CN109825647A

CN109825647A - 一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN109825647A
Application number: CN201910230345.9A
Authority: CN
Inventors: 严丹侃; 章东方; 顾江涛; 赵伟; 戚仁德; 李婷
Original assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety of AAAS
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2019-05-31

Abstract

本发明公开了一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒，包括植物病毒DNA快速提取液和检测体系；植物病毒DNA快速提取液包括NaOH和Tris‑HCl；检测体系包括LAMP反应体系和检测体系；LAMP反应体系包括LAMP反应液和LAMP检测引物；LAMP检测引物包括四种反应引物。本发明可快速检测到植物上的紫云英矮缩病毒，通过快速粗提取DNA，直接进行LAMP反应，具有简便、快速、灵敏等优势，应用本发明提供的快速检测试剂盒，对紫云英矮缩病毒病株进行检测可在1小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂。

Description

一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒

技术领域

本发明属于农业技术领域，尤其涉及一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒。

背景技术

紫云英矮缩病毒病是近年来在我国豆科作物上发现的一种严重影响蚕豆(Viciafaba)、豇豆和四季豆等生产的上一种病毒毁灭性病害，其主要毒源是紫云英矮缩病毒(MilkVetchDrawfVirus,MDV)，通常导致豆科作物矮缩、褪绿和芽簇生以及烟草植株矮小和叶片皱缩，尤其在寄主生长的早期与寄主相互作用，导致寄主整株矮缩且无法自然恢复，甚至于整株死亡，已给我国的豆科作物生产造成了严重的经济损失。为此，必须发明一种简单、快速、灵敏的检测方法用于MDV的检测。

在植物病毒的鉴定识别上常采用的方法：生物学实验，血清学检测，电子显微镜观察及分子生物学检测。目前，检测MDV常见检测方法是分子生物学检测方法，主要是利用PCR方法，但PCR检测耗时，操作繁琐，反应需要PCR仪和特殊设备，不适于快速检测使用。因此，需要一个快速准确的方法来检测该病毒。

环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年由日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为替代PCR的新的核酸扩增技术。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶—BstDNApolymerase在恒温条件下(60～65℃)反应60分钟，即可完成核酸扩增。与常规PCR相比，不需要长时间的温度循环，不需要昂贵的PCR仪器。该技术是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。目前，已广泛应用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病监测和快速诊断。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒，可快速检测到植物上的紫云英矮缩病毒。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒，包括植物病毒DNA快速提取液和检测体系；

所述植物病毒DNA快速提取液包括NaOH和Tris-HCl；

所述检测体系包括LAMP反应体系和检测体系；

所述LAMP反应体系包括LAMP反应液和LAMP检测引物；

所述LAMP检测引物包括四种反应引物，所述四种反应引物依次为：

正向外引物F3：5'-TTTTACTGCCCCTGCTCT-3'；

反向外引物B3：5'-AACACTAGTGTACATAACAACAT-3'；

正向内引物FIP：5'-

TTGGACTCAACCTTGCCTTTACTTAGTGAAGGAAAGTTGCCA-3'；

反向内引物BIP：5'-

TGGAGTTGCAGGTACTGACTGTACAAATGCTGGGTTTGGCT-3'；

进一步地，所述NaOH的浓度为0.5M，所述Tris-HCl的pH值为8.0。

本发明的有益效果是：

本发明提供的一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒，可快速检测到植物上的紫云英矮缩病毒，通过快速粗提取DNA，直接进行LAMP反应，具有简便、快速、灵敏等优势，应用本发明提供的快速检测试剂盒，对紫云英矮缩病毒病株进行检测可在1小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明提供的紫云英矮缩病毒的LAMP特异性检测结果图；图中，泳道M为marker，泳道1、2、4、5和7为感染紫云英矮缩病毒病植株，泳道3、6和8为未感染紫云英矮缩病毒病植株，泳道9为阴性；

图2是本发明提供的紫云英矮缩病毒的不同反应温度的优化电泳图；图中，泳道M为marker，泳道1-5模板浓度分别为15、30、45、60、75℃,泳道6为阴性；

图3是本发明提供的紫云英矮缩病毒的不同反应时间的优化电泳图；图中，泳道M为marker，泳道1-5模板反应时间分别为55、60、65、70、75min，泳道6为阴性；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

植物病毒DNA快速提取液包括NaOH和Tris-HCl，其中，NaOH浓度为0.5M，Tris-HCl的pH值为8.0；

检测体系包括LAMP反应体系和检测体系；

LAMP反应体系包括LAMP反应液；

LAMP检测引物包括四种反应引物，四种反应引物依次为：

正向外引物F3：5'-TTTTACTGCCCCTGCTCT-3'；

反向外引物B3：5'-AACACTAGTGTACATAACAACAT-3'；

正向内引物FIP：5'-

TTGGACTCAACCTTGCCTTTACTTAGTGAAGGAAAGTTGCCA-3'；

反向内引物BIP：5'-

TGGAGTTGCAGGTACTGACTGTACAAATGCTGGGTTTGGCT-3'；

检测体系的制备过程为：取0.8μM的正向内引物FIP、0.8μM的反向内引物BIP、0.2μM的正向外引物F3、0.2μM的反向外引物B3、0.4mMdNTPs、1×ThermoPolBuffer、6mMMgCl2、2mMBetaine、8U的BstDNAPolymerase，加入超纯水制备成检测体系。

本实施例提供的一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒，可快速检测到植物上的紫云英矮缩病毒，通过快速粗提取DNA，直接进行LAMP反应，具有简便、快速、灵敏等优势，应用本发明提供的快速检测试剂盒，对紫云英矮缩病毒病株进行检测可在1小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂。

实施例2：

如图1至图3所示，本发明提供了一种紫云英矮缩病毒的快速检测方法，该方法包括以下步骤：

步骤a：检测体系的制备：取0.8μM的正向内引物FIP、0.8μM的反向内引物BIP、0.2μM的正向外引物F3、0.2μM的反向外引物B3、0.4mMdNTPs、1×ThermoPolBuffer、6mMMgCl2、2mMBetaine、8U的BstDNAPolymerase，加入超纯水制备成检测体系；

步骤b：取待测病叶和0.5MNaOH，得混合物，其中，病叶和0.5MNaOH溶液的质量比为1：4，将混合物放置于反应容器内，快速研磨混合物，得研磨液，将研磨液和Tris-HCl混合，制备得样品粗提总DNA提取液，其中，研磨液和Tris-HCl的体积比为1：49；

步骤c：取1μl样品粗提总DNA提取液，加入到检测体系内，建立扩增体系，设置反应温度为60℃-65℃，反应时间为60min-75min，得到反应后溶液；

步骤d：试验判定的具体过程为：取3μL反应后溶液，经用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外光下检测是否出现扩增条带，若出现，则表示检测为阳性，即存在紫云英矮缩病毒，若未出现，则表示检测为阴性，即不存在紫云英矮缩病毒；该方法可在生产实践中对烟草，豆科作物和绿肥作物紫云英上的紫云英矮缩病毒快速检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病毒的监测和鉴定，操作简便易行。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

序列表

<110> 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所

<120> 一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒

<130> 2019.03.25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial sequence)

<400> 1

ttttactgcc cctgctct 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial sequence)

<400> 2

aacactagtg tacataacaa cat 23

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial sequence)

<400> 3

ttggactcaa ccttgccttt acttagtgaa ggaaagttgc ca 42

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial sequence)

<400> 4

tggagttgca ggtactgact gtacaaatgc tgggtttggc t 41

Claims

1.一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒，其特征在于：包括植物病毒DNA快速提取液和检测体系；

所述植物病毒DNA快速提取液包括NaOH和Tris-HCl；

所述检测体系包括LAMP反应体系；

所述LAMP反应体系包括LAMP反应液和LAMP检测引物；

正向外引物F3：5'-TTTTACTGCCCCTGCTCT-3'；

反向外引物B3：5'-AACACTAGTGTACATAACAACAT-3'；

正向内引物FIP：5'-TTGGACTCAACCTTGCCTTTACTTAGTGAAGGAAAGTTGCCA-3'；

反向内引物BIP：5'-TGGAGTTGCAGGTACTGACTGTACAAATGCTGGGTTTGGCT-3'。

2.根据权利要求1所述的一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒，其特征在于：所述NaOH浓度为0.5M，所述Tris-HCl的pH值为8.0。