的特征条带，其中，标记S1_6907721的核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示。
3.检测如权利要求1-2任一项所述的分子标记的试剂在筛选甜玉米种子活力性状中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取待测植株的基因组DNA；
S2.以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增权利要求1-2任一项所述分子标记的引物，进行PCR扩增反应；
S3.检测PCR扩增产物；
其中，所述分子标记的引物序列如权利要求1所示。
5.检测如权利要求1-2任一项所述的分子标记的试剂在甜玉米种子活力辅助育种中的应用。
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Assignee: WAN NONG HI-TECH (GROUP) CO.,LTD.

Assignor: CROP Research Institute GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

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Denomination of invention: A molecular marker closely linked to seed vigor traits of sweet corn and its application

Granted publication date: 20210730

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