CN105586437A - 四种进境奶牛携带病毒GeXP检测方法的建立 - Google Patents
四种进境奶牛携带病毒GeXP检测方法的建立 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105586437A CN105586437A CN201510784466.XA CN201510784466A CN105586437A CN 105586437 A CN105586437 A CN 105586437A CN 201510784466 A CN201510784466 A CN 201510784466A CN 105586437 A CN105586437 A CN 105586437A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dairy
- disease
- primer
- cow
- detected
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 12
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 9
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 8
- 208000003836 bluetongue Diseases 0.000 claims description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 101100433727 Caenorhabditis elegans got-1.2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 claims description 3
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 abstract description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 abstract description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 abstract 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 14
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 14
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 4
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007716 flux method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本研究拟建立基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多种奶牛疫病检测方法，解决多种奶牛疫病检测时血清学方法灵敏度低，常规PCR只能针对单一病原体检测，基因芯片方法成本较高等问题，构建4种奶牛疫病RNA阳性样本参考品；以参考品RNA的10倍连续稀释参考品为检测对象，灵敏度为检测至10-100拷贝；与其他奶牛疫病无交叉反应，无假阴性；检测实际样本600份，满足大量奶牛多种疫病的监控筛查要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术应用领域，尤其是用于四种进境奶牛病毒病的同时检测与鉴定。
背景技术
口蹄疫(FootandMouthDisease，FMD)、牛病毒性腹泻(BovineViralDiarrhea，BVD)、蓝舌病(Bluetongue，BT)和赤羽病(AkabaneDisease，AKA)是国家规定的进境奶牛需要隔离检疫的4种病毒性疾病。近几年，随着国民对优质奶制品需求的提升，进境奶牛数量逐年攀升，给奶牛进境口岸动物疫病检测实验室带来一定的工作压力和经费负担。因此，建立一种可以同时鉴别诊断多种奶牛疫病的高通量快速检测方法对减轻奶牛进境口岸检测实验室工作负担、降低检测经费及开展进境奶牛携带疫病的流行病学调查具有重要意义。
目前，针对进境奶牛的多种病毒性疾病，口岸动物检疫实验室普遍应用病毒分离、血清学方法和分子生物学方法进行检测。病毒分离培养是诊断的金标准，但存在测周期长、操作繁琐等问题；病毒中和试验需要特异性的标准血清或病毒毒株，在实际应用中具有一定的局限性；进口的酶联免疫试剂盒普遍价格昂贵；普通PCR、荧光定量PCR等分子生物学方法皆为针对单一病毒检测，无法满足多种病原混合感染鉴别诊断的检测需求。多重PCR技术已经应用于多种病原的鉴别诊断，但由于扩增偏爱性问题无法实现真正意义上的高通量检测。
发明内容
近几年由于进口奶牛数量的逐年增多，承担进境奶牛疫病检测任务的动物检疫工作人员亟需一种灵敏度高、特异性好的检测方法以满足降低外来动物疫病传入风险和实现快速通关的工作需求。目前，大多口岸动检实验室所应用的血清学(酶联免疫法)实验，每种检测试剂盒只能检验单一动物疫病，无法鉴别多种动物疫病的混合感染，并且进口检测试剂盒昂贵的价格而给检测实验室带来很大的经济压力。因此，建立一种高通量、快速、特异性好的检测方法对于降低动物疫病传入风险，加速进境动物通关，促进贸易便利化以及降低动物疫病检测成本均有重要的意义。
GeXP多重基因表达分析系统将多重PCR技术和毛细管电泳技术结合起来，不仅具有多重PCR扩增高通量检测的优点，而且具有毛细管电泳灵敏性高的特点。GeXP的技术特点是在特异性引物的5’端加入通用引物序列，组成特异性嵌合引物。在PCR反应过程中，特异性嵌合引物先分别与对应的模板结合，保证后续扩增的特异性，经过多个循环以后，由通用引物主导后续的扩增，这样可以减少同一反应体系中不同引物之间的干扰，实现每对引物扩增效率趋于一致，从而有效解决了常规多重PCR技术的扩增偏爱性问题。
本研究根据4种进境奶牛检疫性病毒的基因保守序列，分别设计了多对特异性引物和通用引物，优化反应条件，通过对单一病毒模板、混合病毒模板的检测验证了GeXP多重RT-PCR体系中每对引物扩增的特异性和准确性，建立了同时检测4种奶牛病毒病的GeXP高通量方法，检测灵敏度至少可达102拷贝/μL。该方法可为进境奶牛病毒病的分子诊断及境外奶牛疫病的流行病学调查提供技术支持。今后，还需要大量的阳性样本或病毒毒株对本方法做进一步的验证和优化。
附图说明
图1-图5GeXP多重RT-PCR特异性验证结果(图1，AKAV；图2，BVDV；图3，BTV；图4，FMDV；图5，50bp-800bpMarker)，图中Y轴为相对荧光单位，表示扩增产物的荧光强度，X轴为毛细管电泳过程中扩增产物的大小。
图6-图11GeXP多重RT-PCR对4种病毒模板的灵敏度结果(图6，106copies/μL；图7，105copies/μL；图8，104copies/μL；图9，103copies/μL；图10，102copies/μL；图11，50bp-800bpMarker)。
具体实施方式
GeXP启动试剂盒、DNAsizestandardKit、分离缓冲液、上样缓冲液购自美国贝克曼公司，一步法RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、基因纯化试剂盒购自德国QIAGEN公司，T7体外转录试剂盒、SpeI限制性核酸内切酶和RNA酶抑制剂均购自大连宝生物公司，pGEX-T载体购自Promega公司。
参考文献选择各病毒基因保守区并从GenBank数据库中下载4种病毒的基因序列，通过DNASTAR软件分析序列同源性，并用GeXPeXpressProfiler工具设计多重特异性引物。在正、反向特异性引物5’端分别连接一段非同源性序列作为通用引物(Tag)，组成特异性嵌合引物。引物由Invitrogen公司合成，HPLC纯化。
SEQIDNO：1-AKA3：5′-AGGTGACACTATAGAATACACTGCCTTTACGCTCCATC-3′5′端用cy5标记；
SEQIDNO：2-AKA4：5′-GTACGACTCACTATAGGGACGGTGCATGTCGATAACCAG-3′；
SEQIDNO：3-BT3：5′-AGGTGACACTATAGAATAGTTCTCTAGTTGACCACC-3′5′端用cy5标记；
SEQIDNO：4-BT4：5′-GTACGACTCACTATAGGGAAAGCCAGACTGTTTCCCGAT-3′；
SEQIDNO：5-BVDV3：5′-AGGTGACACTATAGAATAAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTA-3′5′端用cy5标记；
SEQIDNO：6-BVDV4：
5′-GTACGACTCACTATAGGGAAACTCCATGTGCCATGTACAGCAG-3′；
SEQIDNO：7-FMDV3：5′-AGGTGACACTATAGAATAGCCTGGTCTTTCCAGGTCT-3′5′端用cy5标记；
SEQIDNO：8-FMDV4：5′-GTACGACTCACTATAGGGACCAGTCCCCTTCTCAGATC-3′；
SEQIDNO：9-通用引物1：5′-AGGTGACACTATAGAATA-3′5′端用cy5标记；
SEQIDNO：10-通用引物2：5′-GTACGACTCACTATAGGGA-3′；
灭活的BTV、AKAV、BVDV、FMDV毒株均为本实验室保存。病毒RNA的提取使用QIAGEN公司RNA提取试剂盒，洗脱体积为40μL，于-80℃保存。
以不含通用引物的特异性引物分别扩增含有目的基因区域的病毒RNA，扩增后的PCR产物连接到pGEX-T载体进行单克隆构建质粒，提取克隆质粒，SpeI酶切线性化，并用基因纯化试剂盒对线性化后质粒进行纯化，用T7转录试剂盒进行体外转录，利用紫外分光光度计测量RNA浓度并计算各病毒RNA的拷贝数。
将通用引物稀释至工作浓度10μmol/L，特异性引物稀释至工作浓度1μmol/L。提取4种病毒RNA作为模板，按照一步法RT-PCR试剂盒配制反应体系：10×RT-PCR缓冲液2.5μL，dNTP预混液2μL，RT-PCREnzymeMix1μL，RNA酶抑制剂0.1μL，上下游嵌合引物(1μmol/L)各取1μL，上下游通用引物(10μmol/L)各取1μL，模板RNA2μL，用不含核酸酶的水补足25μL。经过条件优化后，最终确定反应条件为：45℃30min，94℃15min逆转录；然后：94℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；94℃30s，65℃30s，72℃30s，10个循环；94℃30s，50℃30s，72℃30s，20个循环；72℃10min，1个循环。反应产物进行GeXPsystem毛细管电泳分析。
将各病毒对应的嵌合引物分别取等量进行混合，配制成多重混合引物，使各引物浓度为10μmol/L，并在反应体系中的终浓度为50nmol/L，反应体系中其它成分同单重RT-PCR，取4种病毒灭活样本核酸验证多重RT-PCR检测体系中各引物的特异性。
将体外转录病毒RNA梯度稀释至105、104、103、102、101拷贝/μL，各取1μL作为模板，检测多重体系的灵敏度。
根据多引物单模板灵敏度试验结果调整各对引物浓度。将4种病毒体外转录RNA等浓度混合并梯度稀释为106、105、104、103、102拷贝/μL作为模拟混合样品，其余反应条件不变，进行多引物多模板灵敏度分析。实验非同日重复三次，记录检测结果并计算各基因检测的变异系数CV。
具体实施方式
实施例1引物验证
单重RT-PCR产物经GeXP系统毛细管电泳分析，各目的基因扩增片段大小分别为BTV：306～307bp，AKAV：267～270bp，BVDV：348～351bp，FMDV：366～371bp，扩增片段大小与设计相符。
实施例2多重检测体系建立及单模板特异性验证结果
多引物检测体系中，每个反应只扩增出单一病毒模板的特异片段，无交叉反应，提示此方法特异性强，可根据扩增片段大小鉴别区分各病毒，结果见图1-图5。
实施例3多重检测体系单模板灵敏度试验结果
利用克隆质粒体外转录RNA为模板，各种病毒的检测下限分别为：FMDV为10拷贝/μL，AKAV、BVDV和BTV为100拷贝/μL。
实施例4多重检测体系多模板灵敏度结果
优化反应条件后，多重检测体系可在106、105、104、103、102拷贝/μL水平同时检测4种病毒RNA的模拟混合模板，结果见图6-图11。实验非同日三次重复，在104拷贝/μL时，各病毒基因变异系数介于1.2％～8.3％之间。
Claims (3)
1.一种同时检测口蹄疫(FootandMouthDisease，FMD)、牛病毒性腹泻(BovineViralDiarrhea，BVD)、蓝舌病(Bluetongue，BT)和赤羽病(AkabaneDisease，AKA)的引物组合：其特征在于特异性引物和通用引物序列如SEQNO：1至10所示。
2.权利要求1所述的引物组合在制备口蹄疫(FootandMouthDisease，FMD)、牛病毒性腹泻(BovineViralDiarrhea，BVD)、蓝舌病(Bluetongue，BT)和赤羽病(AkabaneDisease，AKA)诊断试剂中的应用。
3.一种同时检测口蹄疫(FootandMouthDisease，FMD)、牛病毒性腹泻(BovineViralDiarrhea，BVD)、蓝舌病(Bluetongue，BT)和赤羽病(AkabaneDisease，AKA)的试剂盒，其特征在于其特异性引物和通用引物序列分别为：SEQNO：1-10所示的引物；GeXP启动试剂盒、分离缓冲液、上样缓冲液，一步法RT-PCR试剂、RNA提取试剂、基因纯化试剂；
将通用引物稀释至工作浓度10μmol/L，特异性引物稀释至工作浓度1μmol/L，提取4种病毒RNA作为模板，按照一步法RT-PCR试剂盒配制反应体系：10×RT-PCR缓冲液2.5μL，dNTP预混液2μL，RT-PCREnzymeMix1μL，RNA酶抑制剂0.1μL，上下游嵌合引物(1μmol/L)各取1μL，上下游通用引物(10μmol/L)各取1μL，模板RNA2μL，用不含核酸酶的水补足25μL；经过条件优化后，最终确定反应条件为：45℃30min，94℃15min逆转录；然后：94℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；94℃30s，65℃30s，72℃30s，10个循环；94℃30s，50℃30s，72℃30s，20个循环；72℃10min，1个循环，反应产物进行GeXPsystem毛细管电泳分析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510784466.XA CN105586437B (zh) | 2015-11-17 | 2015-11-17 | 四种进境奶牛携带病毒GeXP检测方法的建立 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510784466.XA CN105586437B (zh) | 2015-11-17 | 2015-11-17 | 四种进境奶牛携带病毒GeXP检测方法的建立 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105586437A true CN105586437A (zh) | 2016-05-18 |
| CN105586437B CN105586437B (zh) | 2021-07-27 |
Family
ID=55926335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510784466.XA Expired - Fee Related CN105586437B (zh) | 2015-11-17 | 2015-11-17 | 四种进境奶牛携带病毒GeXP检测方法的建立 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105586437B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108342510A (zh) * | 2018-03-23 | 2018-07-31 | 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | Btv-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重rt-pcr试剂盒及其检测方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110070586A1 (en) * | 2007-01-12 | 2011-03-24 | Lawrence Livermore National Security, Llc | Multiplex Detection Of Agricultural Pathogens |
| CN102181578A (zh) * | 2011-04-06 | 2011-09-14 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和检测试剂盒 |
| CN103197082A (zh) * | 2013-04-16 | 2013-07-10 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法 |
| CN103695566A (zh) * | 2014-01-14 | 2014-04-02 | 徐超 | 用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重pcr引物、探针和基因芯片 |
| CN104195268A (zh) * | 2014-09-15 | 2014-12-10 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的试剂盒及制备方法 |
-
2015
- 2015-11-17 CN CN201510784466.XA patent/CN105586437B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110070586A1 (en) * | 2007-01-12 | 2011-03-24 | Lawrence Livermore National Security, Llc | Multiplex Detection Of Agricultural Pathogens |
| CN102181578A (zh) * | 2011-04-06 | 2011-09-14 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和检测试剂盒 |
| CN103197082A (zh) * | 2013-04-16 | 2013-07-10 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法 |
| CN103695566A (zh) * | 2014-01-14 | 2014-04-02 | 徐超 | 用于检测蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻病毒的多重pcr引物、探针和基因芯片 |
| CN104195268A (zh) * | 2014-09-15 | 2014-12-10 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的试剂盒及制备方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| BENJAMIN J HINDSON等: "Diagnostic Evaluation of Multiplexed Reverse Transcription-PCR Microsphere Array Assay for Detection of Foot-and-Mouth and Look-Alike Disease Viruses", 《J CLIN MICROBIOL》 * |
| SCOTT M REID等: "Detection of all seven serotypes of foot-and-mouth disease virus by real-time, fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
| 卢昌: "三种水疱性疾病GeXP检测方法的建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
| 张吉红等: "赤羽病病毒套式RT-PCR检测方法的建立与初步应用", 《畜牧与兽医 》 * |
| 张胜男等: "2013年内蒙古地区蓝舌病流行情况调查", 《中国预防兽医学报》 * |
| 杨素等: "几种动物病毒的基因芯片检测技术", 《中国兽医科技 》 * |
| 赵秀玲等: "进口奶牛病毒性腹泻病毒快速检测鉴定", 《中国兽医学报》 * |
| 邱杨等: "口蹄疫通用型实时荧光RT-PCR检测方法的建立", 《中国兽医杂志 》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108342510A (zh) * | 2018-03-23 | 2018-07-31 | 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | Btv-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重rt-pcr试剂盒及其检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105586437B (zh) | 2021-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106435024B (zh) | 检测禽流感病毒亚型的荧光定量pcr引物、探针和试剂盒及检测方法 | |
| CN102154503B (zh) | 探针法检测cho细胞dna含量的方法 | |
| CN103757139B (zh) | 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法 | |
| CN103275862A (zh) | 一种检测甲型流感病毒h7n9亚型的荧光定量rt-pcr试剂盒 | |
| CN105603120A (zh) | 用于检测蓝舌病毒、牛病毒性腹泻病毒和口蹄疫病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 | |
| CN104862419A (zh) | 一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| CN105349697A (zh) | 同时鉴别8种感染人不同亚型禽流感病毒HA基因的GeXP快速检测试剂盒及其应用 | |
| CN105200049A (zh) | 同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP快速检测试剂盒 | |
| CN105400910B (zh) | 猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法 | |
| CN103276109A (zh) | 禽流感h7n9病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN105586438A (zh) | 用于检测赤羽病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 | |
| CN104263857B (zh) | 一种快速检测水貂肠炎病毒的纳米pcr试剂盒及其应用 | |
| CN101363063B (zh) | 三重荧光定量rt-pcr检测a、b和h5亚型流感病毒的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN105567868A (zh) | 用于检测赤羽病毒、牛病毒性腹泻病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 | |
| CN102071263B (zh) | 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测试剂及检测试剂盒 | |
| CN105002284A (zh) | 一种副鸡嗜血杆菌荧光定量pcr检测方法 | |
| CN106119421B (zh) | 猪蓝耳病qyyz株的荧光定量检测引物、探针及试剂盒 | |
| CN105586437A (zh) | 四种进境奶牛携带病毒GeXP检测方法的建立 | |
| CN103215389B (zh) | 猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法rt-pcr诊断试剂盒 | |
| CN105567869A (zh) | 用于检测赤羽病毒、牛病毒性腹泻病毒和口蹄疫病毒的GeXP多重引物和方法 | |
| CN104745722A (zh) | 一种用于检测水痘带状疱疹病毒的引物、探针和试剂盒 | |
| CN105316430A (zh) | 同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN105316431A (zh) | 同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN104313179A (zh) | 一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 | |
| CN103498008B (zh) | 一种检测猪蓝耳病活疫苗jxa1-r株的方法及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 300457 No.51, 2nd Street, development zone, Dongli District, Tianjin Applicant after: Tianjin Customs Animal, Plant and Food Inspection Center Address before: No.158, Jingmen Avenue, Tianjin Port Free Trade Zone, Tianjin 300461 Applicant before: ANIMAL & PLANT AND FOOD INSPECTION CENTER OF TIANJIN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210727 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |