RU2778251C2 - Рекомбинантный химерный белок, состоящий из большой экстраклеточной петли человеческого рецептора CD81 и стрептавидина - Google Patents
Рекомбинантный химерный белок, состоящий из большой экстраклеточной петли человеческого рецептора CD81 и стрептавидина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2778251C2 RU2778251C2 RU2020143387A RU2020143387A RU2778251C2 RU 2778251 C2 RU2778251 C2 RU 2778251C2 RU 2020143387 A RU2020143387 A RU 2020143387A RU 2020143387 A RU2020143387 A RU 2020143387A RU 2778251 C2 RU2778251 C2 RU 2778251C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- hepatitis
- virus
- streptavidin
- extracellular loop
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 title abstract description 78
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 69
- 101700062651 CD81 Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102100019450 CD81 Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 8
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 210000000234 Capsid Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 101710004181 INTS2 Proteins 0.000 claims description 5
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 33
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 abstract description 10
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 abstract description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 abstract description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 abstract description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000003612 virological Effects 0.000 abstract description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 abstract description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 6
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 101710017489 VACWR058 Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 2
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 50
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 38
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 101700007624 PLB Proteins 0.000 description 19
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 19
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 18
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 17
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 17
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 14
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 14
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 14
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000002609 media Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 12
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 11
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 108091005939 superfolder green fluorescent protein Proteins 0.000 description 7
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101800001171 Leader peptide Proteins 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 6
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 6
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 6
- 241000186983 Streptomyces avidinii Species 0.000 description 5
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 229920000747 poly(lactic acid) polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N val-gly Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N (2S)-2-[[(2S)-2,5-diamino-5-oxopentanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101710034840 GLG6 Proteins 0.000 description 4
- 208000006454 Hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 101710043203 P23p89 Proteins 0.000 description 4
- 210000001322 Periplasm Anatomy 0.000 description 4
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 4
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 4
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 4
- QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 3
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 3
- 210000003000 Inclusion Bodies Anatomy 0.000 description 3
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine zwitterion Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 3
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 3
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 3
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- WUGMRIBZSVSJNP-UFBFGSQYSA-N Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UFBFGSQYSA-N 0.000 description 2
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- CPMKYMGGYUFOHS-FSPLSTOPSA-N Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CPMKYMGGYUFOHS-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Alanine Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FKBFDTRILNZGAI-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Cysteine Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101000005798 CD81 Proteins 0.000 description 2
- NXTYATMDWQYLGJ-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS NXTYATMDWQYLGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000033180 ERVK-6 Human genes 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)[C@@H](C)CC BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N 0.000 description 2
- HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 2
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N Lys-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 206010025650 Malignant melanoma Diseases 0.000 description 2
- OGGRSJFVXREKOR-CIUDSAMLSA-N Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC OGGRSJFVXREKOR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N Phenylalanyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 2
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 2
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N gly-val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 102000037264 human CD81 protein Human genes 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 2
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 2
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 2
- XITLYYAIPBBHPX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O XITLYYAIPBBHPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAONJAHBAUDJKA-BZSNNMDCSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BAONJAHBAUDJKA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- UCNNZELZXFXXJQ-BZSNNMDCSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCNNZELZXFXXJQ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N (2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N (3S)-3-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-(carboxymethylamino)-4-oxobutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]acetate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)[NH3+] ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JQDFGZKKXBEANU-UHFFFAOYSA-N Alanyl-Cysteine Chemical compound CC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O JQDFGZKKXBEANU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055216 Anti-Idiotypic Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N QYLJIYOGHRGUIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XTWSWDJMIKUJDQ-RYUDHWBXSA-N Arg-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XTWSWDJMIKUJDQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Asparagine Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Histidine Chemical compound NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 BNODVYXZAAXSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N Asn-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Aspartyl-L-proline Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003816 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N BNC210 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000024969 Bacterial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N Boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N Bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic hepatitis Diseases 0.000 description 1
- ZSRSLWKGWFFVCM-WDSKDSINSA-N Cys-Pro Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZSRSLWKGWFFVCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LVNMAAGSAUGNIC-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Histidine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 LVNMAAGSAUGNIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBIIZCXWOZDIHS-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS VBIIZCXWOZDIHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 230000036947 Dissociation constant Effects 0.000 description 1
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 1
- 101700079760 EFCB Proteins 0.000 description 1
- 101710005090 ERVFC1-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710038044 ERVK-6 Proteins 0.000 description 1
- 101710013371 ERVS71-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710027967 ERVW-1 Proteins 0.000 description 1
- 210000002969 Egg Yolk Anatomy 0.000 description 1
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N Gly-Cys Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C([O-])=O MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 108010009504 Gly-Phe-Leu-Gly Proteins 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N Guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 Hepatocytes Anatomy 0.000 description 1
- CTCFZNBRZBNKAX-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Glutamine Chemical compound NC(=O)CCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 CTCFZNBRZBNKAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 1
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N Isoamyl alcohol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229920001320 Leader sequence (mRNA) Polymers 0.000 description 1
- 229940067606 Lecithin Drugs 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N Leu-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N Lysyl-Asparagine Chemical compound NCCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N Met-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N Met-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O QXOHLNCNYLGICT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N Met-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N PMSF Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N Pro-Trp Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)[O-])C(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010075569 Rheumatoid Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710023234 Segment 5 Proteins 0.000 description 1
- UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N Ser-Gln Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N Ser-His Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 102000009332 Tetraspanins Human genes 0.000 description 1
- 108050000196 Tetraspanins Proteins 0.000 description 1
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N Thr-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Asparagine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Lysine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- YBRHKUNWEYBZGT-UHFFFAOYSA-N Tryptophyl-Threonine Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)C(=O)NC(C(O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YBRHKUNWEYBZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020713 Tth polymerase Proteins 0.000 description 1
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Aspartate Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700028070 VPX Proteins 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- YSGSDAIMSCVPHG-YUMQZZPRSA-N Val-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C YSGSDAIMSCVPHG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000016350 Viral Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M Xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 108010084758 arginyl-tyrosyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J dATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 108091006031 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034387 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N gly ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090037 glycyl-alanyl-isoleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010027668 glycyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010030617 leucyl-phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000009673 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 108010044655 lysylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 101700016463 pls Proteins 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological Effects 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 230000035943 smell Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 108010029384 tryptophyl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N α-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- ZQFAGNFSIZZYBA-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CCC(N)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 ZQFAGNFSIZZYBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к генной инженерии, конкретно к получению ловушек вируса гепатита С в виде рекомбинантных химерных белков, и может быть использовано в медицинской диагностике для обнаружения вируса гепатита С в биологических жидкостях. Разработан рекомбинантный химерный белок CD81-SAA, обладающий способностью связывать вирионы вируса гепатита С, который содержит аминокислотную последовательность большой экстраклеточной петли человеческого рецептора CD81, слитую с аминокислотной последовательностью стрептавидина. Причем для обеспечения возможности выделения белка на никель-агарозном сорбенте в структуру белка также была включена олигогистидиновая последовательность. Также предложены микрочастицы, состоящие из полимера молочной кислоты, к поверхности которых ковалентно присоединен созданный рекомбинантный белок. Предварительное биотинилирование полимерных микрочастиц позволило достичь более эффективного образования конгломератов за счет высокого сродства биотина к стрептавидину, входящему в состав рекомбинантного белка. Изобретение обеспечивает получение белка, способного связывать вирионы вируса гепатита С за счет специфического взаимодействия CD81 с белком Е2 вирусного капсида. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 пр.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии и генной инженерии и может быть использовано в медицинской диагностике для обнаружения вируса гепатита С в биологических жидкостях.
В современной клинической практике вирус гепатита С (ВГС) диагностируется с помощью иммуноферментных (ИФА) тест-систем 2-го и 3-го поколения. Этот метод основан на специфическом взаимодействии антител к вирусу гепатита С из сыворотки с рекомбинантными белками вируса гепатита С, которые затем связываются с вторичными антителами против иммуноглобулинов классов G и М (IgG или IgM), меченными ферментами, катализирующими развитие цветной реакции. В тест системах 2-го поколения используются антитела против эпитопов, полученных из core (С-22), NS3 (С-33) и NS4 (С-100) регионов вируса гепатита С [Pawlotsky J. Diagnostic testing in hepatitis С virus infection: viral kinetics and genomics // Semin. Liver. Dis. 2003. Vol.23. P. 3-11.].
Недостатком данного метода является продолжительный период, необходимый для появления специфических антител после инфицирования вирусом гепатита С (10 недель). Для того, чтобы сократить диагностическое окно используются иммуноферментные тест-системы 3-го поколения, сконструированные на основе антигена NS5 и высокоиммуногенного эпитопа NS3 регионов. Данное усовершенствование позволяет обнаруживать антитела к антигенам вируса гепатита С на 4-6-й неделе после инфицирования [Colin С., Lanoir D., Touzet S., Meyaud-Kraemer L., Bailly F., Trepo C. Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis С virus antibody detection assays: an analysis of the literature // J. Viral. Hepat. 2001. Vol.8. P. 87-95.].
Однако при использовании упомянутых тест-систем достаточно часто встречаются ложноположительные результаты определения антител к антигенам вируса гепатита С у пациентов с наличием ревматоидного фактора в крови, среди беременных, у пациентов с аутоиммунными заболеваниями и др. Ложноотрицательные результаты выявления антител к антигенам вируса гепатита С могут наблюдаться у пациентов, находящихся на гемодиализе или у лиц с тяжелой иммуносуппрессией, например у ВИЧ-инфицированных или больных с гематологическими злокачественными новообразованиями. Также существует множество генотипов и субтипов вируса гепатита С, которые не определяются с помощью ИФА. Приблизительно у 15% пациентов с хроническим заболеванием печени вирусной этиологии в крови не определяются серологические маркеры [Соринсои С.Н. Вирусные гепатиты. СПб.: Медицина, 1998, с. 128-133].
Наличие антител к антигенам вируса гепатита С не позволяет отдифференцировать начальную стадию заболевания от последующих. Часто определяются общие антитела к вирусу гепатита С, по которым нельзя сказать, острый или хронический гепатит мы наблюдаем в настоящее время. В латентную фазу и фазу клинической активности спектр антител идентичен. [С.В. Губкин, А.Л. Сычев, В.М. Мицура. Преимущества метода ПЦР в сравнении с обнаружением антител к вирусу гепатита С при лабораторной диагностике вирусного гепатита С // Медицинский журнал. 2009. №2. С. 153-154.]
Кроме того, для обнаружения виремии используется определение маркера вируса гепатита С - кор-антигена при помощи хемилюминесцентной детекции [Park Y., Lee B.S., Kim B.S. et al. New automated hepatitis С virus (HCV) core antigen assay as an alternative to real-time PCR for HCV RNA quantification // Clin. Microbiol. 2010. T. 48. C. 2253-2256]. Кор-антиген обнаруживается в плазме крови в период виремии при гепатите С, но на ранних стадиях заболевания антигены вируса гепатита С циркулируют в чрезвычайно низких концентрациях, что делает данный метод не эффективным для ранней диагностики вируса гепатита С. Кроме того, кор-антиген вируса гепатита С изменчив и может «ускользнуть» от антител, что повышает вероятность появления ложноотрицательных результатов. Так же к недостаткам данного метода относится высокая стоимость оборудования, необходимого для проведения данного анализа.
Преодолеть недостатки данных тест-систем позволяют методы молекулярной биологии для выявления нуклеиновых кислот вирусов, которые наиболее адекватно отражают активность вирусной репликации.
Обычно в практике осуществляют анализ на РНК вируса гепатита С методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [Takenobu Kamada, Norio Hayashi, Eiji Mita, Keiji Ueda. Patent Ep 0469348 A2 09.07.91]. Из исследуемого материала (сыворотка или плазма крови, печеночный биоптат) выделяют РНК вируса гепатита С. Учитывая, что нуклеиновая кислота вируса гепатита С представлена РНК, а для амплификации необходима молекула кДНК, при помощи фермента - обратной транскриптазы, происходит образование однонитевых молекул кДНК вируса гепатита С. На следующем этапе к определенному участку каждой из цепей кДНК вируса гепатита присоединяются праймеры - короткие олигонуклеотиды, комплементарные известным нуклеотидным последовательностям.
Сравнение первичной структуры 5'-нетранслируемой области генома различных изолятов вируса гепатита С выявило их незначительную изменчивость (между генотипами, гомология нуклеотидов - 92-98%, а внутри генотипа 98-99%). Это сделало предпочтительным выбор праймеров из этой зоны РНК вируса гепатита С и их применение в диагностических тест-системах, выпускаемых в России и за рубежом.
Далее, при помощи фермента ДНК-зависимой ДНК полимеразы происходит синтез новых участков ДНК. В настоящее время в качестве источника этого фермента чаще всего используют бактерии Thermophilus termus (Tth-полимераза) или Thermophilus aquaticus (Taq-полимераза). Многократное повторение циклов ПЦР приводит к накоплению фрагментов кДНК вируса гепатита С, которые возможно зарегистрировать при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с последующей визуальной детекцией или же с применением гибридизации с олигонуклеотидными зондами [М.И. Михайлов. Лабораторная диагностика гепатита С // Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. 2001. №2(12). С. 56-57]
В настоящее время для количественной детекции вирусной РНК используется ПЦР в реальном времени (real-time ПЦР). Недостатком методов, основанных на реакции обратной транскрипции и ПЦР фрагментов РНК вируса гепатита С, является их низкая чувствительность, требующая на момент проведения диагностики наличия в крови человека большого числа вирионов гепатита С.
Прототипом нашего изобретения является патент [Abrignani Sergio, Grandi Guido. Patent US 2012/0066779 A1 15.03.2012]. В нем речь идет об использовании белка CD81 для лечения и диагностики гепатита С. Описываются фармацевтические композиции, животные модели и диагностические наборы для этих применений. В основном, в патенте описаны возможные пути лечения вирусного гепатита С при помощи CD81, а также модели (клеточные, животные, in vitro модели) для поиска веществ, нарушающих взаимодействие вируса гепатита С с рецептором CD81 человека и некоторых животных, в том числе трансгенных животных. Некоторые аспекты патента относятся к диагностике вирусного гепатита С при помощи белка CD81. Предлагается использовать CD81 в иммуноферментном анализе (ИФА, ELISA) и в радиоиммунологическом анализе (RIA). Предлагается использовать анти- CD81-антитела в качестве антиидиотипических антител против вируса гепатита С. Предлагаются различные варианты использования антител и/или меченного белка Е2 для детекции взаимодействия вируса гепатита С с CD81. Перечисленные выше диагностические методики, предложенные в патенте [Abrignani Sergio, Grandi Guido. Patent US 2012/0066779 A1 15.03.2012], не применяются в нашем изобретении.
Разработанный нами способ включает создание белка слияния стрептавидина с большой экстраклеточной петлей CD81 и использование полученного белка для повышения чувствительности ПЦР-диагностики вируса гепатита С.
Стрептавидин - белок массой 60 кДа, впервые был выделен из бактерии Streptomyces avidinii и является аналогом авидина, выделенного из желтка куриного яйца. Стрептавидин, как и авидин, обладает высоким сродством к биотину (известному как витамин В7) и имеет гомотетрамерную структуру. Константа диссоциации комплекса витамина В7 и стрептавидина составляет примерно 10-17 моль/м3, что характеризует их связь как одно из самых сильных нековалентных взаимодействий в природе. Вторичная структура стрептавидинового мономера состоит из восьми антипараллельных β-нитей, которые сворачиваются в третичную бочкообразную структуру. Участок, отвечающий за связывание биотина, расположен на конце данной структуры. Четыре одинаковых стрептавидиновых мономера соединяясь, образуют четвертичную структуру. Биотинсвязывающий сайт находится внутри данной бочкообразной структуры и включает в себя несколько остатков, в том числе Trp120 из соседней субъединицы.
Предлагаемый способ включает создание плазмиды, обеспечивающей синтез белка слияния стрептавидина с большой экстраклеточной петлей CD81, трансформацию полученной плазмидой клеток E.coli, выращивание трансформированных E.coli с последующим их разрушением, выделение и очистку белка слияния стрептавидина с большой экстраклеточной петлей CD81.
Нами используется лишь сама молекула рецептора CD81 человека, а точнее ее небольшой фрагмент, называемый большой экстраклеточной петлей рецептора CD81 человека.
CD81 - мембранный белок из надсемейства тетраспанинов, продукт гена человека TSPAN28. В перечне последовательностей под номером SEQ ID No: 1 приведена аминокислотная последовательность белка CD81 человека. Аминокислотные остатки (а.к.о.) с 113 по 201 соответствуют большой экстраклеточной петле.
Основным преимуществом нашего изобретения является возможность концентрирования вирионов вируса гепатита С за счет тетрамерности созданной нами молекулы (фиг. 1, 2). На фиг. 1 изображен самособирающийся тетрамер химерного рекомбинантного белка слияния CD81 и стрептавидина (SAA - стрептавидин, CD81 - большая экстраклеточная петля человеческого рецептора CD81). На фиг. 2 изображены агрегаты вирионов, образованные за счет добавления в раствор CD81-SAA, HCV - вирион вируса гепатита С.Это позволяет увеличивать чувствительность существующих методов детекции ВГС за счет увеличения числа вирионов в объеме пробы для постановки реакции обоатной транскрипции с последующей ПЦР. В патенте [Abrignani Sergio, Grandi Guido. Patent US 2012/0066779 A1 15.03.2012] никак не затрагивается проблема повышения чувствительности каких-либо методик детекции ВГС, концентрирование вирионов не описано, рецептор CD81 или его фрагмент не синтезируется в форме какого-либо олигомера, в том числе в форме тетрамера.
В настоящее время основным источником стрептавидина является продуцент S. avidinii АТСС 27419, обладающий высокой природной устойчивостью к антибиотикам и требующий длительное время культивирования. Кроме того, при выделении стрептавидина из S. Avidinii, целевой белок часто загрязнен биотином [Proc. Natl. Acad. Sci. 1980. V. 77. P. 4666-4668; Biochem. Biophys. Methods. 1986. V. 13. P. 103-112; J. Immunol. Methods. 1988. V. 113. P. 83-91].
В связи с этим коммерческий стрептавидин в настоящее время, в основном, является рекомбинантным и получается в E.coli.
В международной заявке [PCT/US2006/016480 от 13.08.2009], предлагается способ экспрессии стрептавидина в питательную среду. Известен способ получения конструкции экспрессионной плазмиды для наработки стрептавидина в параплазматическом пространстве (pSAV27) [Вейко В.П., Гулько Л.Б., Дебабов В.Г., Дьяков Н.А., Окорокова Н.А., Соколов А.К., патент RU 2153535, опуб. 27.07.2000]. Получение плазмиды включает: выделение из S. avidinii M170791 нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид стрептавидина и зрелый белок (прострептавидин) с введением сайтов рестрикции; конструирование высококопийной pSAV27 плазмиды с ампицилиновым маркером; трансформация штамма E.coli JM110 полученной конструкцией; выращивание штамма-продуцента на LB-среде; лизирование полученной биомассы для выделения периплазматической фракции; определение биологической активности стрептавидина путем разделения в ПААГ продуктов связывания стрептавидина с синтетическим биотинилированным олигонуклеотидом. По сравнению с вышеприведенным методом выделения белка из телец включения, данный метод обладает значительным преимуществом. Плазмида pSAV27, несущая последовательность лидерного пептида вместе с нуклеотидной последовательностью гомотетрамерного стрептавидина, селективно экспрессирует белок в периплазматическое пространство, где он локализируется в биологически активном состоянии.
Указанные выше патенты и публикации описывают получение не химерного стрептавидина, то есть стрептавидина, не связанного с какими-либо другими белками или пептидами. Предлагаемым нами изобретением является рекомбинантный химерный стрептавидин, включающий в себя как аминокислотную последовательность стрептавидина, так и последовательность фрагмента другого белка, а именно CD81 человека. С точки зрения химерного стрептавидина, аналогом заявляемого изобретения является способ получения рекомбинантного химерного белка стрептавидина и меланома-адресующего олигопептида [Рубцов М.А., Сыркина М.С., Вейко В.П., Окорокова Н.А., Замятнин А.А., Патент RU 2577138, опуб. 10.03.2016]. В описанном способе предлагается культивирование E.coli, трансформированных плазмидой, кодирующей белок слияния стрептавидина и меланома-адресующего олигопептида. Авторы описывают выделение целевого белка из периплазмы E.coli. Получаемый таким образом белок может быть использован для диагностики меланомы. Заявляемое нами изобретение отличается от [Рубцов М.А., Сыркина М.С., Вейко В.П., Окорокова Н.А., Замятнин А.А., Патент RU 2577138, опуб. 10.03.2016] тем, что мы не используем меланома-адресующий олигопептид в составе получаемого белка, целью нашего изобретения является диагностика вирусного гепатита С. Соответственно, в нашем случае стрептавидин соединен с CD81 человека, получаемый белок не может быть использован для диагностики меланомы, но может быть использован для диагностики гепатита С.
Технической задачей, решаемой предлагаемым нами изобретением, является создание химерного белка, который можно использовать для осуществления диагностики вируса гепатита С на основе детекции вирусной РНК вируса гепатита С при помощи ПЦР.
Техническим результатом является повышение чувствительности существующих методов диагностики вируса гепатита С на основе ПЦР-анализа, для чего разработана генетическая конструкция, обеспечивающая синтез белка слияния стрептавидина с большой экстраклеточной петлей CD81 (SAA-CD81), при этом каждый из четырех мономеров стрептавидина ковалентно связан с молекулой большой экстраклеточной петли CD81 (фиг. 1). В перечне последовательностей под номером 2 (SEQ ID No: 2) приведена аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного белка CD81-SAA. А.к.о. с 3 по 91 соответствуют большой экстраклеточной петле CD81, а.к.о. с 95 по 222 соответствуют последовательности стрептавидина (SAA).
На фиг 3 изображены: А - мономер стрептавидина, Б - белок Е2 капсида вируса гепатита С, В - химерный белок слияния СВ81 и стрептавидина. Стрептавидин - бактериальный белок с молекулярной массой около 60 кДа, впервые выделенный из бактерий Streptomyces avidinii. Вторичная структура мономера стрептавидина состоит из восьми антипараллельных β-нитей, которые сворачиваются в третичную бочкообразную структуру. Четвертичная структура данного белка представляет собой гомотетрамер, состоящий из четырех мономеров стрептавидина. Вирус гепатита С проникает в клетки, в частности в гепатоциты, используя большую экстраклеточную петлю CD81. Идея данного изобретения заключается в том, что рекомбинантные аналоги этого рецептора могут служить в качестве соединения, антигенно неспецифично связывающего вирусные частицы. Использование для этой цели антител против антигенов гепатита С недостаточно эффективно, так как данный вирус обладает высокой вариабельностью, что позволяет ему постоянно «ускользать» от иммунного ответа. Соответственно, невозможно искусственно получить такие антитела, которые связывали бы все образующиеся в организме больного типы вируса гепатита С. При этом все типы этого вируса обязательно способны связывать большую экстраклеточную петлю CD81. Синтезированный нами рекомбинантный белок слияния стрептавидина и большой экстраклеточной петли CD81 связывает поверхностный лиганд большой экстраклеточной петли CD81, а именно Е2 - поверхностный белок вируса гепатита С.
Предлагаемый нами рекомбинантный белок слияния может увеличить чувствительность обратной транскрипции (с последующей вирус-специфичной ПЦР) за счет увеличения количества вирионов в пробе. Каждая молекула SAA-CD81 является тетрамером и содержит по 4 фрагмента большой экстраклеточной петли CD81, взаимодействующего с Е2 (фиг. 1). Таким образом, каждая молекула SAA-CD81 может связывать более одного вириона вируса гепатита С за счет взаимодействия с белком Е2. Вирион гепатита С содержит много молекул Е2 на своей поверхности, следовательно, каждая вирусная частица может связывать более одной молекулы SAA-CD81. Это позволяет образовывать конгломерат, состоящий из большого числа вирионов, связанных между собой химерными белками стрептавидина с большой экстраклеточной петлей CD81. Полученный конгломерат может быть легко осажден центрифугированием (фиг. 2).
Белок CD81-SAA содержит присущие стрептавидину активные центры, связывающие с высокой аффинностью биотин и биотинилированные молекулы, что позволяет сорбировать на биотинилированном высокомолекулярном носителе CD81-SAA, в том числе CD81-SAA, предварительно связавший ВГС. Таким носителем могут быть, например, микрочастицы, состоящие из полимера молочной кислоты. Кроме того, белок CD81-SAA может быть присоединен к микрочастицам иными способами, в том числе при помощи ковалентной химической связи, в том числе с использованием линкеров (фиг. 4). На фиг. 4 изображены вирионы вируса гепатита С, сорбированные на микрочастице при помощи CD81-SAA.
CD81-SAA, также как и стрептавидин, является тетрамерным белком, что выгодно отличает CD81-SAA от свободного CD81 или от большой экстраклеточной петли человеческого рецептора CD81.
Тетрамерная четвертичная структура CD81-SAA позволяет одной молекуле данного белка связывать более одного вириона вируса гепатита С (ВГС) за счет специфического взаимодействия с белка Е2 капсида вируса гепатита С и рецептора CD81. Вирион ВГС может связываться более, чем с одной молекулой человеческого рецептора CD81, таким образом, вирионы ВГС, при добавлении раствора CD81-SAA, могут образовывать агрегаты, состоящие из нескольких вирионов. Такие агрегаты легко осаждаются центрифугированием за счет своего большого размера.
Белок CD81-SAA содержит присущие стрептавидину активные центры, связывающие с высокой аффинностью биотин и биотинилированные молекулы, что позволяет сорбировать на биотинилированном высокомолекулярном носителе CD81-SAA, в том числе белок CD81-SAA, предварительно связавший ВГС.
При синтезе CD81-SAA в E.coli стрептавидиновая часть обеспечивает накопление получаемого целевого белка в тельцах включения, что позволяет удешевить и облегчить производство CD81-SAA по сравнению со свободным CD81 или с большой экстраклеточной петли человеческого рецептора CD81.
Таким образом, был создан рекомбинантный химерный белок CD81-SAA, обладающий способностью связывать вирионы вируса гепатита С за счет специфического взаимодействия CD81 с белком Е2 капсида вируса гепатита С, характеризующийся последовательностью SEQ ID No: 2. и отличающийся тем, что содержит не только аминокислотную последовательность большой экстраклеточной петли человеческого рецептора CD81, но и аминокислотную последовательность стрептавидина. Для обеспечения возможности выделения белка на никель-агарозном сорбенте в структуру белка также была включена олигогистидиновая последовательность.
Кроме того, для создания специфических для вируса ловушек за счет взаимодействия рецептора CD81 с вирионами вируса гепатита С, созданный рекомбинантный белок ковалентно присоединяли к поверхности микрочастиц, состоящих из полимера молочной кислоты. Предварительное биотинилирование полимерных микрочастиц позволило достичь более эффективного образования конгломератов за счет высокого сродства биотина к стрептавидину, входящему в состав рекомбинантного белка.
Пример 1. Создание плазмиды pET22b+-SA-CD81(pelB+)
Для создания плазмиды, которая включает нуклеотидную последовательность стрептавидина дикого типа, слитого с большой экстраклеточной петлей CD81, pelB-лидерным пептидом и олигогистидиновой последовательность, использовали исходный вектор pET22b(+) [Novagen, рЕТ System Manual, 11th Ed.], содержащий ген устойчивости к ампициллину, олигогистидиновую последовательность и нуклеотидную последовательность pelB-лидерного пептида [Novagen, рЕТ System Manual, 11th Ed.], необходимого для направленного транспорта белка в периплазму.
Для наработки исходного вектора pET22b(+)использовали штамм E.coli DH5(α). К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+). Затем инкубировали во льду 15 минут. Для осуществления теплового шока суспензию клеток инкубировали в течение 5 минут при 42°С на водяной бане, с последующей инкубацией во льду 2 минуты. К суспензии добавили 900 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37°С. Клетки высевали на чашки, содержащие агаризованную LB-среду с ампициллином (100 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 37°. Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET22b(+), выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием и использовали для выделения плазмидной ДНК фенол-хлороформным методом. Супернатант сливали, остаток клеток ресуспендировали в 4 мл среды и осаждали центрифугированием, затем супернатант снова сливали. Добавляли по 200 мкл раствора I в каждую пробирку. Раствор I имеет следующий состав: 50 мМ глюкозы, 25 мМ TrisHCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0. Смесь ресуспендировали на вортексе и добавляли по 400 мкл раствора II, следующего состава: 0.2Н NaOH, 1% SDS. Получившуюся суспензию перемешивали быстрым переворачиванием в течение 5 минут и добавляли по 300 мкл раствора III (5М CH3COOK, 11.5% СН3СООН), несколько раз переворачивали и инкубировали во льду в течение 5 минут. Клетки осаждали центрифугированием и отбирали по 600 мкл суспензии и переносили в чистые эппендорфы и затем добавляли по 600 мкл изопропилового спирта (-200С). Затем суспензию инкубировали при -200С в течение 10 минут и осаждали центрифугированием. Спирт сливали и осадок высушивали. Растворяли осадок в 200 мкл воды. Добавляли 250 мкл смеси фенол: хлороформ (1:1) и перемешивали. Суспензию осаждали центрифугированием, супернатант отбирали и добавляли 250 мкл смеси хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) и перемешивали. Суспензию осаждали центрифугированием. Получившийся супернатант отбирали, добавляли 2.5 объема 96% этилового спирта и инкубировали при -200С в течение 30 минут. Затем осаждали центрифугированием, спирт сливали и добавляли 1 мл 70% этилового спирта. Затем смесь осаждали центрифугированием, спирт сливали. Высушивали осадок до исчезновения запаха спирта. Осадок растворяли в 200 мкл воды. Полученную плазмидную ДНК разделяли в 0.8% агарозном геле. Состав геля: 0.8% агароза; 0.5х ТВЕ буфер; 1 мкг/мл этидиум бромид. Состав буфера для образцов: 30% -ный глицерин (v/v); 0.025% ксиленцианол (w/v); 0.025% бромфеноловый синий (w/v). Электродный буфер: 0.5х буфер ТВЕ. Состав 10х буфера ТВЕ: 890 мМ Tris; 890 мМ борная кислота (рН 8.0); 20М EDTA.
Для приготовления геля смесь компонентов прогревали до полного растворения агарозы, после чего охлаждали до 500С, добавляли бромид этидия до концентрации 0.5 мг/мл и заливали на горизонтальную платформу размером 80×110 мм. Толщина геля составляла 5 мм. Напряженность электрического поля составляла 5 В/см В качестве маркеров использовали коммерческие маркеры 250-10000 п. н. («Медиген»). Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием специального набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США).
Для вставки нуклеотидной последовательности стрептавидина дикого типа (SA) в исходную плазмиду использовались «липкие концы», получаемые за счет обработки вектора эндонуклеазми рестрикции NcoI и XhoI. Реакционная смесь рестрикции имела следующий состав (V=60 мкл, t0=37°C, 1 час): pET22b(+): 22 мкл; NcoI 2,5 мкл; XhoI 2,5 мкл; 10Хбуфер 6 мкл; H2O 27 мкл.
После процедуры гидролиза, получившийся линейный вектор подвергался электрофоретическом разделению в 0.8% агарозном геле с использование протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием специального набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США). Для наработки необходимого количества нуклеотидной последовательности SA проводили ПЦР с использованием специально подобранных олигонуклеотидов.
В качестве матрицы для наработки нуклеотидной последовательности использовалась плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность стрептавидина дикого типа [J Chromatogr А. 1994 Aug 5; 676(2):337-45]. Для получения нуклеотидной последовательности нами были подобраны специальные олигонуклеотиды, которые представлены в перечне последовательностей под номерами SEQ ID No: 3 и SEQ ID No: 4.
f-SA-NCO: 5'- (SEQ ID No: 3) ctgccatggctgaagctggtatcacc - олигонуклеотид с сайтом рестрикции для NcoI и последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина -
r-SA-stop-XHO: 5'- (SEQ ID No: 4) ctgctcgagtcattaggaagcagcggacggtt - с сайтом рестрикции XhoI и последовательностью комплементарной последовательности гена стрептавидина.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в реакционной смеси конечным объемом 30 мкл. Состав реакционной смеси: Олигонуклеотиды (прямой и обратный) по 10 пМоль; Буфер для Taq-полимеразы x1, (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 6 нМоль; MgCl2 50 нМоль; Taq-полимераза 1 единица.
ПЦР проводилась в микроцентрифужных пробирках объемом 0.5 мл на аппарате «Терцик» (Россия) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР. Была проведена амплификация нуклеотидных последовательностей методом ПЦР. Температурный профиль ПЦР: 5 минут 950С, 1 минута 950С (денатурация), 1 минута Т0отжига=560С 30 циклов, 1 минута 720С (достройка), 5 минут 720С.
Встраивание нуклеотидной последовательности SA в плазмиду pET22b(+) производили следующим способом. Полученные продукты амплификации нуклеотидной последовательности SA обрабатывали эндонуклеазами рестрикции XhoI и NcoI. Состав реакционной смеси для NcoI и XhoI (V=60 мкл, t0=370C, 1 час): нуклеотидная последовательность SA: 35 мкл; NcoI 2,5 мкл; XhoI 2,5 мкл; 10Хбуфер 6 мкл; H2O 16 мкл.
Таким образом, нами были подготовлены плазмида pET22b(+)/NcoI/XhoI и продукты амплификации нуклеотидной последовательности SA, имеющие идентичные липкие концы. Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности SA смешивались с подготовленным вектором и затем лигировались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/20. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10мкл.): нуклеотидная последовательность SAD 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Лигирование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция, названная нами pEP22b(+)-SA(pelB+), кодирующая белок SA с PelB-лидерным пептидом и олигогистидиновой последовательностью.
Отбор колоний, содержащих плазмиды со вставкой нуклеотидной последовательности SA, производился следующим образом. Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+)-SA(pelB+) и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик ампициллин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к ампициллину, содержащие плазмиды - продукты лигирования.
Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET22b(+)-SA(pelB+), выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием при 4000 об/мин на центрифуге К23 при 40С в течение 30 минут и использовали для выделения плазмидной ДНК методом подробно изложенным выше в тексте.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидная последовательность целевой генетической конструкции дополнительно была исследована с помощью секвенирования по Сэнгеру [J.Mol.Biol. 1975. V. 94. Р. 441-446].
Встраивание нуклеотидной последовательности, кодирующей большую экстраклеточную петлю CD81 в плазмиду pEP22b(+)-SA(pelB+) производили следующим способом. Полученный ранее вектор подготавливали к вставке нуклеотидной последовательности большой экстраклеточной петли CD81. Для этого вектор подвергался рестрикции по сайту NcoI. После процедуры гидролиза, получившийся линейный вектор подвергался электрофоретическом разделению в 0.8% агарозном геле с использование протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США).
Продукты амплификации нуклеотидной последовательности большой экстроклеточной петли CD81 предварительно обрабатывались эндонуклеазой рестрикции NcoI. Реакционная смесь для NcoI. (V=60 мкл, t0=370C, 1 час): нуклеотидная последовательность экстраклеточной петли CD81: 35 мкл; NcoI. 4 мкл; 10Хбуфер 6 мкл; Н2О 15 мкл.
Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности большой экстраклеточной петли CD81 смешивались с подготовленным вектором и затем лигировались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/100. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10мкл.): нуклеотидная последовательность большой экстроклеточной петли CD81 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Лигирование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция, условно названная нами pEP22b(+)-SA-CD81(pelB+), экспрессирующая нуклеотидную последовательность SA, сцепленную с нуклеотидной последовательностью большой экстраклеточной петли CD81, олигогистидиновой последовательностью и с pelB-лидерным пептидом.
Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pEP22b(+)-SA-CD81(pelB+) и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик ампициллин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к ампициллину, содержащие плазмиды - продукты лигирования. Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pEP22b(+)-SA-CD81(pelB+), выращивали при 37°С в условиях аэрации, осаждали центрифугированием и использовали для выделения плазмидной ДНК.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидную последовательность целевой генетической конструкции проверяли с помощью секвенирования по Сэнгеру [J.Mol.Biol. 1975. V. 94. Р. 441-446].
Пример 2. Создание плазмиды pET22b+-SA- CD81(pelB-)
Для создания плазмиды, которая включает нуклеотидную последовательность стрептавидина дикого типа, слитого с большой экстраклеточной петлей CD81 и олигогистидиновой последовательностью, был использован исходный вектор pET22b(+) [Novagen, рЕТ System Manual, 11th Edition], содержащий ген устойчивости к ампициллину и олигогистидиновую последовательность, которая была необходима для последующей очистки целевого белка на никель-агарозном сорбенте. Для наработки исходного вектора pET22b(+) был использован штамм E.coli DH5(α). К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+) и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET22b(+), выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием и использовали для выделения плазмидной ДНК методом подробно изложенным выше в тексте. Полученную плазмидную ДНК разделяли в 0.8% агарозном геле с использование протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США).
Для вставки фрагментов нуклеотидной последовательности стрептавидина дикого типа (SA) в исходную плазмиду, использовались «липкие концы», получаемые за счет обработки вектора эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI. В данном случае вектор разрезался по сайту эндонуклеазы рестрикции NdeI для получения варианта генетической конструкции не несущей в себе последовательность pelB-лидерного пептида. Реакционная смесь рестрикции для NdeI и XhoI имела следующий состав: (V=60 мкл, t0=370C, 1 час): pET22b(+): 22 мкл, NdeI 2,5 мкл, XhoI 2,5 мкл, 10Хбуфер 6 мкл, H2O 27 мкл.
После процедуры гидролиза, получившийся линейный вектор подвергали электрофоретическому разделению в 0.8% агарозном геле с использованием протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля. Для наработки необходимого количества нуклеотидной последовательности SA проводили ПЦР с использованием специально подобранных олигонуклеотидов. В качестве матрицы для наработки нуклеотидной последовательности использовали плазмиду, содержащую нуклеотидную последовательность стрептавидина дикого типа [J Chromatogr А. 1994 Aug 5; 676(2):337-45]. Для получения нуклеотидной последовательности SA нами были подобраны специальные олигонуклеотиды, которые представлены в перечне последовательностей под номерами SEQ ID No: 4 и SEQ ID No: 5.
r-SA-XHO: 5'- (SEQ ID No: 4) ctgctcgagggaagcagcggacggtt - олигонуклеотид с сайтом рестрикции для XhoI, характеризующийся последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина.
f-SA-NDE: 5'- (SEQ ID No: 5) ctgttatgctgaagctggtatcacc - олигонуклеотид с сайтом рестрикции для NdeI и характеризующийся последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина.
Встраивание нуклеотидной последовательности SA в плазмиду pET22b(+) проводилось следующим способом. Полученные продукты амплификации SA предварительно обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NdeI и XbaI. Состав реакционной смеси для NdeI и XhoI (V=60 мкл, t0=370С, 1 час): нуклеотидная последовательность SA: 35 мкл, NdeI 2,5 мкл, XhoI 2,5 мкл, 10Xбyфep 6 мкл, Н2О 16 мкл.
Таким образом, нами были подготовлены плазмида pET22b(+)/NdeI /XhoI и продукты амплификации нуклеотидной последовательности SA, имеющие идентичные липкие концы. Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности SA смешивались с подготовленным вектором и затем лигировались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/20. Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10мкл.): нуклеотидная последовательность SA 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Лигирование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция, условно названная нами pEP22b(+)-SA(pelB-), экспрессирующая ген SA, сцепленный с олигогистидиновой последовательностью.
Отбор колоний, содержащих плазмиды со вставкой нуклеотидной последовательности SA, производили следующим способом. Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+)-SA(pelB-) и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик ампициллин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к ампициллину, содержащие плазмиды - продукты лигирования.
Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET22b(+)-SA(pelB-), выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием при 4°С в течение 30 минут и использовали для выделения плазмидной ДНК методом подробно изложенным выше в тексте.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидная последовательность целевой генетической конструкции дополнительно была исследована с помощью секвенирования по Сэнгеру.
Встраивание нуклеотидной последовательности, кодирующей большую экстраклеточную петлю CD81 в плазмиду pEP22b(+)-SA(pelB-) производилось следующим способом. Полученный ранее вектор подготавливали к вставке нуклеотидной последовательности большой экстраклеточной петли CD81. Для этого вектор подвергался рестрикции по сайту NdeI. Состав реакционной смеси для NdeI (V=60мкл, t0=370C, 1 час): pET22b(+)-SA(pelB-): 22 мкл, NdeI 4 мкл, 10Хбуфер 6 мкл, Н2О 28 мкл.
После процедуры гидролиза получившийся линейный вектор подвергали электрофоретическому разделению в 0.8% агарозном геле.
Продукты амплификации нуклеотидной последовательности большой экстраклеточной петли CD81 предварительно обрабатывались эндонуклеазой рестрикции NdeI. Реакционная смесь для NdeI_(V=60 мкл, t0=370C, 1 час): нуклеотидная последовательность большой экстроклеточной петли CD81: 35 мкл, NdeI 4 мкл, 10Xбyфep 6 мкл, Н2О 15 мкл.
Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности большой экстроклеточной петли CD81 смешивались с подготовленным вектором и затем лигировались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/100. Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10мкл.): нуклеотидная последовательность большой экстраклеточной петли CD81 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Лигирование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция условно названная нами pEP22b(+)-SA-CD81(pelB-), экспрессирующая нуклеотидную последовательность SA, сцепленную с нуклеотидной последовательностью большой экстраклеточной петли CD81 и олигогистидиновой последовательностью.
Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+)-SA-CD81(pelB-) и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик ампициллин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к ампициллину, содержащие плазмиды - продукты лигирования.
Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET22b(+)-SA-CD81(pelB-), выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием и использовались для выделения плазмидной ДНК, изложенным выше в тексте.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидная последовательность целевой генетической конструкции проверялась с помощью секвенирования по Сэнгеру.
Пример 3. Трансформация штамма E.coli BL21(DE3) конструкциями pET22b+-SA-CD81(pelB+) и pET22b+-SA-CD81(pelB-).
Полученные конструкции pET22b+-SA-CD81 (pelB+) и pET22b+-SA-CD81(pelB-) были использованы для трансформации клеткок E.coli BL21(DE3). Для этого к одной суспензии компетентных клеткок E.coli BL21(DE3) (100 мкл) добавили от 100 нг плазмидной ДНК pET22b+-SA-CD81(pelB+), а к другой суспензии компетентных клеткок E.coli BL21(DE3) (100 мкл) от 100 нг плазмидной ДНК pET22b+-SA-CD81(pelB-). Затем инкубировали во льду 15 минут. Для осуществления теплового шока суспензию клеток инкубировали в течение 5 минут при 42°С на водяной бане, с последующей инкубацией во льду 2 минуты. Добавляли 900 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37°С. Клетки высевали на чашки, содержащие агаризованную LB-среду с ампицилином (100 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 37°.
Пример 4.
Культивирование штамма E.coli BL21(DE3)/pET22h(+)-SA-CD81(pelB+) и E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-SA-CD81(pelB-).
Полученные трансформаты E.coli BL21(DE3)/pET22b(+) SA-CD81(pelB+) и E.coli BL21(DE3)/pET22b(+) -SA-CD81(pelB-) засевали в две раздельные колбы с LB-средой (10 мл) с добавлением ампмциллина (100 мкг/мл) и растили в течение ночи при 37°С при постоянном покачивании. Утром инокулят переливали в 500 мл LB-среды. Для селекции трансформированных клеток производилось добавление антибиотика ампициллина (в расчете 100 мкг и 50 мкг соответственно на 1 мл среды). Клетки выращивали при 37°С в условиях аэрации до плотности А600=0.6-1. Синтез белка индуцировали добавлением IPTG (0,5 ммоль/л), культивирование E.coli BL21(DE3)/pET22b(+) -SA-CD81(pelB+) продолжали в течение ночи при 26°С, культивирование E.coli BL21(DE3)/pET22b(+) -SA-CD81(pelB-) продолжали в течение ночи при 37°С.
Пример 5.
Выделение белка слияния из культуральной среды E.coli BL21(DE3)/pET22b(+) -SA-CD81 (pelB+).
Бактериальные клетки отделяли от среды культивирования путем центрифугирования. Среду культивирования подвергали хроматографической очистке на металл-хелатном никелевом сорбенте (Invitrogen) (объем колонки 1.5 мл), согласно стандартному протоколу производителя.
Пример 6. Выделение белка слияния из периплазматической фракции E.coli BL21(DE3)/pET22b(+) -SA-CD81(pelB+)
После отделения бактериальных клеток путем центрифугирования в течение 15 минут при 10 000 g, периплазматическую фракцию получали методом «осмотического шока» [Current Protocols in Molecular Biology. 1989. John Wiley & Sons, New York]. Белок слияния был аффинно очищен на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте. Для этого к полученному содержимому периплазмы бактерий добавляли фенилметилсульфонилфторид и имидазол (конечная концентрация 1 mM и 10 mM соответственно). Раствор фильтровали через металл-хелатный сорбент. Балластные белки отмывали 0,5 м раствором NaCl на 0,1 M К-фосфатном буфере, рН=8,0, содержащем 20 мМ имидазола. Далее белок элюировали 0,15 М NaCl, рН=7,4, содержащем 200 мМ имидазола.
Пример 7. Выделение белка слияния из растворимой клеточной фракции E.coli BL21(DE3)/pET22b(+) -SA-CD81(pelB-)
Клетки ресуспендировали в ФБР и осаждали, а затем разрушали ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора в условиях охлаждения с добавлением стеклянных шариков (Glass Beads, 500 microns, Sigma). Затем супернатант и клеточную массу разделяли, предварительно убрав стеклянные шарики, на центрифуге. Профильтрованный через бумажный фильтр супернатант подвергали хроматографической очистке на металл-хелатном никелевом сорбенте, согласно стандартному протоколу производителя.
Пример 8. Выделение белка слияния из телец включения E.coli BL21(DE3)/pET22b(+) -SA-CD81 (pelB-)
Осадок клеток, оставшийся после выделения из растворимой клеточной фракции, отмывали ФБР, растворяли в 6 М гуанидин-хлориде рН 1.5 и оставляли на 1 ч. Затем осадок центрифугировали. Профильтрованный через бумажный фильтр супернатант подвергали хроматографической очистке на металл-хелатном никелевом сорбенте, согласно стандартному протоколу производителя, предварительно доводя рН супернатанта до 7.
Профильтрованный через бумажный фильтр супернатант подвергали хроматографической очистке на металл-хелатном никелевом сорбенте.
Пример 9. Получение частиц на основе полимолочной кислоты (ПМК)
Частицы на основе ПМК получали методом одинарной эмульсии. 300 мг ПМК (молекулярная масса 15 000 - 30 000) растворяли в 7.5 мл дихлорметана (4 масс./об.%), содержащего 50 мг лецитина. Полученную «маслянную» фазу диспергировали в 75 мл охлажденного льдом водного раствора додецилсульфата натрия (1 масс. %) и Lutrol F-68 (5 масс. %) с применением ультразвукового диспергатора (Sonopuls HD2070, Bandelin, Germany) и магнитной мешалки (MR Hei-Mix S, Heidolph, Germany) при скорости перемешивания 750 об./мин. Полученную эмульсию разбавляли в 250 мл охлажденного льдом 1 масс. % водного раствора поливинилового спирта (молекулярная масса 70 000). Дихлорметан удаляли испарением с использованием роторного испарителя (Hei-VAP Precision ML/G3B, Heidolph, Germany) при остаточном давлении 100 мБар в течение 2-3 часов. Образовавшиеся частицы выделяли центрифугированием при 10 000 g и промывали водой.
Пример 10. Связывание белка β2M-sfGFP с частицами
На первом этапе производили активацию частиц. Генерировали карбоксильные группы на поверхности частиц за счет их обработки 0,1 М раствором NaOH: навеску частиц помещали в пластиковую центрифужную пробирку, прибавляли 0,1 М раствор NaOH, перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, центрифугировали и отбирали надосадочную жидкость. После этого частицы промывали 4-5 раз водой (центрифугируя раствор и отбирая надосадочную жидкость). Следующим этапом связывания являлась активация карбоксильных групп на поверхности частиц с помощью N-гидроксибензотриазола (НОВТ) и гидрохлорида (N-3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимида (CDI). Реакцию проводили в 0,05 М буферном растворе 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (МЭС) рН 5,6. После частицы промывали 5 раз водой, центрифугируя и отбирая надосадочную жидкость. Далее осуществляли связывание на поверхности частиц флуоресцентного белка. В 0,1 М боратном буферном растворе, рН 8.4, растворяли белок, перемешивали и выдерживали раствор при комнатной температуре 15-20 мин, далее этот раствор добавили к частицам, перемешивали на качалке при комнатной температуре 2 ч. После частицы промывали 5 раз водой, центрифугируя и отбирая надосадочную жидкость.
Пример 11. Связывание вирусного белка E2-sfGFP с рецептором CD81, конъюгированным на частицах.
Были созданы микрочастицы из полимолочной кислоты (PLAMP) с иммобилизированной на поверхности большой экстраклеточной петлей CD81 человека (LELCD81). Для лучшей визуализации на конфокальном микроскопе было проведено фракционирование полученных частиц. Тщательно ресуспендированные в PBS частицы PLAMP-LELCD81 последовательно центрифугировались при 0,8 g в течение 3 минут и при 1,5 g в течение 3 минут.Осадки, содержащие крупные частицы (2-5 мкм и 0,8-2 мкм соответственно) отбирались для дальнейших экспериментов. Цель - установить, взаимодействуют ли частицы PLAMP-LELCD81 с созданной нами «зеленой» моделью вируса гепатита С (см. выше раздел «Получение белка слияния оболочечного белка Е2 core вируса гепатита С с зеленым флуоресцентным белком Superfolder»). Для этого мы взяли 2 белка: E2-sfGFP и контрольный белок sfGFP. Оба белка проинкубировали с частицами PLAMP-LELCD81, после чего частицы отмыли и подвергли конфокальной флуоресцентной микроскопии (рисунок 33). Оказалось, что поверхность частиц, проинкубированных с Е2-sfGFP, обладает зеленой флуоресценцией при облучении синим лазером. При этом поверхность частиц, проинкубированных с контролем - sfGFP - при тех же условиях микроскопирования флуоресценцией не обладает.Ниже приведен протокол данного опыта.
К суспензии, содержащей крупные частицы PLAMP-LELCD81 (в 500 мкл PBS), был добавлен зеленый белок E2-sfGFP до конечной концентрации 0,5 мг/мл. В контрольном эксперименте вместо E2-sfGFP было добавлено столько же молей sfGFP. Полученные смеси инкубировались 1 час при комнатной температуре при постоянном перемешивании. После этого PLAMP были осаждены центрифугированием при 12000 g в течение 15 минут и затем отмыты (тщательно ресуспендированы в 500 мкл PBS и снова инкубированы 15 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании). После повторного осаждения PLAMP (12000 g в течение 15 минут) супернатант был слит, а осадок ресуспендирован в 50 мкл PBS. Полученная суспензия была проанализирована при помощи SDS-электрофореза и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (фиг. 5, 6). В результате PLAMP-LELCD81, проинкубированные с E2-sfGFP, обладают яркой зеленой флуоресценцией при облучении лазером с длиной волны 488 нм (фиг. 5). При этом контрольные PLAMP-LELCD81, проинкубированные с sfGFP, зеленой флуоресценцией не обладают (фиг. 6). Фотографии сделаны одновременно при одинаковых настройках микроскопа.
На фиг. 5 приведены 2 поля зрения микрочастиц на основе ПМК с иммобилизированной на поверхности большой экстраклеточной петлей CD81 человека (PLAMP-LELCD81) после инкубации с E2-sfGFP. На фиг. 6 приведены 2 поля зрения микрочастиц на основе ПМК с иммобилизированной на поверхности большой экстраклеточной петлей CD81 человека (PLAMP -LELCD81) после инкубации с sfGFP. Слева: флуоресценция sfGFP при возбуждении лазером с длиной волны 488 нм; по центру: дифференциально-интерференционный контраст (DIC); справа: совмещенное изображение. Конфокальные изображения получали с использованием инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа «LSM 510 Meta» (Zeiss, Германия), с иммерсионным объективом C-Apochromat 40×/1.2 W Korr UV-VIS-IR М27. Флуоресценцию sfGFP детектировали с использованием оптического фильтра 505 нм при возбуждении флуоресценции лазером с длинной волны 488 нм. В проходящем свете изображения получали при помощи метода дифференциально-интерференционного контраста. Обработку изображений осуществляли при помощи прилагаемого к микроскопу программного обеспечения «LSM 510».
Таким образом показано, что полученный нами впервые из бактерий рекомбинантный зеленый флуоресцентный белок слияния E2-sfGFP связывается с CD81 человека, иммобилизированном на PLAMP. Кроме того, важным выводом из данного эксперимента является тот факт, что иммобилизированная на PLAMP большая экстраклеточная петля CD81 человека легко связывает Е2 вируса гепатита С. Такие частицы потенциально могут служить ловушками вируса гепатита С у людей.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> | ФГБНУ "ИЭМ" – FGBNU “IEM” |
<120> | Рекомбинантный химерный белок, состоящий из большой экстраклеточной петли человеческого рецептора CD81 и стрептавидина |
<140> | |
<141> | |
<160> | 5 |
<170> | |
<210> | 1 |
<211> | 236 |
<212> | Аминокислотная последовательность |
<213> | Искусственная последовательность |
<220> | |
<223> | Аминокислотная последовательность белка CD81 человека. А.к.о. с 113 по 201 соответствуют большой экстраклеточной петле. |
<400> | 1 |
Met | Gly | Val | Glu | Gly | Cys | Thr | Lys | Cys | Ile | Lys | Tyr | Leu | Leu | Phe | Val |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Phe | Asn | Phe | Val | Phe | Trp | Leu | Ala | Gly | Gly | Val | Ile | Leu | Gly | Val | Ala |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Leu | Trp | Leu | Arg | His | Asp | Pro | Gln | Thr | Thr | Asn | Leu | Leu | Tyr | Leu | Glu |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Leu | Gly | Asp | Lys | Pro | Ala | Pro | Asn | Thr | Phe | Tyr | Val | Gly | Ile | Tyr | Ile |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Leu | Ile | Ala | Val | Gly | Ala | Val | Met | Met | Phe | Val | Gly | Phe | Leu | Gly | Cys |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Tyr | Gly | Ala | Ile | Gln | Glu | Ser | Gln | Cys | Leu | Leu | Gly | Thr | Phe | Phe | Thr |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Cys | Leu | Val | Ile | Leu | Phe | Ala | Cys | Glu | Val | Ala | Ala | Gly | Ile | Trp | Gly |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Phe | Val | Asn | Lys | Asp | Gln | Ile | Ala | Lys | Asp | Val | Lys | Gln | Phe | Tyr | Asp |
113 | 114 | 115 | 120 | 125 | |||||||||||
Gln | Ala | Leu | Gln | Gln | Ala | Val | Val | Asp | Asp | Asp | Ala | Asn | Asn | Ala | Lys |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ala | Val | Val | Lys | Thr | Phe | His | Glu | Thr | Leu | Asp | Cys | Cys | Gly | Ser | Ser |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Thr | Leu | Thr | Ala | Leu | Thr | Thr | Ser | Val | Leu | Lys | Asn | Asn | Leu | Cys | Pro |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Ser | Gly | Ser | Asn | Ile | Ile | Ser | Asn | Leu | Phe | Lys | Glu | Asp | Cys | His | Gln |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Lys | Ile | Asp | Asp | Leu | Phe | Ser | Gly | Lys | Leu | Tyr | Leu | Ile | Gly | Ile | Ala |
195 | 200 | 201 | 205 | ||||||||||||
Ala | Ile | Val | Val | Ala | Val | Ile | Met | Ile | Phe | Glu | Met | Ile | Leu | Ser | Met |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Val | Leu | Cys | Cys | Gly | Ile | Arg | Asn | Ser | Ser | Val | Tyr | ||||
225 | 230 | 235 | 236 |
<210> | 2 |
<211> | 228 |
<212> | Аминокислотная последовательность |
<213> | Искусственная последовательность |
<220> | |
<223> | Аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного белка CD81-SAA. А.к.о. с 3 по 91 соответствуют большой экстраклеточной петле CD81, а.к.о. с 95 по 222 соответствуют последовательности стрептавидина (SAA) |
<400> | 2 |
Met | Glu | Phe | Val | Asn | Lys | Asp | Gln | Ile | Ala | Lys | Asp | Val | Lys | Gln | Phe |
1 | 3 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Tyr | Asp | Gln | Ala | Leu | Gln | Gln | Ala | Val | Val | Asp | Asp | Asp | Ala | Asn | Asn |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ala | Lys | Ala | Val | Val | Lys | Thr | Phe | His | Glu | Thr | Leu | Asp | Cys | Cys | Gly |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ser | Ser | Thr | Leu | Thr | Ala | Leu | Thr | Thr | Ser | Val | Leu | Lys | Asn | Asn | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Cys | Pro | Ser | Gly | Ser | Asn | Ile | Ile | Ser | Asn | Leu | Phe | Lys | Glu | Asp | Cys |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
His | Gln | Lys | Ile | Asp | Asp | Leu | Phe | Ser | Gly | Lys | Pro | Trp | His | Met | Ala |
85 | 90 | 91 | 95 | ||||||||||||
Glu | Ala | Gly | Ile | Thr | Gly | Thr | Trp | Tyr | Asn | Gln | Leu | Gly | Ser | Thr | Phe |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ile | Val | Thr | Ala | Gly | Ala | Asp | Gly | Ala | Leu | Thr | Gly | Thr | Tyr | Glu | Ser |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ala | Val | Gly | Asn | Ala | Glu | Ser | Arg | Tyr | Val | Leu | Thr | Gly | Arg | Tyr | Asp |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ser | Ala | Pro | Ala | Thr | Asp | Gly | Ser | Gly | Thr | Ala | Leu | Gly | Trp | Thr | Val |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ala | Trp | Lys | Asn | Asn | Tyr | Arg | Asn | Ala | His | Ser | Ala | Thr | Thr | Trp | Ser |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Gly | Gln | Tyr | Val | Gly | Gly | Ala | Glu | Ala | Arg | Ile | Asn | Thr | Gln | Trp | Leu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Leu | Thr | Ser | Gly | Thr | Thr | Glu | Ala | Asn | Ala | Trp | Lys | Ser | Thr | Leu | Val |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Gly | His | Asp | Thr | Phe | Thr | Lys | Val | Lys | Pro | Ser | Ala | Ala | Ser | His | His |
210 | 215 | 220 | 222 | ||||||||||||
His | His | His | His | ||||||||||||
225 | 228 |
<210> | 3 |
<211> | 26 |
<212> | Нуклеотидная последовательность |
<213> | Искусственная последовательность |
<220> | |
<223> | Олигонуклеотид f-SA-NCO с сайтом рестрикции для NcoI и последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина |
<400> | 3 |
сtgccatggc | tgaagctggt | atcacc | 26 |
<210> | 4 |
<211> | 32 |
<212> | Нуклеотидная последовательность |
<213> | Искусственная последовательность |
<220> | |
<223> | Олигонуклеотид r-SA-stop-XHO с сайтом рестрикции XhoI и последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина |
<400> | 4 |
ctgctcgagt | cattaggaag | cagcggacgg | tt | 32 |
<210> | 5 |
<211> | 25 |
<212> | Нуклеотидная последовательность |
<213> | Искусственная последовательность |
<220> | |
<223> | Олигонуклеотид f-SA-NDE с сайтом рестрикции для NdeI и характеризующийся последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина |
<400> | 5 |
ctgttatgct | gaagctggta | tcacc | 25 |
Claims (3)
1. Рекомбинантный химерный белок, обладающий способностью связывать вирионы вируса гепатита С за счет взаимодействия CD81 с белком Е2 капсида вируса гепатита С, характеризующийся последовательностью SEQ ID No: 2.
2. Микрочастица из полимера молочной кислоты с рекомбинантным химерным белком по п. 1, ковалентно присоединенным к ее поверхности, используемая в качестве специфической для вируса гепатита С ловушки.
3. Микрочастица полимера молочной кислоты п. 2, отличающаяся тем, что полимер молочной кислоты предварительно подвергают биотинилированию.
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020143387A RU2020143387A (ru) | 2022-06-27 |
RU2778251C2 true RU2778251C2 (ru) | 2022-08-16 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2153535C1 (ru) * | 1999-05-14 | 2000-07-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii |
US20120066779A1 (en) * | 1997-10-06 | 2012-03-15 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. | Hepatitis c receptor protein cd81 |
RU2577138C1 (ru) * | 2014-11-25 | 2016-03-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Способ получения рекомбинантного белка sav-rgd |
RU2018143867A (ru) * | 2018-12-11 | 2020-06-11 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" | Способ получения модели вируса гепатита с, связывающейся с рецептором сd81 |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120066779A1 (en) * | 1997-10-06 | 2012-03-15 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. | Hepatitis c receptor protein cd81 |
RU2153535C1 (ru) * | 1999-05-14 | 2000-07-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii |
RU2577138C1 (ru) * | 2014-11-25 | 2016-03-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Способ получения рекомбинантного белка sav-rgd |
RU2018143867A (ru) * | 2018-12-11 | 2020-06-11 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" | Способ получения модели вируса гепатита с, связывающейся с рецептором сd81 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2130969C1 (ru) | Композиция для диагностики гепатита c человека (варианты), способ и набор для обнаружения антител к вирусу гепатита c человека | |
RU2155228C2 (ru) | Hcv геномные последовательности для диагностических и терапевтических целей | |
Burioni et al. | Dissection of human humoral immune response against hepatitis C virus E2 glycoprotein by repertoire cloning and generation of recombinant Fab fragments | |
JP3645904B2 (ja) | C型肝炎ウイルスの型の分類方法およびそこで使用する試薬 | |
JP2010518046A (ja) | 病原体の結合 | |
US5218099A (en) | Post-transfusion, non-A, non-B hepatitis virus polynucleotides | |
JP2000513949A (ja) | 生物学的サンプル中における生物学的分子の検出のためのバクテリオファージの使用に基づく方法 | |
JP2004069677A (ja) | 免疫学的測定方法、免疫学的測定用試薬及びその製造方法 | |
EP0476130B1 (en) | Enterically transmitted non-a/non-b hepatitis viral agent and characteristic epitopes thereof | |
CN106589082B (zh) | 活动性结核病诊断分子的筛选与应用 | |
JP4072604B2 (ja) | 腸管伝播性非a非b肝炎ウイルス因子 | |
RU2778251C2 (ru) | Рекомбинантный химерный белок, состоящий из большой экстраклеточной петли человеческого рецептора CD81 и стрептавидина | |
JP3061258B2 (ja) | 非a非b非c非d非e型肝炎試薬及びそれらの使用方法 | |
WO2017125007A1 (zh) | 用于诊断活动性结核的方法和试剂盒 | |
CN1294418C (zh) | 检测白念珠菌菌丝蛋白抗体的方法及试剂盒 | |
JP5109114B2 (ja) | 魚類抗体産生の新規検出法 | |
WO1992009634A1 (en) | Non-a non-b hepatitis virus antigen protein | |
JPH11510705A (ja) | 肝炎gbウイルスの核酸検出 | |
US20100152110A1 (en) | Alternate reading frame polypeptides derived from hepatitis c and methods of their use | |
JPH11511027A (ja) | Gb型肝炎ウィルス遺伝子型の検出 | |
JPH09504685A (ja) | Hardsウイルスの組換えdna抗原を製造する分子クローン | |
JP2003516136A (ja) | 肝炎ウイルスセンチネルウイルスi(svi) | |
JPH06507552A (ja) | 肝炎疾患の診断において有用なdna配列及びコードされたポリペプチド | |
CN117330755B (zh) | 一种基于酶催化生物荧光定量检测dna-蛋白质相互作用的方法 | |
JPH09511137A (ja) | 非a非b非c非d非e型肝炎試薬及びそれらの使用方法 |