CN111334425A - 一种核酸扩增结合crispr检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法 - Google Patents

一种核酸扩增结合crispr检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111334425A
CN111334425A CN202010275357.6A CN202010275357A CN111334425A CN 111334425 A CN111334425 A CN 111334425A CN 202010275357 A CN202010275357 A CN 202010275357A CN 111334425 A CN111334425 A CN 111334425A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tube
reaction
sleeve
nucleic acid
acid amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010275357.6A
Other languages
English (en)
Inventor
骆志成
黄�俊
骆广进
樊伟东
张徐俞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HANGZHOU ALLSHENG INSTRUMENTS CO Ltd
Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Original Assignee
HANGZHOU ALLSHENG INSTRUMENTS CO Ltd
Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU ALLSHENG INSTRUMENTS CO Ltd, Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd filed Critical HANGZHOU ALLSHENG INSTRUMENTS CO Ltd
Priority to CN202010275357.6A priority Critical patent/CN111334425A/zh
Publication of CN111334425A publication Critical patent/CN111334425A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法。所述双系统耦联用反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，管体的内腔包括下部的反应区，以及上部的储存区；所述储存区设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。由于核酸扩增时，仪器对反应管的加热部位只在管体下部的反应区，对上部储存区处设置的储存室内CRISPR检测试剂影响较小，可以在开始时就将核算扩增试剂与CRISPR检测试剂一起加入到反应管内的相应区域，避免了二次开盖，从而减少气溶胶污染和假阳性问题，使整个检测操作过程更简单方便。

Description

一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系 统耦联方法
技术领域
本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法。
背景技术
核酸扩增检测技术是开展分子生物学研究的基础，可用于定性、定量地分析和检测微量核酸，其在临床医学、检验医学、分子生物学、基因组学及食品安全等相关的各个领域发挥着重要的作用，是生命科学发展不可或缺的一种重要检验方法。现有核酸扩增技术可根据是否需要温度循环分为两类：第一类为变温扩增体系，包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、连接酶链式反应(ligase chain reaction，LRC)等。其中PCR技术因其特异性强，灵敏度高，价格低廉等优点，是目前应用最为广泛的核酸体外扩增技术。但该技术需要特定的仪器，同时对操作人员以及实验条件有一定的专业要求。第二类为等温扩增体系，包括环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)、滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)以及重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等，该技术无需热循环过程，不需要特殊仪器，但其扩增易产生假阳性。
近年来，CRISPR技术的出现带来了一种更简便灵敏的检测方式。其主要原理是利用Cas酶在体系中guide RNA的引导下与目标序列结合后，便会切换为激活状态，高效的切割体系内其它的单链DNA。在体系内加入含有报告基团的单链DNA探针底物后，Cas蛋白识别到靶序列的存在，就会切割单链DNA探针底物从而释放荧光报告基团产生荧光信号。在目前已知的利用CRISPR检测的体系中，由于受到反应温度的影响，CRISPR体系无法在起始时刻就添加到反应体系中，必须等到反应结束后二次开盖再进行后续添加，极易造成严重的气溶胶污染和假阳性问题，并且使得整个检测操作过程变得复杂和繁琐。
现有技术中，常用普通PCR管进行上述核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联方法，比如，授权公告号为CN205077049U的实用新型公开了一种PCR管、PCR管条、PCR管板的密封结构，包括有管体、管盖，管盖靠近底部的周向外表面上分别向外凸设有环形防脱安全凸扣、位于防脱安全凸扣下方的环形密封保险凸扣，防脱安全凸扣和密封保险凸扣分别紧密顶压在管体的管口内侧面上形成密封结构。
公开号为CN102534011A的发明公开了一种全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法和装置，所述方法是扩增反应结束后，把反应管在不开盖的情况下放入在密闭性的装置内，在该密闭性装置内反应管被破壁，使反应管内扩增产物与密闭装置内预置的检测液反应，然后进行荧光检测，判读结果。所述装置包括PCR管、离心管和一顶针塞，所述PCR管能置于离心管中，所述顶针塞具有能刺破PCR管的穿刺针，离心管具有可密闭的管盖。然而，该技术方案仅仅是用于PCR扩增结束后荧光检测时避免了PCR反应产物以气溶胶的形式扩散到空气中，并不适用于核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联方法。且操作比较复杂，不能自动化操作，PCR管反应完成后再放入离心管中，PCR管经过长时间操作，外表面也容易沾染污染物，造成假阳性。并且，该技术方案中PCR管刺破过程不易控制，很可能在离心管盖子还没盖合之前就已经将PCR管刺破，或者在离心管盖子盖合后还没将PCR管刺破，造成对结果的影响。另外一方面，该技术方案中只能手动进行操作，而无法实现自动化操作。
发明内容
本申请针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法。
一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，管体的内腔包括下部的反应区，以及上部的储存区；所述储存区设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。
优选的，所述储存室为由管体的储存区管壁向外延伸形成的副管，所述储存室底部与储存区之间分隔开而顶部与储存区之间设有作为所述释放机构的缺口，所述副管的口部与管体的口部高度一致，所述盖体一侧延伸形成用于封盖所述副管的副管盖。由于缺口的存在，在核酸扩增反应结束后，等反应管温度降低，可以通过倾斜或倒置的方式使储存室内的CRISPR检测试剂流出，与核酸扩增反应产物混合汇聚到管体内腔下部的反应区中，然后可以进行CRISPR检测反应。
优选的，所述储存区处设有一个作为所述储存室的套管，所述管体在储存区处向一侧扩径形成用于设置所述套管的设置区。反应区的直径较小，且呈上大下小的锥形。扩径是指直径扩大，储存区处的管体扩径后，使储存区的直径比反应区上部最大处还大很多，从而有足够空间来放置套管。放置区在竖向投影上不遮挡反应区，这样不影响向反应区中加反应试剂。设置区的底面可以向反应区一侧倾斜，这样不会在设置区聚集液体。
更优选的，所述套管与管体内侧壁固定设置，所述套管顶面开口，套管的口部配合设有可去除的套管盖；所述盖体与管体盖合后，套管顶面与所述盖体之间具有间隙；使用时，去除所述套管盖并将所述盖体与管体盖合，套管的口部兼作所述释放机构。套管配套设有可去除的套管盖，可以将CRISPR检测试剂和核酸扩增试剂预装在反应管中，套管盖密封盖合，可以进行运输，使用时，可以去除套管盖，盖上所述盖体后，进行反应，核酸扩增反应完成后，可通过倾斜或倒置方式使套管内的CRISPR检测试剂加入到反应区与核酸扩增反应产物混合。
更优选的，所述套管与管体内侧壁之间上下滑动配合，所述管体内侧壁上设有竖向设置的滑槽，所述套管上配合设有滑块；
所述盖体上在盖合后对应所述套管的位置设有可向下按压的弹性区，
所述释放机构包括设于盖体弹性区、可向下按压所述套管的顶柱，以及设置在所述设置区的底面、用于在所述顶柱向下按压所述套管时刺穿所述套管底面的穿刺针。弹性区可以由盖体的相应区域设计成减薄的波纹状获得。使用时通过向下按压弹性区的顶柱，顶柱抵顶套管的顶面后，使套管下滑，撞上穿刺针后穿刺针刺破套管的底面，使套管内的CRISPR检测试剂流出到反应区。
进一步优选的，所述套管可从管体中取出，所述套管的口部配合设有套管盖，套管放入管体中时口部向上。向套管中加CRISPR检测试剂时，可以将套管从管体中取出，加好后盖合套管盖后放入到管体中。
进一步优选的，所述套管可从管体中取出，所述套管的口部在加入CRISPR检测试剂后使用密封膜密封，套管放入管体中时口部向下。向套管中加CRISPR检测试剂时，可以将套管从管体中取出，加好后用密封膜密封套管的口部，然后将套管使用密封膜密封的一面向下放入到管体中，这样只要刺破密封膜就能够使套管内的CRISPR检测试剂流出到反应区。密封膜可以使用现有技术中常用的材质，比如可以是使用Parafilm膜。
优选的，所述盖体上具有穿过盖体设置且开口向外、作为所述储存室的刺破管，所述释放机构包括与刺破管口部配合密封的活塞杆，以及设于活塞杆端部、在活塞杆向刺破管内挤压时可刺破所述刺破管底部的刺破针。活塞杆部分可以堵塞刺破管的口部，需要刺破时，则需要将活塞杆向下推，使刺破针刺破刺破管，刺破管中的CRISPR检测试剂流出到反应区，而活塞杆依旧堵塞住刺破管的口部。
穿刺针以及刺破针的尖端可以多种形状，如针尖状、一字刀状、十字刀头，三刃刀状等。
优选的，所述管体与盖体之间通过可弯折的连接片连接。一般为了方便使用的情况下，所述管体和盖体是连体设置的，而比较少使用分体设置的方式。
本发明还提供了所述双系统耦联用反应管制备的联管，包括多个所述双系统耦联用反应管，所述管体和盖体分体设置，相邻双系统耦联用反应管的管体之间通过第一连接臂连接，相邻双系统耦联用反应管的盖体之间通过第二连接臂连接。一般，常用的联管可以包括4个、6个或8个所述双系统耦联用反应管。当然，也可以是向两个方向延伸，形成多孔板一样的结构，这样的联管可以在一块板上集成48个、96个等不同数量的所述双系统耦联用反应管。
本发明还提供了一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联方法，使用所述双系统耦联用反应管，所述双系统耦联方法包括以下步骤：
(1)将核酸扩增试剂加入反应区底部，将CRISPR检测试剂加入储存室中，盖上盖体密封；
(2)将加入检测试剂后的双系统耦联用反应管进行核酸扩增反应；
(3)核酸扩增反应完成后降温，通过释放机构将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区与核酸扩增反应产物混合；
(4)进行CRISPR检测反应；
(5)CRISPR检测反应完成后，检测结果。
优选的，核酸扩增采用PCR方法、LRC方法、LAMP方法、RCA方法或RPA方法。
本发明核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管在使用时，先将核酸扩增试剂加入到管体内腔下部的反应区中，然后将CRISPR检测试剂加入到储存室中，盖上盖体密封，然后进行核酸扩增反应，反应结束后降温到室温，然后通过释放机构将储存室中的CRISPR检测试剂释放到反应区与核酸扩增产物混合，进行CRISPR检测反应，一般在37℃反应10min，反应后可在紫外灯下或者相关荧光检测仪上检测结果。
由于核酸扩增时，仪器对反应管的加热部位只在管体下部的反应区，对上部储存区处设置的储存室内CRISPR检测试剂影响较小，可以在开始时就将核算扩增试剂与CRISPR检测试剂一起加入到反应管内的相应区域，避免了二次开盖，从而减少气溶胶污染和假阳性问题，使整个检测操作过程更简单方便。
附图说明
图1为实施例1中双系统耦联用反应管的立体结构示意图。
图2为实施例1中双系统耦联用反应管另一视角的立体结构示意图。
图3为实施例1中双系统耦联用反应管的侧视结构示意图。
图4为实施例1中双系统耦联用反应管另一视角的侧视结构示意图。
图5为图4中沿A-A方向的剖视图。
图6为实施例2中双系统耦联用反应管的立体结构示意图。
图7为实施例2中双系统耦联用反应管的俯视结构示意图。
图8为图7中沿B-B方向的剖视图。
图9为实施例3中双系统耦联用反应管的立体结构示意图。
图10为实施例3中双系统耦联用反应管另一视角的立体结构示意图。
图11为实施例3中双系统耦联用反应管的俯视结构示意图。
图12为图11中沿C-C方向的剖视图。
图13为实施例4中双系统耦联用反应管的立体结构示意图。
图14为实施例4中双系统耦联用反应管的俯视结构示意图。
图15为图14中沿D-D方向的剖视图。
图16为实施例5中双系统耦联用反应管的立体结构示意图。
图17为实施例5中双系统耦联用反应管的侧视结构示意图。
图18为实施例5中双系统耦联用反应管的俯视结构示意图。
图19为图18中沿E-E方向的剖视图。
图20为实施例6中4联管的立体结构示意图。
图21为实施例6中6联管的立体结构示意图。
图22为实施例6中8联管的立体结构示意图。
图23为RPA-CRISPR的扩增检测图。
图24为PCR-CRISPR的扩增检测图。
图25为LAMP-CRISPR的扩增检测图。
具体实施方式
实施例1
如图1～5所示，一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，包括管体1-1及与管体1-1配合密封的盖体1-2，管体1-1与盖体1-2之间通过可弯折的连接片1-3连接。管体1-1的内腔包括下部的反应区1-4，以及上部的储存区1-5；储存区1-5设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。
储存室为由管体1-1的储存区1-5管壁向外延伸形成的副管1-6，储存室底部与储存区1-5之间分隔开而顶部与储存区1-5之间设有作为释放机构的缺口1-7，副管1-6的口部与管体1-1的口部高度一致，盖体1-2一侧延伸形成用于封盖副管1-6的副管盖1-8。由于缺口1-7的存在，在核酸扩增反应结束后，等反应管温度降低，可以通过倾斜或倒置的方式使储存室内的CRISPR检测试剂流出，与核酸扩增反应产物混合汇聚到管体1-1内腔下部的反应区1-4中，然后可以进行CRISPR检测反应。
实施例2
如图6～8所示，一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，包括管体2-1及与管体2-1配合密封的盖体2-2，管体2-1与盖体2-2之间通过可弯折的连接片2-3连接。管体2-1的内腔包括下部的反应区2-4，以及上部的储存区2-5；储存区2-5设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。
储存区2-5处设有一个作为储存室的套管2-6，管体2-1在储存区2-5处向一侧扩径形成用于设置套管2-6的设置区2-9。反应区2-4的直径较小，且呈上大下小的锥形。扩径是指直径扩大，储存区2-5处的管体扩径后，使储存区2-5的直径比反应区2-4上部最大处还大很多，从而有足够空间来放置套管2-6。放置区2-9在竖向投影上不遮挡反应区2-4，这样不影响向反应区2-4中加反应试剂。设置区2-9的底面向反应区2-4一侧倾斜，这样不会在设置区2-9聚集液体。
套管2-6与管体2-1内侧壁固定设置，套管2-6的外侧壁与管体2-1内侧壁之间具有连接用的连接片2-8，套管2-6的底部与设置区2-9的底面一体设置，套管2-6顶面开口，套管2-6的口部配合设有可去除的套管盖2-7；盖体2-2与管体2-1盖合后，套管2-6顶面与盖体2-2之间具有间隙；使用时，去除套管盖2-7并将盖体2-2与管体2-1盖合，套管2-6的口部兼作释放机构。套管2-6配套设有可去除的套管盖2-7，可以将CRISPR检测试剂和核酸扩增试剂预装在反应管中，套管盖2-7密封盖合，可以进行运输，使用时，可以去除套管盖2-7，盖上盖体2-2后，进行反应，核酸扩增反应完成后，可通过倾斜或倒置方式使套管2-6内的CRISPR检测试剂加入到反应区2-4与核酸扩增反应产物混合。
实施例3
如图9～12所示，一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，包括管体3-1及与管体3-1配合密封的盖体3-2，管体3-1与盖体3-2之间通过可弯折的连接片3-3连接。管体3-1的内腔包括下部的反应区3-4，以及上部的储存区3-5；储存区3-5设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。
储存区3-5处设有一个作为储存室的套管3-7，管体3-1在储存区3-5处向一侧扩径形成用于设置套管3-7的设置区3-6。反应区3-4的直径较小，且呈上大下小的锥形。扩径是指直径扩大，储存区3-5处的管体扩径后，使储存区3-5的直径比反应区3-4上部最大处还大很多，从而有足够空间来放置套管3-7。放置区3-6在竖向投影上不遮挡反应区3-4，这样不影响向反应区3-4中加反应试剂。设置区3-6的底面向反应区3-4一侧倾斜，这样不会在设置区3-6聚集液体。
套管3-7与管体3-1内侧壁之间上下滑动配合，管体3-1内侧壁上设有竖向设置的滑槽3-8，套管3-7上配合设有滑块3-9；盖体3-2上在盖合后对应套管3-7的位置设有可向下按压的弹性区3-10，弹性区3-10可以由盖体3-2的相应区域设计成减薄的波纹状获得，即通过盖体3-2设置一圈圈减薄环，且在盖体3-2内外表面交替设置。
释放机构包括设于盖体3-2的弹性区3-10、可向下按压套管3-7的顶柱3-11，以及设置在设置区3-6的底面、用于在顶柱3-11向下按压套管3-7时刺穿套管3-7底面的穿刺针3-13。使用时通过向下按压弹性区3-10的顶柱3-11，顶柱3-11抵顶套管3-7的顶面后，使套管3-7下滑，撞上穿刺针3-13后穿刺针3-13刺破套管3-7的底面，使套管3-7内的CRISPR检测试剂流出到反应区3-4。穿刺针3-13的尖端可以多种形状，如针尖状、一字刀状、十字刀头，三刃刀状等。
套管3-7可从管体3-1中取出，套管3-7的口部在加入CRISPR检测试剂后使用密封膜3-12密封，套管3-7放入管体3-1中时口部向下。向套管3-7中加CRISPR检测试剂时，可以将套管3-7从管体3-1中取出，加好后用密封膜3-12密封套管3-7的口部，然后将套管3-7使用密封膜3-12密封的一面向下放入到管体3-1中，这样只要刺破密封膜3-12就能够使套管3-7内的CRISPR检测试剂流出到反应区3-4。密封膜3-12可以使用现有技术中常用的材质，比如可以是使用Parafilm膜。
实施例4
如图13～15所示，一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，其整体结构与实施例3中相同，仅在套管处与实施例3中结构有所不同，本实施例中套管4-1可从管体中取出，套管4-1的口部配合设有套管盖4-2，套管4-1放入管体中时口部向上。向套管4-1中加CRISPR检测试剂时，可以将套管4-1从管体中取出，加好后盖合套管盖4-2后放入到管体中。这样穿刺针刺破的是套管4-1的底部。
实施例5
如图16～19所示，一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，包括管体5-1及与管体5-1配合密封的盖体5-2，管体5-1与盖体5-2之间通过可弯折的连接片5-3连接。管体5-1的内腔包括下部的反应区5-4，以及上部的储存区5-5；储存区5-5设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。
盖体上具有穿过盖体5-2设置且开口向外、作为储存室的刺破管5-6，释放机构包括与刺破管5-6口部配合密封的活塞杆5-7，以及设于活塞杆5-7端部、在活塞杆5-7向刺破管5-6内挤压时可刺破刺破管5-6底部的刺破针5-8。活塞杆5-7位于刺破管5-6外一端的顶部还设有方便按压的按压帽5-9，按压帽5-9的直径比活塞杆5-7直径大，这样可以方便按压。
活塞杆5-7可以堵塞刺破管5-6的口部，需要刺破时，则需要将活塞杆5-7向下推，使刺破针5-8刺破刺破管5-6，刺破管5-6中的CRISPR检测试剂流出到反应区，而活塞杆5-7依旧堵塞住刺破管5-6的口部。
刺破针5-8的尖端可以多种形状，如针尖状、一字刀状、十字刀头，三刃刀状等。
实施例6
将实施例1～5中的双系统耦联用反应管多个连接在一起可以做成联管，一般，常用的联管可以包括4个、6个或8个双系统耦联用反应管。当然，也可以是向两个方向延伸，形成多孔板一样的结构，这样的联管可以在一块板上集成48个、96个等不同数量的双系统耦联用反应管。但为了使用方便，一般在做成联管时，单个双系统耦联用反应管的管体与盖体分体设置，然后所有管体连接在一起，所有盖体连接在一起，使用时统一盖上盖体。
如图20～22所示，为使用实施例1中结构的双系统耦联用反应管连接做成的联管，其中图20为4联管，图21为6联管，图22为8联管。相邻双系统耦联用反应管的管体6-1之间通过第一连接臂6-3连接，相邻双系统耦联用反应管的盖体6-2之间通过第二连接臂6-4连接。对于实施例1中结构的双系统耦联用反应管来说，由于副管位于外侧，所以管体6-1之间通过第一连接臂6-3连接时，副管之间也可以相互连接起来，以确保连接的牢固性；相应的，副管盖之间也相互连接起来。
实施例7
1、实验材料
样本1：杭州虾苗基地获取的虾苗(由浙江省水产技术推广总站提供)。
阳性质控品：pET28a-MCP质粒，MCP基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2、对虾虹彩病毒DNA的提取
(1)称取约30mg的实验样本(取整颗虾苗)，加入500μL的生理盐水，颠倒混匀后去除液体，重复该步骤一次；
(2)将洗净的虾苗置于研磨管中，加入1颗研磨珠(直径8mm)，加入100μL的裂解液，放入均质仪中，以6m/s匀浆20s；
(3)加入100μL的裂解液，并加入20μL的蛋白酶K，56℃温浴1h；
(4)加入200μL的结合液，70℃下孵育10min；
(5)加入200μL的无水乙醇，颠倒混匀后加入吸附柱中，12000rpm离心30s；
(6)倒掉废液，向吸附柱中加入500μL的盐洗液，12000rpm离心30s；
(7)倒掉废液，向吸附柱中加入600μL的漂洗液，12000rpm离心30s；
(8)重复步骤7；
(9)彻底晾干漂洗液，加入100μL TE Buffer，离心，获得对虾血虹彩病毒DNA。
3、RPA引物、试剂盒及CRISPR-Cas12a蛋白酶检测方法
3.1 RPA引物的筛选
以第2部分提取获得的对虾血虹彩病毒DNA为模板，根据RPA引物的设计原则，设计多条RPA引物，经过筛选，得到最优引物的序列如下：
SHIV-F：CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC；
SHIV-R：CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG；
3.2 SHIV-crRNA的制备
crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGGUGCCUAUGGGAUCGAAU
SHIV-P:FAM-TTATT-BHQ1
3.2.1 引物合成
根据重组酶聚合酶等温扩增产物序列设计特异性的SHIV-crRNA引物，引物如下：
F：TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCGGTGCCTATGGGATCGAAT；
R：ATTCGATCCCATAGGCACCGATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA。
3.2.2 双链DNA的合成
以重组酶聚合酶等温扩增产物序列为模板，利用上述SHIV-crRNA引物进行扩增反应，反应体系的试剂配制和扩增程序如下：
试剂配制如表1所示。
表1
试剂名称 体积(50μL)
10×Buffer(without MgCl<sub>2</sub>) 5μL
引物F(100μM) 5μL
引物R(100μM) 5μL
水 35μL
程序：99℃10min；85℃，5min；80℃，5min；75℃，5min；70℃，5min；将扩增产物(双链DNA)切胶回收。
3.2.3 转录和纯化RNA
对3.2.2扩增得到的双链DNA进行转录和RNA的纯化，转录所用试剂和转录试剂盒如下：
1、转录试剂配制如表2所示。
表2
Figure BDA0002444571390000081
Figure BDA0002444571390000091
其中，转录试剂盒购于南京诺唯赞(货号：TR101)。
程序：37℃6h，结束后加入DNaseI，37℃消化15min，去除模板DNA。
2、RNA纯化(天根RNA纯化试剂盒(货号：DP412))：
(1)将未纯化的RNA产物用RNase-Free ddH2O补足至100μL，然后加入350μL的PK溶液；
(2)混匀后加入250μL无水乙醇；
将混合物加入至纯化柱中，12000rpm离心30s，弃废液；
(3)向管中加入500μL的漂洗液，室温放置2min，12000rpm离心30s，弃废液；
(4)重复上述步骤；
(5)加入14-20μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min；
(6)转录产物置于-80℃冰箱保存备用。
3.3 重组酶聚合酶等温扩增反应
采用3.1筛选的RPA引物和3.2制备的SHIV-crRNA引物进行重组酶聚合酶等温扩增反应，采用实施例1中的双系统耦联用反应管，且反应体系如表3所示(总体积25μL)。
表3反应体系
试剂成分 试剂量
RPA Buffer 12.5μL
SHIV-F 1μL
SHIV-R 1μL
20×Core Reaction 1.25μL
10×E-Mix 2.5μL
280mM醋酸镁 1.25μL
ddH<sub>2</sub>O 至25μL
其中，RPA试剂盒(RPA Buffer、20×Core Reaction、10×E-Mix和MgOAc)购置于英国Twist DX公司；反应体系混匀后，在37℃下放置15min。
3.4 CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应
取出双系统耦联用反应管，将3.3中完成RPA等温扩增反应的扩增产物与放置于储存室内的CRISPR检测体系倾斜、颠倒混匀后，离心，进行CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应，其中储存室内放置的CRISPR检测体系如表4所示(总体积20μL)。
表4反应体系
Figure BDA0002444571390000092
Figure BDA0002444571390000101
其中，Fncas12a酶、10×Fncas12a Bufffer购置于New England Biolabs(NEB)公司；RNase抑制剂购自于上海生工生物工程有限公司。
3.5 荧光检测的方法和结果
检测方法：将3.4混匀后的反应管进行离心，然后放置于恒温荧光检测仪(如杭州奥盛仪器有限公司的GENE8C仪器)或荧光定量PCR仪上进行等温检测，本实验在ABI StepOne仪器中进行，程序设置如下：37℃预变性1s；37℃变性45s；37℃退火、延伸15s(荧光信号采集)，共40个循环。
最终得到CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应的检测结果。
检测结果：根据实验结果，出现扩增曲线的为阳性，无扩增曲线的则为阴性，实际样本和阳性质控品都出现了扩增曲线，而阴性对照未出现扩增(如图23所示)。
实施例8
1、实验材料
样本1：杭州虾苗基地获取的虾苗(由浙江省水产技术推广总站提供)。
2、对虾虹彩病毒DNA的提取
同实施例7。
3、PCR引物、试剂盒及CRISPR-Cas12a蛋白酶检测方法
3.1 PCR引物的筛选
以第2部分提取获得的对虾血虹彩病毒DNA为模板，根据PCR引物的设计原则，设计多条PCR引物，经过筛选，得到最优引物的序列如下：
PCR-F：GACGCCGACAAGATTGATTT；
PCR-R：ATGGTAGACCCAACATTCCG。
3.2 PCR扩增反应
采用3.1筛选的PCR引物进行PCR扩增反应，采用实施例2中的双系统耦联用反应管，且反应体系如表5所示(总体积25μL)。
表5反应体系
试剂成分 试剂量
2X PCR Mix 12.5μL
PCR-F 1μL
PCR-R 1μL
ddH<sub>2</sub>O 至25μL
其中，PCR扩增试剂TAKARA公司；反应体系混匀后，按照下列程序进行扩增：98℃10sec；55℃15sec；72℃5sec；循环数为35cycle。
3.3 CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应
取出双系统耦联用反应管，将3.2中的PCR扩增产物与放置于储存室内的CRISPR检测体系颠倒混匀后离心，进行CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应，其中储存室内放置的CRISPR检测体系如表6所示(总体积20μL)。
表6反应体系
试剂成分 试剂量
10×Fncas12a Bufffer 2μL
Fncas12a 1μL
crRNA 2μL
RNase抑制剂 1μL
SHIV-P 1μL
其中，Fncas12a酶、10×Fncas12a Buffer购置于New England Biolabs(NEB)公司；RNase抑制剂购自于上海生工生物工程有限公司。
3.4 荧光检测的方法和结果
检测方法：同实施例7。检测结果：根据实验结果，出现扩增曲线的为阳性，无扩增曲线的则为阴性，实际样本出现了扩增曲线，而阴性对照未出现扩增(如图24所示)
实施例9
1、实验材料
同实施例7。
2、对虾虹彩病毒DNA的提取
同实施例7。
3、LAMP引物、试剂盒及CRISPR-Cas12a蛋白酶检测方法
3.1 LAMP引物的筛选
以第2部分提取获得的对虾血虹彩病毒DNA为模板，根据LAMP引物的设计原则，设计多条LAMP引物，经过筛选，得到最优引物的序列如下：
F3：TTCTTCGGTGTCAGGAAC
B3：GTAGTAGGGTTCGATCAGTG
FIP：ATCTGGGTCGAAATCAATCTTGTCCCAATCCAAATGTTTGGTCC
BIP：CGCATTCGATCCCATAGGCAAGAAGTAATCGGCAGTCATC
LF：GGGTGATGCGGTTGTGTAATT
LB：CCGCAAACATTAGATACGAATCTTC
3.2 LAMP扩增反应
采用3.1筛选的LAMP引物进行等温扩增反应，采用实施例2中的双系统耦联用反应管，且反应体系如表7所示(总体积25μL)。
表7反应体系
Figure BDA0002444571390000111
Figure BDA0002444571390000121
其中，LAMP试剂为ALLSHENG自配；反应体系混匀后，按照下列程序进行扩增：63℃，45min。
3.3 CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应
取出双系统耦联用反应管，将3.2中的LAMP扩增产物与放置于储存室内的CRISPR检测体系颠倒混匀后离心，进行CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应，其中储存室内放置的CRISPR检测体系如表8所示(总体积20μL)。
表8反应体系
试剂成分 试剂量
10×Fncas12a Bufffer 2μL
Fncas12a 1μL
crRNA 2μL
RNase抑制剂 1μL
SHIV-P 1μL
其中，Fncas12a酶、10×Fncas12a Buffer购置于New England Biolabs(NEB)公司；RNase抑制剂购自于上海生工生物工程有限公司。
3.4 荧光检测的方法和结果
检测方法同实施例7。检测结果：根据实验结果，出现扩增曲线的为阳性，无扩增曲线的则为阴性，实际样本出现了扩增曲线，而阴性对照未出现扩增(如图25所示)。
序列表
<110> 杭州奥盛仪器有限公司
浙江科技学院
<120> 一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 对虾彩虹病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 1
atgttgagat ttatttatga aaaaaaaatc ttgttaataa aaaattgtaa aatggctaat 60
attgcaggag ctctacaaga tatggctaat ctaggggcgg ttgaaaggta ccagtacgga 120
accaccaacg ccgtcactta ttttattcgt gaaacgagaa agtctacatt gttttctcaa 180
ctcccaattc aactctcatc taaaaatgga aatcccgatt tcgatcgtga atggtctgta 240
gaaccaagta aggcgttcga ttatctgatc catatgtgga tccgggttac cgttcccgaa 300
gttaaacttt tggcgggtaa tgtatataag gagcacggtc gaattcgctg gacccgaaac 360
tttatgcaca atcttatcaa gaaggtttca ttcaacgtaa acgatctcga gattgaaaag 420
tttgacaact atttcctcga tttctggaac caatttactc tgtcctcttc aaagaaggat 480
ggatacaaca acatgattgg aaacgatgat gatcttctga tcccaaaatc caaggatgga 540
aagattgaat caaagagtct tacacttcct atccccttct tcttttctcg tgattctggt 600
ttggctctcc cagtcggtgg tgtcaagtgg aacaagctca ggattgattt cgaattcagg 660
aactggacag agcttctgat tcttgaaaat gttggtgcgg cccacaatgg agagaaaaat 720
ccatgcaagg ttcctcaggt tggaagtgat atcgccgttg ccccctcact gtcaaatgtg 780
caatgttggg tgaatggtgg tcttatcccc gaagccgagc gagcacgtat gggatgtgtt 840
caccgcgaca tgttgattga atctatccag acttcttcca agctcaactt taaccccgtc 900
ctcaacccaa atccctctta cgacatcagg ttccagagaa ctgtaaaggc tctcttcttc 960
ggtgtcagga acactaccaa tccaaatgtt tggtccaatt acacaaccgc atcacccgta 1020
cccgacgccg acaagattga tttcgaccca gatcagagcg cattcgatcc cataggcacc 1080
gcaaacatta gatacgaatc ttcagatcgt attcccgtga tgactgccga ttacttctca 1140
ctgatcgaac cctactacaa ggcaccggcc attcccgaac tcaccggata ccacatgttc 1200
tcttacgctc tcaagatgaa caatgttgat ccttctgggt ctgccaatta cagcatcctg 1260
aacaatgtga gtatccaact tcaatgctcc gaagctgcta ttaaagcggc aaagggtgaa 1320
ggtgaagcca agactggtac cgattatgcg cagagcttcc agtttctggt tatcgccatc 1380
tctcagaatg ttcttactct gaagaacgga atgttgggtc taccatttat gtaa 1434
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagatcagag cgcattcgat cccataggca ccgc 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtaagagaa catgtggtat ccggtgagtt cggg 34
<210> 4
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga ucggugccua ugggaucgaa u 41
<210> 5
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggg taatttctac taagtgtaga tcggtgccta tgggatcgaa 60
t 61
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attcgatccc ataggcaccg atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
a 61
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacgccgaca agattgattt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggtagacc caacattccg 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcttcggtg tcaggaac 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtagtagggt tcgatcagtg 20
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atctgggtcg aaatcaatct tgtcccaatc caaatgtttg gtcc 44
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgcattcgat cccataggca agaagtaatc ggcagtcatc 40
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggtgatgcg gttgtgtaat t 21
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgcaaacat tagatacgaa tcttc 25

Claims (12)

1.一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联用反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，其特征在于，管体的内腔包括下部的反应区，以及上部的储存区；所述储存区设有用于在核酸扩增时暂时存放CRISPR检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。
2.如权利要求1所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述储存室为由管体的储存区管壁向外延伸形成的副管，所述储存室底部与储存区之间分隔开而顶部与储存区之间设有作为所述释放机构的缺口，所述副管的口部与管体的口部高度一致，所述盖体一侧延伸形成用于封盖所述副管的副管盖。
3.如权利要求1所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述储存区处设有一个作为所述储存室的套管，所述管体在储存区处向一侧扩径形成用于设置所述套管的设置区。
4.如权利要求3所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述套管与管体内侧壁固定设置，所述套管顶面开口，套管的口部配合设有可去除的套管盖；所述盖体与管体盖合后，套管顶面与所述盖体之间具有间隙；使用时，去除所述套管盖并将所述盖体与管体盖合，套管的口部兼作所述释放机构。
5.如权利要求3所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述套管与管体内侧壁之间上下滑动配合，所述管体内侧壁上设有竖向设置的滑槽，所述套管上配合设有滑块；
所述盖体上在盖合后对应所述套管的位置设有可向下按压的弹性区；
所述释放机构包括设于盖体弹性区、可向下按压所述套管的顶柱，以及设置在所述设置区的底面、用于在所述顶柱向下按压所述套管时刺穿所述套管底面的穿刺针。
6.如权利要求5所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述套管可从管体中取出，所述套管的口部配合设有套管盖，套管放入管体中时口部向上。
7.如权利要求5所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述套管可从管体中取出，所述套管的口部在加入CRISPR检测试剂后使用密封膜密封，套管放入管体中时口部向下。
8.如权利要求1所述的双系统耦联用反应管，其特征在于，所述盖体上具有穿过盖体设置且开口向外、作为所述储存室的刺破管，所述释放机构包括与刺破管口部配合密封的活塞杆，以及设于活塞杆端部、在活塞杆向刺破管内挤压时可刺破所述刺破管底部的刺破针。
9.如权利要求1～8任一所述双系统耦联用反应管，其特征在于，所述管体与盖体之间通过可弯折的连接片连接。
10.如权利要求1～8任一所述双系统耦联用反应管制备的联管，其特征在于，包括多个所述双系统耦联用反应管，所述管体和盖体分体设置，相邻双系统耦联用反应管的管体之间通过第一连接臂连接，相邻双系统耦联用反应管的盖体之间通过第二连接臂连接。
11.一种核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联方法，其特征在于，使用如权利要求1所述双系统耦联用反应管，所述双系统耦联方法包括以下步骤：
(1)将核酸扩增试剂加入反应区底部，将CRISPR检测试剂加入储存室中，盖上盖体密封；
(2)将加入检测试剂后的双系统耦联用反应管进行核酸扩增反应；
(3)核酸扩增反应完成后降温，通过释放机构将CRISPR检测试剂从储存室中释放到反应区与核酸扩增反应产物混合；
(4)进行CRISPR检测反应；
(5)CRISPR检测反应完成后，检测结果。
12.如权利要求11所述的双系统耦联方法，其特征在于，核酸扩增采用PCR方法、LRC方法、LAMP方法、RCA方法或RPA方法。
CN202010275357.6A 2020-04-09 2020-04-09 一种核酸扩增结合crispr检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法 Pending CN111334425A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010275357.6A CN111334425A (zh) 2020-04-09 2020-04-09 一种核酸扩增结合crispr检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010275357.6A CN111334425A (zh) 2020-04-09 2020-04-09 一种核酸扩增结合crispr检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111334425A true CN111334425A (zh) 2020-06-26

Family

ID=71180830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010275357.6A Pending CN111334425A (zh) 2020-04-09 2020-04-09 一种核酸扩增结合crispr检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111334425A (zh)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111218392A (zh) * 2019-02-25 2020-06-02 上海快灵生物科技有限公司 一种生化反应试管及其使用方法和基因扩增试剂盒
CN111808980A (zh) * 2020-07-22 2020-10-23 杭州奥盛仪器有限公司 一种对虾肝肠胞虫lamp-crispr等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法
CN112143780A (zh) * 2020-09-01 2020-12-29 浙江大学 一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法
CN112342317A (zh) * 2020-11-26 2021-02-09 杭州奥盛仪器有限公司 Ihhnv病毒lamp-crispr等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法
CN112795470A (zh) * 2020-12-25 2021-05-14 山东舜丰生物科技有限公司 一种检测装置
CN112812951A (zh) * 2021-02-03 2021-05-18 杭州杰毅生物技术有限公司 一种封闭式反应耗材
CN112877191A (zh) * 2021-02-22 2021-06-01 西安交通大学 一种防污染耗材以及应用该防污染耗材进行crispr分子诊断的方法
CN113150965A (zh) * 2021-04-21 2021-07-23 西安交通大学 一种防污染检测管和基于其的crispr分子诊断检测方法
CN113150956A (zh) * 2020-10-30 2021-07-23 重庆中元汇吉生物技术有限公司 一站式反应器及核酸检测分析仪
CN113502215A (zh) * 2021-08-27 2021-10-15 营口市农业农村综合发展服务中心 小反刍兽疫病毒的lamp检测方法及基于该方法的实施装置
WO2022088667A1 (zh) * 2020-10-30 2022-05-05 中元汇吉生物技术股份有限公司 一站式反应器

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111218392A (zh) * 2019-02-25 2020-06-02 上海快灵生物科技有限公司 一种生化反应试管及其使用方法和基因扩增试剂盒
CN111218392B (zh) * 2019-02-25 2020-11-27 上海快灵生物科技有限公司 一种生化反应试管及其使用方法和基因扩增试剂盒
CN111808980A (zh) * 2020-07-22 2020-10-23 杭州奥盛仪器有限公司 一种对虾肝肠胞虫lamp-crispr等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法
CN112143780A (zh) * 2020-09-01 2020-12-29 浙江大学 一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法
CN112143780B (zh) * 2020-09-01 2022-04-08 浙江大学 一种核酸扩增后处于灰区样本的确证方法
CN113150956A (zh) * 2020-10-30 2021-07-23 重庆中元汇吉生物技术有限公司 一站式反应器及核酸检测分析仪
WO2022088667A1 (zh) * 2020-10-30 2022-05-05 中元汇吉生物技术股份有限公司 一站式反应器
CN112342317A (zh) * 2020-11-26 2021-02-09 杭州奥盛仪器有限公司 Ihhnv病毒lamp-crispr等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法
CN112795470A (zh) * 2020-12-25 2021-05-14 山东舜丰生物科技有限公司 一种检测装置
CN112812951A (zh) * 2021-02-03 2021-05-18 杭州杰毅生物技术有限公司 一种封闭式反应耗材
CN112877191A (zh) * 2021-02-22 2021-06-01 西安交通大学 一种防污染耗材以及应用该防污染耗材进行crispr分子诊断的方法
CN113150965A (zh) * 2021-04-21 2021-07-23 西安交通大学 一种防污染检测管和基于其的crispr分子诊断检测方法
CN113502215A (zh) * 2021-08-27 2021-10-15 营口市农业农村综合发展服务中心 小反刍兽疫病毒的lamp检测方法及基于该方法的实施装置
CN113502215B (zh) * 2021-08-27 2022-11-04 营口市农业农村综合发展服务中心 小反刍兽疫病毒的lamp检测方法及基于该方法的实施装置

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111334425A (zh) 一种核酸扩增结合crispr检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法
CN111705161A (zh) 一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测引物组合物及试剂盒
CN110241021B (zh) 一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒
CN108913757B (zh) 一种染色体非整倍体数目异常的引物组与检测试剂盒及其应用
CN115029459A (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a可视化检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒及应用
CN111621412A (zh) 一种两步法核酸扩增与检测用的反应管
CN111073964B (zh) 用于检测人类白细胞抗原hla-abcdrdq基因分型的试剂盒
CN113122648A (zh) 一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法
CN110724762A (zh) 一种非洲猪瘟病毒的lamp检测引物及检测方法
CN108034741A (zh) 一种双芽巴贝斯虫巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法
CN108070636A (zh) 一种荧光pcr扩增样本的处理方法和试剂盒
CN110607381B (zh) 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及方法
CN110804677B (zh) 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒
CN111926109B (zh) 非洲猪瘟病毒荧光热对流pcr扩增引物对、探针引物、及制备的试剂盒
CN107012234A (zh) 检测y染色体微缺失的多重pcr引物组、试剂盒和应用
CN111808980A (zh) 一种对虾肝肠胞虫lamp-crispr等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法
CN212316127U (zh) 一种核酸扩增结合crispr检测的双系统耦联用反应管及联管
CN112609006B (zh) 人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用
CN113136457A (zh) 一种非洲马瘟病毒核酸现场快速提取及检测试剂盒
US20080293585A1 (en) 5&#39;/3&#39; Ratioing Procedure for Detection of Gene Rearrangements
CN202671540U (zh) 鸡产蛋性状相关基因—bmp15基因snp分型试剂盒
CA2834113C (en) Methods of nucleic acid liquid-phase extraction and detection
CN114790455B (zh) 用于扩增gjb2基因和slc26a4基因的引物组、试剂盒和方法
CN111690737A (zh) 一种a-地中海贫血基因检测试剂盒及使用方法
CN111363794A (zh) 用于红细胞RHD c.1227G&gt;A基因分型的检测引物组及分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination