CN102268482A - 基于环介导等温扩增检测象耳豆根结线虫的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于环介导等温扩增检测象耳豆根结线虫的试剂盒及其应用。本发明提供了辅助鉴定象耳豆根结线虫的专用引物，由序列表的序列1至6所示DNA组成。本发明提供的试剂盒含有所述专用引物。本发明设计特异性的引物并优化反应条件，提供一种可用于定性检测象耳豆根结线虫5S rDNA-IGS2区的试剂盒及检测方法，解决常规分子检测成本高、效率低、速度慢，不能满足当前植物检疫和植物保护需要的难题。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于环介导等温扩增检测象耳豆根结线虫的试剂盒及其应用。
背景技术
象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)是一种致病力很强，危害广泛的检疫性植物根结线虫，能寄生于包括豆科(Fabaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、茄科(Solanaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、番荔枝科(Annonaceae)和竹芋科(Marantaceae)等多种植物。同其他根结线虫一样，象耳豆根结线虫可导致根瘤和植株衰退，侵染性强。此外，象耳豆根结线虫表现的毒力可以克服其他常见根结线虫的几种抗源，如能克服番茄品种抗性基因Mi-1的抗性。
目前，象耳豆根结线虫已在亚洲、欧洲、非洲和南北美洲范围内的多个国家发生，对农业生产和环境生态构成潜在的巨大威胁，越来越被重视。快速准确鉴定象耳豆根结线虫，有助于控制其传播危害，并制定针对性的防治措施。
传统的根结线虫种的鉴定主要依靠接种鉴别寄主植物、形态显微观察等常规方法，以差异蛋白及同功酶电泳为主的生化分析方法，这些方法由于对线虫需要量高、检测周期长、经验要求高或准确性等多种原因，难以满足植物检疫和植物保护的需要。近年来，分子检测技术有了长足的发展，植物线虫学家尝试发展了象耳豆根结线虫的分子检测方法，已报道的有RFLP、RFLP、IGS-PCR、SCAR、种特异性卫星DNA扩增等，这些方法和传统手段相比，更为迅速可靠。然而，以常规PCR为基础的分子检测，需要相对多且高质量的线虫DNA模板，扩增和检测需要多个仪器设备，且整个过程需要数个小时，对于需要快速通关的植物检疫部门和条件简陋的基层农技部门来说，这些分子检测方法的实用性受到限制。因此，需要开发新型、快速、简便、可靠且低成本的象耳豆根结线虫检测手段。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)技术是一种新的恒温核酸扩增技术，利用能识别靶序列上6个位点的4个特殊设计的引物和一种具有链置换功能的DNA聚合酶，在60-65℃恒温条件下，对核酸进行等温扩增，且在1小时内扩增效率可达到109-1010个数量级。扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。和常规扩增方法相比，该技术主要优点体现在如下几个方面：1)该方法仅需水浴或金属浴等恒温装置，以提供实现核酸扩增的条件，不需要热循环仪；2)特异性高，采用4/6条特异引物识别目的基因上的6/8个区域；3)扩增速度快，效率高，可在30-60分钟内获得结果；4)结果判定简单，扩增产生大量产物和焦磷酸镁沉淀，无需电泳，结果可经肉眼直接判断，结合使用荧光染料或试纸条，检测结果更为灵敏可靠，结合专门开发的浊度仪，可实时观测扩增进程，可使检测时间缩短至15分钟。目前已经应用于食品安全、环境微生物、农业病害及医学诊断等领域。
目前尚未见采用环介导等温扩增方法检测象耳豆根结线虫的试剂盒及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增检测象耳豆根结线虫的试剂盒及其应用。
本发明提供的辅助鉴定象耳豆根结线虫的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成。
所述试剂盒可用于辅助鉴定象耳豆根结线虫和/或检测待测样本是否含有象耳豆根结线虫。
本发明还保护一种含有所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定象耳豆根结线虫和/或检测待测样本是否含有象耳豆根结线虫。所述试剂盒还可含有Bst DNA聚合酶。所述试剂盒还可含有5倍LAMP反应液和/或样品预处理液和/或荧光染料SYBRGreen I和/或特异探针。所述5倍LAMP反应液具体可由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述5倍LAMP反应液中的浓度如下：5mM dNTP、100mM Tris-盐酸(pH8.8)、50mM氯化钾、50mM硫酸铵、20mM硫酸镁、0.5％(体积比)曲拉通X-100和2M甜菜碱。所述样品预处理液具体可由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、10mM Tris(pH8.2)、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45％(体积比)吐温20和0.01％(g/100mL)明胶。所述特异探针的核苷酸序列具体可如序列表的序列7所示。
所述试剂盒还可包括阳性对照质粒；所述性对照质粒为将序列表的序列8所示的DNA插入PGEM-T easy质粒的NcoI和NotI酶切位点之间得到的重组质粒。
所述试剂盒还可包括检测液(Milenia Biotec GmbH，Germany，Cat#：MILR7)和检测试纸条(Milenia Biotec GmbH，Germany，Cat#：MILR7；包被有抗FITC抗体的金标物和生物素配体)。用所述检测液和所述检测试纸条进行检测时，如果加入PCR反应产物后，质控线和检测线同时出现清晰条带，待测线虫为象耳豆根结线虫；如质控线有清晰条带，而无明显检测线条带，待测线虫为候选的非象耳豆根结线虫。
所述专用引物可用于辅助鉴定象耳豆根结线虫。
所述专用引物在可用于检测待测样本是否含有象耳豆根结线虫。
本发明还保护一种辅助鉴定象耳豆根结线虫的方法，是用所述专用引物对待测线虫的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：
(1)加入SYBR Green I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的象耳豆根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非象耳豆根结线虫；
(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的象耳豆根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非象耳豆根结线虫；
(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的象耳豆根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非象耳豆根结线虫；
所述待测线虫具体可为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫或象耳豆跟结线虫。
本发明还保护一种辅助鉴定待测样本中是否感染象耳豆根结线虫的方法，是用所述专用引物对待测样本的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：
(1)加入SYBR Green I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测样本中疑似含有象耳豆根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测样本中疑似不含有象耳豆根结线虫；
(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测样本中疑似含有象耳豆根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测样本中疑似不含有象耳豆根结线虫；
(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测样本中疑似含有象耳豆根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测样本中疑似不含有象耳豆根结线虫。
以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的反应体系具体可为：所述基因组DNA5μl，LAMP引物母液1μl，所述5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水13μl。所述LAMP引物母液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：Me-F3 5μM、Me-B3 5μM、Me-FIP 40μM、Me-BIP 40μM、Me-LP 20μM和Me-BP 20μM。
以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的条件具体可为：63℃水浴50分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。
本发明与现有技术相比，优点如下：
(1)操作简单
LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要水浴锅或金属模块即可，产物检测用肉眼观察、琼脂糖凝胶电泳或浊度仪检测即可判断，不需要特殊的试剂及仪器。
(2)快速高效
因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。样品检测全程可在1.5小时内均可完成，本发明添加了环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20-30分钟均可检测到扩增产物，且产物可以扩增至109倍，达0.5mg/ml。应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性
由于本发明是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，引物的延伸端有着高度的序列选择性，与其他近缘线虫相应序列不匹配，不能进行核酸扩增。故其特异性极高。
(4)高灵敏度
扩增模板可达fg级，比PCR高出数量级的差异，加上本发明针对基因组中存在多拷贝的5S rDNA-IGS2区，扩增灵敏度进一步提高。
(5)适用性强，成本低、技术依赖性小
本试剂盒可采用不同方法进行结果判读，各使用单位可以根据自身条件，灵活选择一种或结合使用，特别适合基层农技人员使用。
本发明设计特异性的引物并优化反应条件，提供一种可用于定性检测象耳豆根结线虫5S rDNA-IGS2区的试剂盒及检测方法，解决常规分子检测成本高、效率低、速度慢，不能满足当前植物检疫和植物保护需要的难题。
附图说明
图1为电泳检测环介导的等温扩增结果。
图2为环介导等温扩增检测根结线虫样品DNA，SYBR Green I染色后，分别在可见光与紫外光下观察结果。
图3为横流试验试纸条检测环介导等温扩增结果。
图4为实施例3中的灵敏度检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
象耳豆根结线虫(M.enterolobii，简称Me或M.e)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Tiganoa M，de Siqueiraa K，Castagnone-Serenob P，Muletb K，Queiroza P，dos Santosa M，Teixeiraa C，Almeidaa M，Silvaa J，Carneiroa R.Genetic diversity of the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii anddevelopment of a SCAR marker for this guava-damaging species.Plant Pathology，2010，59(6)：1054-1061。
南方根结线虫(Meloidogyne incognita，简称Mi或M.i)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Zijlstra C，Donkers-Venne DTHM，Fargette M，2000.Identification of Meloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria usingsequence characterised amplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology2，847-53.。
爪哇根结线虫(M.javanica简称Mj或M.j)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Zijlstra C，Donkers-Venne DTHM，Fargette M，2000.Identification ofMeloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria using sequencecharacterised amplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology 2，847-53.。
花生根结线虫(M.arenaria，简称Ma或M.a)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Zijlstra C，Donkers-Venne DTHM，Fargette M，2000.Identification ofMeloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria using sequencecharacterised amplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology 2，847-53.。
北方根结线虫(M.hapla，简称Mh或M.h)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Zijlstra C，2000.Identification of Meloidogyne chitwoodi，M.fallaxand M.hapla based on SCAR-PCR a powerful way of enabling reliableidentification of populations or individuals that share common traits.European Journal of Plant Pathology 106，283-90.。
实施例1、试剂盒的组成
一、试剂盒各组分的制备
1、引物的制备
根据象耳豆根结线虫5S rDNA基因和IGS2区，存在种间多态性区段，设计特异性寡核苷酸引物。合成1组专用引物，由外侧引物(Me-F3和Me-B3、内侧引物(Me-FIP：和Me-BIP)和环引物(Me-LP和Me-BP)组成。
Me-F3：5’-CCAAGTACTAAGGAAGCCC-3’(序列表的序列1)；
Me-B3：5’-ATCCTAATTTTCCTCCCACACA-3’(序列表的序列2)；
Me-FIP的5’末端Biotin标记，核苷酸序列如下(序列表的序列3)：
5’-ACAGTGATTACGACCATACCGCGTTAACGTTGCTTAACTTGCCAGA-3’；
Me-BIP：5’-TCTAAGGCAAAGTGGGCGGAGCTCTTTTTGCCTTAAACCATTCCC-3’(序列表的序列4)；
Me-LP：5’-AAGCACGCCATCCCGTC-3’(序列表的序列5)；
Me-BP：5’-TGTTGTTCGCTGTTCGC-3’(序列表的序列6)。
专用引物的25倍母液(LAMP引物母液)由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：Me-F3 5μM、Me-B3 5μM、Me-FIP 40μM、Me-BIP40μM、Me-LP 20μM和Me-BP 20μM。
2、5倍LAMP反应液的制备
5倍LAMP反应液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述5倍LAMP反应液中的浓度如下：5mM dNTP、100mM Tris-盐酸(pH8.8)，50mM氯化钾，50mM硫酸铵，20mM硫酸镁，0.5％(体积比)曲拉通X-100和2M甜菜碱。
3、样品预处理液的制备
样品预处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、10mM Tris(pH8.2)、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45％(体积比)吐温20和0.01％(g/100mL)明胶。
4、探针溶液的制备
探针Me-Probe的5’末端具有FITC标记，探针的核苷酸序列如下：
5’-CGATGTTCGCTGTTCGCGGGAATGGTTTAAAGG-3’(序列表的序列7)。
将探针溶于水，使其终浓度为20μM，即为探针溶液(-20℃避光保存)。
5、阳性对照液的制备
将序列表的序列8所示的DNA插入PGEM-T easy质粒(Promage，Cat#：A1360)的NcoI和NotI酶切位点之间，得到阳性对照质粒。将阳性对照质粒用超纯水稀释至10ng/μl，得到阳性对照液。
二、试剂盒的组成
试剂盒由步骤一制备的LAMP引物母液、5倍LAMP反应液、Bst DNA聚合酶(活性单位为8U/μl)、样品预处理液、25×的荧光染料SYBR Green I(显色液)、探针溶液、检测液(Milenia Biotec GmbH，Germany，Cat#：MILR7)、检测试纸条(Milenia BiotecGmbH，Germany，Cat#：MILR7；包被有抗FITC抗体的金标物和生物素配体)和阳性对照液组成。各组分均单独包装。
三、试剂盒使用方法
应用步骤二的试剂盒时，采用如下步骤对待测样本进行检测：
1、提取样本的基因组DNA
当待测样本为单个卵、幼虫或成虫时，采用如下方法提取基因组DNA：加20μl样品预处理液于盖玻片上，挑取待测样本于样品预处理液中，挤压盖玻片使虫体破裂，得到体液混合物；转移10μl体液混合物于预先装有10μl灭菌水的1.5ml离心管中，液氮中速冻至少1分钟，65℃水浴20分钟，95℃水浴5min，12000rpm离心5分钟，取1-5μl上清用作反应模板(基因组DNA)。
当待测样本为疑似被根结线虫感染的单条根结时，采用如下方法提取基因组DNA：取待测样本，放入预先装有30μl灭菌水的1.5ml离心管中，用牙签、锥子或尖头玻璃棒等锐器迅速研磨成匀浆，液氮中速冻至少1分钟，65℃水浴20分钟，95℃水浴5min，12000rpm离心5分钟，取5μl上清用作反应模板(基因组DNA)。
当待测样本为疑似含有根结线虫的土壤时，可采用PowerSoilTM DNA isolated Kit试剂盒(需自行订购)按说明书进行基因组DNA的提取。
2、配制反应体系
在200μl PCR管中配制LAMP反应体系(25μl)，见表1。
表1 LAMP反应体系
| 组分 | 加样量 |
| DNA模板(100fg-1μg) | 1-5μl |
| LAMP引物母液 | 1μl |
| 5倍LAMP反应液 | 5μl |
| Bst DNA聚合酶(8U/μl) | 1μl |
| 双蒸水 | 17-13μl |
3、LAMP扩增
①60-65℃水浴40-60分钟，
②加入1μl探针溶液，继续63℃水浴5分钟，进行探针杂交(如不通过横流试验试纸条检测结果，该步骤可舍去)。
③然后80℃加热5分钟终止反应。
4、结果判定
结果判定可采取如下方法之一或结合使用：
(1)加入1μl 25×的荧光染料SYBR Green I，肉眼观察，绿色为阳性，橙色为阴性。
(2)10,000×g室温离心5分钟，管底出现白色沉淀(焦磷酸镁)为阳性，无沉淀为阴性。
(3)取3-5μl扩增产物进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，出现阶梯状条带的为阳性，不出现阶梯状条带的为阴性。
(4)反应结束后，取5μl反应液和20μl检测液(Milenia Biotec GmbH，Germany，Cat#：MILR7)混合，滴加于试纸条(Milenia Biotec GmbH，Germany，Cat#：MILR7；包被有抗FITC抗体的金标物和生物素配体)的样品涂抹区。在孵育过程中，检测线在试纸条中迁移，肉眼观察结果，同时出现检测线和控制线红色条带的，视为阳性结果。仅有质控线出现的为阴性。
四、试剂盒的工作原理
1、通过反应液颜色进行结果判读。如果待测样本中具有DNA靶序列，随着反应体系的扩增产生大量核苷酸链，SYBR Green I能够嵌入链中产生绿色荧光。如果待测样本中不具有DNA靶序列，体系中不能产生大量核苷酸链，SYBR Green I分子只能处于游离状态，显现橙黄色。
2、通过观察白色沉淀进行结果判读。如果待测样本中具有DNA靶序列，在环介导等温扩增中，被不断添加入新合成的核苷酸链，同时大量脱下焦磷酸镁副产物，焦磷酸镁是一种白色沉淀物，在60-65℃的扩增温度条件下难溶解，因此伴随产物的大量扩增而积累，反应结束后，可以直接观察到白色沉淀。如果待测样本中不具有DNA靶序列，反应产物中缺少焦磷酸镁副产物，不能观察到白色沉淀。应用本方法判读时，反应体系中可以不加入SYBR Green I。
3、通过琼脂糖凝胶电泳检测进行结果判读。环介导等温扩增利用特异引物依靠高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段：内部引物FIP的3’末端和下游引物BIP的3’末端与模板结合延伸，外部引物F3与B3与模板结合并延伸，启动链置换合成置换出完整的FIP连接的互补单链，自我碱基配对形成环状结构，以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。第2阶段是扩增循环阶段：以茎环状结构为模板，内侧引物与茎环结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。周而复始。如果待测样本中具有DNA靶序列，扩增产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，呈现梯状电泳条带。如果待测样本中不具有DNA靶序列，则不能得到扩增产物，电泳后无梯状条带显示。应用本方法判读时，反应体系中可以不加入SYBR Green I。
4、使用试纸条检测。如果待测样本中具有DNA靶序列，生物素标记的PCR产物与FITC标记的特异探针杂交、FITC标记的特异探针与抗FITC抗体的金标物颗粒结合后，将该免疫复合物滴加到试纸条上，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线，不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的质控线。如果待测样本中不具有DNA靶序列，不能得到与特异探针杂交的PCR产物，不能形成具有颜色的检测线。应用本方法判读时，反应体系中可以不加入SYBR Green I。
实施例2、试剂盒的应用
应用实施例1制备的试剂盒分别检测各个实验样本。
一、提取基因组DNA
将5种线虫实验样本分别按如下方法提取单个线虫的基因组DNA：
1、加20μl样品预处理液于盖玻片上，挑取单条线虫于样品预处理液中，挤压盖玻片使虫体破裂，得到体液混合物；吸取10μl体液混合物，转移到预先装有10μl灭菌水的1.5ml离心管中。
2、液氮中速冻1分钟，65℃水浴20分钟，95℃水浴5min。
3、12000rpm离心5分钟，取5μl上清用作反应模板(基因组DNA)。
二、鉴定待测样本是否为象耳豆根结线虫
将5种根结线虫提取的基因组DNA分别进行LAMP反应。
1、反应体系和反应条件
在200μl PCR管中配制如下反应体系(25μl)：基因组DNA 5μl，LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水13μl。用等体积的阳性对照液作为基因组DNA的阳性对照，用等体积的双蒸水作为基因组DNA的阴性对照。
反应步骤：(1)63℃水浴50分钟；
(2)加入1μl探针溶液，继续63℃水浴5分钟，进行探针杂交(如不通过横流试验试纸条检测结果，本步骤舍去)；
(3)然后80℃加热5分钟终止反应。
2、结果判读
分别采用如下三种方法进行结果判读：
(1)取3μl反应产物进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1，有阶梯状条带出现为阳性结果，反之为阴性。象耳豆根结线虫结果为阳性；南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫、北方根结线虫和阴性对照均为阴性结果。
(2)在反应管中加入1μl 25×的荧光染料SYBR Green I，见图2。在可见光下，象耳豆根结线虫呈现绿色的阳性结果，其他线虫和阴性对照均为阴性的橙色。在紫外光下，象耳豆根结线虫呈现荧光信号为阳性结果，其它线虫和阴性对照没有呈现荧光信号，为阴性结果。
(3)取5μl反应液和20μl检测液混合，滴加于检测试纸条的样品涂抹区。在孵育过程中，检测线在试纸条中迁移，肉眼观察结果，见图3。象耳豆根结线虫同时出现检测线和控制线红色条带，视为阳性结果；南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫和阴性对照均只出现质控线，视为阴性结果。
三种检测方法结果一致。
实施例3、试剂盒的灵敏度检测
一、少量提取基因组DNA
1、收集新鲜孵化的2龄象耳豆根结线虫幼虫，在1.5ml离心管中离心清洗后形成10-20μL线虫沉淀块。
2、用镊子将此管及尖头玻璃棒液氮中冷冻30s，用力研磨成粉末。
3、加入700μL DNA提取缓冲液(含50mM Tris-HCl、pH 7.5，50mmol/L NaCl，5mM EDTA，0.5％SDS)和7μL的20mg/mL蛋白酶K，轻轻混匀。
4、将管放入50℃水浴4-5h。
5、接着分别用等体积的Tris饱和酚和氯仿/异戊醇各抽提1次，12000rpm离心10min。
6、取上清入一新管，加入0.1倍体积的3M NaAc(pH5.2)水溶液和2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀20min。
7、12000rpm离心10min，弃上清。
8、风干沉淀，将DNA溶解于40μL ddH2O中，-20℃保存备用。
二、梯度稀释
将象耳豆根结线虫的基因组DNA调整初始浓度为100ng/μl(溶液1；稀释度为100)，然后进行10倍系列梯度稀释，依次为10ng/μl(溶液2；稀释度为10-1)、1ng/μl(溶液3；稀释度为10-2)、100pg/μl(溶液4；稀释度为10-3)、10pg/μl(溶液5；稀释度为10-4)、1pg/μl(溶液6；稀释度为10-5)、100fg/μl(溶液7；稀释度为10-6)、10fg/μl(溶液8；稀释度为10-7)和1fg/μl(溶液9；稀释度为10-8)。
三、LAMP反应
在200μl PCR管中配制如下反应体系(25μl)：溶液(溶液1至溶液9中的任何一种)1μl，LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水17μl。
反应条件为：63℃水浴50分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。
四、PCR反应
PCR扩增体系：溶液(溶液1至溶液9中的任何一种)1μl，10×Ex Taq buffer2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，Me-F3(10μM)0.5μl，Me-R3(10μM)0.5μl，Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa Biotech Ltd.Cat#A1260)2μl(含2U)，16.5μlddH2O。
PCR反应条件：95℃2min；95℃20s，60℃30s，扩增30循环；72℃，5min。
五、琼脂糖凝胶电泳
分别将步骤三和步骤四的各个反应产物(3μl)进行1.8％琼脂糖凝胶电泳。结果见图4。采用本发明的引物组合物进行LAMP检测象耳豆根结线虫在100ng-10fg模板浓度范围内，有阶梯状条带出现，为阳性结果。而采用PCR检测，象耳豆根结线虫在100ng-1pg范围内有清晰条带，结果为阳性。结果表明，采用本发明的引物组合物基于LAMP方法检测象耳豆根结线虫，敏感度可达fg级，优于常规PCR。
Claims (10)
1.辅助鉴定象耳豆根结线虫的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成。
2.权利要求1所述专用引物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于辅助鉴定象耳豆根结线虫和/或检测待测样本是否含有象耳豆根结线虫。
3.一种含有权利要求1所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定象耳豆根结线虫和/或检测待测样本是否含有象耳豆根结线虫。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有Bst DNA聚合酶。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有5倍LAMP反应液和/或样品预处理液和/或荧光染料SYBR Green I和/或特异探针；
所述5倍LAMP反应液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述5倍LAMP反应液中的浓度如下：5mM dNTP、pH8.8100mM Tris-盐酸、50mM氯化钾、50mM硫酸铵、20mM硫酸镁、0.5％(体积比)曲拉通X-100和2M甜菜碱；
所述样品预处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、pH8.2 10mM Tris、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45％(体积比)吐温20和0.01％明胶；
所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列7所示。
6.权利要求1所述专用引物在辅助鉴定象耳豆根结线虫中的应用。
7.权利要求1所述专用引物在检测待测样本是否含有象耳豆根结线虫中的应用。
8.一种辅助鉴定象耳豆根结线虫的方法，是用权利要求1所述专用引物对待测线虫的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：
(1)加入SYBR Green I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的象耳豆根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非象耳豆根结线虫；
(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的象耳豆根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非象耳豆根结线虫；
(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的象耳豆根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非象耳豆根结线虫。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述待测线虫为南方根结线虫、爪哇 根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫或象耳豆跟结线虫。
10.一种辅助鉴定待测样本中是否感染象耳豆根结线虫的方法，是用权利要求1所述专用引物对待测样本的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：
(1)加入SYBR Green I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测样本中疑似含有象耳豆根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测样本中疑似不含有象耳豆根结线虫；
(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测样本中疑似含有象耳豆根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测样本中疑似不含有象耳豆根结线虫；
(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测样本中疑似含有象耳豆根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测样本中疑似不含有象耳豆根结线虫。
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