CN118291676A

CN118291676A - 检测西番莲木质化病毒的引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN118291676A
Application number: CN202410642030.6A
Authority: CN
Inventors: 应东山; 高玲; 王洁; 孙悦; 冯振国; 赵家桔; 李莉萍; 谢彩虹
Original assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Current assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Priority date: 2024-05-23
Filing date: 2024-05-23
Publication date: 2024-07-05

Abstract

本公开属于病毒检测技术领域，提供了检测西番莲木质化病毒的引物组、试剂盒及方法。引物组包括：PWV‑F、PWV‑R、PWV‑P1或PWV‑P2。试剂盒包括反应液，反应液包括上述引物组和检测内参基因PeERS2的引物组。检测方法：提取西番莲植物总RNA，对其进行逆转录合成cDNA第一链；以cDNA第一链为模板，利用上述试剂盒中的两个引物组进行荧光定量PCR，通过扩增曲线和标准曲线来判断是否有西番莲木质化病毒存在。本公开采用基于双重荧光探针检测的多重实时荧光定量PCR，同时对靶标基因和内参基因进行检测，大大提升了检测通量，保证了结果的可靠性和可重复性。

Description

检测西番莲木质化病毒的引物组、试剂盒及方法

技术领域

本公开涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测西番莲木质化病毒的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

西番莲属于山茶亚目西番莲科西番莲属，有530多个种。俗称百香果、激情果、番石榴、巴西果等，原产南美洲巴西和阿根廷。近年来作为国内水果市场的新宠，西番莲在中国台湾、福建、广东、广西、海南和云南等地区栽培推广。西番莲具有很高的营养价值，富含糖类、脂肪、蛋白质、维生素和矿质元素等物质。其果汁占鲜果重量的35~38%，果皮占50~55%，种子占5~8%；干果皮中含果胶20%，粗纤维25%。西番莲果汁具有芒果、石榴、柠檬等多种水果的浓郁香味，风味独特，具有“果汁之王”的美称。

西番莲生产种植过程中，真菌、细菌和病毒病害对其产量造成重要影响。目前已发现20余种病毒可侵染西番莲，其中西番莲木质化病毒（passion fruit woodiness virus，PWV）可引起西番莲木质化病，该病害是西番莲生产中危害最大的病毒性病害之一。感病植株典型症状为整株长势弱小，叶片扭曲、皱缩、花叶，有时会伴随瘤状突起。果实畸形、变小、木质化，果皮变厚，品质严重下降，果实可食率降低。严重危害产量，甚至绝收，限制了西番莲产业的健康发展。

目前对植物病毒的检测、鉴定虽然有一些方法，如电子显微镜检测、血清学检测、ELISA、PCR检测、高通量测序等。常用的巢式PCR法经两轮PCR及电泳，每次试验只能针对一种靶标进行检测，操作繁琐，检测时间长且多次开盖容易交叉污染，尤其是扩增分区条件不好的实验室容易形成气溶胶污染环境而出现假阳性。传统的荧光定量PCR每次也只能扩增一种靶标，要准确检测目的靶标费时费力。多重实时荧光定量PCR可以有效弥补这一缺陷，可降低成本。然而，利用荧光探针检测的多重实时PCR也存在一些问题，如多个荧光探针的共存导致反应体系的背景荧光增加，致使检测灵敏度的下降。

因此，亟需提供一种更高效、适应性更强、灵敏性更高的多重检测方法，以更好地检出西番莲木质化病毒。

发明内容

本公开提供了检测西番莲木质化病毒的引物组、试剂盒及方法，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。

根据本公开的第一方面，提供了检测西番莲木质化病毒的引物组，包括：

上游引物PWV-F，其核酸序列如SEQ ID NO:1：GCATACCGTGCCAAGCTTCT所示；

下游引物PWV-R，其核酸序列如SEQ ID NO:2：AGAAACATGGAGGGACTGTACATG所示；

TaqMan荧光探针PWV-P1，其核酸序列如下所示：VIC-SEQ ID NO:3-BHQ1；其中，SEQID NO:3的核酸序列为：CTCTCAAATTGCGGAGAAGGCCGTACC；或者，TaqMan荧光探针PWV-P2，其核酸序列如下所示：VIC-SEQ ID NO:4-BHQ1；其中，SEQ ID NO:4的核酸序列为：CTCTCAAATTGCGGAGAAGGCCGTACCTA；

其中，PWV-P1和PWV-P2的5’端标记荧光染料VIC，3’端标记BHQ1基团。

具体地，TaqMan荧光探针是在TaqMan探针的3’端连接不发光的淬灭基团BHQ1，与TaqMan探针相比，探针长度缩短，易于与模板退火，从而更有利于提高检测的灵敏度，非常适用于对灵敏度要求高的植物病毒的定量检测，可提高西番莲木质化病毒检测的效率。

在一优选的实施方式中，所述检测西番莲木质化病毒的引物组，包括：

上游引物PWV-F，下游引物PWV-R，TaqMan荧光探针PWV-P1。

根据本公开的第二方面，提供了一种检测西番莲木质化病毒的试剂盒，包括反应液，所述反应液包括上述引物组和检测内参基因PeERS2的引物组。

具体地，为了确保总RNA逆转录的有效性，在逆转录扩增检测西番莲木质化病毒的同时，增加了西番莲内参基因作为对照，以判断逆转录是否有效扩增。

在一可实施方式中，所述检测内参基因PeERS2的引物组包括：

上游引物PeERS2-F1，其核酸序列如SEQ ID NO:5：TTGGAGGAATGTGCAATATGGAT所示；

下游引物PeERS2-R1，其核酸序列如SEQ ID NO:6：GTGCTTGATAATTTAGGGTGTGAGAA所示；

TaqMan荧光探针PeERS2-P1，其核酸序列如下所示：FAM-SEQ ID NO:7-BHQ1；其中，SEQ ID NO:7的核酸序列为：CCATCCCGTACTGGTTCCACTCTGCA；

或者，包括：上游引物PeERS2-F2，其核酸序列如SEQ ID NO:8：GGTCGGACATTAGGCTTGGA所示；

下游引物PeERS2-R2，其核酸序列如SEQ ID NO:9：CTTGATAATTTAGGGTGTGAGAAAGCT所示；

TaqMan荧光探针PeERS2-P2，其核酸序列如下所示：FAM-SEQ ID NO:10-BHQ1；其中，SEQ ID NO:10的核酸序列为：TGCCATCCCGTACTGGTTCCACTCTG；

或者，包括：上游引物PeERS2-F1；

下游引物PeERS2-R3，其核酸序列如SEQ ID NO:11：TTGTGCTTGATAATTTAGGGTGTGA所示；

TaqMan荧光探针PeERS2-P3，其核酸序列如下所示：FAM-SEQ ID NO:12-BHQ1；其中，SEQ ID NO:12的核酸序列为：CCCGTACTGGTTCCACTCTGCAGCTTT；

其中，PeERS2-P1、PeERS2-P2和PeERS2-P3的5’端标记荧光染料FAM，3’端标记BHQ1基团。

在一优选的实施方式中，所述检测内参基因PeERS2的引物组包括：

上游引物PeERS2-F1，下游引物PeERS2-R3，TaqMan荧光探针PeERS2-P3。

在一优选的实施方式中，所述反应液包括：

检测西番莲木质化病毒的引物组：上游引物PWV-F，下游引物PWV-R，TaqMan荧光探针PWV-P1；

和，检测内参基因PeERS2的引物组：上游引物PeERS2-F1，下游引物PeERS2-R3，TaqMan荧光探针PeERS2-P3。

在一可实施方式中，所述反应液还包括2×qPCR Mix、FAM/VIC Reference Dye Ⅱ和水。

在一可实施方式中，所述反应液共10μL，包括：2×qPCR Mix 5μL，FAM/VICReference Dye Ⅱ各0.2μL，10μmol/L上、下游引物各0.2μL，10μmol/L的TaqMan荧光探针各0.1μL，模板1μL，水3.0μL。

在一可实施方式中，所述试剂盒还包括标准品、阳性对照和阴性对照。

在一可实施方式中，所述标准品包括pMD18-T-PWV和pMD18-T-PeERS2，两个所述标准品的工作浓度均为1.0×10¹~1.0×10⁷拷贝/μL，各100μL。

在一可实施方式中，所述阳性对照包括PWV阳性对照和内参基因阳性对照；所述PWV阳性对照为1.0×10⁵拷贝/μL的pMD18-T-PWV，所述内参基因阳性对照为1.0×10⁵拷贝/μL的pMD18-T-PeERS2，各100μL。

在一可实施方式中，所述阴性对照为水，体积为100μL。

具体地，所述水为无酶水（RNase-free H₂O）。

具体地，所述水作为PWV阴性对照和内参基因阴性对照。

根据本公开的第三方面，提供了根据上述试剂盒检测西番莲木质化病毒的方法，包括以下步骤：

S1：提取西番莲的植物总RNA，逆转录所述植物总RNA合成cDNA第一链；

S2：以步骤S1合成的所述cDNA第一链为模板，利用第二方面所述试剂盒中的两个引物组进行荧光定量PCR，通过扩增曲线和标准曲线来判断是否存在所述西番莲木质化病毒；先用标准品绘制引物相对的标准曲线，所述标准曲线的拟合公式为Y=algx+b，其中Y为Ct值，x为拷贝数；根据所述拟合公式的截距b进行判定，若Ct值＜b，则判断样品中存在所述西番莲木质化病毒；若Ct值≥b，则判断样品中不存在所述西番莲木质化病毒。

具体地，按实时荧光定量PCR的原理，本公开设计的TaqMan荧光探针，使探针长度缩短，在退火过程中，易与模板结合，从而提高TaqMan荧光探针的结合效率。特异性引物在PCR扩增过程中可切断TaqMan荧光探针释放荧光基团，产生强烈的荧光信号，即荧光信号强度可同时反映引物扩增和TaqMan荧光探针结合的效率，是方法整体效果的反映。

在一可实施方式中，步骤S1从西番莲的叶片中提取所述西番莲的植物总RNA。

在一可实施方式中，步骤S2进行所述荧光定量PCR时，使用10μL的反应液：2×qPCRMix 5μL，FAM/VIC Reference Dye Ⅱ各0.2μL，10μmol/L上、下游引物各0.2μL，10μmol/L的TaqMan荧光探针各0.1μL，模板1μL，水3.0μL。

在一可实施方式中，步骤S2进行所述荧光定量PCR的条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火并延伸30s，扩增45个循环；在60℃结束时收集荧光信号。

根据本公开的一种可实施方式，至少具有以下效果：

实时荧光定量PCR技术具有高敏感度、高特异度且操作快速简便等优点，在植物病毒检测中有广阔的应用前景。然而，传统的荧光定量PCR每次只能扩增一种病原体核酸，要准确检测植物病毒费时费力，多重实时荧光定量PCR（multiplex real-time-PCR，MRTPCR）可以有效弥补这一缺陷，并且成本低廉。本公开采用基于双重荧光探针检测的多重实时荧光定量PCR技术，同时对靶标基因和内参基因进行检测，每一种探针又对应较多媒介子，大大提升了检测通量，保证了结果的可靠性和可重复性；该技术具有灵敏度高、特异性好、样品需求量少、检测结果重复性好、准确度高、适应性强、操作快速简便等优点，适用于大批样品的检测。该技术不仅能检测西番莲木质化病毒侵染症状的样品，还能鉴定处于潜伏阶段而未表现出明显病毒侵染症状的样品，有助于实现感病植株早诊断早治疗，为西番莲的增收增产提供重要作用；此外，该技术避免了由于过多荧光探针的共存使反应体系的背景荧光增加，进而导致检测灵敏度的下降。

应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。

附图说明

通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，其中：

在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。

图1示出了本公开实施例1中使用第1组引物组合扩增PeERS2的扩增曲线图和标准曲线图；其中，上为扩增曲线图，下为检出标准曲线图；

图2示出了本公开实施例1中使用第2组引物组合扩增PeERS2的扩增曲线图和标准曲线图；其中，上为扩增曲线图，下为检出标准曲线图；

图3示出了本公开实施例1中使用第3组引物组合扩增PeERS2的扩增曲线图和标准曲线图；其中，上为扩增曲线图，下为标准曲线图；

图4示出了本公开实施例1中使用第1组引物组合扩增PWV的扩增曲线图和标准曲线图；其中，上为扩增曲线图，下为标准曲线图；

图5示出了本公开实施例1中使用第2组引物组合扩增PWV的扩增曲线图和标准曲线图；其中，上为扩增曲线图，下为标准曲线图；

图6示出了本公开实施例3中使用第1组引物组合扩增PWV，并使用第3组引物组合扩增PeERS2的扩增曲线图。

具体实施方式

为使本公开的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而非全部实施例。基于本公开中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

西番莲感染西番莲木质化病毒（PWV）后，植株最直接的表现为果实畸形、变小、木质化等症状，果实可食率降低，果实品质严重下降，严重危害产量，甚至绝收，严重限制西番莲产业的健康发展。病毒的快速检测技术为繁育健康种苗提供技术支撑，能够有效促进百香果产业的健康可持续发展。

本公开通过改进多重实时荧光定量PCR法的反应体系，设计特异性TaqMan荧光探针，并优化荧光探针加入量，来区分样品中的每一个靶标，实现更高效、更灵敏的双靶标检测方法。该方法对样品需求量少、检测结果重复性好、准确性高，适用于大批样品检测。该方法不仅能检测西番莲木质化病毒侵染症状的样品，还能鉴定处于潜伏阶段而未表现出明显病毒侵染症状的样品，有助于实现感病植株早诊断早治疗，为西番莲的增收增产提供重要作用。本公开的具体方案将根据以下实施方式来阐明。

以下实施方式用到的一些材料如下：

植物基因组总RNA快速提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）；

引物合成、DL2000、Probe qPCR Mix、pMD18-T Vector克隆试剂盒、感受态细胞（均购自或合成于生工生物工程（上海）股份有限公司）；

反转录试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒（均购自宝生物工程（大连）有限公司）；

其他试剂均为国产分析纯；

荧光定量PCR仪（ABI公司的CFX Opus 96）。

实施例1

检测西番莲木质化病毒的引物组的筛选：

（1）根据NCBI中西番莲公开数据库设计西番莲的内参基因和西番莲木质化病毒（PWV）基因的特异性引物和TaqMan荧光探针序列；为了确保总RNA逆转录的有效性，在逆转录扩增检测西番莲木质化病毒的同时，增加了西番莲内参基因作为对照判断逆转录是否有效性扩增。筛选出如表1所示的几组用于扩增西番莲内参基因和西番莲木质化病毒基因片段的特异性引物和TaqMan荧光探针。

表1

（2）制备标准品：重组质粒标准品pMD18-T-PWV（PWV病毒阳性对照质粒，工作浓度为1.0×10¹~1.0×10⁷拷贝/μL）和pMD18-T-PeERS2（内参基因阳性对照质粒，工作浓度为1.0×10¹~1.0×10⁷拷贝/μL），RNase-free H₂O为PWV病毒阴性对照和内参基因阴性对照。

（3）用表1筛选出的5组特异性引物和TaqMan荧光探针组合对西番莲样品不同浓度的PWV、PeERS2质粒标准品作为模板进行实时荧光定量PCR检测，参考试剂及仪器使用说明，采用10μL反应体系，包含2×qPCR Mix 5μL，FAM/VIC Reference Dye Ⅱ 0.2μL，10μmol/L上下游引物各0.2μL，10μmol/L TaqMan-BHQ1探针各0.1μL，灭菌水4.3μL。荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火并延伸30s，扩增45个循环；在60℃结束时收集荧光信号。

结果显示，根据扩增曲线的S型、标准质粒测试的检测下限、R方、引物扩增效率等方面综合考虑，来筛出最佳引物组组合，结果如图1~5所示。按荧光定量PCR的原理，只有在引物扩增效率高且探针也高效与模板退火结合的情况下（本公开创新采用TaqMan荧光探针的目的就是使探针长度缩短，易于与模板退火以提高探针的效率），引物在扩增的过程中才能同时切断探针释放荧光基团，才会产生强烈的荧光信号，即荧光信号强度可同时反映引物扩增和探针结合的效率，是方法整体效果的反映。因此，综合上述各方面，结合图1~5，可以看出西番莲内参和西番莲木质化病毒的最佳特异性引物和TaqMan荧光探针组合为PeERS2的第3组（PeERS2的F1、R3、P3）和PWV的第1组（PWV的F、R、P1），之后将使用这一组合。

实施例2

提供检测西番莲木质化病毒的试剂盒：

反应液：检测西番莲木质化病毒的引物组（第1组）和检测内参基因PeERS2的引物组（第3组），具体序列见表2；2×qPCR Mix；FAM/VIC Reference Dye Ⅱ；灭菌水；

表2

标准品：分别以PeERS2和PWV为DNA模板，使用引物PeERS2-F1、PeERS2-R3和引物PWV-F、PWV-R分别进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后与pMD18-T Vector连接，转化DH5α，制备重组质粒pMD18-T-PeERS2和pMD18-T-PWV，并进行PCR及测序鉴定是否重组成功。提取鉴定后的上述两种重组质粒，测定浓度后，以10倍梯度稀释至1.0×10¹~1.0×10⁷拷贝/μL作为标准品，各100μL；

阳性对照：1.0×10⁵拷贝/μL的pMD18-T-PeERS2和1.0×10⁵拷贝/μL的pMD18-T-PWV；

阴性对照：RNase-free H₂O，体积为100μL。

实施例3

荧光定量PCR检测样品中是否含有西番莲木质化病毒：

（1）取5~10g新鲜的西番莲嫩叶，置于研钵中，加液氮研磨，将研碎的粉末装入无RNA酶的1.5mL离心管中，加入裂解液，按照天根提取试剂盒说明书进行操作，提取西番莲植物总RNA，再经宝生物反转录试剂盒进行逆转录反应合成cDNA第一链。

（2）采用实施例2提供的试剂盒，按10μL反应体系（包含：2×qPCR Mix 5μL，FAM/VIC Reference Dye Ⅱ各0.2μL，10μmol/L上下游引物各0.2μL，10μmol/L的TaqMan荧光探针各0.1μL，模板1μL，灭菌水3.0μL）进行荧光定量PCR，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火并延伸30s，扩增45个循环；在60℃结束时收集荧光信号。

使用PWV的第1组引物、探针组合分别对7个浓度的标准品pMD18-T-PWV进行实时荧光定量PCR检测，结果得标准曲线为Y=-3.193lgx+41.021，其中Y为Ct值，x为拷贝数。通过标准曲线计算（见表3）可知，当模板起始拷贝数等于1（即拷贝数的对数值为0）时，其Ct值为41.02，而理论上当模板起始拷贝数小于1时，可认为无意义，即基因几乎不表达。因此，是否存在待检的西番莲木质化病毒，根据表3中质粒标准品PWV-1的拷贝数及Ct值，当Ct值≥41时，判读为未感病，没有西番莲木质化病毒存在；当Ct值＜41时，判读为感病，有西番莲木质化病毒存在。

表3

同时，收集荧光信号后的扩增曲线图如图6所示。图6显示，出现两种不同的S型扩增曲线，表明上述西番莲总RNA中存在西番莲木质化病毒，且本公开的检测方法的特异性较高。

应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种检测西番莲木质化病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应液，所述反应液包括检测西番莲木质化病毒的引物组和检测内参基因PeERS2的引物组；所述检测西番莲木质化病毒的引物组包括：

TaqMan荧光探针PWV-P1，其核酸序列如下所示：VIC-SEQ ID NO:3-BHQ1；其中，SEQ IDNO:3的核酸序列为：CTCTCAAATTGCGGAGAAGGCCGTACC；或者，TaqMan荧光探针PWV-P2，其核酸序列如下所示：VIC-SEQ ID NO:4-BHQ1；其中，SEQ ID NO:4的核酸序列为：CTCTCAAATTGCGGAGAAGGCCGTACCTA；

其中，PWV-P1和PWV-P2的5’端标记荧光染料VIC，3’端标记BHQ1基团；

所述检测内参基因PeERS2的引物组包括：

TaqMan荧光探针PeERS2-P1，其核酸序列如下所示：FAM-SEQ ID NO:7-BHQ1；其中，SEQID NO:7的核酸序列为：CCATCCCGTACTGGTTCCACTCTGCA；

TaqMan荧光探针PeERS2-P2，其核酸序列如下所示：FAM-SEQ ID NO:10-BHQ1；其中，SEQID NO:10的核酸序列为：TGCCATCCCGTACTGGTTCCACTCTG；

或者，包括：上游引物PeERS2-F1；

TaqMan荧光探针PeERS2-P3，其核酸序列如下所示：FAM-SEQ ID NO:12-BHQ1；其中，SEQID NO:12的核酸序列为：CCCGTACTGGTTCCACTCTGCAGCTTT；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测西番莲木质化病毒的引物组包括：上游引物PWV-F，下游引物PWV-R，TaqMan荧光探针PWV-P1。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测内参基因PeERS2的引物组包括：上游引物PeERS2-F1，下游引物PeERS2-R3，TaqMan荧光探针PeERS2-P3。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括：检测西番莲木质化病毒的引物组：上游引物PWV-F，下游引物PWV-R，TaqMan荧光探针PWV-P1；

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液还包括2×qPCR Mix、FAM/VIC Reference Dye Ⅱ和水。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品、阳性对照和阴性对照；

所述标准品包括pMD18-T-PWV和pMD18-T-PeERS2，两个所述标准品的工作浓度均为1.0×10¹~1.0×10⁷拷贝/μL，各100μL；

所述阳性对照包括PWV阳性对照和内参基因阳性对照；所述PWV阳性对照为1.0×10⁵拷贝/μL的pMD18-T-PWV，所述内参基因阳性对照为1.0×10⁵拷贝/μL的pMD18-T-PeERS2，各100μL；

所述阴性对照为水，体积为100μL。

7.根据权利要求1~6任一项所述试剂盒检测西番莲木质化病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2：以步骤S1合成的所述cDNA第一链为模板，利用所述试剂盒中的两个引物组进行荧光定量PCR，通过扩增曲线和标准曲线来判断是否存在所述西番莲木质化病毒；先用标准品绘制引物相对的标准曲线，所述标准曲线的拟合公式为Y=algx+b，其中Y为Ct值，x为拷贝数；根据所述拟合公式的截距b进行判定，若Ct值＜b，则判断样品中存在所述西番莲木质化病毒；若Ct值≥b，则判断样品中不存在所述西番莲木质化病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S2进行所述荧光定量PCR的条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火并延伸30s，扩增45个循环；在60℃结束时收集荧光信号。