JP2015506666A - 核酸プローブ及びビーズサブセットを用いて呼吸器病原体を検出する組成物及び方法 - Google Patents

核酸プローブ及びビーズサブセットを用いて呼吸器病原体を検出する組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、複数の呼吸器病原体を検出及び同定する多重核酸増幅アッセイを教示する。

Description

ファイリングデータ：本出願はオーストラリア仮特許出願No.2011904105（2011年10月4日出願、発明の名称“アッセイ（An Assay）”（その完全な内容は参照により本明細書に含まれる））と関連し、その優先権を主張する。
本開示は、複数の呼吸器病原体を検出及び同定する多重核酸増幅アッセイを教示する。
本明細書で著者が引用した刊行物の文献目録の詳細は本明細書の最後にアルファベット順にまとめられている。
先行するいずれの刊行物（又は前記に由来する情報）又は公知のいずれの事柄の本明細書における言及も、当該先行する刊行物（又は前記に由来する情報）又は公知の事柄が、本明細書が関係する対象分野で共通の一般的知識の部分を形成するということの認知若しくは承認又はいかなる形態の示唆ともみなされることなく、かつみなされるべきではない。
オーストラリア肺財団（Australian Lung Foundation）は、オーストラリアでは上気道感染症は一般開業医（GP）への毎年約3−4百万の受診の原因となり、これは直接経費として1億5千万オーストラリアドル及び間接経費としてこれより相当に多い費用が納税者の負担となると報告している。下気道感染症は、オーストラリアでは毎年ほぼ3百万のGP受診の原因となっている。前記の社会的及び経済的影響は、呼吸器感染症に起因する入院数によってさらにその度合いを増す。例えば、地域性肺炎は、65歳以上の入院患者の年間約12％のオーストラリアの全死亡率と密接に関係する。この死亡率は、合併症（例えば慢性閉塞性肺疾患、うっ血性心不全、糖尿病）が存在する場合には約20％に増加する。さらにまた、喘息については30,000件まで及び慢性閉塞性肺疾患については40,000件までの入院がウイルス感染症によって突然もたらされる（ウイルス感染症は喘息及び慢性閉塞性肺疾患の全入院の50から80％に関与している）。結果として、オーストラリアにおける直接的及び間接的費用負担は、毎年5億オーストラリアドルを超えると概算される。
呼吸器感染症と関連した病因因子は、細菌（ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）を含む）、真菌及びウイルスに分類できる。インフルエンザA又はB型ウイルスはほぼ毎冬流行病を引き起こす。季節性ワクチン接種（インフルエンザ注射）はインフルエンザA及びB型による疾患を予防できるが、インフルエンザC型は防ぐことができない。呼吸器合胞体形成ウイルス（RSV）は、幼児及び低年齢児童の急性下気道感染症の主要な原因であり、入院の大半は1歳未満の幼児で発生する。世界的に、160,000−600,000の年間死亡率にはRSVが密接に関係していると考えられる。重篤なRSV症のリスクが高い者には、未熟児並びに先天性心疾患、神経筋疾患、気道の構造的異常及び免疫不全を有する乳児が含まれる。ヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV）は、低年齢児童の下気道疾患の一般的原因としてRSVに次いで２位に位置する。HPIVはまた繰り返し感染して重篤な下気道疾患を引き起こし得る（下気道疾患には、肺炎、気管支炎及び細気管支炎（特に高齢者及び免疫系不全患者）が含まれる）。
世界的な呼吸器疾患の規模にもかかわらず、治療は主として事実上対症的なものである。気管支拡張剤、コルチコステロイド及びロイコトリエンレセプターアンタゴニスト（例えばモンテルカスト）の使用は、決定的な臨床的成果を示すにはおおむね不成功で、抗ウイルス剤（例えばリバビリン）は、不十分な臨床成果を示しただけである。呼吸器感染症の治療及び予防に対するこれまでのアプローチは、第二世代モノクローナル抗体及び極めて強力な抗ウイルス化合物（例えばインフルエンザ治療用のオセルタミビア（登録商標タミフル）及びザナミビア（登録商標リレンザ））を含む。ワクチン組成物もまた開発中である。しかしながら、既存治療法の有効性は、問題となっている呼吸器病原体の同定に大きく左右される。残念ながら、極めて多くの存在可能な呼吸器病原体及び対応する株が与えられるとすると、特有の呼吸器病原体をサンプルで同定する標準的な診断方法の使用は、多くの時間及び費用を必要とし、しばしば不正確又は非決定的診断につながる。典型的なウイルス診断検査室ではウイルスの培養、免疫蛍光染色及びポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、呼吸器ウイルスをスクリーニングする。しかしながら、既存技術には著しい制限が存在する。例えば、ウイルスの培養は多くの時間を要し、さらに特に輸送中に不安定であるか、及び／又は面倒な増殖要件を有するウイルスの検出については必須の感受性が欠如している。免疫蛍光染色は感度が低く、しばしば偽陰性結果につながり、従来のPCRアッセイは典型的には、複数の標的を含む大量のサンプルを効率的に取り扱う高処理検出能力を欠いている。
複数の呼吸器病原体をスクリーニングする、高レベルの迅速性及び感度を有するアッセイの開発が希求されている。
本明細書で提供されるものは、複数の呼吸器病原体についてサンプルをスクリーニングし特定の病原体を検出する方法であり、前記方法は以下の工程を含む：
（a）サンプルから1つ以上の呼吸器病原体に由来する核酸を含むと推定される核酸を単離する工程；
（b）該核酸を増幅に付する工程、ここで水性プライマー対が呼吸器病原体の核酸のある領域の増幅を指令し、プライマー対数はスクリーニングを所望される病原体数を基準に選択され、該プライマー対の少なくとも一方のメンバーは、増幅後の生成アンプリコンに取り込まれる第一の光学的に検出可能な標識を含み、該アンプリコンは、アンプリコンのある領域と相補性でありビーズセット中のビーズに固定されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることによって捕捉され、該ビーズセットはビーズサブセットを有し、各サブセットはビーズサイズ及び場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度に関して均質であり、それによってサイズ及び／又は第二の検出可能な標識の強度に基づいて不均質なビーズセットを生じ、さらに該サブセット数はスクリーニングされるべき呼吸器病原体数と一致し；
（c）第一の検出可能な標識の強度を基準にしてどのビーズとアンプリコンが結合したかを決定する工程、及び、アンプリコンが複数のビーズサブセットと結合する場合には、ビーズサイズを基準に、さらに場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度を基準として複数のビーズサブセットを区別する工程；
ここでアンプリコンと特有のビーズサブセットとの結合は、該サンプルに特有の呼吸器病原体が存在することの指標である。
ある実施態様では、増幅は固相増幅である。
ある実施態様では、第一の光学的に検出可能な標識を含むプライマーの伸長によって開始されるアンプリコンは、第二の光学的に検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチド（半入れ子プライマー）のハイブリダイゼーション及び伸長のための鋳型として機能する（ここで前記オリゴヌクレオチドはビーズセット中のビーズに固定されていれる）。
さらに別の教示は、複数の呼吸器病原体についてサンプルをスクリーニングし特有の病原体を検出する方法であり、前記方法は以下の工程を含む：
（a）サンプルから1つ以上の呼吸器病原体に由来する核酸を含むと推定される核酸を単離する工程；
（b）該核酸を固相増幅に付する工程、ここで水性プライマー対が呼吸器病原体の核酸のある領域の増幅を指令し、プライマー対数はスクリーニングを所望される病原体数を基準に選択され、該プライマー対の少なくとも一方のメンバーは、増幅後の生成アンプリコンに取り込まれる第一の光学的に検出可能な標識を含み、第一の光学的に検出可能な標識を含むプライマーの伸長によって開始される該生成アンプリコンは、第二の光学的に検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチド（半入れ子プライマー）のハイブリダイゼーション及び伸長のための鋳型として機能し、前記オリゴヌクレオチドはビーズセット中のビーズに固定され、該ビーズセットはビーズサブセットを有し、各サブセットはビーズサイズ及び場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度に関して均質であり、それによってサイズ及び／又は第二の検出可能な標識の強度を基準として不均質なビーズセットを生じ、さらに該サブセット数はスクリーニングされるべき呼吸器病原体数と一致し；
（c）第一の検出可能な標識の強度を基準にしてどのビーズとアンプリコンが結合したかを決定する工程、及び、アンプリコンが複数のビーズサブセットと結合する場合には、ビーズサイズを基準に、さらに場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度を基準に複数のビーズサブセットを区別する工程；
ここでアンプリコンと特有のビーズサブセットとの結合は、該サンプルに特有の呼吸器病原体が存在することの指標である。
ある実施態様では、本方法は、第二の光学的に検出可能な標識の強度を基準にして複数のビーズサブセットを区別する工程を含む。
ある実施態様では、呼吸器病原体は以下から成る群から選択される：インフルエンザA、インフルエンザB、インフルエンザA H1N1、インフルエンザA H5N1、呼吸器合胞体形成ウイルスA亜型、呼吸器合胞体形成ウイルスB亜型、ヒトパラインフルエンザウイルス1、ヒトパラインフルエンザウイルス2、ヒトパラインフルエンザウイルス3、ヒトパラインフルエンザウイルス4、ヒトメタニューモウイルス、ヒトアデノウイルスB亜型、ヒトアデノウイルスC亜型、ヒトアデノウイルスE亜型、ヒトエンテロウイルス、ヒトライノウイルス、ボルデテラ・ペルツシス、クラミドフィラ・ニューモニアエ（Chlamydophila pneumoniae）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasma pneumoniae）、並びにストレプトコッカス（Streptococcus）、ヘモフィルス（Haemophilus）、モラキセラ（Moraxella）、シュードモナス（Pseudomonas）、クレブシエラ（Klebsiella）、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）、アシネトバクター（Acinetobacter）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、レジオネラ（Legionella）、クラミドフィラ（Chlamydophila）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、コクシエラ（Coxiella）、ノカルジア（Nocardia）、ニューモシスチス（Pneumocystis）、ノカルジア、及びアスペルギルス（Aspergillus）属の他の微生物。
ある実施態様では、呼吸器病原体由来核酸は以下から成る群から選択される：インフルエンザAマトリックスタンパク質のセグメント7をコードする遺伝子、インフルエンザBヘマグルチニンのセグメント4をコードする遺伝子、インフルエンザAの2009 H1N1流行株のセグメント4をコードする遺伝子、インフルエンザAのH5N1流行株のセグメント4をコードする遺伝子、呼吸器合胞体形成ウイルス（A及びB型）のポリメラーゼ遺伝子、ヒトパラインフルエンザウイルス1、2及び3のヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ糖タンパク質をコードする遺伝子、ヒトパラインフルエンザウイルス4のリンタンパク質遺伝子、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスタンパク質のM2領域をコードする遺伝子、アデノウイルスB、C及びE型のヘキソン領域をコードする遺伝子、ヒトライノウイルス/エンテロウイルスの5’UTR領域、ボルデテラ・ペルツシスの挿入エレメント（IS）481、クラミドフィラ・ニューモニアエの主要外膜タンパク質をコードする遺伝子、及びマイコプラズマ・ニューモニアエのP1シトアドヘシンをコードする遺伝子。
ある実施態様では、プライマー対は、配列番号：1から16並びに配列番号：33及び35から成る群から選択されるフォワードプライマー、並びに、配列番号：17から32並びに配列番号：34及び36から成る群から選択される対応するリバースプライマーを含む。
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブ/半入れ子プライマーは、配列番号：37から52から成る群から選択される。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号：53及び54から選択されるコントロールオリゴヌクレオチドプローブである。
ある実施態様では、該方法は、配列番号：33及び35から選択されるフォワードプライマー並びに配列番号：34及び36から選択される対応するリバースプライマーを含むプライマー対を用いてコントロール核酸配列を増幅する工程を含む。
ある実施態様では、該方法は、配列番号：1から16のフォワードプライマー及び配列番号：17から32の対応するリバースプライマーを含む16のプライマー対を用い、さらにここで該オリゴヌクレオチドプローブ/半入れ子プライマーが配列番号：37から52から成る群から選択される増幅条件に該核酸を付す工程を含む。
ある実施態様では、該方法は、配列番号：74から126から選択されるフォワード及びリバースプライマー対並びに対応するプローブを用いて核酸配列を増幅する工程を含む。
ある実施態様では、該方法は、配列番号：74から126から選択されるフォワード及びリバースプライマー対並びに対応するプローブを用い、さらにここで該プライマーが半入れ子プライマーである固相増幅条件に該核酸を付す工程を含む。
ある実施態様では、第一及び第二の光学的に検出可能な標識は以下から成る群から選択されるフルオロフォアである：オキシクマリン、アミノクマリン、メトキシシウマリン、カスケードブルー、ルシファーイェロー、NBD、フィコエリトリン（PE）、PerCP、アロフィコシアニン、ヘキスト33342、DAPI、SYTOXブルー、ヘキスト33258、クロモマイシンA3、ミトラマイシン、YOYO-I、SYTOX グリーン、SYTOXオレンジ、7-AAD、アクリジンオレンジ、TOTO- 1、To-PRO-I、チアゾールオレンジ、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751、以下を含むAlexaFluor（AlexaFluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700及び-750）、以下を含むBoDipy染料（BoDipy 630/650及びBoDipy 650/665）、CY染料（特にCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5及びCy7）、6-FAM（フルオレセイン）、PE-Cy5、PE-Cy7、フルオレセインdT、ヘキサクロロフルオレセイン（Hex）、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,T-ジメトキシフルオレセイン（JOE）、以下を含むオレゴングリーン染料（488-X及び514）、以下を含むローダミン染料（X-ローダミン、リサミンローダミンB、ローダミングリーン、ローダミンレッド及びROX）、TRITC3テトラメチルローダミン（TMR）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、テトラクロロフルオレセイン（TET）、レッド6B5 FluorX、BODIPY-FL及びテキサスレッド。
ある実施態様では、第一の光学的に検出可能な標識はAlexaFluor-647である。
ある実施態様では、第二の光学的に検出可能な標識は、ホウ素-ジピロメテン(BoDipy)-TMRである。ある実施態様では、第二の光学的に検出可能な標識は該オリゴヌクレオチドプローブに結合される。ある実施態様では、第二の光学的に検出可能な標識は、該オリゴヌクレオチドプローブの内部チミジン残基のアミノC6改変を介して前記オリゴヌクレオチドプローブに結合される。ある実施態様では、該オリゴヌクレオチドプローブは半ネストオリゴヌクレオチドである。ある実施態様では、該オリゴヌクレオチドプローブは、チオール又はメタクリル結合を介してビーズと共有結合される。
ある実施態様では、各サブセット内のビーズのサイズは、直径3.0μm、3.5μm、3.8μm、4.3μm、5.0μm、5.2μm及び5.7μmから成る群から選択される。
さらに本明細書で教示されるものは、配列番号：1及び17、2及び18、3及び19、4及び20、5及び21、6及び22、7及び23、8及び24、9及び25、10及び26、11及び27、12及び28、13及び29、14及び30、15及び31並びに16及び32から選択される、2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、並びに配列番号：37から52から選択される対応するプローブをそれぞれ含むキットである。
さらに本明細書で教示されるものは、表8に列挙した2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対及び対応するプライマープローブ（配列番号：74から126）を含むキットである。
ヌクレオチド及びアミノ酸配列は配列識別子番号（SEQ ID NO.（配列番号））によって示される。配列表は本明細書の末尾に添付され、参照により本明細書に含まれる。SEQ ID NOは、配列識別子<400>1（配列番号：1）、<400>2（配列番号：2）などのように数字が一致する。本明細書を通して用いられる配列識別子の要旨は表1に提供される。これらの配列の一覧は表2に提供される。
表1：配列識別子のまとめ
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表2：配列のまとめ
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1Aから1Dはコントロール構築物挿入配列及びそれらの識別子を示す。 1Aから1Dはコントロール構築物挿入配列及びそれらの識別子を示す。 1Aから1Dはコントロール構築物挿入配列及びそれらの識別子を示す。 1Aから1Dはコントロール構築物挿入配列及びそれらの識別子を示す。 特異的RT-PCRによるRNA鋳型の同一性を確認する写真である。 全ての標的DNA鋳型の効率的な増幅をもたらすプライマー濃度を示す写真である。 RNA及びDNA鋳型の効率的な増幅をもたらすプライマー条件を示す写真である。 5A及び5Bは、バックグラウンドヒト染色体DNAが存在しないとき又は存在するときの、RT-PCR増幅プロフィールを示す写真である。 5A及び5Bは、バックグラウンドヒト染色体DNAが存在しないとき又は存在するときの、RT-PCR増幅プロフィールを示す写真である。 概括的プライマー設計プロセスの概要を示す図である。
本明細書を通して文脈が特段に必要としないかぎり、“comprise（含む）”又はその変形、例えば“comprises”又は“comprising”という語は、記述された1つの成分若しくは整数若しくは方法の工程又は複数の成分若しくは整数若しくは方法の工程のグループを含むが、いずれの成分若しくは整数若しくは方法の工程又は複数の成分若しくは整数若しくは方法の工程のグループも排除しないことを含蓄すると理解されるであろう。
本明細書で用いられるように、単数形“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうでないことを示していないかぎり、単数及び複数相を含む。したがって、例えば“a respiratory pathogen”と言えば、ただ1つの呼吸器病原体とともに2つ以上の異なる呼吸器病原体を含み、“an agent”と言えば、ただ1つの薬剤とともに2つ以上の薬剤を含み、“the disclosure（開示）”と言えば、当該開示によって教示されるただ1つの又は複数の特徴を含む。本明細書で教示される特徴（the aspects）は“invention（発明）”という用語に包含される。そのような特徴は全て本特許請求の範囲の中で可能となる。
本開示は、サンプル中の複数の呼吸器病原体の検出及び弁別を教示する。
本明細書で可能となるものは、複数の呼吸器病原体についてサンプルをスクリーニングし特有の病原体を検出する方法であり、前記方法は以下の工程を含む：
（a）サンプルから1つ以上の呼吸器病原体に由来する核酸を含むと推定される核酸を単離する工程；
（b）該核酸を増幅に付する工程、ここで水性プライマー対が呼吸器病原体の核酸のある領域の増幅を指令し、プライマー対数はスクリーニングを所望される病原体数を基準に選択され、該プライマー対の少なくとも一方のメンバーは、増幅後の生成アンプリコンに取り込まれる第一の光学的に検出可能な標識を含み、該アンプリコンは、アンプリコンのある領域と相補性でありビーズセット中のビーズに固定されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることによって捕捉され、該ビーズセットはビーズサブセットを有し、各サブセットはビーズサイズ及び場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度に関して均質であり、それによってサイズ及び／又は第二の検出可能な標識の強度を基準として不均質なビーズセットを生じ、さらに該サブセット数はスクリーニングされるべき呼吸器病原体数と一致し；
（c）第一の検出可能な標識の強度を基準にしてどのビーズとアンプリコンが結合したかを決定する工程、及び、アンプリコンが複数のビーズサブセットと結合する場合には、ビーズサイズを基準に、さらに場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度を基準に複数のビーズサブセットを区別する工程；
ここでアンプリコンと特有のビーズサブセットとの結合は、該サンプルに特有の呼吸器病原体が存在することの指標である。
ある実施態様では、増幅は固相増幅である。
ある実施態様では、第一の光学的に検出可能な標識を含むプライマーの伸長によって開始されるアンプリコンは、第二の光学的に検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチド（半入れ子プライマー）のハイブリダイゼーション及び伸長のための鋳型として機能する（ここで前記オリゴヌクレオチドはビーズセット中のビーズに固定されている）。
さらに可能となるものは、複数の呼吸器病原体についてサンプルをスクリーニングし特有の病原体を検出する方法であり、前記方法は以下の工程を含む：
（a）サンプルから1つ以上の呼吸器病原体に由来する核酸を含むと推定される核酸を単離する工程；
（b）該核酸を固相増幅に付する工程、ここで水性プライマー対が呼吸器病原体の核酸のある領域の増幅を指令し、プライマー対数はスクリーニングを所望される病原体数を基準に選択され、該プライマー対の少なくとも一方のメンバーは、増幅後の生成アンプリコンに取り込まれる第一の光学的に検出可能な標識を含み、第一の光学的に検出可能な標識を含むプライマーの伸長によって開始される該生成アンプリコンは、第二の光学的に検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチド（半入れ子プライマー）のハイブリダイゼーション及び伸長のための鋳型として機能し、前記オリゴヌクレオチドはビーズセット中のビーズに固定され、該ビーズセットはビーズサブセットを有し、各サブセットはビーズサイズ及び場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度に関して均質であり、それによってサイズ及び／又は第二の検出可能な標識の強度を基準として不均質なビーズセットを生じ、さらに該サブセット数はスクリーニングされるべき呼吸器病原体数と一致し；
（c）第一の検出可能な標識の強度を基準にしてどのビーズとアンプリコンが結合したかを決定する工程、及び、アンプリコンが複数のビーズサブセットと結合する場合には、ビーズサイズを基準に、さらに場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度を基準に複数のビーズサブセットを区別する工程；
ここでアンプリコンと特有のビーズサブセットとの結合は、該サンプルに特有の呼吸器病原体が存在することの指標である。
“病原体”という用語は、宿主に感染するか又は宿主でコロニーを形成することができる微生物又はウイルスを指す。宿主は単一細胞でも複数の細胞を含む対象体でもよい。したがって、“宿主”には対象体が含まれる。例示的病原体にはウイルス、細菌、真菌及び真核微生物が含まれる。“呼吸器病原体”は、宿主の気道に感染するか又は前記でコロニーを形成することができる病原体を指し、本明細書では前記病原体はコロニー形成病原体、固有病原体、共生病原体又は共生生物とも称される。ある病原体は感染を経験していない健康な対象体に存在し得ることは当業者には理解されよう。正常な健康状態では、これらの病原体は感染症を引き起こさず、一方、当該対象体は呼吸器症状を発展させない。しかしながら、誘引（例えば体調不良、ストレス）に続いて、該病原体は、慢性/急性呼吸器感染症の原因病原体になり得る。
呼吸器病原体は当業者に公知である。例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：インフルエンザA、インフルエンザB、インフルエンザA H1N1、インフルエンザA H5N1、呼吸器合胞体形成ウイルスA亜型、呼吸器合胞体形成ウイルスB亜型、ヒトパラインフルエンザウイルス1、ヒトパラインフルエンザウイルス2、ヒトパラインフルエンザウイルス3、ヒトパラインフルエンザウイルス4、ヒトメタニューモウイルス、ヒトアデノウイルスB亜型、ヒトアデノウイルスC亜型、ヒトアデノウイルスE亜型、ヒトエンテロウイルス、ヒトライノウイルス、ボルデテラ・ペルツシス、クラミドフィラ・ニューモニアエ及びマイコプラズマ・ニューモニアエ、並びに前記の株。さらに想定されるものは、ストレプトコッカス、ヘモフィルス、モラキセラ、シュードモナス、クレブシエラ、ステノトロフォモナス、アシネトバクター、スタフィロコッカス、マイコプラズマ、レジオネラ、クラミドフィラ、マイコバクテリウム、コクシエラ、ノカルジア、ニューモシスチス、ノカルジア、及びアスペルギルス属の微生物であり、上記に列挙されたものが含まれる。
本明細書で教示されるものはまた、サンプル中の呼吸器病原体の1つ以上の固有株を検出及び／又は弁別する方法である。本明細書で“株”というとき、分析物の種又はタクソンの任意の変種を含む。呼吸器病原体の“株”の例には、該病原体の亜種、種々のレベルのビルレンスを有する該病原体の変種、宿主に感染又はコロニーを形成したとき種々の予後を明示する該病原体の変種、該病原体の生化学的変種などが含まれる。
本明細書で用いられる“サンプル”という用語は“分析物”という用語と互換的に用いられ、1つ以上の呼吸器病原体を含むと推定される組成物のような任意の実体を指す。例には対象体由来の生物学的サンプルが含まれ、前記サンプルには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：血液、血清、血漿、唾液、糞便、尿、リンパ液、羊水、脳脊髄液、組織液、精液、滲出物、膿汁、呼吸器流出液及び粘液、並びに局所の傷、癌及び病巣のスワブ、並びに組織又は細胞サンプル（例えば細胞切屑、生検材料など）。
本明細書開示の方法が意図するサンプルにはまた工業サンプル、例えば空気、水及び土壌などが含まれる。サンプルにはまた以下が含まれる：氷、岩、熱水ベント及び気体；ヘルスケア周辺物（病院、病院設備、外科手術設備、ヘルスケアスタッフの衣類などを含む）；“工業”周辺物（製造施設、製薬施設、醸造所、ワイナリーなどを含む）；及び“研究室”周囲物（ファーメンター、培養物、作業台、装置などを含む）。
本明細書で用いられるように、“対象体”という用語は、呼吸器病原体による感染又はコロニー形成に鋭敏であり得る任意の生物を指す。対象体の例には動物、植物、真菌及び細菌（バクテリオファージによって感染され得る）が含まれるが、ただし前記に限定されない。対象体は宿主細胞1つ又は複数の宿主細胞を含む。本明細書で用いられるように、“動物”という用語には哺乳動物が含まれ、前記哺乳動物は霊長類、例えば下等霊長類及び高等霊長類（ヒトを含む）を含む。しかしながら、“動物”という用語はまた、特に家畜種（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びロバ）を実験動物と同様に含む。実験用テスト動物の例にはマウス、ラット、ウサギ、モルモット及びハムスターが含まれる。ウサギ及びげっ歯類動物、例えばラット及びマウスは、霊長類及び下等霊長類と同様に便利なテスト系又は動物モデルを提供する。非哺乳類動物、例えば鳥類種、ゼブラフィッシュ、両性類（ケイントウド（cane toad）を含む）及びドロソフィラ（Drosophila）種（例えばドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster））もまた意図される。対象体は非動物（例えば植物）でもよい。
ある実施態様では、対象体はヒトである。
動物、特に家畜種の呼吸器感染症は著しい経済的損失を引き起こし得る。例えば、ウシ呼吸器疾患（BRD）（前記は上気道感染症、ジフテリア及び肺炎を含む）は、肥育場のウシの疾病及び死の60−70％を超える原因となっている。ウイルス及び細菌の両因子がBRDを引き起こし、制御は極めて困難であり得る。当該動物は大半の事例で回復するが、それらは典型的にはある程度の長期的損傷を提示する。例えば、肺病巣の形跡を示す全屠殺牛の30−50％が過去の呼吸器疾患の結果であることが研究によって示された。このような状況下で呼吸器疾患を制御するために、多くの家畜取扱業者は機敏に診断し、隔離及び感染動物の抗生物質及び／又は抗ウイルス医薬による治療によって大発生に対処している。しかしながら、これらの治療による試みは例によって高価であり、しばしば疾患の治癒に失敗する。さらにまた、治療の成功は例外なく、疾患開始前及び活動中の呼吸器病原体の同定前の当該動物の呼吸器の健康状態に左右される。したがって、本明細書に開示する方法を利用して感染動物又は動物集団で呼吸器病原体を同定し、それによってより質の高い診断及びより有効な治療計画の実施を可能にする。
動物の治療への応答に影響を与えるだけでなく、以前の呼吸器疾患により生じる病理学的損傷は、肥育場における動物の状態に悪影響を及ぼし得る。例えば、大きな呼吸器損傷を有する肥育場のウシは、呼吸器損傷が小さい動物よりも体重増加が小さいことが示されている。さらにまた、大きな損傷を有するウシに由来する肉は、損傷が小さいウシに由来する肉よりも品質がしばしば低下する。
ある実施態様では、対象体は家畜動物である。関連する実施態様では、呼吸器病原体は、肥育場のウイルス（ウシヘルペスウイルス（BHV-1又はIBR）、パラインフルエンザウイルス3（P13）、ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）及びウシ呼吸器合胞体形成ウイルス（BRSV）を含むが、ただしこれらに限定されない）及び肥育場の細菌又は細菌様生物（マンヘイミア・ヘモリチカ（Mannheimia haemolytica）、パスツレラ・ムルトシーダ（Pasteurella multocida）、ヘモフィルス・ソムヌス（Haemophilus somnus）、マイコプラズマ亜種及びクラミジア（Chlamydia）を含むが、ただしこれらに限定されない）から選択される。
“核酸”、“ヌクレオチド”及び“ポリヌクレオチド”という用語は本明細書では互換的に用いられ、RNA、cDNA、ゲノムDNA、合成形及び混合ポリマー、センス及びアンチセンス両鎖が含まれ、化学的又は生化学的に改変できるか、又は非天然若しくは誘導ヌクレオチド塩基を含むことができ、そのことは当業者には容易に理解されよう。そのような改変には、例えば標識、メチル化、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナローグ（例えばモルフォリン環）による置換、ヌクレオチド間改変（例えば非荷電結合（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど））、荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、懸垂成分（例えばポリペプチド）、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、及び改変結合（例えばα-アノマー核酸など）が含まれる。さらにまた含まれるものは、水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定の配列と結合するその能力に関してポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は当業界では公知であり、例えば分子の骨格でペプチド結合がリン酸結合の代用となる分子である。
核酸は、当業者に公知の任意の方法を用いて対象体のサンプルから単離することができる。単離核酸は、当該核酸が天然の状態では密接に関係しているか又は本来の状態では結合している他の成分から概ね分離されてある核酸を意味すると理解できる。ある実施態様では、単離された核酸は、当該核酸が天然の状態では密接に関係している他の成分を少なくとも50％、又は少なくとも75％、又は少なくとも90％取り除かれている。表示される単離の程度は干渉物質からの純度に関係し得る。
DNAは当業者に公知の任意の便利な手段を用いてサンプルから単離できる。例えば、ヒト細胞で発現されると推定されるウイルスの場合には、グアニジン又は機能的に等価の薬剤を用いて細胞を溶解することができる。いくつかの実施態様では、DNAは、限定量のDNA結合剤（例えばシリカであるがただし前記に限定されない）を用いてサンプルから精製される。限定量のDNA結合剤を用いることによって、均一な量のDNAを種々のサンプルから単離できる。なぜならば、各事例で回収されるDNAの量は、当該限定量のDNA結合剤が結合することができる最大DNA量と等しいからである。続いて任意の便利な手段を用い、DNA結合剤と結合したDNAを該DNA結合剤から回収するか又は溶出させる。
周囲の状況に応じて（当業者には明白であろう）、例えば問題の呼吸器病原体がRNAウイルスであるときは、RNAを単離する。RNAを単離したら、該RNAを増幅するか、又は後の増幅及び分析のために当業者に公知の方法を用いて該RNAをcDNAに逆転写することができる。ある実施態様では、ウイルスRNA又は対応するDNAは感染宿主細胞から単離される。
本明細書で教示する方法は、問題のタクソンのメンバーを通して高度に保存されているサンプル中の核酸配列を増幅するために、特異的プライマーの使用を含む。模式的に示せば、増幅領域は以下の一般構造を有する：
CF−X−CR
式中、
CFは標的タクソンのメンバーに渡って保存されているヌクレオチド配列であり、かつ“フォワード”（F）プライマーの結合部位であり；
Xはヌクレオチド配列であり、前記の部分は標的タクソンのメンバーに渡って保存されている領域を含み；さらに
CRは標的タクソンのメンバーに渡って保存されているヌクレオチド配列であり、かつ対応する“リバース”（R）プライマーの結合部位である。
プライマー部位（例えば本明細書に記載したもの）からの増幅は、効率的に標識核酸鎖（アンプリコン）を生成し、前記アンプリコンは、ビーズに固定されたオリゴヌクレオチド捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに続いて固相支持体にロードされる。ある実施態様では、標識アンプリコンは、ビーズに固定された半ネストプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び伸長に続いて固相支持体上にロードされる。
ある実施態様では、プライマー対は、インフルエンザAの核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、インフルエンザAマトリックスタンパク質のセグメント7をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/CGAGGTCGAAACGTAYGTTCTYTCTAT（配列番号：1；フォワードプライマー；F）及びGCCATTCCATGAGAGCCTCRAGATC（配列番号：17；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、インフルエンザBの核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、インフルエンザBヘマグルチニンのセグメント4をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/TACGGTGGATTAAACAAAAGCAAGCC（配列番号：2；フォワードプライマー；F）及びCAGGAGGTCTATATTTGGTTCCATTGGC（配列番号：18；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、インフルエンザAの2009 H1N1流行株の核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、インフルエンザAの2009 H1N1流行株のセグメント4をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/CCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCA（配列番号：3；フォワードプライマー；F）及びGCTTTTTGCTCCAGCATGAGGACAT（配列番号：19；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、インフルエンザAのH5N1流行株の核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、インフルエンザAのH5N1流行株のセグメント4をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/GCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCC（配列番号：4；フォワードプライマー；F）及びYCTTCTCCACTATGTAAGACCATTCCGG（配列番号：20；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、呼吸器合胞体形成ウイルス（A及びB型）の核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、呼吸器合胞体形成ウイルス（A及びB型）のポリメラーゼ遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/ACAGTCAGTAGTAGACCATGTGAATTC（配列番号：5；フォワードプライマー；F）及びRTCRATATCTTCATCACCATACTTTTCTGTTA（配列番号：21；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、ヒトパラインフルエンザウイルス1の核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、ヒトパラインフルエンザウイルス1のヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ糖タンパク質をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/TGGTGATGCAATATATGCGTATTCATC（配列番号：6；フォワードプライマー；F）及びCCGGGTTTAAATCAGGATACATATCTG（配列番号：22；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、ヒトパラインフルエンザウイルス2の核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、ヒトパラインフルエンザウイルス2のヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ糖タンパク質をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/CYCGTCCTGGAGTCATGCCATGCAA（配列番号：7；フォワードプライマー；F）及びCRTTAAGCGGCCACACATCTGCGT（配列番号：23；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、ヒトパラインフルエンザウイルス3の核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、ヒトパラインフルエンザウイルス3のヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ糖タンパク質をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/CAAGTTGGCAYAGCAAGTTACAATTAGGA（配列番号：8；フォワードプライマー；F）及びGTCCCCATGGACATTCATTGTTTCCTGGT（配列番号：24；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、ヒトパラインフルエンザウイルス4の核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、ヒトパラインフルエンザウイルス4のリンタンパク質遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/GTTGATCAAGACAATACAATTACACTTGA（配列番号：9；フォワードプライマー；F）及びTAAGTGCATCTATACGAACRCCTGCTC（配列番号：25；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、ヒトメタニューモウイルスの核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスタンパク質のM2領域をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/GACAAATCATMATGTCTCGYAARGCTCC（配列番号：10；フォワードプライマー；F）及びCTATCWGGCCAACTCCAGTAATTGTG（配列番号：26；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、アデノウイルスB及び／又はE型の核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、アデノウイルスB及び／又はE型のヘキソン領域をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、TGCCSCARTGGKCDTACATGCACATC（配列番号：11；フォワードプライマー；F）及び5’AmMC6/GCRCGGGCRAACTGCACCAG（配列番号：27；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、アデノウイルスC型の核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、アデノウイルスC型のヘキソン領域をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’Phos/TGCCSCARTGGKCDTACATGCACATC（配列番号：12；フォワードプライマー；F）及び5’AmMC6/GCRCGGGCRAACTGCACCAG（配列番号：28；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、ヒトライノウイルス/エンテロウイルスの核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、ヒトライノウイルス/エンテロウイルスの5’UTR領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、5’AmMC6/GAAACACGGACACCCAAAGTAGT（配列番号：13；フォワードプライマー；F）及びACTCACTATAGGAGCCTGCGTGGCKGCC（配列番号：29；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、ボルデテラ・ペルツシスの核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、ボルデテラ・ペルツシスの挿入エレメント（IS）481のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、CCGGCCGGATGAACACCCATAAGCA（配列番号：14；フォワードプライマー；F）及び5’AmMC6/GGGCCGCTTCAGGCACACAAACTTG（配列番号：30；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、クラミドフィラ・ニューモニアエの核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、クラミドフィラ・ニューモニアエの主要外膜タンパク質をコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、CATGAATGGCAAGTAGGAGCCTCTC（配列番号：15；フォワードプライマー；F）及び5’AmMC6/AGTTTTGGCTGAGCAATGCGGATGT（配列番号：31；リバースプライマー；R）を含む。
ある実施態様では、プライマー対は、マイコプラズマ・ニューモニアエの核酸のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、マイコプラズマ・ニューモニアエのP1サイトアドヘシンをコードする遺伝子のある領域を増幅するように設計できる。ある実施態様では、プライマー対は、GAACCGAAGCGGCTTTGACCGCATC（配列番号：16；フォワードプライマー；F）及び5’AmMC6/GCGTGGGCGTTTGCGGGTTTAACTT（配列番号：32；リバースプライマー；R）を含む。
本開示はコントロール配列の増幅を教示する。ある実施態様では、該コントロール配列は、生物学的サンプルが得られた対象体のゲノムのある領域を含むことができる。しかしながら、本明細書に開示する方法は、これら特有のコントロール配列に全く制限されず、当業者に明白な他のコントロール配列もまた意図され、前記には呼吸器病原体のゲノムに由来する配列を含む人工的に作製された核酸構築物が含まれる。さらに、本明細書に開示する方法はまたコントロール配列を増幅せずに実施することができる。コントロール配列の増幅が実施される場合、本明細書では生成されるアンプリコンもまた“コントロールアンプリコン”と称される。
ある実施態様では、プライマー対は、MYL3遺伝子のある領域を増幅するように設計される。例えば、プライマー対は、GCACCCAGACAATACACACAGGTGT（配列番号：33；フォワードプライマー；F）及び5’AmMC6/GGCGGAAGTCAGCATGTGTCTG（配列番号：34；リバースプライマー；R）を含むことができる。
ある実施態様では、コントロール配列は、無傷のRNAがサンプルから首尾よく単離されてあることを確認するための遺伝子配列を含む。例えば、プライマー対は、マトリックスMS-2遺伝子のある領域を増幅するように設計される。ある実施態様では、プライマー対は、GCACGCTCCTGCTACAGCCTCTTCC（配列番号：35；フォワードプライマー；F）及び5’AmMC6/CTTTTGCAGGACTTCGGTCGACGCC（配列番号：36；リバースプライマー；R）を含む。
他のプライマー対及びプローブは表8に列挙されている（配列番号：74から126）。
単離されたDNAは、当業者に公知の任意のDNA増幅プロトコルを用いて増幅させることができる。本明細書に開示の方法を全く制限しない一連の例示的DNA増幅方法は以下に提示されている：“DNA Amplification: Current Technologies and Applications”（Demidov and Broude Eds. (2004) Horizon Bioscience）。単離RNAは当業者に公知の任意のRNA方法を用いて増幅させることができ、多数のRNA増幅技術が開発されている。これらのうちの2つの主要なカテゴリーは以下のとおりである：（i）温度サイクリングを利用するもの、例えばRT-PCR及び（ii）等温アッセイ、例えば核酸配列依存増幅（NASBA）（Compton (1991) Nature 350:91-92；Kievits et al. (1991) J Virol. Methods 35:273-286）、及び転写媒介増幅（TMA）（Hill (1996) J. Clin. Ligand Assay 7P:43-51）。等温アッセイは以下を基準にしてさらに分類することができる：（i）それらは標的配列を複写及び増幅させるか、例えばTMA、NASBA及び自己存続性配列複製（3SR）（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl Acad. ScI USA 57:1874-1878；Chadwick et al. (1998) J. Virol. Methods 70:59-70；概説には以下を参照されたい：Chan and Fox (1999) Rev. Med. Microbiol. 70:185-196）、又は（ii）それらは、さらに増幅可能な標的依存シグナルを発生させるか、例えばインベーダーアッセイ（Lyamichev et al. (1999) Nat. Biotechnol. 77:292-296；Ryan et al. (1999) MoI. Diagn. 4:135- 144）。しかしながら、本明細書に開示する方法はまた、当業者に周知の任意のRNA増幅方法も意図することは理解されよう。さらにまた、本明細書に開示する方法はまた、逆転写酵素又はその機能的等価物を使用してRNAをDNAに変換する（前記DNAを続いて増幅することができる）ことを意図することも理解されよう。
本明細書で教示する方法では、プライマー対の少なくとも一方のメンバーは検出可能な標識を含み、前記は本明細書では“第一の検出可能な標識”又は“第一の光学的に検出可能な標識”と称され、蛍光、燐光及び／又は白熱光を放出する分子、原子又はイオンを含む（ただしこれらに限定されない）。
ある実施態様では、第一の光学的に検出可能な標識は“蛍光マーカー”又は“蛍光”である。多くの種々の蛍光マーカーが当業者に良く知られてあり、その選択は本明細書で開示する方法に一切の制限を加えない。例示的蛍光マーカーは、以下の群から選択される光源を用いて励起できる任意の蛍光マーカーを含む：
（i）アルゴンイオンレーザー：青色の488ランラインを含み、緑から赤の領域で蛍光を発する多くの染料及び蛍光色素の励起に適切である。一連の波長（458nm、488nm、496nm、515nm及び他の波長）でレーザーを放出する同調性アルゴンレーザーもまた利用できる。
（ii）ダイオードレーザー：635nmの発光波長を有する。現在利用可能な他のダイオードレーザーは532nmで作動する。興味深いことには、この波長はヨウ化プロピオジウム（PI）を最適に励起する。PI染色は、DNA分析、生/死計測、及び倍数性決定のために広範囲に用いられる。476nm周辺の光を放出する青色ダイオードレーザーもまた利用できる。
（iii）HeNeガスレーザー：赤色633nmラインにより作動する。
（iv）HeCdレーザー：325μmで作動する。
（v）100W水銀アークランプ：UV染料（例えばヘキスト及びDAPI）の励起のためにもっとも効率的な光源。
例示的なフルオロフォア（本明細書では蛍光色素とも称される）には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：オキシクマリン、アミノクマリン、メトキシシウマリン、カスケードブルー、ルシファーイェロー、NBD、フィコエリトリン（PE）、PerCP、アロフィコシアニン、ヘキスト33342、DAPI、SYTOXブルー、ヘキスト33258、クロモマイシンA3、ミトラマイシン、YOYO-I、SYTOX グリーン、SYTOXオレンジ、7-AAD、アクリジンオレンジ、TOTO-I、To-PRO-I、チアゾールオレンジ、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751、以下を含むAlexaFluor染料（AlexaFluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700及び-750）、以下を含むBoDipy染料（BoDipy 630/650及びBoDipy 650/665）、CY染料（特にCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5及びCy7）、6-FAM（フルオレセイン）、PE-Cy5、PE-Cy7、フルオレセインdT、ヘキサクロロフルオレセイン（Hex）、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,T-ジメトキシフルオレセイン（JOE）、以下を含むオレゴングリーン染料（488-X及び514）、以下を含むローダミン染料（X-ローダミン、リサミンローダミンB、ローダミングリーン、ローダミンレッド及びROX）、TRITC、テトラメチルローダミン（TMR）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、テトラクロロフルオレセイン（TET）、レッド6B、FluorX、BODIPY-FL及びテキサスレッド。いくつかの実施態様では、第一の検出可能標識はAlexaFluor-647である。
ある実施態様では、第一のプライマー対の少なくとも一方のメンバーは検出可能標識で標識され、さらに第二のプライマー対の少なくとも一方のメンバーは、異なる検出可能標識で標識され、したがって複数のアンプリコンセット内で複数のアンプリコンを弁別することを可能にする。
プライマー対の少なくとも一方のメンバーは、当業者に公知の任意の便利な手段を用いて標識できる。例示的な方法には合成前及び合成後の方法の両方が含まれる。合成前標識方法にはPCRプライマーの標識が含まれ、前記は、続いてPCRを介してアンプリコンの増幅に用いられ、したがってアンプリコンに取り込まれる。この方法では、典型的には標識は、アンプリコンの増幅に適切なプライマーの5’末端に結合されるが、ただしプライマー内の他の位置での標識（例えば3’標識又は非末端標識）もまた意図される。
化学的リンカーもまた標識と標識されるプライマーとの間で用いることができる。例示的リンカー配列は当業者には容易に確認され、おそらくC6、C7及びC12アミノ改変リンカー及びチオール基を含むリンカーが含まれる。容易に確認されるように、プライマーは、リンカー及び標識又はリンカーのみ（標識は後の段階で前記リンカーに結合できる）を含むことができる。
本明細書で教示する方法は、2つ以上のビーズサブセットを有するその能力のために複数の呼吸器病原体についてサンプルをスクリーニングするときに有用である。各サブセットのビーズは、ビーズサイズ及び場合によってビーズ上に固定された検出可能な標識の強度を基準として、別のサブセットのビーズと物理化学的に区別することができる。したがっていずれのサブセット内のビーズも共通の光学的に検出可能な標識及び／又は共通のサイズを有することができる。いずれのサブセット内のビーズもまた共通のオリゴヌクレオチドプローブを有することができる。したがって、複数の呼吸器病原体を複数のビーズサブセット（本明細書ではビーズセットと称される）を用いて検出できる。
ある実施態様では、ビーズは“ミクロ粒子”を含む。当業者には明らかなように、ほぼ全ての物質を（均質でもそうでなくても）ミクロ粒子のために用いることができる。本明細書で意図されるミクロ粒子はまた2つ以上の物質を含むことができ、したがってシェル、合金又は有機物質及び／又は無機物質の混合物を含むことができる。用いることができる有用な材料には以下から成る群から選択される材料が含まれる：シリカ（例えば石英又はガラス）、ラテックス、チタニア、二酸化錫、イットリア、アルミナ、及び他の二元性金属酸化物（例えばZnO）、ペロブスキー石及び他のピエゾ電気性金属酸化物（例えばBaTiO3）、ZnS、シュクロース、アガロース及び他のポリマービーズ。いくつかの実施態様では、ミクロ粒子はシリカを含む。
本明細書で用いられる“物理化学的に区別できる”という用語は、ビーズサイズ、特有の検出可能な標識の有無、及び／又は検出可能標識の強度のいずれかで測定可能な相違を指す。
本明細書に開示する方法で使用を意図されるビーズは、任意の都合のよい規則的な又は不規則な三次元形状で製造できる。しかしながら、小さな球形又は類球形粒子を合成するのが概して実際的である。そのような球形又は類球形粒子は本明細書ではまた“ビーズ”と称される。したがって、関連する実施態様では、“ミクロ粒子”は実質的に球形若しくは類球形であるか、又は“ミクロ球”を含む。
ビーズは“ミクロ球”と称することができるが、ビーズの実際のサイズは多様な因子に左右され、さらにビーズは実際にマイクロメートル範囲の測定値を含むことがあるか、又は含まないことがある。例えば、ビーズは約300nmから約30μmの直径（又は非類球形粒子では等価の測定値）を含み、前記は以下を含む：300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、l.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、l.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm、5.0μm、5.1μm、5.2μm、5.3μm、5.4μm、5.5μm、5.6μm、5.7μm、5.8μm、5.9μm、6.0μm、6.lμm、6.2μm、6.3μm、6.4μm、6.5μm、6.6μm、6.7μm、6.8μm、6.9μm、7.0μm、7.1μm、7.2μm、7.3μm、7.4μm、7.5μm、7.6μm、7.7μm、7.8μm、7.9μm、8.0μm、8.1μm、8.2μm、8.3μm、8.4μm、8.5μm、8.6μm、8.7μm、8.8μm、8.9μm、9.0μm、9.1μm、9.2μm、9.3μm、9.4μm、9.5μm、9.6μm、9.7μm、9.8μm、9.9μm、10μm、l1μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm及び30μm。いくつかの実施態様では、ビーズは3μmから6μmの直径（又は非類球形粒子では等価の測定値）を含む。
ある実施態様では、ビーズは、ジェネラバイオシステムズ社（Genera Biosystems, Victoria, Australia）製造のアンパサンド（AmpaSand）ビーズである。しかしながら、本明細書に記載する方法は、特にこれらのビーズの使用にのみ制限されると解されるべきではない。
ビーズは、検出可能な標識の有無を基準に区別することができる。前記標識は、本明細書では“第二の検出可能な標識”又は“第二の光学的に検出可能な標識”と称され、蛍光、燐光及び／又は白熱光を放出する任意の分子、原子又はイオンが含まれる（ただし前記に限定されない）。便利な光学的に検出可能な標識には、紫外領域（波長域は約350nmから約3nm）、可視領域（波長域は約350nmから約800nm）、近赤外領域（NIR）（波長域は約800nmから約1500nm）、及び／又は赤外領域（IR）（波長域は約1500nmから約10μm）で発光するものが含まれる。しかしながら、検出の容易さから、いくつかの実施態様では、前記光学的に検出可能な標識は可視波長域で検出可能である。
該光学的に検出可能な標識は、フルオロフォア、半導体粒子、燐光粒子、ドープ浸漬粒子及びナノクリスタル又は量子ドットから成る群から選択される1つ以上の標識を含むことができる。関連する実施態様では、第二の光学的に検出可能な標識はフルオロフォアである。
当業界で利用可能な多くの蛍光色素があり、それらをフルオロフォアとして本明細書に開示する方法にしたがって用いることができる。その使用のための潜在能力を決定する、蛍光色素又は他のフルオロフォアの重要な特性はフルオロフォアの励起波長であり、前記波長は、典型的には光源の利用可能な波長と適合する。しかしながら、様々な多くの蛍光色素及び他のフルオロフォアが当業者には良く知られてあり、蛍光マーカーの選択は本明細書に記載の方法を一切制限しない。物質の標識に用いることができる特に便利な蛍光色素には、PCRアンプリコンの標識に関して上記で考察したものが含まれる。しかしながら、蛍光標識を選択するとき、ビーズに固定された蛍光標識（第二の検出可能標識）の発光スペクトルは、プライマー対の少なくとも一方のメンバーのために用いられる検出可能な標識（第一の検出可能標識）の発光スペクトルとは全く異なっているべきである。
ビーズ及びミクロ球を蛍光で標識する方法は当業者には良く知られてあり、内部染色及び外部染色（表面染色）が含まれる。前記2つの技術は、固有の特性を有するビーズを生じ、各々は異なる適用について有益である。内部染色は、典型的には狭い蛍光発光を有する極めて安定な粒子を生じる。これらの粒子はしばしば光退色に対して強い耐性を示す。フルオロフォアはビーズの内部に存在し、表面基は、リガンド（タンパク質、抗体、核酸など）とビーズ表面との結合に使用されるために利用可能であるので、内部標識ビーズは、典型的には分析物検出及び免疫アッセイでの適用で用いられる。表面標識は、フルオロフォアとビーズ表面との結合を必要とする。そのフルオロフォアはビーズ表面に存在するので、前記フルオロフォアは、まさに染色細胞上のフルオロフォアとしてそれらの周囲物と相互作用することができる。得られる結果は、多様な種々の条件（例えば夾雑物の存在又はpHの変化）の下で、染色細胞サンプルと同じ励起及び発光特性を示すビーズの標準である。表面標識ビーズの“周囲物に応答する”性質は、これらビーズを生物学的サンプルの模倣のために理想的に適合させる。外部標識は、蛍光検出を利用する多数の適用でコントロール及び標準物としてしばしば用いられる。しかしながら、本明細書に開示する方法は、任意の手段によるビーズと蛍光標識との結合を意図する。
第二の光学的に検出可能な標識はまた、標識をビーズそれ自体と直接結合させるのではなく固定されたオリゴヌクレオチドプローブに取り込ませることができる。例えば、ビーズは固定された“タグ”又はオリゴヌクレオチドプローブを含む。該タグは内部アミン（NH2）を保持でき、前記は続いて染料のスクシンイミジルエステルと結合させることによって改変される。いくつかの実施態様では、第二の検出可能標識はBoDipy-TMRである。
標識及び非標識オリゴヌクレオチドプローブ又は標識を混合し、続いてこの混合物をビーズに結合させることによって、種々のレベルの蛍光マーカー、したがって第二の検出可能標識強度を有するビーズの複数のクラスを製造することができる。
該第二の検出可能な標識をある範囲の濃度又は強度でビーズに適用し、それによって特有のビーズを“物理化学的に区別し得る”別の基準を提供することができる。例えば、特有の光学的に検出可能なシグナルの最大検出可能強度が100％であるとすると、該標識は、0％、2％、4％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の強度を与えるように一連のビーズに適用できる。
いくつかの実施態様では、該ビーズセットはビーズの6サブセットを含み、前記ビーズは直径が3.0μm、3.5μm、3.8μm、5.0μm、5.2μm及び5.7μm（又は非類球形粒子では等価の測定値）であり、ここで前記6つのビーズサブセットの各々はさらに以下を含む3つのサブセット（二次サブセット）をそれぞれ含む：1）非標識オリゴヌクレオチドプローブと結合させたビーズ（TO:FLO＝0；無TMR）、2）1：50−200の混合比の標識オリゴヌクレオチドプローブ：非標識オリゴヌクレオチドプローブと結合させたビーズ（TO:FLO＝50−200；中TMR）、及び1：1.5−2の混合比の標識オリゴヌクレオチドプローブ：非標識オリゴヌクレオチドプローブと結合させたビーズ（TO:FLO＝1.5−2；高TMR）。
ビーズに“固定された”オリゴヌクレオチドプローブと言えば、オリゴヌクレオチドがビーズと結合しているか、或いはビーズと会合していることを指す。オリゴヌクレオチドは、当業者に公知の任意の便利な手段によってビーズと結合させ得るか、或いは会合させ得る。例えば、オリゴヌクレオチドプローブはビーズ製造中にビーズ内に被包化させるか、又は製造後にビーズ表面に結合させることができる。オリゴヌクレオチドプローブをビーズに会合させるために用いられる方法は、使用される材料に左右され、前記は当業者には容易に確認されよう。さらにまた、オリゴヌクレオチドプローブの結合前に、さらに別の処理（シラン化（シランによる物質のコーティング）を含む）を実施して、プローブのビーズへの結合を高めることができる。
ビーズは、当該ビーズ表面と共有結合（或いは吸着）する任意の化合物で被覆することができ、さらにオリゴヌクレオチドプローブもまたオリゴヌクレオチドプローブ結合用化学成分（例えばチオール、アミン又はカルボキシル基）を有することができよう。これらの特徴を有する化合物の例には、アミノ末端を有するシラン、例えばアミノ-プロピルトリメトキシシラン又はアミノ-プロピルトリエトキシシランが含まれる。シランの他に、ガラス表面と非共有結合し、さらにポリヌクレオチドのリン酸基に静電気的に吸着する化合物、例えばポリ-L-リジンもまた本明細書に開示する方法の範囲内である。したがって、他の化合物（オリゴヌクレオチドプローブとビーズ表面との結合に適切な他のシランを含む）も当業者には容易に認定され、本明細書に開示する方法はこれら化合物の選択により制限を受けることはない。
例えば、オリゴヌクレオチドプローブは物理的吸着又は化学的結合によってビーズと結合できる。さらにまた、ビーズは、オリゴヌクレオチドプローブとビーズ表面との吸着若しくは結合を促進又は高める薬剤（例えばアミノ-シラン）でさらに被覆することができる。しかしながら、前記機能を発揮する他の薬剤も当業者には容易に認定されよう。
例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、ユニバーサルアンカリングシステム（Universal Anchoring System（UAS））（Genera Biosystems, Victoria, Australia）によりビーズに結合させることができる。簡単に記せば、この系は、基質上の核酸“タグ”配列と標的配列をつなぎ合わせるために“架橋”核酸分子の使用を含む。前記“架橋”配列は、該タグ配列と部分的に相補性で、かつ該標的配列と部分的に相補性であり、したがって架橋配列はタグ及び標的配列の両方と結合し、リガーゼがタグ及び標的配列を連結させ得る配置でそれらを保持することができる。UASはまた市場で入手できる。しかしながら、本明細書に開示する方法は、核酸分子と基質とを結合させるこの特有の方法にのみ制限されると解されるべきではない。
結合がアンプリコンとオリゴヌクレオチドプローブとの間で生じたか否かの決定は、物理化学的に区別可能なビーズに固定されたオリゴヌクレオチドプローブと結合した標識アンプリコンの位置決定を可能にする、当業者に公知の任意の方法論を用いて実施できる。ある実施態様では、フローサイトメトリーが用いられる。しかしながら、本明細書に開示する方法は、特有のフローサイトメトリー方法又は装置に全く制限されるものではない。
フローサイトメトリーを用いれば、与えられたビーズのサイズを目的物の光分散によって決定できる。例えば、フローサイトメトリーを用いて、直径が約3.0μm、3.5μm、3.8μm、5.0μm、5.2μm及び5.7μm（又は非類球形粒子では等価の測定値）のビーズを区別することができる。
サイズの検出の他に、フローサイトメトリーは、典型的には蛍光検出のために1つ以上のレーザー及び検出装置を備える。本明細書に記載するように、フローサイトメトリーに有用な多くのフルオロフォアが存在する。フローサイトメトリーアッセイで使用する上でその潜在能力を決定するフルオロフォアの重要な特性は励起波長である。すなわち、励起波長は光源の利用可能な波長と適合しなければならない。フローサイトメトリーはまた、蛍光強度（すなわち第二の検出可能標識の強度）を基準にしてビーズサブセットを区別するために用いることができる。例えば、本発明者らは、フローサイトメトリーは、無TMR、中TMR及び高TMRと等価のレベルの第二の光学的に検出可能な標識で標識されたビーズを区別できると決定した。
別の特徴では、複数の呼吸器病原体についてサンプルをスクリーニングし特有の病原体を検出するビーズセットが提供され、ここで前記ビーズセットは複数のビーズサブセットを含み、
（a）各サブセットのビーズはサイズに関して均質であり、
（b）各サブセット内のビーズは、呼吸器病原体のゲノムの分析物特異的領域と結合することができる核酸オリゴヌクレオチドプローブと連結され、さらに
（c）場合によって、ビーズセットは検出可能標識で標識されたビーズサブセットを含み、各ビーズサブセットは異なる検出可能標識強度を有して該検出可能標識の強度を基準に不均質なビーズ混合物を生じ、
ここで、該ビーズサブセットの正体、したがって呼吸器病原体の型及び／又は株は、ビーズのサイズ及び／又は検出可能標識の強度を基準にして同定することができる。
該ビーズセットは、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20以上のビーズサブセットを含み、各サブセットは、プライマー対による増幅後に生成されるアンプリコンのある領域と相補性であるオリゴヌクレオチドプローブを含む。ある実施態様では、該オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号：37から54から成る群から選択される核酸を含む。これらの配列特異的オリゴヌクレオチドプローブというときは、これら配列に対して少なくとも90％同一性を有するか、又は低ストリンジェンシー条件下で前記若しくは前記の相補形とハイブリダイズできる核酸分子を含む。少なくとも90％というときは、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99及び100％を含む。
ビーズセット中のビーズサブセットの数は、典型的にはスクリーニングされるべき分析物（すなわち呼吸器病原体の型及び／又は株）の数と一致するであろう。ビーズセットはまた、本明細書に記載するように、コントロール配列検出用の1つ以上の追加のサブセットを含むことができる。
“オリゴヌクレオチドプローブ”という用語は、ビーズに固定された（すなわちビーズに結合或いは密接に関係させた）ポリヌクレオチドを指すために本明細書では用いられる。各オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書に記載する方法にしたがって生成されるアンプリコンのある領域と相補的な配列を含むポリヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドプローブはまた、本明細書に記載するように、コントロール配列と相補的な配列を含むことができる。
したがって、オリゴヌクレオチドプローブのビーズセットは以下を含むことができる：
［B1-CX1, B2-CX2, B3-cX3, Bn-cXn, By-cY, Bz-cZ］
式中、
B1、Bn、By、Bzは各々物理化学的に区別できるビーズであり；
cXnはビーズに固定されたポリヌクレオチドであり、ここで前記ポリヌクレオチドは、呼吸器病原体の特有の型及び／又は株に特異的な特有の核酸配列（すなわち型及び／又は株特異的配列）に相補的なヌクレオチド配列を含み；
nは、該ビーズを用いて検出されるべき呼吸器病原体の数又は対象病原体の特有の株の数であり；
cYは、ビーズセットの随意メンバーで、ビーズに固定されるポリヌクレオチドであり、ここで前記ポリヌクレオチドは、病原体間で又は病原体の株間で保存されている配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；
cZは、ビーズセットの随意メンバーで、ビーズに固定されるポリヌクレオチドであり、ここで前記ポリヌクレオチドは、多細胞性対象体から増幅されるコントロール配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、該コントロール配列はヒトゲノムDNA配列である。いくつかの実施態様では、該コントロール配列はヒトMYL3遺伝子に由来する。
該オリゴヌクレオチドプローブは、ビーズ製造中にビーズと結合或いは密接に関係させるか、又は製造後にビーズ表面に結合させることができる。該ポリヌクレオチドをビーズと密接に関係させるために用いられる選択方法は使用材料に左右され、前記は当業者には容易に確認されよう。さらにまた、オリゴヌクレオチドプローブの結合前に、さらに別の処理（シラン化（シランによる物質のコーティング）を含む）を実施して、前記ポリヌクレオチドのビーズへの結合を高めることができる。
本明細書で用いられるように、“〜と結合或いは密接に関係させる”という語句は、分子をビーズと密接に関係させることができる任意のプロセスを指す。そのような密接な関係を媒介することができる例示的態様には、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン結合、金属結合、極性結合及び提供（共有）結合などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
オリゴヌクレオチドプローブを含む分子はまた、該オリゴヌクレオチドプローブとビーズ表面との吸着又は結合を促進若しくは増強させる薬剤（そのような薬剤は本明細書では“リンカー”と称される）を介して、ミクロ類球形粒子と結合させることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、チオール、アミン又はカルボキシル基を含むリンカーを介してミクロ類球形粒子に密接に関係させることができる。適切なリンカーの例には末端にアミノを有するシラン、例えばアミノ-プロピルトリメトキシシラン又はアミノ-プロピルトリエトキシシランが含まれる。シランの他に、表面（例えばガラス）と非共有結合し、さらにポリヌクレオチドのリン酸基に静電気的に吸着する化合物、例えばポリ-L-リジンもまた想定される。したがって、他の分子（オリゴヌクレオチドプローブとビーズ表面との結合又は密接な関係の促進に適切な他のシランを含む）も当業者には容易に認定され、本明細書に開示する方法はリンカーの選択により制限を受けることはない。
“相補的な”という用語によって、当該オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書に記載の方法にしたがって生成されたアンプリコンと低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするはずであるということが理解されよう。好ましくは、該固定オリゴヌクレオチドプローブは、中ストリンジェンシー条件下で当該アンプリコンとハイブリダイズするはずであり、もっとも好ましくは、該固定オリゴヌクレオチドプローブは、高ストリンジェンシー条件下で当該アンプリコンとハイブリダイズするはずである。
プライマー対が配列番号：1及び17である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCAGTCTCTGCGCGATCTCGGCTTTGAG（配列番号：37）である。
プライマー対が配列番号：2及び18である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGGTGTTTTCACCCATATTGGGCAATT（配列番号：38）である。
プライマー対が配列番号：3及び19である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCCATGCTGCCGTTACACCTTTGTTCG（配列番号：39）である。
プライマー対が配列番号：4及び20である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCCCGAGGAGCCAT CCAGCTACACTAC（配列番号：40）である。
プライマー対が配列番号：5及び21である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGTTCTATAAGCTGGTATTGATGCAGG（配列番号：41）である。
プライマー対が配列番号：6及び22である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCCCTATATCTGCACATCCTTGAGTGATT（配列番号：42）である。
プライマー対が配列番号：7及び23である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCACCCCTGTGATGCAATTAGCAGGGCA（配列番号：43）である。
プライマー対が配列番号：8及び24である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCAGCACATTATGCCATGTCCATTTTATCC（配列番号：44）である。
プライマー対が配列番号：9及び25である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGGTTCCAGAYAAWATGGGTCTTGCTA（配列番号：45）である。
プライマー対が配列番号：10及び26である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTTGCCCCGYACTTCATATTTGCA（配列番号：46）である。
プライマー対が配列番号：11及び27である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGT（配列番号：47）である。
プライマー対が配列番号：12及び28である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTAC（配列番号：48）である。
プライマー対が配列番号：13及び29である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTCCTCCGGCCCCTGAATGYGGCTAA（配列番号：49）である。
プライマー対が配列番号：14及び30である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTGCCCGATTGACCTTCCTACGTCGA（配列番号：50）である。
プライマー対が配列番号：15及び31である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCTGGTCTCGAGCAACTTTTGATGCTG（配列番号：51）である。
プライマー対が配列番号：16及び32である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGGGCGCGCCTTATACGACCTCGATT（配列番号：52）である。
プライマー対が配列番号：33及び34である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGCTATGGACCAAACACAGACACAGAGAGACCCACAGACA（配列番号：53）である。
プライマー対が配列番号：35及び36である実施態様では、相補性オリゴヌクレオチドプローブは、5’ThioMC6-D/AAT/iAmMC6T/GAATTCGGATCCGAAGTGCCGCAGAACGTTGCGAACC（配列番号：54）である。
ある実施態様では、プライマー対及び対応するプローブは表8に列挙されたものから選択される（配列番号：74から126）。ある実施態様では、2つ以上のプライマー対及び対応するプローブが選択される。“2つ以上”とは約2から約18、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17又は18を含む。
低、中及び高ストリンジェンシー条件は当業者には公知であろう。例えば、低ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションのために少なくとも約0から少なくとも約15％v/vのホルムアミド（1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％及び14％v/vホルムアミドを含む）及び少なくとも約1Mから少なくとも約2Mの塩、並びに洗浄条件のために少なくとも約1Mから少なくとも約2Mの塩を含む。中ストリンジェンシーは、例えば、ハイブリダイゼーションのために少なくとも約16％v/vから少なくとも約30％v/vのホルムアミド（16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、24％、26％、27％、28％、29％及び30％v/vホルムアミドを含む）及び少なくとも約0.5Mから少なくとも約0.9Mの塩、並びに洗浄条件のために少なくとも約0.5Mから少なくとも約0.9Mの塩を含む。高ストリンジェンシーは、例えば、ハイブリダイゼーションのために少なくとも約31％v/vから少なくとも約50％v/vのホルムアミド及び少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mの塩、並びに洗浄条件のために少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mの塩を含む。ハイブリダイゼーション及び洗浄工程の温度は変更することができ、ホルムアミドの代わりに、及び／又はまた別のストリンジェンシーを提供するためにより高い温度を用いることができる。
ある実施態様では、ビーズサブセットのオリゴヌクレオチドプローブは第二の検出可能な標識で標識され、本明細書に開示の方法が、複数の呼吸器病原体又はあるクラスの呼吸器病原体の複数のメンバーを弁別することを可能にする。例えば標識の対応する蛍光波長を基準にして、第一の検出可能標識と容易に弁別できる第二の検出可能標識を用いるのが一般的に便利である。
オリゴヌクレオチドプローブは、株特異的アンプリコンの標識に関して上記で例示したものを含む、任意の便利な手段を用い本明細書に記載の検出可能標識で標識できる。例えば、化学的リンカーを標識と標識されるオリゴヌクレオチドプローブとの間で用いることができる。当業者は例示的リンカー配列を容易に確かめることができ、前記にはおそらくC6、C7及びC12アミノ改変体のようなリンカー及びチオール基を含むリンカーが含まれる。容易に確認されるところであるが、プライマーは、リンカー及び標識又はリンカーのみ（標識は後の段階で前記リンカーに結合できる）を含むことができる。いくつかの実施態様では、リンカーはC6アミノ酸改変である。
ある実施態様では、用いられる標識は、以下から成る群から選択されるフルオロフォア（本明細書では蛍光色素とも称される）である：オキシクマリン、アミノクマリン、メトキシシウマリン、カスケードブルー、ルシファーイェロー、NBD、フィコエリトリン（PE）、PerCP、アロフィコシアニン、ヘキスト33342、DAPI、SYTOXブルー、ヘキスト33258、クロモマイシンA3、ミトラマイシン、YOYO-I、SYTOX グリーン、SYTOXオレンジ、7-AAD、アクリジンオレンジ、TOTO-I、To-PRO-I、チアゾールオレンジ、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751、以下を含むAlexaFluor（AlexaFluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700及び-750）、以下を含むBoDipy染料（BoDipy 630/650及びBoDipy 650/665及びBoDipy-TMR）、CY染料（特にCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5及びCy7）、6-FAM（フルオレセイン）、PE-Cy5、PE-Cy7、フルオレセインdT、ヘキサクロロフルオレセイン（Hex）、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,T-ジメトキシフルオレセイン（JOE）、以下を含むオレゴングリーン染料（488-X及び514）、以下を含むローダミン染料（X-ローダミン、リサミンローダミンB、ローダミングリーン、ローダミンレッド及びROX）、TRITC、テトラメチルローダミン（TMR）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、テトラクロロフルオレセイン（TET）、レッド6B、FluorX、BODIPY-FL及びテキサスレッド。いくつかの実施態様では、第二の検出可能標識はBoDipy-TMRである。
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、さらにビーズセット内の複数のビーズ間の弁別を可能にする2つ以上の検出可能な標識で標識される。
ある実施態様では、ビーズと結合或いは密接に関係する標識オリゴヌクレオチドプローブの量を制御して、上記に記載したように、第二の検出可能標識の予め決定した又は必要とされる強度を有するビーズを製造することができる。そのような方法は当業者には公知である。例えば、標識及び非標識オリゴヌクレオチドプローブの混合物をビーズと接触させることができ、ここで、標識及び非標識オリゴヌクレオチドプローブの比は、ビーズセット内のビーズに結合或いは密接に関係する標識オリゴヌクレオチドプローブの量、したがって各ビーズ上の第二の検出可能標識の強度を指定する。標識及び非標識オリゴヌクレオチドプローブの混合物は、例えば下記に示す2つの連続式を用いて調製できる：
1）H＝G*C*((E/D)−1)/F
式中、
H＝必要な非標識オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドプローブ）ストックの体積（μL）、G＝必要な標識オリゴヌクレオチドの体積（μL）、C＝標識オリゴヌクレオチドの濃度、E＝所望されるTO:FLO比、D＝標識オリゴヌクレオチドストックのTO:FLO比、F＝非標識オリゴヌクレオチドストックの濃度；
2）水（μL）＝(0.01*((G*C)＋(H*F)))−(G＋H)
式中、
G＝必要な標識オリゴヌクレオチドの体積（μL）、C＝標識オリゴヌクレオチドの濃度、H＝必要な非標識オリゴヌクレオチドストックの体積（μL）[1）から誘導]、F＝非標識オリゴヌクレオチドストックの濃度。
したがって、ビーズセットのビーズ、B1・・・Bn、By、Bzは物理化学的に区別できるビーズである。“物理化学的に区別できる”という用語は、1つのビーズ（例えばB1）を別のビーズ（例えばB2）と弁別することを可能にする任意の物理的又は化学的特徴を指す。したがって、物理化学的に区別可能なビーズは、複数の呼吸器病原体又はその株の弁別を可能にする。本明細書に開示の方法にしたがえば、ビーズセットのビーズは、サイズ及び／又は第二の検出可能標識の強度を基準にして区別することができる。いくつかの実施態様では、“物理化学的に区別できる”という用語は、ビーズサイズ、特有の光学的に検出可能な標識の有無及び／又は光学的に検出可能な標識の強度のいずれかにおいて測定可能な相違を指す。
ある実施態様では、ビーズセット内のビーズは、サイズ、第二の検出可能標識の強度レベル、フルオロフォアのタイプ及びビーズに固定されたオリゴヌクレオチドプローブの配列を基準にして区別することができる。
本開示はさらに、本明細書に開示する方法にしたがって使用される診断キットを教示する。前記使用には、ヒト対象体の呼吸器感染症の診断、サンプルにおける呼吸器病原体の存在の決定及び／又は呼吸器感染症を進行させるヒト対象体のリスクの判定が含まれる。
ある実施態様では、キットはビーズサブセットを含むビーズセットを含み、ここで各サブセット内のビーズは、物理化学的に区別できるビーズサブセットのビーズに固定されたオリゴヌクレオチドプローブを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは呼吸器病原体のヌクレオチド配列に相補性である。場合によって、該キットは、呼吸器病原体の種々の株間で保存された配列と結合することができるプライマー対を含み、呼吸器病原体の特有の株に対して別個のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成し、生成アンプリコンは、該キットのビーズに固定されたオリゴヌクレオチドプローブと相補性であると推定される。
ある実施態様では、キットは、配列番号：1から16及び配列番号：33及び35から選択されるフォワードプライマー並びに配列番号：17から32及び配列番号：34及び36から選択される対応するリバースプライマーを含む少なくとも2つのプライマー対、並びに配列番号：37から54から選択される少なくとも2つの相補性オリゴヌクレオチドプローブを含む。
本明細書はさらに本明細書に開示の方法によって検出される分析物を提供する。
さらにまた本明細書で与えられるものは、本明細書に開示の方法で使用することができる標識又は標識前ビーズを含むキットである。ある実施態様では、配列番号：1及び17、2及び18、3及び19、4及び20、5及び21、6及び22、7及び23、8及び24、9及び25、10及び26、11及び27、12及び28、13及び29、14及び30、15及び31並びに16及び32から選択される、2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、並びに配列番号：37から52から選択される対応するプローブをそれぞれ含むキットが本明細書で教示される。ある実施態様では、表8に列挙した2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対及び対応するプライマープローブ（配列番号：74から126）を含むキットが本明細書で教示される。“2つ以上”又は“少なくとも2つ”とは、2から約18（2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17又は18を含む）を含む。
本明細書に教示の特徴を以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
プライマーの設計
多重プライマー設計に関する一般的な配慮には以下が含まれる：
−可能ならば、コンピュータシステムによる融解温度（Tom）は58℃を超えない；
−可能ならば、％GC含量は40−65％である；
−3つを超えて連続するG又はCを避ける；
−アンプリコンの長さは最小にする（可能ならば150bp未満）。
RNA標的の場合には、AlexaFluor-標識（5’アミノ改変）プライマーを、RT-PCR中にRNA鋳型からcDNA合成をプライミングするために必要なプライマーとした。プローブオリゴヌクレオチドは、シリカビーズとの連結を可能にするために5’チオール（Thio）又はアクリジン（AmM）改変を用いて合成し、さらに内部アミノ改変を行い、前記プローブオリゴヌクレオチドに実施して蛍光色素（BoDipy-TMR）による標識を可能にした。増幅プライマー対（フォワード及びリバース）は、全分析株を通して高度に保存された領域で設計し、保存を最大にしかつ3’末端の縮退を最小にすることを重視した。
インフルエンザA
標的アンプリコン選択対象：セグメント7（MP）
標的遺伝子：セグメント7（MP）
分析配列数：16026
コントロール構築物：RTI-C2
コメント：ヒト由来インフルエンザAのための配列はインフルエンザプライマー設計リソース（Influenza Primer Design Resource, IPDR）から入手した。インフルエンザAマトリックスタンパク質（MP）の合計16026の配列を用いてコンセンサス配列を作製し、続いて前記を用いて、Vector NTIのコンセンサス配列ファイルを作成した。プライマーは、全株を通して高度に保存された領域で設計し、保存を最大にしかつ3’末端の縮退を最小にすることを重視した。
プライマー/プローブ1：その後使用せず
Figure 2015506666
プライマー/プローブ１を用いる標的増幅の効率は実際の診断目的には高すぎると思われた。インフルエンザAインプット鋳型を欠くサンプルで陽性InfAシグナルが散発的に観察されることが、反復試験によって確認された。これら偽陽性の変則性により、作業場環境の小量のインフルエンザAによるスポット汚染がおそらくその原因であると認められた。その結果、アンプリコンの長さが増加しさらに増幅効率が低下するように、フォワードプライマーを再設計（alt Am-InfA F）した（下記のプライマー/プローブ2を参照されたい）。
プライマー/プローブ2：その後使用せず
Figure 2015506666
alt Am-InfA F（プライマー/プローブ2）の使用は、高度に鋭敏なインフルエンザA標的DNA検出をもたらした。しかしながら、偽陽性結果がこれらの増幅条件下で発生し続けた。その結果、インフルエンザAを増幅させるまた別のプライマー/プローブセットを設計し合成した（下記プライマー/プローブ3）。
プライマー/プローブ3：
Figure 2015506666
インフルエンザAプライマー/プローブ3のタイトレーションにより、400コピーの合成インフルエンザA構築物の検出、さらに100コピーの検出すら可能にする増幅/標識条件が得られた。さらにまた、独立した3実験（合計して26の指定の水コントロール及び23の指定のHeLa/MS2コントロールを含む）で偽陽性は観察されなかった。さらにまた、これらのプライマーは、これらの条件下でInfA/H1N1についてHealthScope陽性コントロールを効率的に検出することが示された。
インフルエンザB
標的アンプリコン選択対象：セグメント1（PB2）及びセグメント4（HA）
標的遺伝子：セグメント4（HA）
分析配列数：2980
コントロール構築物：RTI-C3
プライマー/プローブ1：その後使用せず
Figure 2015506666
多重シナリオの関係で、一般的にインフルエンザBコントロール構築物及び確認されているインフルエンザB陽性臨床標本の検出は低かった。一次増幅は効率的であるように見えたが（PCR生成物のゲル電気泳動後のバンド強度によって判定）、ラムダエキソヌクレアーゼ消化に続くハイブリダイゼーションを介するか、又は固相増幅方法を介するビーズへのローディングは非常に貧弱なようであった。したがって、新たなプライマー/プローブセットを設計して、また別のプローブ配列の利用を可能にした（下記のプライマー/プローブ2を参照されたい）。
プライマー/プローブ2：
Figure 2015506666
インフルエンザA（H1N1 2009）
標的アンプリコン選択対象：セグメント4（HA）
標的遺伝子：インフルエンザの2009H1N1流行株のセグメント4（HA）
分析配列数：4839
コントロール構築物：RTI-C4
コメント：他のブタ（及びヒト）HIサブタイプウイルスから2009年流行ブタ流感を区別するために前記選択プライマー/プローブを設計した。
Figure 2015506666
インフルエンザA（H5N1）
標的アンプリコン選択対象：セグメント4（HA）
標的遺伝子：インフルエンザのH5N1流行株のセグメント4（HA）
分析配列数：2757
コントロール構築物：RTI-C5
Figure 2015506666
呼吸器合胞体ウイルス（A及びB型）
標的アンプリコン選択対象：ポリメラーゼ；糖タンパク質/融合物；核タンパク質
標的遺伝子：ポリメラーゼ遺伝子
分析配列数：14
コントロール構築物：RTI-C18及びRTI-C19
コメント：高度に保存された核タンパク質及びポリメラーゼ遺伝子はRSV-A及びRSV-Bの両方の検出に最適である。しかしながら、核タンパク質遺伝子を標的とする最初のプライマー（プライマー/プローブ1）を用いる効率の悪い増幅（コントロール構築物RTI-C6及びRTI-C7）は、ポリメラーゼ遺伝子を標的とするプライマー/プローブの再設計につながった（コントロール構築物RTI-C18及びRTI-C19；下記プライマー/プローブ2を参照されたい）。
プライマー/プローブ1：核タンパク質−その後使用せず
Figure 2015506666
プライマー/プローブ2：ポリメラーゼ
Figure 2015506666
ヒトパラインフルエンザウイルス1型（HPIV-1）
標的アンプリコン選択対象：HN
標的遺伝子：HN
分析配列数：30
コントロール構築物：RTI-C8
コメント：下記のプライマー/プローブ1配列を用いる合成鋳型の一次増幅生成は極めて効率的であるように見えたが（ゲル電気泳動により判定）、ビーズへのローディング、したがって固相検出は低かった。したがって、また別のプライマー/プローブセットを設計し合成した（プライマー/プローブ2）。プライマー濃度を最適化した後、この新規なプライマー/プローブセットを用いても固相の検出感度は劇的には強化されなかった。しかしながら、プライマー/プローブ2は、この2つのプライマーセットの直接的配列比較の後で最終的に用いられ、プライマー/プローブ2は分析したHNデータベース配列をおそらくより高い割合で検出し得ることを示した。
プライマー/プローブ1：その後使用せず
Figure 2015506666
プライマー/プローブ2：
Figure 2015506666
ヒトパラインフルエンザウイルス2型（HPIV-2）
標的アンプリコン選択対象：HN
標的遺伝子：HN
分析配列数：13
コントロール構築物：RTI-C9
コメント：合計18配列をEMBL-EBIソフトウェアを用いてアラインメントし、13/18配列についてデータが存在する高度に保存された領域を同定した。得られたコンセンサス配列から、以下のプライマー/プローブ配列を同定した。
Figure 2015506666
ヒトパラインフルエンザウイルス3型（HPIV-3）
標的アンプリコン選択対象：HN
標的遺伝子：HN
分析配列数：5つの完全なゲノム配列及び18のHN配列
コントロール構築物：RTI-C10
Figure 2015506666
ヒトパラインフルエンザウイルス4型（HPIV-4）
標的アンプリコン選択対象：リンタンパク質（P）遺伝子
標的遺伝子：P遺伝子
分析配列数：40
コントロール構築物：RTI-C11
コメント：EMBL-EBIソフトウェアを用いた、4a（22）及び4b（18）リンタンパク質遺伝子の40配列とNCBIデータベースのただ1つの完全なゲノム配列（HPIV 4b；アクセッション番号EU627591）とのアラインメントは、プライマー/プローブの設計に用いることができるコンセンサス配列をもたらした。
Figure 2015506666
*EU627591による
ヒトメタニューモウイルス（hMPV）
標的アンプリコン選択対象：核タンパク質（N）、マトリックス（M）
標的遺伝子：マトリックスのM2領域
分析配列数：74
コントロール構築物：RTI-C12
コメント：EMBL-EBIソフトウェアを用い、12の完全なゲノム配列のアラインメントからM2遺伝子のコンセンサス配列をまず初めに作製し、前記からプライマー/プローブを設計した。続いてこれらのプライマーを、マトリックスのコンティーグ4及び全てのhMPVマトリックス配列をhMPVリファレンス配列（NC_004148）とともにアッセンブルしたNC_004148アッセンブリーに対してチェックした。
Figure 2015506666
アデノウイルス（B、C及びE型）（AdV）
標的アンプリコン選択対象：ヘキソン
標的遺伝子：ヘキソン
分析配列数：247のヘキソン配列及び15の完全なゲノム配列
コントロール構築物：RTI-C13
Figure 2015506666
*ベクターNTIで計算
ライノウイルス/エンテロウイルス（RhV）
標的アンプリコン選択対象：5’UTR（非翻訳領域）
標的遺伝子：5’UTR
分析配列数：962の5’UTR配列及び138の完全なゲノム配列
コントロール構築物：RTI-C14
Figure 2015506666
ボルデテラ・ペルツシス（Bper）
標的アンプリコン選択対象：IS481；ptx
標的遺伝子：セグメント4（HA）
分析配列数：2980
コントロール構築物：RTI-C15
Figure 2015506666
クラミドフィラ・ニューモニアエ（Cpn）
標的アンプリコン選択対象：MOMP
標的遺伝子：MOMP
分析配列数：19
コントロール構築物：RTI-C16
コメント：プライマー/プローブは主要外膜タンパク質（MOMP）の高度に保存された領域内に位置していた。
Figure 2015506666
マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mpneu）
標的アンプリコン選択対象：P1サイトアドヘシン、16s rRNA及びATPase
標的遺伝子：P1サイトアドヘシン
分析配列数：212
コントロール構築物：RTI-C17
コメント：コンセンサスは、最終的にP1サイトアドヘシン遺伝子の高度に保存された領域に由来する5つの配列から得られた。
Figure 2015506666
MS-2ファージ（MS-2）
標的アンプリコン選択対象：マトリックス
標的遺伝子：マトリックス
分析配列数：2つの完全なゲノム
コントロール構築物：RTI-C1
コメント：MS-2コントロールを用いて、推奨核酸精製方法により無傷のRNAが上手く抽出されたことが確認された。この核酸抽出/精製方法の溶解溶液の添加後直ちに精製MS2 RNAを添加した。
Figure 2015506666
ヒト
標的アンプリコン選択肢：MYL3、β-アクチン
標的遺伝子：MYL3
分析配列数：1
コントロール構築物：RNaseを含まないHeLaゲノム調製物（Qiagen）
コメント：この内部コントロールの目的は、適切な標本量及び完全性を確立することであった。MYL3遺伝子は、主として心臓組織で発現される一コピー遺伝子である。対象的に、β-アクチン遺伝子はマルチコピー及び偽遺伝子を有し、全ての組織で大量に発現される。
Figure 2015506666
*ベクターNTIで計算
非標識オリゴヌクレオチド調製
全てのオリゴヌクレオチドは、インテグレーテッドDNAテクノロジーズ社（Integrated DNA Technologies, IDT）に脱塩するように注文した。3回のエタノール沈殿の後で、IDT社提供のデータ-シートを基にして理論的濃度が約400μMを達成するようにプライマーを水に溶解した。
非標識プローブオリゴヌクレオチドはIDT社に脱塩するように注文し、3回のエタノール沈殿後に、IDT社提供のデータ-シートを基にして理論的濃度が約400μMを達成するようにプライマーを水に溶解した。非標識オリゴヌクレオチドストックは-20℃で保存した。
Bodipy-TMR及びAlexaFluor647によるオリゴヌクレオチドの標識
内部チミジンヌクレオチドのC6位でのアミン改変を用いて合成したプライマー及びプローブオリゴヌクレオチドを、0.1M炭酸緩衝液（pH9.0）の存在下で適切な染料（Invitrogen）のスクシンイミジルエステルの15倍モル過剰で一晩標識した。続いてオリゴヌクレオチドを3回のエタノール沈殿に付して未結合染料を除去し、さらに非標識（ただしそれ以外の点では同一の）オリゴヌクレオチドを用いて調節し、所望の標識オリゴヌクレオチド：非標識オリゴヌクレオチド比を達成した。標識オリゴヌクレオチドの最終濃度及びTO:FLOは下記の式を用いて調節した：
V0＝V2ｘC2ｘ((TF1/TF0)−1)/C0
Vw＝(1/Ctｘ((V2ｘC2)＋(V0ｘC0)))−(V2＋V0)
式中、
V0は添加が要求される非標識オリゴ
V2は調節に用いられるべき標識オリゴの体積
C2は調節に用いられるべき標識オリゴの濃度
TF1は標的のTO:FLO
TF0は最初のTO:FLO
C0は非標識オリゴの濃度
Vwは添加を要求される水の体積
Ctは標的の濃度
一般的に、標識プライマーオリゴヌクレオチドについては、標識対非標識オリゴヌクレオチドの比は1：1.8であった。高MTR及び中MTRビーズに結合させるために設計した標識プローブオリゴヌクレオチドについては、標識対非標識オリゴヌクレオチドの比はそれぞれ1：2及び1：100であった。TO:FLO調節標識プライマーオリゴヌクレオチドは-20℃で保存した。
ビーズのシラン化、プローブの連結及びビーズのプール操作
このようにして調製した5μLの体積のビーズミックスを各RT-PCR反応に用いた。シリカビーズ（Bangs Laboratories Inc.）を水で3回洗浄し、ペレットにしたビーズを続いて1.55M のHNO3で30分、室温で処理した。続いてビーズを水で5回、イソプロパノールで3回洗浄した。続いて丸底フラスコで、95mLのイソプロパノール中の約1ｘ109のビーズを沸騰させ、0.5mLの水及び5mLの新しく開封した3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（3MPTS；Sigma）を添加した。シラン化は還流下で23−25h間実施し、その後でビーズを3回イソプロパノールで洗浄し、真空濃縮装置にて40分間45℃で乾燥させた。続いて、乾燥ビーズを、アルゴンガス下にて室温で保存する前に、105℃で16−24hの加熱養生を実施した。プローブオリゴヌクレオチドの連結については、シラン化ビーズを秤量し、pH4.75に調節した0.1MのMES緩衝液（Sigma Aldrich）に再懸濁し、続いて1％w/v過硫酸アンモニウム（APS）の存在下で5’-Acrydite(商標)改変を介してプローブオリゴヌクレオチド（IDT）に連結し、その後洗浄し、続いてアクィジション緩衝液（10mMのTris-Cl、0.5mLのEDTA、0.0125％w/vのNaN3、0.01％v/vトリトンX-100）に再懸濁した。続いて個々のビーズ溶液をZlカウンター粒子計測装置（Beckman Coulter）で計測して2.1ｘ107ビーズ/mLに調節し、その後で等モル比でプールし、最終濃度を1.26ｘ107ビーズ/mLに調節した。特に、ビーズのプール操作は、各（18）連結ビーズ集団（2.1ｘ107ビーズ/mL）の等しい割合を混合し、続いて混合ビーズの体積の2/3に等しいアクィジション緩衝液を添加することによって実施した。表3を参照されたい。
例えば10μLの各ビーズのプール操作は以下のとおりである：
18ｘ各ビーズ10μL＝180μL
2/3ｘ180μL＝120μLのアクィジション緩衝液の添加
最終体積＝180μL＋120μL＝300μLのビーズプール
このようにして調製した5μLの体積のビーズミックスを各RT-PCR反応に用いた。最初の実験は、アクィジション緩衝液と同様であるがトリトンX-100を減じた（0.001％v/vトリトンX-100）緩衝液にプール核酸を再懸濁させる工程を含むことに留意されるべきである。その後の実験データ（nv3pg8）によって、ビーズをアクィジション緩衝液又は低減トリトンX-100（0.001％v/vトリトンX-100）のアクィジション緩衝液にプールしたとき等価の結果が得られることが示された。したがって、便利さ及び従来のプロトコルにいっそう一致した製造プロセスのために、ビーズプールは最終的にアクィジション緩衝液中でまとめられた。
いったんプライマー対を決定したら、続いてコントロール構築物を設計した。コントロール構築物はGenScriptから100ugの凍結乾燥形で得られ、前記では、社内ベクターpUC57のポリリンカー中で合成製造DNA挿入物（約500bp）が平滑端クローニングされていた。一般的は、以下の重要な特色を有する合成製造DNA挿入物が設計された：
1）効率的なin vitro転写のために5’T7及びT3プロモーター；
2）＞20bpのフランキング配列を有する標的アンプリコン；
3）＞20bpのフランキング配列を有するまた別のアンプリコン（例えばHealthScope又は他の文献）；
4）転写終了を可能にする、鋳型の直線化のための3’NotI制限部位（当該病原体配列に内部NotI部位が存在しないことを担保する）。
表3：ビーズ1mgにつき要求される100μMプローブオリゴヌクレオチドの体積
Figure 2015506666
コントロール構築物の設計及び構築
RNAウイルスについては特有の注意をはらい、挿入物のRNA転写に際して正確な（ゲノムの）センスRNAが生成されることを担保した。
全てのコントロール構築物を設計し、記録の目的でベクターNTIに保存した。ベクターの設計図のハードコピーをアーカイブに保管した。GenScriptに付託した配列は図1に提供される。呼吸器合胞体形成ウイルスの必要なプライマー/プローブ再設計のために、前記病原体のために新たなコントロール構築物が設計及び合成されたことは留意されるべきである。RSVポリメラーゼ遺伝子の部分を含むコントロール構築物RTI-C18及びRTI-C19は、最終的なRSVプライマー/プローブによって標的とされる鋳型である。
アンビオンメガスクリプト（Ambion Megascript）キットを用い製造業者の指示にしたがい、合成コントロール構築物鋳型を用いるin vitro転写を実施した。簡単に記せば、凍結乾燥DNA鋳型を無RNase水に約1μg/μLで溶解し、10μgを1ｘNE緩衝液3＋BSA中で制限酵素NotIを2時間37℃で用いて直線化した。続いて反応を65℃で20分間熱不活化し、Qiagenゲル抽出キットを製造業者の指示にしたがって用い核酸を精製した。100μLの無ヌクレアーゼ水に溶出させたDNAを続いてエタノール沈殿に付し、最終DNAペレットを12μLの無ヌクレアーゼ水に溶解した。続いて分光光度計を用いて各DNAサンプルのアリコットを定量した。
新しく調製したDNA鋳型の1μgでin vitro転写を実施し、サーモサイクラーにて37℃で3時間及び30分進行させた。続いて1μLのターボ（Turbo）DNaseを添加し、反応物をさらに15分37℃でインキュベートして投入DNA鋳型の全痕跡を除去した。製造業者の指示にしたがってRNイージー（RNeasy）キットを用いてRNAを回収し、50μLのRNA貯蔵溶液（RNA Storage Solution, Ambion）に溶出させた。分光光度計を用いてトリプリケートでRNAを定量し、さらにRNAの完全性及び濃度は変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。転写RNAの同一性は、特異的な内部配列を増幅するように設計したプライマーを用いてPCRによって確認した（図2参照）。
一般的には、RNAストック溶液のアリコットをRNA貯蔵溶液（Ambion）中に1ｘ109コピー/μLに稀釈し、必要となるまで-20℃で保存した。アッセイの最適化は、1ｘ109コピー/μLのストック管から新しく稀釈したRNAの既知量で日常的に実施した。
変性アガロースゲル電気泳動及び分光分析法で決定した場合、-20℃で1ヶ月保存後にRNAストック（RNA貯蔵緩衝液で保存）の明瞭な分解は認められなかった。
固相RT-PCR
一工程RT-PCRは本質的に製造業者（Qiagen）の指示にしたがって設定された。簡単に記せば、1ｘ反応緩衝液、dNTP、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド配列については本文を参照されたい）及び酵素ミックスを含むマスターミックスの10μLを5μLの予めプレートしたビーズに添加した。続いてサンプル（10μL）を添加し、プレートを密閉し、300ｘgで1分間回転させた。続いて、以下のようにサイクル（45サイクル）させる前にトレイを50℃で20分及び95℃で15分のインキュベーションに付した：95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で1分。72℃で2分間の最後の伸長工程は、ハイブリダイゼーションプロフィールの開始前に行われた。前記ハイブリダイゼーションプロフィールは、90℃で30秒間の最初のインキュベーション、続いて25℃の最終温度が達成されるように65サイクルの15秒毎に1℃のインキュベーション温度の段階的低下を含んでいた。
データ入手及び分析
固相RT-PCRサイクリングに続いて、プレートを1000ｘgで1分間回転させ、ペレットにしたビーズを120μLのシース緩衝液（Sheath Buffer；8mMのNaCl、0.0001％v/vトリトンX-100）で5回洗浄し、洗浄緩衝液のペレットビーズへの添加の間に300ｘgで1分間回転させた。或いは、プレート洗浄はハイドロスピードプレート洗浄装置（Tecan）で実施し、穏やかな吸引と分配のサイクルの間に5分間のビーズ定着時間を可能にした。ファクスアレイ（FACSArray）フローサイトメーター（BD Biosciences）での分析前に、ビーズを最終的に80μLから120μLのシース緩衝液に再懸濁させた。FCS 2.0ファイルとして送り出されたデータを続いてFCSエクスプレス（De Novo Software）又は注文処理分析ソフトウェア（Genera Biosystems）を用いて分析した。
PCR最適化
アニーリング温度1：フランキングプライマー（内部プローブオリゴヌクレオチドは存在しない）
標的鋳型の効率的なPCR増幅を可能にするプライマー対のためのアニーリング温度は、グラディエントPCR及びQiagen RT-PCR緩衝液中のホットスター（HotStar）Taqを用いてまず初めに決定された。PCRは標的鋳型10000コピー（1000コピー/μLの10μL）で実施した。広域のアニーリング温度が評価されることを担保するために、52−70℃のアニーリング温度のグラディエントを用いた。前記は、本実験で用いたエッペンドルフマスターサイクラーEpSの各列内のウェルの端から端まで51.8℃、52.2℃、53.3℃、55.0℃、57.1℃、59.5℃、61.9℃、64.3℃、66.5℃、68.2℃、69.5℃及び70.0℃の温度に変換された。PCRサイクルは以下のとおりであった：95℃で15分、続いて40サイクルの95℃で30秒、グラディエント52−70℃で30秒、72℃にて30秒および10分間の最後の伸長。
全ての事例で、5μLのPCR生成物を2.5％TAEアガロースゲル（150Vで泳動）で泳動させ、SYBR-セーフ染料（Invitrogen）中で2ｘ最終濃度にて20分染色した後でUVトランスルミネーターでDNAを可視化した。続いて、各プライマーセットについて効率的なPCR増幅（バンドの強度で判定）をもたらすアニーリング温度を決定し、下記表4に示す。
表4：第一世代プライマーのアニーリング温度
Figure 2015506666
*最終アッセイで用いられたプライマー対とは異なる初期プライマー対で得られた結果
コンピュータシステムでの予想と一致して、標的鋳型の最大増幅を可能にするアニーリング温度は極めて高く（＞59℃）、59.9℃から70℃まで変動した。60℃のアニーリング温度は全ての標的の効率的な増幅を許容し、したがって本アッセイの固相RT-PCRの成分のためのアニーリング温度として最初に選択された。これらのデータのいくつかは、最終アッセイでは用いなかった第一世代のプライマー対から得られたことは繰り返し述べておかなければならない。
多重PCR：DNA鋳型；バックグラウンドDNA無し
D NA鋳型を用いるPCR反応（逆転写無し）をまず初めに、0.6μM（最終）濃度の各プライマーを含むプライマーミックスを用いて実施した（Qiagen一工程RT-PCRキットの使用については製造業者の推奨にしたがった）。これらの条件下で、全標的が増幅された（15％w/vのTBEプレカーストゲル（Biorad）の100Vで4hのPAGE電気泳動の後でバンドを可視化して判定）。RSV-A、hMPV及びRhVについては貧弱な増幅が繰り返し観察された。プライマーミックス中のプライマー対濃度を調整したその後の実験で、全標的分析物の効率的な増幅を促進するプライマーミックスが同定された（図3参照）。
多重RT-PCR：RNA鋳型+/-バックグラウンドDNA
DNA鋳型実験で確立されたプライマー濃度を用いたとき、10000コピーのRNA鋳型による最初のRT-PCRでは、MS2、RSV-A、Para3、Para4、hMPV、AdV及びRhVを含む多様な標的分析物の非効率的増幅が示された。RT工程の時間（20分又は30分）及び温度（40℃又は45℃又は50℃又は55℃又は60℃）を調整する最適化実験は、PAGE分析で判定したとき標的鋳型のより効率的な増幅をもたらさなかった。したがって、製造業者の推奨する50℃で20分間をその後の全ての逆転写工程で用いた。
プライマーミックス中のプライマー対濃度を調整し、プライマー/プローブ組合せをMS2及びRSVについて再設計した実験では、全ての標的分析物（RhVを除く）の明白な増幅を促進する（ポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定）プライマーミックスが同定された（図4参照）。
無RNAseのバックグラウンドHeLa染色体DNA（各反応につき約2500細胞等価物の最終濃度）のその後の添加は、PAGE分析で判定したとき増幅プロフィールを顕著には変化させなかった（下記図5を参照されたい）。
非対称性RT-PCR
固相RT-PCR時のビーズへのPCR生成物のローディングを最適にするために、プライマーのタイトレーションを慎重に実施し、あるレベルの非対称性を標的分析物の増幅に導入した。特に、各分析物について、標識プライマーと比較して（プローブオリゴヌクレオチドのセンスと同じセンスの）非標識プライマーを50倍超モル不足まで連続的に減少させた。生じた非対称性増幅プロフィールは、プローブオリゴヌクレオチドによるその後の良好なプライミングに利用可能な新生鎖の過剰蓄積を可能にすると期待された。実際、大半の事例で、ビーズへのより効率的なローディングが非標識プライマー量の減少とともに観察された。しかしながら、同族ビーズへのPCR生成物の最適ローディングを提供する非標識プライマー：標識プライマーのモル比はそれぞれ1：1から1：6の範囲であった（下記の表5を参照されたい）。
表5：標的分析物のRT-PCR増幅後の効率的なビーズ検出を指令するプライマー濃度

Figure 2015506666
*AlexaFluor647標識プライマー
分析物の検出感度
予備的な分析物検出感度は、確立したRTIプロット閾値を用い、既知量の合成コントロール構築物の増幅及び検出後に認定した。洗浄（6回）は1ｘのシース緩衝液を用いて実施した。以下の合成構築物コピーについて明確な信号が成功裡に得られた（表6参照）。
表6：分析物検出感度の確認
Figure 2015506666
RSV-A対RSV-Bの検出感度
RSV（RSV-A及びRSV-B）の検出感度を分析する予備的データは、標的鋳型としてC18及びC19コントロール構築物の両方の等モル混合物の使用を含んでいた（配列については図1を参照されたい）。したがって、RSV-A及びRSV-Bの両方についての独立した検出感度データを得るために、本発明の多重アッセイを用いてどちらかの構築物の既知コピーを別個に評価した。このアッセイは、TRIプロットソフトウェア（RSVについて400の閾値を設定した）による分析によれば、125コピーのRSV-A構築物（C18）及び250コピーのRSV-B構築物（C19）の良好な検出を可能にした。
臨床データ
72のアーカイブサンプル（細胞培養からウイルスを分離して作製されたデータが記録されている）の濃縮セットについて盲検態様で本アッセイの予備的評価を実施した。サンプルは、核酸として又は臨床標本（アッセイの前に再抽出が必要）として-80℃で保存された。この試験の所見の要旨は図6に示されている。3サンプルのウイルス培養データは重感染を示し、したがって、サンプル総数（72）は、62の分析物陽性サンプル＋13の分析物陰性サンプル−3つの重感染サンプルに等しいことに留意されるべきである。
簡単に記せば、データは、分析物陽性サンプルについて本アッセイと細胞培養データの95％一致を示している（本分析の不確定RTIplexの結果を除く）。さらにまた、培養後にウイルスの単離及び／又は同定が不能であった13のサンプルのうち、本アッセイは、これらのサンプルの7つ（54％）で病原体を検出できた。さらにまた、これら72の臨床標本から、本アッセイは、細胞培養技術では以前に未報告であった合計24の分析物を検出した。これらの新たに同定された分析物の多くがPCRによる方法（以下で実施された：Department of Molecular Microbiology, Royal Women’s Hospital, Melbourne, Victoria, Australia（オーストラリア、ヴィクトリア州、メルボルン、ロイヤル婦人病院、分子微生物学部門）によって確認された。
表7：アーカイブ臨床標本の細胞培養データの分析
Figure 2015506666
NT＝試験せず
MM＝Department of Molecular Microbiology, Royal Women’s Hospital, Melbourne, Victoria, Australia
IND＝確定不可
na＝適用不能
HU IC＝ヒト内部コントロール
本アッセイ方法で用いられるオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブ
表8は、本アッセイの方法及び呼吸器病原体用キットで用いられるプライマー及び捕捉プローブのリストを提供する。少なくとも2つのプライマー対及び対応するプローブが当該キットで用いられる。“少なくとも2つ”とは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17又は18を意味する。
本明細書に記載の特徴は、具体的に記載したもの以外の変型及び改変にも感受性を有することは、当業者には理解されよう。これらの特徴には全てのそのような変型及び改変が含まれることは理解されるべきである。これらの特徴にはまた、本明細書で個別に又は包括的に言及した又は明示した全ての工程、特色、組成物及び化合物、並びに前記工程又は特色の任意の2つ以上の組合せのいずれか又は全てが含まれる。
表8：呼吸器病原体のためのアッセイ方法で用いられるプライマー及び捕捉プローブ
Figure 2015506666

Figure 2015506666
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Claims (23)

  1. 以下の工程を含む、複数の呼吸器病原体についてサンプルをスクリーニングし特有の病原体を検出する方法：
    （a）サンプルから1つ以上の呼吸器病原体に由来する核酸を含むと推定される核酸を単離する工程；
    （b）該核酸を増幅に付する工程、ここで水性プライマー対が呼吸器病原体由来核酸のある領域の増幅を指令し、プライマー対数はスクリーニングを所望される病原体数を基準に選択され、該プライマー対の少なくとも一方のメンバーは、増幅後の生成アンプリコンに取り込まれる第一の光学的に検出可能な標識を含み、該アンプリコンは、アンプリコンのある領域と相補性でありビーズセット中のビーズに固定されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることによって捕捉され、該ビーズセットはビーズサブセットを有し、各サブセットはビーズサイズ及び場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度に関して均質であり、それによってサイズ及び／又は第二の検出可能な標識の強度を基準として不均質なビーズセットを生じ、さらに該サブセット数はスクリーニングされるべき呼吸器病原体数と一致し；
    （c）第一の検出可能な標識の強度を基準にしてどのビーズとアンプリコンが結合したかを決定する工程、及び、アンプリコンが複数のビーズサブセットと結合する場合には、ビーズサイズを基準に、さらに場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度を基準に複数のビーズサブセットを区別する工程；
    ここでアンプリコンと特有のビーズサブセットとの結合は、該サンプルに特有の呼吸器病原体が存在することの指標である。
  2. 増幅が固相増幅である、請求項1に記載の方法。
  3. 第一の光学的に検出可能な標識を含むプライマーの伸長によって開始されるアンプリコンが、第二の場合によって検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチド（半入れ子プライマー）のハイブリダイゼーション及び伸長のための鋳型として機能し、該オリゴヌクレオチドがビーズセット中のビーズに固定されている、請求項2に記載の方法。
  4. 以下の工程を含む、複数の呼吸器病原体についてサンプルをスクリーニングし特有の病原体を検出する方法：
    （a）サンプルから1つ以上の呼吸器病原体由来核酸を含むと推定される核酸を単離する工程；
    （b）該核酸を固相増幅に付する工程、ここで水性プライマー対が呼吸器病原体由来核酸のある領域の増幅を指令し、プライマー対数はスクリーニングを所望される病原体数を基準に選択され、該プライマー対の少なくとも一方のメンバーは、増幅後の生成アンプリコンに取り込まれる第一の光学的に検出可能な標識を含み、第一の光学的に検出可能な標識を含むプライマーの伸長によって開始される該生成アンプリコンは、第二の光学的に検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長のための鋳型として機能し、該オリゴヌクレオチドプライマーはビーズセット中のビーズに固定され、該ビーズセットはビーズサブセットを有し、各サブセットはビーズサイズ及び場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度に関して均質であり、それによってサイズ及び／又は第二の検出可能な標識の強度を基準として不均質なビーズセットを生じ、さらに該サブセット数はスクリーニングされるべき呼吸器病原体数と一致し；
    （c）第一の検出可能な標識の強度を基準にしてどのビーズとアンプリコンが結合したかを決定する工程、及び、アンプリコンが複数のビーズサブセットと結合する場合には、ビーズサイズを基準に、さらに場合によって第二の光学的に検出可能な標識の強度を基準に複数のビーズサブセットを区別する工程；
    ここでアンプリコンと特有のビーズサブセットとの結合は、該サンプルに特有の呼吸器病原体が存在することの指標である。
  5. 第二の光学的に検出可能な標識の強度を基準にして複数のビーズサブセットを区別する工程を含む、請求項1又は請求項4に記載の方法。
  6. 該呼吸器病原体が以下から成る群から選択される、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法：インフルエンザA、インフルエンザB、インフルエンザA H1N1、インフルエンザA H5N1、呼吸器合胞体形成ウイルスA亜型、呼吸器合胞体形成ウイルスB亜型、ヒトパラインフルエンザウイルス1、ヒトパラインフルエンザウイルス2、ヒトパラインフルエンザウイルス3、ヒトパラインフルエンザウイルス4、ヒトメタニューモウイルス、ヒトアデノウイルスB亜型、ヒトアデノウイルスC亜型、ヒトアデノウイルスE亜型、ヒトエンテロウイルス/ヒトライノウイルス、ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）、ヘモフィルスインフルエンザ、ヒトコロナウイルス、ヒトボカウイルス1、2及び3型、並びにストレプトコッカス（Streptococcus）、ヘモフィルス（Haemophilus）、モラキセラ（Moraxella）、シュードモナス（Pseudomonas）、クレブシエラ（Klebsiella）、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）、アシネトバクター（Acinetobacter）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、レジオネラ（Legionella）、クラミドフィラ（Chlamydophila）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、コクシエラ（Coxiella）、ノカルジア（Nocardia）、ニューモシスチス（Pneumocystis）、ノカルジア（Nocardia）及びアスペルギルス（Aspergillus）属由来の微生物。
  7. 1つ以上の呼吸器病原体由来核酸が以下から成る群から選択される、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法：インフルエンザAマトリックスタンパク質のセグメント7をコードする遺伝子、インフルエンザBヘマグルチニンのセグメント4をコードする遺伝子、インフルエンザAの2009 H1N1流行株のセグメント4をコードする遺伝子、インフルエンザAのH5N1流行株のセグメント4をコードする遺伝子、呼吸器合胞体形成ウイルス（A及びB型）のポリメラーゼ遺伝子、ヒトパラインフルエンザウイルス1、2及び3のヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ糖タンパク質をコードする遺伝子、ヒトパラインフルエンザウイルス4のリンタンパク質遺伝子、ヒトメタニューモウイルスのマトリックスタンパク質のM2領域をコードする遺伝子、アデノウイルスB、C及びE型のヘキソン領域をコードする遺伝子、ヒトライノウイルス/エンテロウイルスの5’UTR領域、ボルデテラ・ペルツシスの挿入配列（IS）481、クラミドフィラ・ニューモニアエの主要外膜タンパク質をコードする遺伝子、及びマイコプラズマ・ニューモニアエのP1シトアドヘシンをコードする遺伝子。
  8. プライマー対が、配列番号：1から16から成る群から選択されるフォワードプライマー、及び配列番号：17から32から成る群から選択される対応するリバースプライマーを含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
  9. オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号：37から52から成る群から選択される、請求項8に記載の方法。
  10. オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号：53及び54から選択されるコントロールオリゴヌクレオチドプローブである、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 配列番号：33及び35から選択されるフォワードプライマー並びに配列番号：34及び36から選択される対応するリバースプライマーを含むプライマー対を用いてコントロール核酸配列を増幅する工程を含む、請求項10に記載の方法。
  12. 配列番号：1から16のフォワードプライマー及び配列番号：17から32の対応するリバースプライマーを含む16のプライマー対を用い、さらに該オリゴヌクレオチドプローブが配列番号：37から52から成る群から選択される増幅条件に該核酸を付す工程を含む、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 表8に列挙した配列の2つ以上から選択されるプライマー対及び対応するプローブ（配列番号：74から126）を用いる増幅条件に該核酸を付す工程を含む、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
  14. 第一及び第二の光学的に検出可能な標識が以下から成る群から選択される、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法：オキシクマリン、アミノクマリン、メトキシシウマリン、カスケードブルー、ルシファーイェロー、NBD、フィコエリトリン（PE）、PerCP、アロフィコシアニン、ヘキスト33342、DAPI、SYTOXブルー、ヘキスト33258、クロモマイシンA3、ミトラマイシン、YOYO-I、SYTOX グリーン、SYTOXオレンジ、7-AAD、アクリジンオレンジ、TOTO-1、To-PRO-I、チアゾールオレンジ、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751、以下を含むAlexaFluor（AlexaFluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700及び-750）、以下を含むBoDipy染料（BoDipy 630/650及びBoDipy 650/665）、CY染料（特にCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5及びCy7）、6-FAM（フルオレセイン）、PE-Cy5、PE-Cy7、フルオレセインdT、ヘキサクロロフルオレセイン（Hex）、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,T-ジメトキシフルオレセイン（JOE）、以下を含むオレゴングリーン染料（488-X及び514）、以下を含むローダミン染料（X-ローダミン、リサミンローダミンB、ローダミングリーン、ローダミンレッド及びROX）、TRITC3テトラメチルローダミン（TMR）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、テトラクロロフルオレセイン（TET）、レッド6B5 FluorX、BODIPY-FL及びテキサスレッド。
  15. 第一の光学的に検出可能な標識がAlexaFluor-647である、請求項14項に記載の方法。
  16. 第二の光学的に検出可能な標識がホウ素-ジピロメテン(BoDipy)-TMRである、請求項14又は請求項5に記載の方法。
  17. 第二の光学的に検出可能な標識がオリゴヌクレオチドプローブに結合される、請求項16に記載の方法。
  18. 第二の光学的に検出可能な標識が、オリゴヌクレオチドプローブの内部チミジン残基のアミノC6改変を介して前記オリゴヌクレオチドプローブに結合される、請求項17に記載の方法。
  19. オリゴヌクレオチドプローブが半ネストオリゴヌクレオチドである、請求項1から18のいずれか1項に記載の方法。
  20. オリゴヌクレオチドプローブが、チオール又はメタクリル結合を介してビーズと共有結合される、請求項1から19のいずれか1項に記載の方法。
  21. 各サブセット内のビーズのサイズが、直径3.0μm、3.5μm、3.8μm、4.1μm、5.0μm、5.2μm及び5.7μmから成る群から選択される、請求項1から20のいずれか1項に記載の方法。
  22. 配列番号：1及び17、2及び18、3及び19、4及び20、5及び21、6及び22、7及び23、8及び24、9及び25、10及び26、11及び27、12及び28、13及び29、14及び30、15及び31並びに16及び32から選択される、2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、並びに配列番号：37から52から選択される対応するプローブをそれぞれ含むキット。
  23. 表8に列挙した2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対及び対応するプローブ（配列番号：74から126）を含むキット。
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