CN115011737A - 一种快速检测猪轮状病毒的引物和探针、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体公开一种快速检测猪轮状病毒的引物和探针、试剂盒及其使用方法。引物和探针的序列为：上游引物为SEQ ID NO:1；下游引物为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQ ID NO:3。本发明引物和探针的灵敏度高，最低检测限能达到13拷贝/μL，用于RT‑RPA检测方法中，恒温条件下仅需要20min即可完成反应，且结合测流层析试纸条可实现肉眼可视化RPA检测猪轮状病毒，有利于对猪轮状病毒的早期快速诊断，同时，对仪器设备的要求低，实现了在非实验室条件下快速直观检测猪轮状病毒的目的，适用于野外现场检测，对猪场一线PoRV的快速诊断和防控具有十分重要的意义。

Description

一种快速检测猪轮状病毒的引物和探针、试剂盒及其使用 方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种快速检测猪轮状病毒的引物和探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

猪轮状病毒(Porcine Rotarvirus，PoRV)是呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，抵抗力较强，在室温环境条件下能够存活7个月，对一般温度、消毒药和酸碱度有一定的抵抗力。PoRV对各年龄猪均易感，是仔猪腹泻的主要病原之一，且1周龄以内仔猪感染后症状最为严重，病死率可达80％以上，给我国畜牧业的发展和规模化猪场的正常经营造成了严重的阻碍。PoRV为含11个双链RNA的双股RNA病毒，其中VP6基因所编码的Cap蛋白是PoRV的核心蛋白，是参与介导病毒黏膜免疫反应的特异性抗原，占病毒蛋白的50％以上。VP6基因在不同地区PoRV分离株中高度保守，其病毒检测、分型及免疫性保护过程中具有重要的诊断学意义。

目前，对PoRV的检测方法主要有传统的病原分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(VNT)、免疫电镜法、RT-PCR等，但用于PoRV临床快速检测上存在耗时长、成本高、技术复杂等局限。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymeraseamplification，RPA)是一种核酸恒温扩增技术，现被广泛应用于人和动物病原核酸的快速检测。但是，RPA检测方法对引物和探针的要求较为苛刻，且PoRV的临床症状及病变特征与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)相似，仅通过临床症状和病理变化中非常容易误诊，造成较大的经济损失或者疫情的扩散等。因此，发展一种简便、高特异性、高灵敏度的PoRV快速检测方法，对早期防治PoRV具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有猪轮状病毒的检测方法存在检测方法复杂、耗时长、检测条件要求苛刻及检测效率低的问题，本发明提供一种快速检测猪轮状病毒的引物和探针、试剂盒及其使用方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种快速检测猪轮状病毒的引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5′-GGGACTATGTGGATTAATGCTGGGTCAGA-3′(SEQ ID NO:1)；

下游引物：5′-CAACAGAAATTCAACTTCTACATTACTTGGTC-3′(SEQ ID NO:2)；

所述探针的序列为：5′-AGACGTGCACTTACGACAGCTACAATTACT-THF-TGCTACCAGATGCTG-3′(SEQ ID NO:3)。

相对于现有技术，本发明提供的检测猪轮状病毒的引物和探针，可以特异性的结合到猪轮状病毒的RNA上，准确检测出猪轮状病毒，而与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪delta冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型等均无交叉扩增反应，特异性较强；且上述引物和探针的灵敏度高，最低检测限能达到13拷贝/μL，用于RT-RPA检测方法中，恒温条件下仅需要20min即可完成反应，且结合测流层析试纸条可实现肉眼可视化RPA检测猪轮状病毒，有利于对猪轮状病毒的早期快速诊断。同时，对仪器设备的要求低，实现了在非实验室条件下快速直观检测猪轮状病毒的目的，适用于野外现场检测，对猪场一线PoRV的快速诊断和防控具有十分重要的意义。

优选的，所述下游引物的5′端标记有生物素，所述探针的5′端标记有荧光素，3′端进行封闭修饰。

优选的，所述荧光基团为FAM，所述封闭修饰为C3-spacer修饰；经过所述标记和修饰的探针为：5′-FAM-AGACGTGCACTTACGACAGCTACAATTACT-THF-TGCTACCAGATGCTG-C3-spacer-3′。

所述下游引物：5′-Biotin-CAACAGAAATTCAACTTCTACATTACTTGGTC-3′。

本发明还提供了上述引物和探针在非诊断性检测猪轮状病毒中的应用。

本发明还提供一种检测猪轮状病毒的试剂盒，该试剂盒包含上述引物和探针。

优选的，所述试剂盒还包括基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。

本发明提供了所述试剂盒的使用方法。该使用方法的具体操作为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RT-RPA扩增，并在扩增结束后进行侧流层析试纸条检测。

上述检测猪轮状病毒的方法，耗时短、操作简单、反应结果直观，可用于猪轮状病毒的快速检测。

需要说明的是，侧流层析试纸条上预先标记抗FAM抗体和胶体金颗粒标记的抗biotin抗体。

优选的，所述RT-RPA扩增体系包括以下试剂及用量：

上述优选的反应条件可进一步提高猪轮状病毒的检测效率。

优选的，所述RT-RPA扩增体系的扩增条件为：42-44℃，20-25min。

优选的，所述RT-RPA扩增体系的扩增条件为：43℃，20min。

上述优选的扩增条件，可进一步缩短扩增反应时间，提高检测的灵敏度。

优选的，利用侧流层析试纸条(LFB)对RT-RPA扩增产物进行检测时，LFB出现两条红带为阳性，一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明扩增产物中含有待检测核酸片段；LFB的质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明扩增产物中不含有检测片段；LFB的质控区若没有红色条带，则表示检测结果无效。

本发明建立的猪轮状病毒的快速检测方法，在40℃-45℃均能实现对靶基因的有效扩增，反应10min即可实现对检测结果的肉眼可视化判定，且灵敏度高，检出限可达13copies/μL，对设备仪器要求低，无需专业技术人员操作，可快速直观的实现对检测结果的判断，能够在疫情现场进行猪轮状病毒的检测操作，对于PoRV感染的早期防控具有十分重要的意义。

附图说明

图1是本发明实施例1重组质粒pGEM-VP6-PoRV的结构图；

图2是本发明实施例1中1.5引物和探针的设计中不同引物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M,Maker；1,RPA F1/R1；2,RPA F2/R2；3,RPA F3/R3；4,RPA F4/R4；

图3是本发明实施例1中RT-RPA方法在不同反应温度扩增产物的检测图谱；其中，1，40℃；2，41℃；3，42℃；4，44℃；5，45℃；

图4是本发明实施例1中RT-RPA方法在43℃条件下不同反应时间扩增产物的检测图谱；其中，1，10min；2，15min；3，20min；4，30min；

图5是本发明实施例2中的RT-RPA方法的特异性检测图谱；其中，1为检测的猪轮状病毒，2，猪流行性腹泻病毒；3，猪传染性胃肠炎病毒；4，猪delta冠状病毒；5，猪细小病毒；6，猪瘟病毒；7，猪繁殖与呼吸综合征病毒；8，猪圆环病毒2型；

图6是本发明实施例1中的RT-RPA方法的敏感性检测图谱；其中，1-6分别代表模板的拷贝数为1.3×10⁵copies/μL、1.3×10⁴copies/μL、1.3×10³copies/μL、1.3×10²copies/μL、1.3×10¹copies/μL、1.3×10⁰copies/μL。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.1材料与仪器

RT-基础型核酸扩增试剂盒、RT-试纸型核酸扩增试剂盒、侧流层析试纸条，均购自苏州先达生物科技有限公司；One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit、限制性内切酶NdeⅠ，购自宝生物工程(大连)有限公司；病毒RNA提取试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、质粒小提试剂、普通DNA产物纯化试剂盒、MarkerⅠ/Ⅰ、RNA纯化回收试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、2×Taq PCR预混试剂Ⅱ，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1645050电泳仪，美国伯乐公司产品；BT-20T振荡恒温金属浴，上海本亭仪器有限公司产品；实时荧光PCR仪(ABI Q5)，美国ABI公司；Nano Drop2000c核酸蛋白分析仪，美国Thermo公司；VORTEX 2涡旋振荡仪，德国艾卡公司产品；FUSION FX5凝胶成像系统，法国Viber Lourmat公司产品。

1.2病毒株和临床样品

含有PoRV(NX株)VP6基因全长序列的重组质粒pGEM-VP6-PoRV，猪流行性腹泻病毒(PEDV，CV777毒株)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV，HB08株)、猪delta冠状病毒(PDCoV，HB21株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，TJM-F92疫苗株)、猪瘟病毒(CSFV，C疫苗株)、猪细小病毒(PPV，BJ-2疫苗株)、猪圆环病毒2型(PCV2，HB-MC1株)的RNA或DNA均保存于本实验室。

40份猪粪便样品，均来自河北不同地区养猪场具有腹泻症状猪。

重组质粒pGEM-VP6-PoRV：由江苏塞索菲生物科技有限公司合成，如图1所示。

1.3 RNA的提取

按照病毒RNA提取试剂盒和病毒DNA/RNA提取试剂盒使用说明，分别提取1.2中所列其它病毒的RNA或DNA，以及40猪粪便样品的病毒RNA，所有的病毒RNA或DNA均保存于-80℃备用。

1.4 RNA标准品的制备

使用限制性内切酶NdeⅠ对PoRV重组质粒pGEM-VP6-PoRV进行线性化处理，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳确定目的条带，然后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带。回收产物使用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录，以获得体外转录的PoRV RNA。使用无RNase的RQ1 DNase对体外转录的PoRV RNA进行DNA消化，从T7启动子区域到pGEM-T Easy载体的NdeⅠ切割位点共计97个核苷酸，因此转录产物总长度为1291bp，并通过琼脂糖凝胶电泳确定获得体外转录RNA的大小及完整性。使用ND-2000c核酸浓度测定仪测定体外转录RNA的浓度，并通过下列公式计算体外转录RNA的拷贝数：RNA浓度(拷贝/μL)＝6.02×10²³×RNA浓度(ng/μL)×10^-9/(体外转录RNA长度)×340。

最终测得RNA的浓度是：75.9ng/μL，计算得出原始病毒含量为1.04×10¹¹拷贝/μL。

1.5引物和探针的设计

参考GenBank中猪轮状病毒的VP6基因为靶基因，设计RT-RPA的引物和探针，引物和探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，所述引物和探针的序列见表1。

表1引物和探针序列

使用RT-基础型核酸扩增试剂盒对4对RPA引物进行筛选，配制50μL RT-RPA反应体系：向装有RPA冻干粉的0.2mL反应管中加入25μL A Buffer、PoRV-F(10μM)2μL、PoRV-R(10μM)2μL、模板RNA 4μL、DEPC H₂O 14.5μL，最后将2.5μL B Buffer加在反应管盖中，盖上管盖，上下颠倒混5-6次，低速离心10s，然后放入金属浴反应模块上，42℃条件下反应30min，设定振荡频率250rpm/min。反应结束后，使用普通DNA产物纯化试剂盒对RPA产物进行纯化，取5μL产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察并分析电泳结果，结果如图2所示。

从图中可以看出，RPA-F3和PPA-R3引物扩增出的为单一清晰的扩增条带且产物量最多，因此，以RPA-F3和PPA-R3作为最佳引物，扩增片段大小为264bp。

最终确定的引物和探针为：

上游引物5′-GGGACTATGTGGATTAATGCTGGGTCAGA-3′(SEQ ID NO:1)；

下游引物：5′-Biotin-CAACAGAAATTCAACTTCTACATTACTTGGTC-3′(SEQ ID NO:2)；

所述探针的序列为：5′-FAM-AGACGTGCACTTACGACAGCTACAATTACT-THF-TGCTACCAGATGCTG-C3-spacer-3′(SEQ ID NO:3)。

1.6 LFB RT-RPA检测方法的建立

使用检测的猪轮状病毒LFB RT-RPA试剂盒对病毒进行检测，反应体系为：

反应体系中的各组分分别加入反应管中混合，在反应开始之前在反应管盖上加入280mM的醋酸镁，盖上管盖，上下颠倒混匀5-6次，低速离心10s，放入金属浴反应模块上，40-45℃条件下250rpm/min振荡反应不同时间(10min、15min、20min、30min)，取出5μL产物至1.5mL离心管，用200μL纯水稀释，混合均匀，将侧向流检测试纸条放置离心管中，室温静置2min后取出，在5min内观察结果，确定最佳反应温度和反应时间。试纸条质控线和检测线位置均出现红色条带，判为阳性；仅质控线位置出现红色条带，判为阴性；若质控线位置没有红色条带，则结果无效。

以浓度为10⁴copies的PoRV体外转录RNA为模板，在不同反应温度下进行LFB RT-RPA扩增的检测结果如图3所示。从图中可以看出，在40-45℃之间均能实现对靶基因的有效扩增，其中反应温度为43℃时，检测线条带最清晰，因此，选择43℃作为最佳反应温度。

当LFB RT-RPA方法在43℃恒温扩增10min时，检测线出现红色特异性条带，且10-15min之间随着反应时间延长，检测线逐渐增强；当反应时间为20min-30min时，检测线最明显且两者没有明显区别(图4)。因此，确定PoRV RT-RPA方法的最佳反应条件为43℃恒温反应20min。

实施例2特异性检测

以PoRV体外转录RNA，以及猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的病原核酸为模板，按照1.6中的检测方法进行扩增，反应重复3次。

如图5所示，本发明所建立的LFB RT-RPA方法对猪轮状病毒的基因组RNA呈现特异性扩增，而对其他常见病原均没有任何扩增，3次重复结果一致，表明所建立的LFB RT-RPA方法具有良好的特异性。

将1.5项下的其他引物与本发明构建方法中的探针组成试剂盒，按照上述方法进行特异性检测，结果证明1.5项下RPA F1/R1，RPA F2/R，RPA F4/R4均会出现非特异性扩增。

实施例3灵敏性检测

将1.4中RNA标准品进行10倍倍比稀释，使其浓度为1.3×10⁵-1.3×10⁰copies/μL之间，以其作为模板，按照1.6的检测方法进行RPA扩增，每个浓度重复3次，以确认该方法的检出限。

结果如图6所示，对于浓度在1.3×10⁵-1.3×10¹copies/μL之间的模板，3次检测均可检出，浓度为1.3×10⁰copies/μL的模板，3次检测均未检出，3次重复试验结果一致。表明，所建立的LFB RT-RPA方法的检出限为13copies/μL，比现有real-time RT-PCR方法的灵敏度高10倍。

将1.5项下的其他引物与本发明构建方法中的探针组成试剂盒，按照上述方法进行灵敏度性检测，结果证明1.5项下RPA F1/R1，RPA F2/R，RPA F4/R4的灵敏度均在130-1300copies/μL。

实施例4实际样品检测

为验证本发明建立的PoRV LFB RT-RPA方法的实际使用效果，使用病毒RNA提取试剂盒提取1.2中所列40份猪粪便样品的核酸，并取5μL为模板，应用1.6项下的检测方法进行PoRV检测，重复3次检测。

3次检测结果证明，40份猪粪便样品中检测阳性样本28份，阴性样本12份。

采用现有qRT-PCR法检测上述40份猪粪便样品中检出阳性样本26份，阴性样本14份。

上述qRT-PCR检测方法参见文献《PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用》。

综上所述，本发明针对保守区域设计RPA引物和探针，结合侧流层析试纸条，成功建立了LFB RT-RPA检测方法，且方法具有较强的特异性和较高的灵敏性，最低检测浓度为13copies/μL，与已知的PoRV RT-LAMP和qRT-PCR方法相比，灵敏性高10倍，且不依赖于复杂仪器设备，能够20min内实现对检测结果的肉眼可视化判定，在现场疫病快速诊断中具有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 石家庄海关技术中心

<120> 一种快速检测猪轮状病毒的引物和探针、试剂盒及其使用方法

<130> 2022

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

gggactatgt ggattaatgc tgggtcaga 29

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 2

caacagaaat tcaacttcta cattacttgg tc 32

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 探针

<400> 3

agacgtgcac ttacgacagc tacaattact tgctaccaga tgctg 45

Claims (10)

1.一种快速检测猪轮状病毒的引物和探针，其特征在于：所述引物的序列为：

上游引物：5′-GGGACTATGTGGATTAATGCTGGGTCAGA-3′；

下游引物：5′-CAACAGAAATTCAACTTCTACATTACTTGGTC-3′；

所述探针的序列为：5′-AGACGTGCACTTACGACAGCTACAATTACT-THF-TGCTACCAGATGCTG-3′。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述下游引物的5′端标记有生物素，所述探针的5′端标记有荧光素，3′端进行封闭修饰。

3.如权利要求2所述的引物和探针，其特征在于：所述荧光基团为FAM，所述封闭修饰为C3-spacer修饰；经过所述标记和修饰的探针为：5′-FAM-AGACGTGCACTTACGACAGCTACAATTACT-THF-TGCTACCAGATGCTG-C3-spacer-3′。

4.权利要求1-3任一项所述的引物和探针在非诊断性检测猪轮状病毒中的应用。

5.一种检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-3任一项所述的引物和探针。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。

7.权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：具体操作为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RT-RPA扩增，并在扩增结束后进行侧流层析试纸条检测。

8.如权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RT-RPA扩增体系包括以下试剂及用量：

9.如权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RT-RPA扩增体系的扩增条件为：42-44℃，20-25min。

10.如权利要求9所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RT-RPA扩增体系的扩增条件为：43℃，20min。

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