CN111621412A - 一种两步法核酸扩增与检测用的反应管 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两步法核酸扩增与检测用的反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，所述盖体包括伸入所述管体中、与管体口部插接配合的塞子部，以及配合时位于管体外的操作部；所述盖体的内部具有用于在第一步核酸扩增时暂时存放检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后通过操作所述操作部将储存室中检测试剂释放到管体中的释放机构。本发明反应管使用时，由于核酸扩增时，仪器对反应管的加热部位只在管体下部的区域，对管体的储存室内暂存的检测试剂影响较小，可以在开始时就将核酸扩增试剂与检测试剂一起加入到相应区域，避免了二次开盖，从而减少气溶胶污染和假阳性问题，使整个检测操作过程更简单方便。

Description

一种两步法核酸扩增与检测用的反应管

技术领域

本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及一种两步法核酸扩增与检测用的反应管。

背景技术

核酸扩增检测技术是开展分子生物学研究的基础，可用于定性、定量地分析和检测微量核酸，其在临床医学、检验医学、分子生物学、基因组学及食品安全等相关的各个领域发挥着重要的作用，是生命科学发展不可或缺的一种重要检验方法。现有核酸扩增技术可根据是否需要温度循环分为两类：第一类为变温扩增体系，包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、连接酶链式反应(ligase chain reaction，LRC)等。其中PCR技术因其特异性强，灵敏度高，价格低廉等优点，是目前应用最为广泛的核酸体外扩增技术。但该技术需要特定的仪器，同时对操作人员以及实验条件有一定的专业要求。第二类为等温扩增体系，包括环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)、滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)以及重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等，该技术无需热循环过程，不需要特殊仪器，但其扩增易产生假阳性。

近年来，CRISPR技术的出现带来了一种更简便灵敏的检测方式。其主要原理是利用Cas酶在体系中guide RNA的引导下与目标序列结合后，便会切换为激活状态，高效的切割体系内其它的单链DNA。在体系内加入含有报告基团的单链DNA探针底物后，Cas蛋白识别到靶序列的存在，就会切割单链DNA探针底物从而释放荧光报告基团产生荧光信号。在目前已知的利用CRISPR检测的体系中，由于受到反应温度的影响，CRISPR体系无法在起始时刻就添加到反应体系中，必须等到反应结束后二次开盖再进行后续添加，极易造成严重的气溶胶污染和假阳性问题，并且使得整个检测操作过程变得复杂和繁琐。

现有技术中，常用普通PCR管进行上述核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联方法，比如，授权公告号为CN205077049U的实用新型公开了一种PCR管、PCR管条、PCR管板的密封结构，包括有管体、管盖，管盖靠近底部的周向外表面上分别向外凸设有环形防脱安全凸扣、位于防脱安全凸扣下方的环形密封保险凸扣，防脱安全凸扣和密封保险凸扣分别紧密顶压在管体的管口内侧面上形成密封结构。

公开号为CN102534011A的发明公开了一种全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法和装置，所述方法是扩增反应结束后，把反应管在不开盖的情况下放入在密闭性的装置内，在该密闭性装置内反应管被破壁，使反应管内扩增产物与密闭装置内预置的检测液反应，然后进行荧光检测，判读结果。所述装置包括PCR管、离心管和一顶针塞，所述PCR管能置于离心管中，所述顶针塞具有能刺破PCR管的穿刺针，离心管具有可密闭的管盖。然而，该技术方案仅仅是用于PCR扩增结束后荧光检测时避免了PCR反应产物以气溶胶的形式扩散到空气中，并不适用于核酸扩增结合CRISPR检测的双系统耦联方法。且操作比较复杂，不能自动化操作，PCR管反应完成后再放入离心管中，PCR管经过长时间操作，外表面也容易沾染污染物，造成假阳性。并且，该技术方案中PCR管刺破过程不易控制，很可能在离心管盖子还没盖合之前就已经将PCR管刺破，或者在离心管盖子盖合后还没将PCR管刺破，造成对结果的影响。另外一方面，该技术方案中只能手动进行操作，而无法实现自动化操作。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种两步法核酸扩增与检测用的反应管，可以在开始加入试剂时，将核酸扩增试剂和检测试剂加入反应管中的不同位置，待核酸扩增完成后，不需要打开反应管就可以将检测试剂混入，避免二次开盖造成对结果的影响。

一种两步法核酸扩增与检测用的反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，所述盖体包括伸入所述管体中、与管体口部插接配合的塞子部，以及配合时位于管体外的操作部；所述盖体的内部具有用于在第一步核酸扩增时暂时存放检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后通过操作所述操作部将储存室中检测试剂释放到管体中的释放机构。

优选的，所述塞子部的外周设有若干圈第一密封环。所述第一密封环为间隔设置的2～4圈。第一密封环的设置可以增强盖体与管体之间的密封效果。

优选的，盖体的塞子部与操作部一体成型，所述塞子部的底面开口设置，所述储存室从塞子部底面开口处向上延伸到操作部，所述操作部的至少一段为可向下按压的弹性区；

使用时，盖体倒置，从塞子部底面开口处将检测试剂加入所述储存室并用密封膜密封开口；

所述释放机构包括设于所述储存室顶壁、可随弹性区被按压时下移并刺破所述密封膜的插针。

弹性区的设置所要达到的技术效果是可以在需要时将插针按压下去刺破密封膜，所以，所述弹性区可以是使用的材质本身具有弹性，也可以通过结构设计成具有弹性的形状，比如，设计成波纹管的形状。插针的刺破端可以设计成尖头，方便刺破。

更优选的，所述塞子部和操作部之间设有与管体配合时抵顶管体侧壁顶面的限位环；所述反应管还包括包覆所述操作部的护套，所述护套的底部与所述限位环连接固定。在将盖体与管体配合安装时，盖体的塞子部塞入管体中，直到限位环顶住管体。护套用于保护操作部，避免不小心触碰到操作部使插针意外刺破密封膜。

所述护套的底部具有与所述限位环过盈配合的安装区，以及用于容纳所述操作部的容纳区。护套可以通过安装区与限位环之间过盈配合卡紧。在需要刺破密封膜时，可以直接按压操作部的弹性区，也可以先将护套取下后再按压。护套可以设计成有开口的C字环形结构，这样会方便将护套取下。

优选的，盖体的塞子部与操作部分体设计，所述塞子部具有顶面开口的内腔，所述操作部向下延伸形成与塞子部内腔密封配合的配合部，所述配合部的底面开口设置，所述储存室从配合部底面开口处向上延伸到操作部；所述塞子部在与配合部连接处设有外径缩小的限位区，限位区外套设有可拆卸的限位套；

使用时，操作部倒置，从配合部底面开口处将检测试剂加入所述储存室并用密封膜密封开口；

所述释放机构包括设于塞子部内腔底面、在拆卸限位套并将操作部下压时刺破所述密封膜的插针，塞子部内腔底面还设有供检测试剂流出到管体中的通孔。

所述限位区的外径不大于配合部的外径。所述塞子部的顶部具有与管体配合时抵接管体侧壁顶面的限位环；装配后，所述限位套的底面与限位环的顶面抵接。

为了方便取下限位套，所述限位套为具有开口的C字环形结构，限位套的材质为具有弹性的塑料件。

为了增强配合部与塞子部内腔的密封配合效果，所述配合部的外周设有若干圈第二密封环。所述第二密封环为间隔设置的2～4圈。

为了方便操作，所述操作部包括设于顶部的拿捏片，拿捏片为薄片状结构，方便手工或者机器自动化操作时对操作部进行操作，可以通过旋转下压操作部来使插针刺破密封膜。

本发明反应管可以用于两步法核酸扩增与检测，核酸扩增可以采用PCR方法、LRC方法、LAMP方法、RCA方法或RPA方法；检测可以使用CRISPR检测方法。

管体的下部为常用PCR检测管一样的倒锥形，可以放入PCR仪中进行反应，也可以使用离心机进行离心，使试剂集中到管体内腔底部。使用时，将核酸扩增试剂加入到管体内腔底部，将检测试剂加入到盖体中的储存室中密封暂存，将盖体与管体装配到一起，然后进行核酸扩增反应，反应结束后降温到室温，然后通过释放机构将储存室中的检测试剂释放到管体中与核酸扩增产物混合，进行检测反应，检测反应结束后可以检测结果。

本发明反应管使用时，由于核酸扩增时，仪器对反应管的加热部位只在管体下部的区域，对管体的储存室内暂存的检测试剂影响较小，可以在开始时就将核酸扩增试剂与检测试剂一起加入到相应区域，避免了二次开盖，从而减少气溶胶污染和假阳性问题，使整个检测操作过程更简单方便。

附图说明

图1为实施例1中两步法核酸扩增与检测用的反应管的立体结构示意图。

图2为实施例1中两步法核酸扩增与检测用的反应管的侧视结构示意图。

图3为图2中沿A-A方向的剖视图。

图4为实施例2中两步法核酸扩增与检测用的反应管的立体结构示意图。

图5为实施例2中两步法核酸扩增与检测用的反应管的侧视结构示意图。

图6为图5中沿B-B方向的剖视图。

图7为实施例2中塞子部的俯视图。

图8为图7中沿C-C方向的剖视图。

具体实施方式

实施例1

如图1～3所示，一种两步法核酸扩增与检测用的反应管，包括管体1-1及与管体1-1配合密封的盖体1-2，盖体1-2包括伸入管体1-1中、与管体1-1口部插接配合的塞子部1-3，以及配合时位于管体1-1外的操作部1-4，盖体1-2的内部具有用于在第一步核酸扩增时暂时存放检测试剂的储存室1-7，以及在核酸扩增完成后通过操作操作部1-4将储存室1-7中检测试剂释放到管体1-1中的释放机构。

塞子部1-3与管体1-1内腔之间塞紧密封，可以将管体1-1内腔与塞子部1-3之间配合面均设计成带有一定锥度，以便增强密封效果。为了增强盖体1-2与管体1-1之间的密封效果，可以在塞子部1-3的外周设有若干圈第一密封环1-5，第一密封环1-5可以为间隔设置的2～4圈。

盖体1-2的塞子部1-3与操作部1-4一体成型，塞子部1-3的底面开口设置，储存室1-7从塞子部1-3底面开口处向上延伸到操作部1-4，该处所说延伸到操作部1-4可以是只延伸到塞子部1-3与操作部1-4的边界处，也可以是延伸到操作部1-4中间的某一区域，还可以是延伸到操作部1-4远离塞子部1-3的一端，只需要能够满足暂存检测试剂以及通过释放机构释检测试剂的要求即可。操作部1-4的至少一段为可向下按压的弹性区1-6。使用时，盖体1-2倒置，从塞子部1-3底面开口处将检测试剂加入储存室1-7并用密封膜1-9密封开口。释放机构包括设于储存室1-7顶壁、可随弹性区1-6被按压时下移并刺破密封膜1-9的插针1-8。

弹性区1-6的设置所要达到的技术效果是可以在需要时将插针1-8按压下去刺破密封膜1-9，所以，弹性区1-6可以是使用的材质本身具有弹性，也可以通过结构设计成具有弹性的形状，比如，设计成波纹管的形状，图中所示实施方式为将弹性区1-6设计成波纹管的形状，这一段弹性区1-6可以被向下压缩。插针1-8的刺破端可以设计成尖头，方便刺破。

塞子部1-3和操作部1-4之间设有与管体1-1配合时抵顶管体1-1侧壁顶面的限位环1-10；反应管还包括包覆操作部1-4的护套1-11，护套1-11的底部与限位环1-10连接固定。在将盖体1-2与管体1-1配合安装时，盖体1-2的塞子部1-3塞入管体1-1中，直到限位环1-10顶住管体1-1。护套1-11用于保护操作部1-4，避免不小心触碰到操作部1-4使插针1-8意外刺破密封膜1-9。

护套1-11的底部具有与限位环1-10过盈配合的安装区，以及用于容纳操作部1-4的容纳区。护套1-11可以通过安装区与限位环1-10之间过盈配合卡紧。在需要刺破密封膜1-9时，可以直接按压操作部1-4的弹性区1-6，也可以先将护套1-11取下后再按压。护套1-11可以设计成有开口的C字环形结构，这样会方便将护套1-11取下。

使用时，先将核酸扩增的试剂加入管体1-1内腔底部，将盖体1-2倒置，从塞子部1-3底面开口处将检测试剂加入储存室1-7并用密封膜1-9密封开口；然后将盖体1-2与管体1-1装配好，放入PCR仪中进行核酸扩增反应；核酸扩增反应完成后，降温到室温，然后拆下(也可以不拆下)护套1-11后向下按下弹性区1-6，使插针1-8刺破密封膜1-9，将储存室1-7中的检测试剂释放到管体1-1中与核酸扩增产物混合，进行检测反应，检测反应结束后可以检测结果。

实施例2

如图4～8所示，一种两步法核酸扩增与检测用的反应管，包括管体2-1及与管体2-1配合密封的盖体2-2，盖体2-2包括伸入管体2-1中、与管体2-1口部插接配合的塞子部2-3，以及配合时位于管体2-1外的操作部2-4，盖体2-2的内部具有用于在第一步核酸扩增时暂时存放检测试剂的储存室2-7，以及在核酸扩增完成后通过操作操作部2-4将储存室2-7中检测试剂释放到管体2-1中的释放机构。

塞子部2-3与管体2-1内腔之间塞紧密封，可以将管体2-1内腔与塞子部2-3之间配合面均设计成带有一定锥度，以便增强密封效果。为了增强盖体2-2与管体2-1之间的密封效果，可以在塞子部2-3的外周设有若干圈第一密封环2-5，第一密封环2-5可以为间隔设置的2～4圈。

盖体2-2的塞子部2-3与操作部2-4分体设计，塞子部2-3具有顶面开口的内腔，操作部2-4向下延伸形成与塞子部2-3内腔密封配合的配合部2-6，配合部2-6的底面开口设置，储存室2-7从配合部2-6底面开口处向上延伸到操作部2-4。该处所说延伸到操作部2-4可以是只延伸到配合部2-6与操作部2-4的边界处，也可以是延伸到操作部2-4中间的某一区域，还可以是延伸到操作部2-4远离配合部2-6的一端，只需要能够满足暂存检测试剂以及通过释放机构释检测试剂的要求即可。

塞子部2-3在与配合部2-6连接处设有外径缩小的限位区2-11，限位区2-11外套设有可拆卸的限位套2-12。使用时，操作部2-4倒置，从配合部2-6底面开口处将检测试剂加入储存室2-7并用密封膜2-9密封开口。释放机构包括设于塞子部2-3内腔底面、在拆卸限位套2-12并将操作部2-4下压时刺破密封膜2-9的插针2-8，塞子部2-3内腔底面还设有供检测试剂流出到管体2-1中的通孔2-15。如图所示，通孔2-15设于塞子部2-3内腔底面一侧，塞子部2-3内腔底面的其余部分向通孔2-15处倾斜，便于检测试剂流出。限位区2-11的外径不大于配合部2-6的外径，这样，在刺破密封膜2-9时，操作部2-4旋转下压过程中限位区2-11不会与塞子部2-3发生挤压、影响下压过程。塞子部2-3的顶部具有与管体2-1配合时抵接管体侧壁顶面的限位环2-10；装配后，限位套2-12的底面与限位环2-10的顶面抵接。

为了方便取下限位套2-12，限位套2-12为具有开口的C字环形结构，限位套2-12的材质为具有一定弹性的塑料件。

为了增强配合部2-6与塞子部2-3内腔的密封配合效果，配合部2-6的外周设有若干圈第二密封环2-13，第二密封环2-13为间隔设置的2～4圈。

为了方便操作，操作部2-4包括设于顶部的拿捏片2-14，拿捏片2-14为薄片状结构，方便手工或者机器自动化操作时对操作部2-4进行操作，可以通过旋转下压操作部2-4来使插针2-8刺破密封膜2-9。

使用时，先将核酸扩增的试剂加入管体2-1内腔底部，将操作部2-4倒置，从配合部2-6底面开口处将检测试剂加入储存室2-7并用密封膜2-9密封开口；然后将操作部2-4和配合部2-6与塞子部2-3配合安装，安装后再将整个盖体2-2与管体2-1装配好，放入PCR仪中进行核酸扩增反应；核酸扩增反应完成后，降温到室温，然后拆下限位套2-12后，旋转下压操作部2-3，使插针2-8刺破密封膜2-9，使储存室2-7中的检测试剂释放到塞子部2-3的内腔中，再经塞子部2-3内腔底面的通孔2-15释放到管体2-1中与核酸扩增产物混合，进行检测反应，检测反应结束后可以检测结果。

Claims (15)

1.一种两步法核酸扩增与检测用的反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，其特征在于，所述盖体包括伸入所述管体中、与管体口部插接配合的塞子部，以及配合时位于管体外的操作部；所述盖体的内部具有用于在第一步核酸扩增时暂时存放检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后通过操作所述操作部将储存室中检测试剂释放到管体中的释放机构。

2.如权利要求1所述的反应管，其特征在于，所述塞子部的外周设有若干圈第一密封环。

3.如权利要求2所述的反应管，其特征在于，所述第一密封环为间隔设置的2～4圈。

4.如权利要求1所述的反应管，其特征在于，盖体的塞子部与操作部一体成型，所述塞子部的底面开口设置，所述储存室从塞子部底面开口处向上延伸到操作部，所述操作部的至少一段为可向下按压的弹性区；

使用时，盖体倒置，从塞子部底面开口处将检测试剂加入所述储存室并用密封膜密封开口；

所述释放机构包括设于所述储存室顶壁、可随弹性区被按压时下移并刺破所述密封膜的插针。

5.如权利要求4所述的反应管，其特征在于，所述弹性区为一段波纹管。

6.如权利要求4所述的反应管，其特征在于，所述塞子部和操作部之间设有与管体配合时抵顶管体侧壁顶面的限位环；所述反应管还包括包覆所述操作部的护套，所述护套的底部与所述限位环连接固定。

7.如权利要求6所述的反应管，其特征在于，所述护套的底部具有与所述限位环过盈配合的安装区，以及用于容纳所述操作部的容纳区。

8.如权利要求1所述的反应管，其特征在于，盖体的塞子部与操作部分体设计，所述塞子部具有顶面开口的内腔，所述操作部向下延伸形成与塞子部内腔密封配合的配合部，所述配合部的底面开口设置，所述储存室从配合部底面开口处向上延伸到操作部；所述塞子部在与配合部连接处设有外径缩小的限位区，限位区外套设有可拆卸的限位套；

使用时，操作部倒置，从配合部底面开口处将检测试剂加入所述储存室并用密封膜密封开口；

所述释放机构包括设于塞子部内腔底面、在拆卸限位套并将操作部下压时刺破所述密封膜的插针，塞子部内腔底面还设有供检测试剂流出到管体中的通孔。

9.如权利要求8所述的反应管，其特征在于，塞子部的内腔底面向通孔处倾斜。

10.如权利要求8所述的反应管，其特征在于，所述通孔设于塞子部内腔底面一侧，通孔的投影面积占塞子部内腔底面投影面积的10％～60％。

11.如权利要求8所述的反应管，其特征在于，所述限位区的外径不大于配合部的外径。

12.如权利要求11所述的反应管，其特征在于，所述塞子部的顶部具有与管体配合时抵接管体侧壁顶面的限位环；装配后，所述限位套的底面与限位环的顶面抵接。

13.如权利要求8所述的反应管，其特征在于，所述限位套为具有开口的C字环形结构，限位套的材质为具有弹性的塑料件。

14.如权利要求8所述的反应管，其特征在于，所述配合部的外周设有若干圈第二密封环。

15.如权利要求14所述的反应管，其特征在于，所述第二密封环为间隔设置的2～4圈。

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