CN111733266A - 一种快速检测沙门菌并鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速检测沙门菌并鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒及其应用。申请人通过针对cigR基因设计引物，采用PCR检测技术进行cigR基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象是否属于沙门菌或是否为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。于一具体方案中，检测试剂盒中至少包括SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。本申请中的试剂盒简单快速、特异性好、灵敏度高且重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物检测试剂盒，特别是涉及一种快速检测沙门菌并鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒及其制备和应用。
背景技术
沙门菌病是公共卫生学上有重要意义的人兽共患病之一，其病原沙门菌属于肠杆菌科，家畜，家禽及蛋肉制品是主要传播媒介，它不但可引起多种畜禽疾病，造成全身性败血症和肠炎，还可以作为食源性疾病的病原体，引起人类胃肠炎和食物中毒。鸡白痢和鸡伤寒分别是由鸡白痢沙门菌(Salmonella Pullorum)和鸡伤寒沙门菌(SalmonellaGallinarum)引起的。鸡白痢沙门菌，又称雏沙门菌，可引起禽的鸡白痢，多侵害3周龄以内的幼雏，发病率和病死率较高；成年鸡亦可被感染，常导致母鸡产蛋减少，生殖道畸形，体质量下降，也导致孵化率和出雏率明显下降且可长期带菌与排菌。禽伤寒是因感染鸡伤寒沙门菌而导致的急性或慢性败血性禽类传染病，表现出腹泻、厌食、精神不振等症状，鸡伤寒沙门菌对雏鸡、成年鸡均可致病，以引起贫血、白细胞增多、出血为特征。在全球范围内影响着养鸡业的发展，在我国颇为严重。目前，根据Kauffman-White(K-W)血清型分型方法，依据沙门菌菌体抗原及鞭毛抗原的不同，沙门菌的血清型有2600种以上，中国已报道了292种不同的血清型，分属于35个O群。
传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生化特性及血清学鉴定很费力、耗时，需4-7 天才能完成，而其它方法如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性使之不适于常规检测。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后导致沙门菌的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得沙门菌的检测受到一些限制。
因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时有效地防控沙门菌。
发明内容
针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速检测沙门菌并鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒及其制备和应用。
发明人发现cigR基因仅存在于沙门菌，而鸡白痢和鸡伤寒沙门菌cigR基因相较于其它血清型沙门菌cigR缺少中间的核苷酸片段，即鸡白痢和鸡伤寒沙门菌中没有，根据cigR基因的分布特点可将鸡白痢和鸡伤寒沙门菌区分开。在此基础上发明人设计了相关的检测试剂盒。
为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种快速检测沙鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括cigR基因检测引物。
优选地，所述cigR基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。可扩增出一条目的条带(421bp)的泳道为鸡白痢或鸡伤寒沙门菌，扩展出一条目的条带(463bp)的泳道为非鸡白痢/鸡伤寒的其它沙门菌。
优选地，所述试剂盒中还包含如SEQ ID NO.3所示的反向引物。通过这一引物的加入可以更加方便的检测出非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌，形成多重PCR检测方案。可扩增出一条目的条带(421bp)的泳道为鸡白痢或鸡伤寒沙门菌，扩展出两条目的条带(463和65bp)的泳道为非鸡白痢/鸡伤寒的其它沙门菌，没有扩增出条带的泳道表示没有沙门菌。
本发明的试剂盒采用PCR检测技术进行cigR基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象是否属于沙门菌或是否为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。
基于本发明所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：无菌水(ddH2O)、2x Taq Master mix、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的 PCR检测液。
所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddH2O)、2x Taq Master mix。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。
优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有cigR基因表达的DNA样本。
优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无cigR基因表达的DNA样本。
本发明的第二方面，提供了前述检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述cigR基因检测引物；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。
步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。
优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)95℃ 3min；(b)95℃ 15s；(c) 50℃ 15s；(d)72℃ 30s，步骤(b)～(d)循环30次，(e)72℃ 10min。
本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备cigR基因检测产品中的用途。
优选地，在多重PCR检测试剂盒中，所述检测产品用于分别检测沙门菌和鉴定鸡白痢/ 鸡伤寒沙门菌。
本发明的第四方面提供了cigR基因在制备或筛选鸡白痢/鸡伤寒沙门菌试剂中的用途。
将cigR基因用于制备鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂，是指将cigR基因作为基于检测 cigR基因含量的鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂的标准品或阳性对照，用于cigR基因的检测。
将cigR基因用于筛选鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂，是指将cigR基因作为检测靶标应用于鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂的筛选。在本发明的一些实施方式中，基于所述的cigR 基因序列，筛选特异性针对cigR基因的PCR扩增引物对从而作为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的试剂盒能快速高通量检测沙门菌并鉴定鸡白痢/伤寒沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为鸡白痢/伤寒沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、特异性好、灵敏度高且重复性好的新方法。
附图说明
图1：为利用cigR基因鉴定沙门菌并鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的示意图；cigR基因存在于各种血清型沙门菌中，而鸡白痢和鸡伤寒沙门菌cigR基因相较于其它血清型沙门菌cigR缺少了部分核苷酸片段，即鸡白痢/鸡伤寒沙门菌只能扩增出一条片段，非鸡白痢/鸡伤寒沙门菌能扩增出两条片段。
图2：为多重PCR鉴定cigR基因在不同血清型沙门菌和其它细菌中的分布和片段大小图片；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道C50041、C50336、S21、T7N1、B1、F10、SL5928、T4、T6N1、G11、GS3-1、A6、H2-G14、Z11、P125109、GE2、50093、1、C10、C7、S190、 50071、SH138、S10、J093、SG78、A、C14、C500：cigR基因片段(463和65bp)；泳道 S06004、C79-13、SG9、RKS5078和449/87：cigR基因片段(421bp)；泳道H37Rv、EGDe、 11168、115-1、1314、301和ATCC27217：非cigR基因片段(无目的条带)；C50041、C50336、 Z11和P125109为肠炎沙门菌，S06004、C79-13、RKS5078和449/87为鸡白痢沙门菌，SG9 为鸡伤寒沙门菌，S21为鸭沙门菌，T7N1为阿贡那沙门菌，B1为彻斯特沙门菌，F10为德尔卑沙门菌，SL5928为都柏林沙门菌，T4为印第安纳沙门菌，T6N1为婴儿沙门菌，G11为伦敦沙门菌，GS3-1为纽波特沙门菌，A6为巴基斯坦沙门菌，H2-G14为约鲁巴沙门菌，GE为波茨坦沙门菌，50093为甲型副伤寒沙门菌，1为乙型副伤寒沙门菌，C10为罗森沙门菌，C7 为鼠伤寒沙门菌，S190为肯塔基沙门菌，50071为伤寒沙门菌，SH138为姆班达卡沙门菌， S10为蒙得维的亚沙门菌，J093为汤普森沙门菌，SG78为田纳西沙门菌，A为马流产沙门菌， C14为乌盖利沙门菌，C500为猪霍乱沙门菌；H37Rv为结核分枝杆菌，EGDe为李斯特菌， 11168为空肠弯曲菌，115-1为结肠弯曲菌，1314为大肠杆菌，301为弗氏志贺菌，ATCC27217 为金黄色葡萄球菌。
图3：为鉴定鸡白痢沙门菌的PCR检测试剂盒灵敏度；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1-7为鸡白痢沙门菌S06004基因组，浓度依次为163ng/μl、16.3ng/μl、1.63ng/μl、163 pg/μl、16.3pg/μl、8.15pg/μl、4.075pg/μl。
图4：为PCR鉴定87份病鸡或死鸡肝脏选择性增菌液中的沙门菌；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1～87为病鸡或死鸡肝脏进行选择性增菌后增菌液中的沙门菌；可扩增出两条目的条带的泳道为非鸡白痢/伤寒沙门菌的其它血清型沙门菌，仅扩增出一条目的条带的泳道为鸡白痢/伤寒沙门菌，没有目的条带的泳道为非沙门菌。
图5：为PCR鉴定40份鸡蛋样品选择性增菌液中的沙门菌；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1～40为鸡蛋样品进行选择性增菌后增菌液中的沙门菌；可扩增出两条目的条带的泳道为非鸡白痢/伤寒沙门菌的其它血清型沙门菌，没有目的条带的泳道为非沙门菌。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1生物信息学方法鉴定cigR基因的分布
在NCBI中使用Blastn在线比对软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因组数据库中搜索cigR基因，搜索结果表明cigR基因仅存在于沙门菌，而鸡白痢和鸡伤寒沙门菌cigR 基因相较于其它血清型沙门菌cigR缺少中间的核苷酸片段(如图1)，即鸡白痢和鸡伤寒沙门菌中没有，根据cigR基因的分布特点可将鸡白痢和鸡伤寒沙门菌与其他菌种区分开。
实施例2试剂盒的制备
引物设计与合成：以鼠伤寒沙门菌的cigR基因为模板，根据所有沙门菌共有的片段设计引物以区分是否为沙门菌，又针对鼠伤寒沙门菌多于鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的片段设计了引物以进一步鉴定出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌，通过NCBI网站中的Primer-BLAST在线比对引物的特异性，人工从中选择最佳检测用引物对。其中，cigR-F和cigR-R1引物扩增非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌部分序列(463bp)或鸡白痢和鸡伤寒沙门菌cigR部分序列(421bp)，cigR-F和cigR-R2 引物扩增非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的部分片段(65bp)，其核苷酸序列如下表1所示：
表1
以不同血清型沙门菌和其它细菌的基因组分别为模板，分别加入以上引物对，进行扩增，其中：
1)以cigR-F和cigR-R1引物
PCR反应体系为(25μL)：2x Taq Master mix 12.5μL，cigR-F 80nM，cigR-R140nM， cigR-R2 40nM，模板1μL，ddH2O补至25μL。
PCR程序为95℃ 3min；95℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。
扩增出的目的基因，经检测分别为非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的cigR基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示，具体为：
和鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的cigR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
2)以cigR-F和cigR-R2引物
PCR反应体系为(25μL)：2x Taq Master mix 12.5μL，cigR-F 80nM，cigR-R140nM， cigR-R2 40nM，模板1μL，ddH2O补至25μL。
PCR程序为95℃ 3min；95℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。
扩增出的目的基因，经检测扩增出为非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的cigR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
可见，通过cigR-F和cigR-R1为引物可以扩增出两条不同的目的基因，可扩增出一条目的条带(421bp)的泳道为鸡白痢或鸡伤寒沙门菌，扩展出一条目的条带(463bp)的泳道为非鸡白痢/鸡伤寒的其它沙门菌。
上述各引物对可单独包装，也可以配成PCR检测液。所述PCR检测液中，cigR-F，cigR-R1 和cigR-R2引物在多重PCR最终体系中的浓度分别为80，40和40nM。
也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各引物对，也可以是含有配置好的含有各引物对的PCR检测液。
进一步地，所述试剂盒还可以含有无菌水(ddH2O)、2x Taq Master mix、样品基因组DNA 提取试剂等等。
实施例3试剂盒检测沙门菌及鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的特异性鉴定
采用实施例2所述试剂盒中的两组引物对，以不同血清型沙门菌和其它细菌的基因组分别为模板，多重PCR方法检测沙门菌及鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的特异性。
PCR反应体系为(25μL)：2x Taq Master mix 12.5μL，cigR-F 80nM，cigR-R140nM， cigR-R2 40nM，模板1μL，ddH2O补至25μL。
PCR程序为95℃ 3min；95℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明以非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌基因组为模板的泳道可扩增出两条带，分别为463bp和65bp；以鸡白痢和鸡伤寒沙门菌基因组为模板的泳道仅扩增一条带，为421bp(图2)。
表明以实施例2所述试剂盒中特定的cigR扩增引物，可以通过多重PCR方法快速鉴定未知细菌是否为沙门菌或鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。
实施例4试剂盒检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的灵敏性鉴定
采用实施例2所述试剂盒中的两组引物对，将鸡白痢沙门菌S06004基因组依次稀释(浓度依次为163ng/μl、16.3ng/μl、1.63ng/μl、163pg/μl、16.3pg/μl、8.15pg/μl、4.075pg/μl)，分别以稀释的基因组为模板，鉴定试剂盒检测鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的灵敏性。
PCR反应体系为(25μL)：2x Taq Master mix 12.5μL，cigR-F 80nM，cigR-R140nM， cigR-R2 40nM，模板1μL，ddH2O补至25μL。
PCR程序为95℃ 3min；95℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明基于cigR的多重PCR检测试剂盒可检测8.15pg/μl的鸡白痢沙门菌基因组(图3)。
实施例5试剂盒在鸡只样品的应用
采用实施例2中试剂盒，检测87份鸡只样品的肝脏增菌液，可快速准确地检测出沙门菌并鉴定出鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。具体步骤如下：
1)鸡只样品的处理
本试验中样品采自江苏和上海某鸡场，无菌取出已生病或刚死亡的鸡只的肝脏进行增菌处理(Fei X,et al.Food Control,2017)。
2)多重PCR方法检测样本中的沙门菌
取100μL增菌液经SW清洗两次后用50μL SW重悬，重悬后的菌液经沸水浴10min后即可作为PCR模板，PCR反应体系为(25μL)：2x Taq Master mix 12.5μL，cigR-F 80nM，cigR-R1 40nM，cigR-R2 40nM，模板1μL，ddH2O补至25μL。PCR程序为95℃ 3min；95℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出一条目的条带(421bp)的泳道为鸡白痢或鸡伤寒沙门菌，扩展出两条目的条带(463 和65bp)的泳道为非鸡白痢/鸡伤寒的其它沙门菌，没有扩增出条带的泳道表示没有沙门菌。
结果显示87份样品中共有9份可检测出一个条带，这些样品中含有鸡白痢或鸡伤寒沙门菌，有15份检测出两个条带，这些样品中含有非鸡白痢或鸡伤寒的其它沙门菌。
3)沙门菌的传统血清型鉴定
增菌后涂布XLT4并经生理生化分析得到了24株沙门菌，参考现有技术进行血清型鉴定 (Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)。
鉴定结果表明24株沙门菌中共有15株肠炎沙门菌和9株鸡白痢沙门菌，PCR检测结果与血清型鉴定结果完全一致。
在本实施例中，采用传统分菌和血清型鉴定的方法，将87份鸡只样品的沙门菌携带情况筛选出来，需要至少3天的时间，而采用本发明实施例2的检测试剂盒，因不需要挑取单菌落，可减少至少24h，即可判断出样品中是否有沙门菌或鸡白痢/鸡伤寒沙门菌，且正确率为 100％。
实施例6试剂盒在鸡蛋样品的应用
采用实施例2中试剂盒，检测40份鸡蛋样品的增菌液，可快速准确地检测出沙门菌并鉴定出鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。具体步骤如下：
1)鸡蛋样品的处理
本试验中样品采自江苏某鸡场，无菌取出蛋清进行增菌处理。
2)多重PCR方法检测样本中的沙门菌
取100μL增菌液经SW清洗两次后用50μL SW重悬，重悬后的菌液经沸水浴10min后即可作为PCR模板，PCR反应体系为(25μL)：2x Taq Master mix 12.5μL，cigR-F 80nM，cigR-R1 40nM，cigR-R2 40nM，模板1μL，ddH2O补至25μL。PCR程序为95℃ 3min；95℃ 15s，50℃ 15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出一条目的条带(421bp)的泳道为鸡白痢或鸡伤寒沙门菌，扩展出两条目的条带(463 和65bp)的泳道为非鸡白痢/鸡伤寒的其它沙门菌，没有扩增出条带的泳道表示没有沙门菌。结果显示40份样品中共有23份可检测出两个条带，这些样品中含有非鸡白痢或鸡伤寒的其它沙门菌。
3)沙门菌的传统血清型鉴定
增菌后涂布XLT4并经生理生化分析得到了23株沙门菌，参考现有技术进行血清型鉴定 (Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，鉴定结果表明23株沙门菌中均为肠炎沙门菌，PCR检测结果与血清型鉴定结果完全一致。
在本实施例中，采用传统分菌和血清型鉴定的方法，将40份鸡蛋样品的沙门菌携带情况筛选出来，需要至少3天的时间。而采用本发明实施例2的检测试剂盒，因不需要挑取单菌落，可减少至少24h，即可判断出样品中是否有沙门菌或鸡白痢/鸡伤寒沙门菌，且正确率为 100％。
综上所述，本发明试剂盒相较于传统血清型鉴定方法的优势：
传统沙门菌鉴定采用生化鉴定和血清型鉴定，需购买特定的生化和血清型鉴定试剂盒，价格昂贵，步骤繁琐，尤其在大量样本中分离特定血清型的沙门菌(如鸡白痢和鸡伤寒沙门菌)时，需耗费大量时间(至少两天)，且工作量庞大，其结果是由肉眼进行判断，因而可能存在人为误差；而本发明试剂盒的检测方法操作简单，成本非常低，整个鉴定过程在三小时内即可完成(包含PCR和琼脂糖凝胶电泳)，且准确率达到100％。
因此，本发明的一种快速检测沙门菌、鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的多重PCR检测试剂盒，有利于简化沙门菌生化鉴定和血清型鉴定的传统步骤，为在大量样本中筛选沙门菌或鸡白痢/鸡伤寒沙门菌提供了一种快速鉴定的新方法。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种快速检测沙门菌并鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒及其制备和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaataatc gtcgtggttt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taataatcgc cgtgaccacc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtagcgctca gggaaaacg 19
<210> 4
<211> 463
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaataatc gtcgtggttt aaccgccgtc ctggcgacgt tgattacgtt ttccctgagc 60
gctacgcctg tgctggcgaa tccgggaaat ggtaatggcg gcggacatgg taataacgcg 120
gctaatcagg gtaataacgg taacggacat aaaggaaatg ccgggcaaaa aacggaacac 180
cgtaaaaatg gcggtaaacc ggatcacgtc gagtcggaca ttagctatgc tgtcgccagg 240
caactggcag tgaatttagg gctgacgggt tatcagtctt tacctccggg gattgcgaaa 300
aatctggcga gaggaaaacc gctaccgccg ggaatcgcta aaaaaacggt gccggcgtct 360
atgctgggac aattacctta ttatccgggc tatgagtgga aaatcgttgg ggataatctg 420
gtgctgatcg cgctcagtac cgcggtggtc acggcgatta tta 463
<210> 5
<211> 421
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaataatc gtcgtggttt aaccgccgtc ctggcgaatc cgggaaatgg taatggcggc 60
ggacatggta ataacgcggc taatcagggt aataacggta acggacataa aggaaatgcc 120
gggcaaaaaa cggaacaccg taaaaatggc ggtaaaccgg atcacgtcga gtcggacatt 180
agctatgctg tcgccaggca actggcagtg aatttagggc tgacgggtta tcagtcttta 240
cctccgggga ttgcgaaaaa tctggcgaga ggaaaaccgc taccgccggg aatcgctaaa 300
aaaacggtgc cggcgtctat gctgggacaa ttaccttatt atccgggcta tgagtggaaa 360
atcgttgggg ataatctggt gctgatcgcg ctcagtaccg cggtggtcac ggcgattatt 420
a 421
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaataatc gtcgtggttt aaccgccgtc ctggcgacgt tgattacgtt ttccctgagc 60
gctac 65
Claims (10)
1.一种快速检测沙门菌并鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括cigR基因检测引物。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述cigR基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含如SEQ IDNO.3所示的反向引物。
4.根据权利要求1-3任一所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括无菌水(ddH2O)、2x Taq Master mix、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。
5.根据权利要求1-3任一所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有阳性对照和/或阴性对照。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有cigR基因表达的DNA样本，所述阴性对照为无cigR基因表达的DNA样本。
7.如权利要求1-6任一项所述的检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述cigR基因检测引物；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于：步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：
(a)95℃ 3min；(b)95℃ 15s；(c)50℃ 15s；(d)72℃ 30s，步骤(b)～(d)循环30次，(e)72℃ 10min。
9.如权利要求1-6任意一项所述检测试剂盒在制备cigR基因检测产品中的用途。
10.cigR基因在制备或筛选鸡白痢/鸡伤寒沙门菌试剂中的用途。
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|---|---|---|---|---|
| WO2022012037A1 (zh) * | 2020-07-13 | 2022-01-20 | 扬州大学 | 一种快速检测沙门菌并鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的pcr检测试剂盒及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022012037A1 (zh) | 2022-01-20 |
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