CN109735665A - 用于检测pcv1和pcv3的实时荧光定量pcr-hrm引物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组用于检测猪圆环病毒1型和猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR‑HRM引物，属于动物传染病学领域。该引物根据PCV1和PCV3基因组在复制相关蛋白（Rep）的核苷酸序列特征性差异设计，该差异区PCV1和PCV3存在明显的特征性核苷酸序列差异（GC%含量存在差异），导致PCV1和PCV3在该区域存在熔解温度（Tm）峰值差异，经过建立的实时荧光定量PCR方法扩增后，会出现不同的Tm峰值进行PCV1和PCV3的区分。本发明仅需一组引物即可对PCV1和PCV3进行鉴别诊断，同时还可特异性的明确猪只感染PCV1和PCV3的感染程度。本发明使用方法简单有效，成本低廉，准确性高。

Description

用于检测PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物

技术领域

本发明涉及一组用于检测猪圆环病毒1型和猪圆环病毒3型(porcine circovirustype 1 and type 3，PCV1和PCV3)的实时荧光定量PCR-HRM引物，属于动物传染病学领域。

背景技术

高分辨率熔解曲线（High Resolution Melt，HRM ）是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。该技术仅仅只是在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。当使用SYBR Green I 为荧光染料时，在实时荧光PCR扩增结束后通常要运行一步熔解曲线反应程序。即将PCR产物的温度由低到高逐步升高，在升温的过程中，双链DNA解链成单链DNA分子，原先与双链结合的荧光染料分子就与DNA脱离，而不再产生荧光信号。因此，随着温度的升高，样品的荧光信号由强转弱，从而形成一个荧光信号随温度升高而减弱的熔解曲线图，再以荧光值随温度的变化率为纵坐标作图，就形成荧光变化率随温度变化的峰形图，每一个样品在该图上呈现为一个峰形曲线。这个峰值所对应的特定温度我们就称之为该样品的熔解温度Tm，在该温度下50%的双链已解链变为单链，该温度和扩增区域的GC%含量存明显的正相关关系。

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一，当前猪圆环病毒有3种：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1为非致病性的病毒；PCV2为致病性的病毒；PCV3的有无致病力好需要更进一步深入明确。对PCV1和PCV2的基因组进行分析发现，PCV1基因组全长1759bp，PCV2全长1768 bp（或1767 bp），二者序列同源性小于80%，但PCV-1毒株间的核酸序列同源性大于99%，PCV-2毒株间的核序列同源性大于96%。ORF1是PCV1和PCV2最大的阅读框，位于病毒基因组的5’端，编码病毒的复制蛋白（Rep），分子量大小为37KDa，与病毒的复制转录有关。

2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征（PDNS）和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3，PCV3）。作为一种新发现病原体，PCV3对猪致病性及在猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）中作用以及现有商品化PCV2疫苗对其免疫效力等有待进一步研究。和PCV1、PCV2一样，PCV3病毒颗粒直径为17-20nm，核酸类型为单股DNA病毒，基因组长度为2000bp，包含有与复制相关的复制蛋白rep和与抗原相关的抗原蛋白cap。

本发明的目的是提供一种PCV1和PCV3的鉴别诊断方法。一般而言，对2种或以上的病原进行实时荧光定量PCR需要分别设计引物，进行分别扩增，再组装成多重试剂盒。即一般需要设计4条引物，才可以对猪圆环病毒2种基因型（PCV1和PCV3）进行扩增。但是4条引物在条件优化上均为繁琐复杂，且引物越多可能导致的潜在交叉可能性越大，较难达到相关研究目的。本发明最大的优点是基于PCV1和PCV3的基因组结构特点，选择PCV1和PCV3的复制相关蛋白编码区核苷酸特异性差异区设计引物（一组引物），该引物针对的区域需要同时对PCV1和PCV3均可进行实时荧光定量PCR，且该扩增区域存在核苷酸特征的GC含量差异，导致实时荧光定量结果的溶解曲线Tm值存在差异，即可对PCV1和PCV3进行鉴别诊断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

用于检测鉴别PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物，所述引物其核苷酸序列如下所示：

上游引物P1：5’- GTGGTGGGATGGDTATMATGG -3’，

下游引物P2：5’- CCASCCATAAAAATCATCCA -3’。

所述的引物用于检测鉴别PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物，包含以下步骤：

（1）从疑似临床样品中提取基因组DNA；

（2）以提取的DNA为模板，用所述的引物P1和P2进行实时荧光定量PCR扩增；

（3）利用高分辨率熔解曲线方法导致的PCV1和PCV3熔解温度值差异，对PCV1和PCV3进行鉴别诊断。

所述的PCR-HRM引物在制备鉴别诊断PCV1和PCV3试剂盒上的应用。

本发明的优点在于：

本发明是基于PCV1和PCV3的基因组结构特点，选择PCV1和PCV3的复制相关蛋白编码区核苷酸特异性差异区设计引物（一组引物），该引物针对的区域需要同时对PCV1和PCV3均可进行实时荧光定量PCR，且该扩增区域存在核苷酸特征的GC含量差异，导致实时荧光定量结果的溶解曲线Tm值存在差异，即可对PCV1和PCV3进行鉴别诊断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

附图说明

图1 PCV1和PCV3核苷酸同源性比较。

图2 PCV1和PCV3核苷酸分析。

图3 熔解曲线分析。

图4 扩增曲线特异性分析。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、毒株：

猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒3（PCV3）、猪细小病毒（PPV）、经典猪伪狂犬病毒（PRV）、变异型猪伪狂犬病毒（V-PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。

2、引物设计与合成

2.1 PCV1和PCV3基因组序列比对

选择PCV1代表株（PK株，GenBank登陆号DG650650；BJ-1株，GenBank登陆号FJ475129）PCV3代表株（CN2018LN-2株，GenBank登陆号MH277116；CN2018LN-3株，GenBank登陆号MH277117）为例，选择DNAStar生物学软件进行核苷酸同源性比较，结果可见：PCV1相互之间的核苷酸同源性在99.7%以上，PCV3相互之间的核苷酸同源性在99.5%以上， PCV1和PCV2相互之间的核苷酸同源性在48.7%-48.9%之间（图1），表明PCV1和PCV3核苷酸差异较大。

经核苷酸同源性比对发现（图2），PCV1和PCV3在基因组的5复制相关蛋白（Rep）存在特征性核苷酸差异（见图中方框中间的区域），但是在差异区的前后均存在PCV1和PCV3特异性的保守区（见图中方框）。

2.2 引物设计

基于PCV1和PCV3基因组序列比对的分析结果，在PCV1和PCV3特异性的保守区——前端保守区设计特异性的上游引物P1（图2——上游），在保守区——后端保守区设计特异性的下游引物P2（图2——下游），该引物就可以同时对PCV1和PCV3进行扩增。

其中引物P1和P2序列为：

上游引物P1：5’- GTGGTGGGATGGDTATMATGG -3’，

下游引物P2：5’- CCASCCATAAAAATCATCCA -3’。

3、实时荧光定量PCR扩增

以常规方法提取PCV1和PCV3的基因组DNA。用所设计的特异性实时荧光定量PCR引物P1和P2进行实时荧光定量PCR扩增。

优化出的25 μL 最佳反应体系为：12.5μL 的TB Green Premix Ex Taq II (2×)(Tli RNaseH Plus)、上/下游引物（10 μmol/L） 各1 μL、模板1μL、水补足至20 μL。最佳反应条件为：95 ℃ 30s预变性；95 ℃ 5 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，共40个循环，循环结束后，做出熔解曲线。

4、实时荧光定量PCR熔解曲线

实时荧光定量PCR反应结束后，根据做出的熔解曲线，根据PCV1和PCV3存在特异性核苷酸缺失导致扩增区域的GC含量差异，GC含量差异会导致出现特异性的熔解曲线峰值Tm值存在差异对PCV1和PCV3感染进行判断，结果为：

从生成的熔解曲线（图3）可见看出，若在Tm=（77.2±0.16） ℃出现单一的特异性峰判为PCV1阳性；若在Tm=（78.8±0.12）℃出现单一的特异性峰判为PCV3阳性。

5 特异性实验

以优化后条件和温度对猪群常见传染病，如猪细小病毒（PPV）、经典猪伪狂犬病毒（PRV）、变异型猪伪狂犬病毒（V-PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪细环病毒（PTTV）进行扩增，扩增后观察熔解曲线和扩增曲线，判断本研究的特异性。

从熔解曲线（图3）分析可见，仅PCV1和PCV3出现特异性的熔解曲线峰值，而其他猪群常见传染病（PPV、PRV、V-PRV、PRRSV、PEDV和PTTV均未见特异性的熔解曲线峰值（见图3的实验对照）。

从扩增曲线（图4）分析可见，仅PCV1和PCV3出现特异性的扩增曲线，而其他猪群常见传染病（PPV、PRV、V-PRV、PRRSV、PEDV和PTTV均未见特异性的扩增曲线（见图4的实验对照）。

从熔解曲线和扩增曲线可见，本发明的引物特异性强。

6、临床应用

应用本方法和PK-15方法对临床送检129份猪PMWS病料进行检测。将病料按照常规方法研磨处理后，利用核酸提取试剂盒提取病毒的基因组DNA，利用优化后的方法进行实时荧光定量PCR检测。结果可见，实时荧光定量PCR方法检测到PCV1阳性7份，阳性率为5.42%；利用PK-15分离到病毒6株，阳性率为4.65%，且该毒株的病料经优化后的方法进行实时荧光定量PCR方法检测为阳性，阳性符合率为100%。实时荧光定量PCR方法检测到PCV3阳性25份，阳性率为19.38%（由于PCV3无法用PK-15分离，故本次未进行病毒分离鉴定）。上述结果表明，本研究建立的方法和经典方法的灵敏度更高，且经病毒分离出病毒的病料对应的检测结果的符合率均为100%，表明本发明建立的方法，可用于临床开展PCV1和PCV3鉴别诊断研究。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农科院畜牧兽医研究所

<120> 用于检测PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtggtgggat ggdtatmatg g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccasccataa aaatcatcca 20

Claims (3)

1.用于检测鉴别PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物，其特征在于：所述引物其核苷酸序列如下所示：

上游引物P1：5’- GTGGTGGGATGGDTATMATGG -3’，

下游引物P2：5’- CCASCCATAAAAATCATCCA -3’。

2.如权利要求1所述的引物用于检测鉴别PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物，其特征在于，包含以下步骤：

（1）从疑似临床样品中提取基因组DNA；

（2）以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的引物P1和P2进行实时荧光定量PCR扩增；

（3）利用高分辨率熔解曲线方法导致的PCV1和PCV3熔解温度值差异，对PCV1和PCV3进行鉴别诊断。

3.如权利要求1所述的PCR-HRM引物在制备鉴别诊断PCV1和PCV3试剂盒上的应用。