CN118326070A - 一种基于RPA-Cas12a的油菜黑胫病快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于RPA‑Cas12a的油菜黑胫病的快速检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA；利用RPA上下游引物进行靶标基因的RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；利用RPA扩增产物、Cas12a蛋白、crRNA及核酸探针建立RPA‑Cas12a检测体系，反应后得到RPA‑Cas12a反应产物，通过荧光检测法或试纸条检测法进行鉴定。本发明提供的检测方法，具备稳定性强、灵敏度高和适合现场快速检测等特点，对油菜黑胫病菌近缘种或亚种都能很好的区分，避免了假阳性的产生。同时提供了基于无毒基因的油菜黑胫病的监测技术，便于抗性品种的种植，延缓病原菌入侵大面积危害。

Description

一种基于RPA-Cas12a的油菜黑胫病快速检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于RPA-Cas12a的油菜黑胫病快速检测方法。

背景技术

油菜黑胫病是一种危害十字花科植物的世界性病害，其病原是小球腔菌属(Leptosphaeria)的两种近缘真菌，即斑点小球腔菌(Leptosphaeria maculans,Lm)和双球小球腔菌(Leptosphaeria biglobosa,Lb)，为便于检疫，我国在2009年将高毒力的斑点小球腔菌(L.maculans)引起的病害命名为油菜茎基溃疡病，并列为检疫性病害。

斑点小球腔菌(L.maculans)侵染油菜，还危害白菜、甘蓝和芥菜等近30种十字花科植物，引起茎基溃疡、植株倒伏和死亡，是世界范围内广泛分布的一种严重危害油菜产业的病原菌，具有高毒力和侵略性，L.maculans造成的产量损失约10％～20％，发生严重时可达30％～50％甚至更高。全世界每个生长季节的损失估计超过9亿美元。经济分析预测，通过执行严格的检疫程序将推迟流行病的开始，节省数十亿美元。因此加强检疫和监管是控制该L.maculans病菌传入的重要手段。因此，亟需建立一种高效快速检测技术预防油菜茎基溃疡病。

通常一个L.maculans菌株拥有多个无毒基因，受不同的选择压力的影响不同年份、不同地区的无毒基因分布频率存在差异，因此随着抗性被克服，不同年份应根据当地农业相关部门发布的无毒基因监测情况和预测结果进行针对性种植，避免播种含有无毒基因对应抗性的品种。

目前无毒基因的监测通常选择常规PCR、竞争性等位基因特异性PCR、扩增阻滞突变系统PCR(又称为等位基因特异性PCR)、实时荧光定量PCR、限制性片段长度多态性、焦磷酸测序等技术。这些方法依赖精密的仪器设备，操作难度大，易污染，耗时长而容易出现假阳性，且需要专业、经验丰富的科研人员，需要采集样品运输到实验室进行检测，对偏远的种植区域而言L.maculans的无毒基因监测出现了滞后性，难以满足快速通关的要求。

基于以上技术问题，本发明提供一种基于RPA-Cas12a的油菜黑胫病快速检测方法。

发明内容

本发明针对现有检测技术大多依赖于精密的实验仪器、专业的实验人员和实验场地，检测时间长且容易出现假阳性的问题，提供一种基于RPA-Cas12a的油菜黑胫病快速检测方法，该方法具有稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病病原菌近缘种或亚种都能很好的区分，避免了假阳性的产生，且该方法操作简便、迅速。同时提供了基于无毒基因的油菜黑胫病的监测方法，便于抗性品种的种植延缓入侵后大面积危害。

本发明提供一种基于RPA-Cas12a的油菜黑胫病快速检测方法，包括以下步骤：

提取待测样品的基因组DNA；待测样品包括病原菌或油菜籽或油菜植物组织；

合成油菜黑胫病病原菌中靶标基因的RPA上下游引物，利用所述RPA上下游引物对待测样品的基因组DNA进行靶标基因的RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；

利用所述RPA扩增产物、Cas12a蛋白、crRNA及核酸探针建立RPA-Cas12a检测体系，反应后得到反应产物；

通过荧光检测法或试纸条检测法进行鉴定：

荧光检测法：将所述反应产物用紫外光照射，若呈现荧光，则判定为阳性，表明样品中含有包括靶标基因的油菜黑胫病病原菌；若未呈现荧光，则判定为阴性，表明样品中不含有包括靶标基因的油菜黑胫病病原菌；

试纸条检测法：将所述反应产物用Cas12a专用核酸检测试纸条进行检测，若呈现两条带T+C，则判定为阳性，表明样品中含有包括靶标基因的油菜黑胫病病原菌；若呈现一条带C，则判定为阴性，表明样品中不含有包括靶标基因的油菜黑胫病病原菌。

优选地，所述靶标基因为油菜黑胫病病原菌的actin基因。

优选地，所述actin基因的RPA上下游引物为：

F：CCATCAACCCCAAGTCCAACCGTGAGAAGA，

R：TTCAAGACCAAGCACAGAAGGCTGGAAAAGAG；

RPA-Cas12a检测体系中crRNA为以下任一种：

(1)LbaT1，见SED ID NO.6；

(2)LmaT2，见SED ID NO.2；

(3)LmaT3，见SED ID NO.3；

(4)LmaT4，见SED ID NO.4；

(5)LmaT5，见SED ID NO.5。

优选地，所述靶标基因为油菜黑胫病病原菌的无毒基因，所述无毒基因为AvrLm2、AvrLm(4-7)、AvrLm(5-9)、AvrLm6或AvrLm11；

所述无毒基因为AvrLm2时，RPA扩增引物为：F：CTGAATTGGACGAGATTTGCCAGCAATACAA，R：，GTAGTTCGAATCTGTGAACGCACTGAGGGA；crRNA选自Avr2-T1或Avr2-T2，Avr2-T1见SED ID NO.7，Avr2-T2见SED ID NO.8；

所述无毒基因为AvrLm(4-7)时，RPA扩增引物为：F：GTTACAACGACAAGCTTATTTAACAATCAA，R：GTTACTTTGTTACAATCATTCAAAGCTTCA；crRNA选自Avr(4-7)T2、Avr(4-7)T3、Avr(4-7)T4或Avr(4-7)T5，Avr(4-7)T2见SED ID NO.9，Avr(4-7)T3见SED ID NO.10，Avr(4-7)T4见SED ID NO.11，Avr(4-7)T5见SED ID NO.12；

当所述无毒基因为AvrLm(5-9)时，RPA扩增引物为：F：TCCTAATCTACTTAAAACTCCTTCTCTTCA，R：TTATAGAATTGCCCTTTACGGACATATAAC；crRNA选自Avr(5-9)T1、Avr(5-9)T2、Avr(5-9)T3或Avr(5-9)T4，Avr(5-9)T1见SED ID NO.13，Avr(5-9)T2见SED ID NO.14，Avr(5-9)T3见SED ID NO.15，Avr(5-9)T4见SED ID NO.16；

当无毒基因为AvrLm6时，RPA扩增引物为：F：GATCCCACATATTCACTTCACATTCTTAAC，R：CTAGTAACATACTAAAAACAAATCTGCCTC；crRNA选自Avr6-T1、Avr6-T2或Avr6-T4，Avr6-T1见SED ID NO.17，Avr6-T2见SED ID NO.18，Avr6-T4见SED ID NO.19；

当无毒基因为AvrLm11时，RPA扩增引物为：F：GTTTCTTGCTTCCTATATTTTCTGCTACTC，R：TAAAATTCAGACCTACTTATGGATCTGGTA，crRNA为Avr11-T4，见SED ID NO.20。

优选地，提取待测样品的基因组DNA的具体操作过程为：取疑似发病组织，加入TE缓冲液充分研磨，放入定量滤纸或whatmanNO.1滤纸，充分吸收研磨液后转移至洗涤缓冲液中洗涤，将滤纸转移到RPA扩增体系中进行扩增；所述洗涤缓冲液中含有10mM、pH＝8.0Tris及0.1％Tween-20。

优选地，RPA扩增反应体系为：向冻干酶球中加入29.5μL Buffer、上下游引物各2.4μL、MgOAc 2.5μL，ddH₂O补齐至45μL。冻干酶球选择一颗商品化冻干酶球。

优选地，每10μL RPA扩增反应体系中加入2μL待测样品基因组DNA，在37℃下反应10～30min。

优选地，适用于荧光检测法的反应产物为RPA-Cas12a-FQ，获得方法如下：将100nMCas12a、200nM crRNA、3μM ssDNA-FQ、1×Buffer 2.1、2μL RPA扩增产物混合，ddH₂O补齐至10μL，混匀，在37℃下反应20min，得到反应产物RPA-Cas12a-FQ；所述ssDNA-FQ的序列为5’-荧光基团-TTATT-荧光猝灭基团-3’；

适用于试纸条检测法的反应产物为RPA-Cas12a-FB，获得方法如下：将200nMCas12a、500nM crRNA、500nM ssDNA-FB、1×Buffer 2.1、2μL RPA扩增产物混合，ddH₂O补齐至10μL，混匀，在37℃下反应20min，得到反应产物RPA-Cas12a-FB；所述ssDNA-FB的序列为5’-荧光基团-TTATTTTATTTTATT-Biotin-3’。

优选地，所述荧光基团选自HEX、JOE、TET、ROX、TAMRA或FAM中任一种；所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或MGBNFQ中任一种。

优选地，所述快速检测方法用于区分高同源性油菜黑胫病病原菌近缘种或亚种；或

所述快速检测方法用于油菜黑胫病病原菌的无毒基因的分布频率检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明提供一种基于RPA-Cas12a的油菜黑胫病快速检测方法，具备稳定性强、灵敏度高和适合现场快速检测的特点。通过对不同年份、不同地区和不同寄主的样品检测证明：此方法对有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种或亚种都能很好的区分。

2、本发明提供的检测方法，能够用于油菜黑胫病病原菌的无毒基因的分布频率检测，为避免播种含有无毒基因对应抗性的品种提供可靠的理论依据，延缓病原菌入侵大面积危害。

3、本发明提供的DNA提取和检测方法，具有检测时间短、操作简单、对检测材料质量要求低等特点，只需在37℃下反应15～40分钟便可分析结果，同时在检测时不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选。

4、本发明提供的检测方法，油菜茎秆DNA以及分离得到的其他真菌均不会影响检测结果。检测体系特异性强，crRNA仅识别扩增出的目标核酸分子才能激活Cas12a的“反式切割”活性，Cas12a不参与对油菜基因组DNA及其他真菌的大量脱靶切割，能有效降低假阳性干扰。因此，本发明提供的RPA-Cas12a-FQ检测体系可应用于田间样品直接粗提检测，而无需额外步骤来纯化目标DNA。

附图说明

图1为实施例1不同RPA引物扩增效果的比较；

图2为CRISPR-Cas12a荧光检测油菜黑胫病的高活性crRNA筛选；A：RPA-Cas12a-FQ检测流程示意图。B：30min裂解ssDNA-FQ的荧光积累量(T1-T5代表靶向actin基因的不同crRNA)。C：在365nm紫外线下使用凝胶成像系统和智能手机相机拍摄(DNA模板是Lm actin基因的PCR产物)；

图3为在油菜基因组DNA和Peasy-Lmactin质粒模板中通过凝胶电泳分析actin和Lmactin基因的PCR产物。A、凝胶电泳图；B、RPA-Cas12a-FQ检测；C、荧光信号检测结果。(处理1：1ng质粒。处理2：1ng油菜基因组DNA。处理3：1ng质粒+1ng油菜基因组DNA。处理4：1ng质粒+2ng油菜基因组DNA。处理5：1ng质粒+5ng油菜基因组DNA。处理6：1ng质粒+10ng油菜基因组DNA。处理7：1ng质粒+100ng油菜基因组DNA。)。NTC：无模板对照。误差线表示±标准误差，每个反应重复三次(n＝3)。

图4为RPA-Cas12a检测体系对油菜病原真菌及油菜黑胫病菌近缘真菌特异性评估。A：常见油菜病原真菌菌落形态图。B：使用RPA-Cas12a-FQ从常见油菜病原真菌中特异性检测油菜黑胫病菌。C：RPA-Cas12a-LFD特异性检测油菜茎基溃疡病菌。

图5为RPA-Cas12a-FQ荧光检测和PCR测限度的比较。A：使用琼脂糖凝胶电泳分析Lm actin PCR扩增产物。B：使用RPA-Cas12a-FQ从10倍梯度稀释的质粒DNA中获得的荧光信号。C：使用RAA-exo从10倍梯度稀释的Lm DNA中获得的荧光信号。D：RPA-Cas12a-FQ检测Lb灵敏度(i.使用琼脂糖凝胶电泳分析Lb actin PCR扩增产物。ii.使用RPA-Cas12a-FQ从10倍梯度稀释的基因组DNA中获得的荧光信号。iii.使用酶标仪实时监测反应荧光强度。iv.使用酶标仪监测20min终点荧光强度。)

图6为RPA底相和CRISPR-Cas12a顶相的体积比对检测的影响。

图7为模拟田间发病油菜茎秆的POCT检测。A：人工接种发病的油菜茎秆。B：人工接种发病茎秆的RPA-Cas12a-FQ荧光检测。C：PCR检测电泳图。

图8为海关进口带菌油菜籽检测。A：海关提供的阳性油菜种子样品，包括圆润的种子(上)以及种皮和干瘪的种子(下)。B：携带L.maculans油菜种子的RPA-Cas12a-FQ(Lmactin)检测。C：种子浸泡液在紫外光以及凝胶成像系统下观察图。

图9为不同感病寄主上的油菜黑胫病的检测。A：不同感病寄主(a.油菜茎秆b.油菜叶片c.芥菜叶片d.油菜果荚e.大白菜叶片f.芥蓝叶片)及不同寄主上分离纯化得到的病原菌菌株。B：PCR扩增检测。C：RPA-Cas12a-FQ检测。D：基于Lb actin的RPA-Cas12a-LFD检测。

图10为2018～2019年不同省份的油菜黑胫病菌株的检测。

图11为不同L.maculans，L.biglobosa'brassicae'和L.biglobosa'canadensis'菌株基于RPA-Cas12a-FQ的检测。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

基于RPA-Cas12a油菜黑胫病检测方法的建立

1、待测样品的基因组DNA粗提

取一块疑似发病病组织，加入50μL TE缓冲液进行充分研磨，放入一片d＝1.5mm的定量滤纸，充分吸收研磨液后转移至100μL洗涤缓冲液(10mM Tris[pH＝8.0]，0.1％Tween-20)中洗涤1min，将滤纸片转移到RPA扩增体系中进行扩增。

2、靶标基因选择

对MAT 1-2、actin和β-tublin这三个基因进行滑动窗口分析，以量化它们序列的核苷酸多态性。actin在180～320区间内Lm亚种间无多态性，Lb、Lm种间存在差异(Grandaubert et al 2014,Voigt et al 2005)。因此选择actin基因作为靶标基因，并在此区间内设计检测位点。

3、RPA引物设计

根据RPA试剂盒分析指南提供的引物设计规则，通过NCBI设计了RPA引物用于扩增。

表1基于Lm actin的RPA扩增引物

在RPA引物筛选试验中，所有引物均能从病原菌基因组DNA上扩增出目的条带(图1)。R-Lma-F1、R-Lma-R3的条带最亮扩增效率较高，经检测R-Lma-F1、R-Lma-R3也可扩增Lbactin基因相应片段，因此选取F1、R3作为后续检测试验扩增引物。

4、RPA扩增

RPA扩增程序为：向一颗TwistDx冻干酶球(或同类市售产品)中加入29.5μLBuffer、上下游引物各2.4μL、MgOAc 2.5μL及ddH₂O补齐至45μL混匀分装成5份，取2μL待测样品基因组DNA加入，在37℃下反应10～30min。

5、crRNA的设计

利用在线设计网站(https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/index.html)根据靶标基因的PAM序列(5’-TTTV-3’)的相邻基序设计crRNA引导序列。

表2 crRNA体外转录模板扩增用引物对

选择保守性较高的actin基因(act1)作为油菜黑胫病的检测靶标。通过体外转录合成了crRNA。以actin基因的PCR产物(dsDNA)作为底物，分别检测crRNA结合LbCas12a裂解ssDNA-FQ的活性。结果显示，基于Lm设计的靶标中4条crRNA具有裂解ssDNA-FQ的活性(图2)，仅LmaT1无明显的荧光。LmaT4荧光信号最强，检测活性显著优于其他4条crRNA。基于Lb设计的靶标LbaT1具有较好的荧光信号。

6、RPA-Cas12a检测体系建立

利用得到的RPA扩增产物、Cas12a蛋白、crRNA及核酸探针FQ或FB建立RPA-Cas12a检测体系。

RPA-Cas12a-FQ检测体系：100nM Cas12a、200nM crRNA、1×Buffer 2.1、3μMssDNA-FQ报告基因、2μL RPA产物，ddH₂O足至10μL，37℃孵育20min。

RPA-Cas12a-FB检测体系：将200nM Cas12a、500nM crRNA、500nM ssDNA-FB、1×Buffer 2.1、2μL RPA产物，ddH₂O补齐至10μL，混匀，在37℃下反应20min。

实施例2

油菜黑胫病检测体系特异性评价

1、油菜组织基因组DNA对检测结果的影响

设置处理1：仅添加1ng含有Lmactin片段的质粒，处理2：仅添加1ng油菜基因组DNA，处理3-7：1ng含有Lmactin片段的质粒中分别混入1ng、2ng、5ng、10ng、100ng油菜基因组DNA模拟田间检测样品。

其中，含有Lmactin片段的质粒是按照以下步骤进行构建：

对L.maculans和L.biglobosa actin基因的DNA序列分别进行扩增，反应体系为100μL，其中Mix 50μL，上下游引物各4μL(10pmoL，引物序列参照实施例1中的SED ID NO.21及SED ID NO.25)，模板2μL(约50ng)。反应程序为：94℃30s、57℃30s、72℃5s，共进行32个循环，最后72℃延伸5min，将PCR产物在浓度为1％的琼脂糖胶上进行电泳并用胶回收试剂盒(Axygen,USA)回收。将回收目的片段分别克隆到质粒pEASY-Blunt(TransGen,北京,中国)中。生成的重组质粒，称为pEASY-Lm-actin和pEASY-Lb-actin，在大肠杆菌DH5α细胞中复制，使用无内毒素质粒大提试剂盒提取和纯化。提纯质粒由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。将测序序列与NCBI核酸数据库中序列进行同源性比对。使用NanoDrop 2000对质粒DNA进行定量。

以不同处理组DNA为模板，分别对样品进行PCR扩增和RPA-Cas12a检测。

PCR扩增与检测：以不同处理组DNA为模板，用引物对actin7-F(5'-GTTACGCTCTTCCTCACGCT-3'，SEQ ID NO:29)、actin7-R(5'-CAGGGGCTTCCATTCCG-3'，SEQ IDNO:30)和Lmactin-F2(CGTTGTCCCCATCTACGAGG，SEQ ID NO:31)、Lmactin-R2(ACCACCGCTTTCAAGACCAA，SEQ ID NO:32)分别对样品进行扩增。

PCR扩增程序：95℃3min，95℃15s，59℃退火30s，72℃延伸15s，设置32个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。条带大小分别为315bp、337bp。

RPA-Cas12a检测方法同实施例1。

通过琼脂糖凝胶电泳检测不同样品的PCR扩增产物，如图3A所示，在含有油菜基因组DNA的样品为模板的反应中，油菜的actin 7条带(315bp)能被扩增出来；而在含有Peasy-Lmactin质粒的样品为模板的反应中，油菜茎基溃疡病菌actin基因(337bp)能被扩增出来(图3A)。

通过RPA-Cas12a-FQ检测方法，如图3B可见，单独以油菜基因组DNA为模板无法检测到荧光信号；而以Peasy-Lmactin质粒为模板扩增的产物，可检测到高亮度的荧光信号；不同比例混合的油菜基因组DNA和Peasy-Lmactin质粒为模板也可检测到高亮度的荧光信号。与多功能酶标仪检测的终点荧光值(图3C)的结果一致。

2、油菜常见病原真菌及油菜黑胫病病原菌近缘菌株特异性检测

用CTAB法提取菌丝DNA，以提取的DNA为模板，用通用引物ITS1、ITS4进行PCR扩增，具体步骤是：95℃3min，95℃15s，55℃退火30s，72℃延伸15s，设置32个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。确认片段扩增成功后用胶回收试剂盒进行纯化后送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。将测序序列提交到NCBI核酸数据库中进行同源性比对，确定病原菌种类。

测序结果表明采集分离的菌株分别为茎点霉菌株、根霉菌株、灰霉菌株、镰刀菌菌株、毛霉菌株、链格孢菌株、丝核菌菌株、核盘菌菌株等。菌株信息见表3、菌落形态图见图4A。

表3本发明中所用菌株信息

将形态学相似，遗传上相近的近缘菌株(包括3株Lm，3株Lbb，4株Lbc)与常见病原真菌样品随机排序并编号，以菌株的基因组DNA为RPA扩增模板进行优化后的RPA-Cas12a-FQ荧光检测特异性评价，以ddH₂O作为阴性对照，整个试验重复3次。同时，RPA-Cas12a-LFD反应的特异性也进行了类似的评价。

如图4B所示，通过基于Lm actin的RPA-Cas12a-FQ检测体系对所有样品进行检测，以油菜茎基溃疡病菌DNA为模板能特异检测到荧光，而在以油菜黑胫病菌(Lbb、Lbc)、茎点霉菌株、灰霉菌株、镰刀菌菌株、毛霉菌株、链格孢菌株、丝核菌菌株、核盘菌菌株DNA为模板的样品中未检测到荧光。通过Lb actin的RPA-Cas12a-FQ检测体系对所有样品进行检测，以油菜黑胫病菌(Lbb)DNA为模板能特异检测到荧光，而在以油菜茎基溃疡病菌、油菜黑胫病菌(Lbc)、茎点霉菌株、灰霉菌株、镰刀菌菌株、毛霉菌株、链格孢菌株、丝核菌菌株、核盘菌菌株DNA为模板的样品中未检测到荧光。同时利用基于Lm actin的RPA-Cas12a-LFD检测体系对样品进行检测结果与荧光检测一致(图4C)。

结果表明，油菜茎秆DNA以及分离得到的其他真菌均不会影响检测结果。检测体系特异性强，crRNA仅识别扩增出的目标核酸分子才能激活Cas12a的“反式切割”活性，Cas12a不参与对油菜基因组DNA及其他真菌的大量脱靶切割，能有效降低假阳性干扰，但是受非靶DNA丰度的抑制。因此，CRISPR-Cas12a检测方法可应用于田间样品直接粗提检测，而无需额外步骤来纯化目标DNA。

实施例3

RPA-Cas12a-FQ检测体系灵敏度评价

根据质粒序列和插入片段分子量计算含有900bp Lm actin序列的pEASY-Lm-actin质粒的拷贝数：拷贝数＝(浓度ng/μL×6.022×10²³)/(长度bp×1×10⁹×660)。将实施例2中制备的pEASY-Lm-actin质粒从10¹⁰copies/μL到10⁰copies/μL连续稀释，以不同稀释倍数的质粒为模板。

以Lmactin-F和Lmactin-R为引物进行常规PCR反应灵敏度评价。反应体系为20μL，其中2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme,China)10μL，上下游引物各10pmol，模板1μL。57℃退火30s，72℃延伸15s，设置32个循环，最后72℃延伸5min。分别取2μL上述PCR产物在浓度为1％的琼脂糖胶上进行电泳分析产物。

以R-Lma-F1、R-Lma-R3为引物进行RPA-Cas12a-FQ荧光强度灵敏度评价，试验重复3次，37℃反应30min通过酶标仪读取并记录实时荧光积累量。反应平行样品用智能手机相机和365nm紫外手电筒记录结果。不同处理的荧光信号积累强度进行基于邓肯式单因素方差分析，在P<0.05下评估显著性差异。比较不同检测方法之间的灵敏度差异。

将RPA-Cas12a检测体系与现有Lm检测方法进行灵敏度比较。现有Lm检测方法记载在申请号为202110343962.7的专利文献中。

通过凝胶电泳可见PCR检测Lm actin基因的最低灵敏度为1×10⁵copies(5ng)(图5A)；RAA-exo检测Lm的最低灵敏度为1ng(图5C)；而RPA-Cas12a-FQ体系通过便携式紫外手电筒检测，其最低灵敏度为1×10⁴copies(0.5ng)(图5B)。由此可见，RPA-Cas12a-FQ方法检测Lm actin灵敏度是普通PCR凝胶电泳检测灵敏度的10倍，约是RAA-exo检测方法的2倍。PCR检测Lb actin基因的最低灵敏度为1ng(图5D-i)，RPA-Cas12a-FQ方法检测Lb灵敏度是普通PCR检测方法的10倍，为100pg(图5D-ii)；反应过程(图5D-iii)及20min终点荧光(图5D-iv)使用酶标仪实时监测。

实施例4

基于Lm无毒基因的快速检测体系

通过NCBI数据库下载不同无毒基因核苷酸序列设计特异性引物检测NT-14、ZZ-5、479-2Lm菌株所携带的无毒基因类型。三株Lm菌株均不含有AvrLm1、AvrLm14、AvrLmSTEE98，AvrLm10B、AvrLmS-Lep2含量较低。因此本发明以AvrLm2、AvrLm(4-7)、AvrLm(5-9)、AvrLm6及AvrLm11作为无毒基因建立检测体系。

1、无毒基因的引物设计及crRNA设计

方法同实施例1。

无毒基因为AvrLm2时，RPA扩增引物为：F：CTGAATTGGACGAGATTTGCCAGCAATACAA，SED ID NO.33，R：，GTAGTTCGAATCTGTGAACGCACTGAGGGA，SED ID NO.34；crRNA选自Avr2-T1或Avr2-T2，Avr2-T1见SED ID NO.7，Avr2-T2见SED ID NO.8。

无毒基因为AvrLm(4-7)时，RPA扩增引物为：F：GTTACAACGACAAGCTTATTTAACAATCAA，SED ID NO.35，R：GTTACTTTGTTACAATCATTCAAAGCTTCA，SED ID NO.36；crRNA选自Avr(4-7)T2、Avr(4-7)T3、Avr(4-7)T4或Avr(4-7)T5，Avr(4-7)T2见SED ID NO.9，Avr(4-7)T3见SED ID NO.10，Avr(4-7)T4见SED ID NO.11，Avr(4-7)T5见SED ID NO.12。

无毒基因为AvrLm(5-9)时，RPA扩增引物为：F：TCCTAATCTACTTAAAACTCCTTCTCTTCA，SED ID NO.37，R：TTATAGAATTGCCCTTTACGGACATATAAC，SED ID NO.38；crRNA选自Avr(5-9)T1、Avr(5-9)T2、Avr(5-9)T3或Avr(5-9)T4，Avr(5-9)T1见SED ID NO.13，Avr(5-9)T2见SED ID NO.14，Avr(5-9)T3见SED ID NO.15，Avr(5-9)T4见SED ID NO.16。

无毒基因为AvrLm6时，RPA扩增引物为：F：GATCCCACATATTCACTTCACATTCTTAAC，SEDID NO.39，R：CTAGTAACATACTAAAAACAAATCTGCCTC，SED ID NO.40；crRNA选自Avr6-T1、Avr6-T2或Avr6-T4，Avr6-T1见SED ID NO.17，Avr6-T2见SED ID NO.18，Avr6-T4见SED IDNO.19。

无毒基因为AvrLm11时，RPA扩增引物为：F：GTTTCTTGCTTCCTATATTTTCTGCTACTC，SED ID NO.41，R：TAAAATTCAGACCTACTTATGGATCTGGTA，SED ID NO.42，crRNA为Avr11-T4，见SED ID NO.20。

表4crRNA体外转录模板扩增用引物对

在梯度一步法检测体系中，基于RPA的目标扩增和基于CRISPR-Cas12a的荧光检测通过动态扩散连接。

RPA反应溶液(顶相)由480nM引物、280nM MgOAc、10％蔗糖或甘油和1ng粗提靶标DNA在1×缓冲液中混合。CRISPR-Cas12a检测溶液(底相)由100nM Cas12a、3μM ssDNA-FQ报告基因和500nM crRNA在1×Buffer 2.1中混合，顶相与底相比例为1:1～3。37℃孵育20min，用于无毒基因的检测，孵育结束后由智能手机相机在365nm紫外手电筒光下拍摄(图6)。

实施例5

基于RPA-Cas12a检测体系构建田间即时检测方法

1、模拟田间发病油菜茎秆POCT检测应用实例

选用3株油菜茎基溃疡病病菌(Lm)NT-14、ZZ-5、479-2在V8培养基平板上活化，1株油菜黑胫病病菌(Lbb)W10，1株油菜黑胫病加拿大亚类(Lbc)Lbc1204在PDA培养基平板上活化获得新鲜菌丝。采集一些健康的油菜茎秆，保持粗细、长势尽可能一致，用无菌水清洗后晾干。取茎秆基部10cm对半切开，100℃沸水煮10min，装入锥形瓶中高温高压灭菌(121℃30min)，冷却后进行接种。

模拟单一病原菌侵染时，在每个茎秆两端各接种1个2mm×2mm的新鲜菌丝块；模拟多种病原菌混合侵染时，将两种病原菌菌丝块紧靠放置在茎秆两端。接种后放入含无菌水的锥形瓶保湿，放置于20℃恒温培养箱黑暗培养14d。

用灭菌小刀刮取感染发病的油菜茎秆组织并进行DNA快速提取，提取方法见第五章1.1。以粗提DNA为模板进行RPA-Cas12a-FQ检测分析。

同时使用特异性引物LbigF(ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA，SED ID NO.43)、LmacF(CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA，SED ID NO.44)、LmacR(GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG，SEDID NO.45)对该批样品进行检测。具体步骤是：95℃3min，95℃15s，57℃退火30s，72℃延伸15s，设置32个循环，最后72℃延伸5min。将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。阳性扩增结果是Lm的基因组DNA可扩增得到一条331bp大小的特异性条带，而Lbb是444bp大小的条带，阴性结果则无任何条带。试验重复3次。

模拟Lm、Lbb、Lbc单一病原菌侵染的5组油菜茎秆以及模拟Lm、Lbb两种病原菌混合侵染的3组油菜茎秆接种培养14天后(图7A)。用Lm actin、Lbb actin检测体系分别对8组发病油菜茎秆进行POCT检测。在Lm actin检测中，只接种Lm的油菜茎秆以及同时接种Lm、Lbb两种病原菌的茎秆样品检测结果均为阳性，在便携式紫外手电光照下呈现明显的荧光，模拟Lbb、Lbc侵染的茎秆样品显示为阴性；在Lbb actin检测中，只接种Lbb的茎秆样品以及同时接种Lm、Lbb两种病原菌的茎秆样品检测结果均显示为阳性，模拟Lm、Lbc侵染的茎秆样品显示为阴性(图7B)，与PCR检测结果(图7C)一致。

2、海关进口带菌油菜籽检测应用实例

种子样品用无菌水室温浸泡0.5h～1h，无菌水洗涤3次后加入无菌水浸泡。置于20℃-25℃培养1d无菌水洗涤3次后转入-20℃下冷冻处理过夜：1％次氯酸钠消毒10min无菌水洗涤3次后置于APDA培养基上(30粒/皿～40粒/皿)，20℃下黑暗培养10d。

用油菜籽样品用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，孔径2.5mm筛上物多为豆荚、茎秆等植株残体，孔径1.5mm筛下物多为碎屑和干瘪、细小油菜籽。筛上物和筛下物，取1g制样，每份样品加入2mL无菌水分别浸泡30min。取2μL浸泡液进行RPA-Cas12a-FQ检测，同时以PCR反应作为对照。

广州海关及上海黄浦海关提供的携带L.maculans的油菜种子样品(图8A)用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，孔径2.5mm筛上物多为豆荚、茎秆等植株残体，孔径1.5mm筛下物多为碎屑和干瘪、细小油菜籽。筛上物和筛下物，取1g制样，每份样品加入2mL无菌水分别浸泡30min。取2μL浸泡液进行RPA-Cas12a-FQ检测，同时以PCR反应作为对照。RPA-Cas12a-FQ(Lm actin)检测，五份样品均呈现强阳性荧光(图8B)，与PCR检测结果一致，检出率100％。

3、田间发病植物检测应用

不同寄主检测：从2022年青海省、新疆维吾尔自治区、四川省、湖北省等地采集的油菜茎秆、油菜叶片、油菜果荚、甘蓝叶片、芥蓝叶片、白菜叶片上分别取0.2cm×0.2cm的疑似发病组织进行DNA快速提取以及经R-lma-F1、R-lma-R3扩增后分别加入基于Lm和Lbactin的Cas12a-FQ检测体系中进行检测，再对发病组织进行病原菌分离纯化、DNA提取和基于ITS的PCR检测。

从2022年青海省、新疆维吾尔自治区、四川省、湖北省等地采集疑似发病的油菜茎秆、油菜叶片、油菜果荚、甘蓝叶片、芥蓝叶片、白菜叶片。在病健交界处取样进行分离纯化(图9A)，氯仿酚提取DNA并进行PCR检测(图9B)。再取0.2g发病组织快速提取DNA经R-lma-F1、R-lma-R3扩增后分别加入基于Lm和Lb actin的Cas12a-FQ检测体系中进行检测(图9C)。六种不同寄主上的病原菌均为Lb，荧光检测结果与PCR一致。根据荧光检测结果选用基于Lbactin的RPA-Cas12a-LFD检测体系进行检测，检测结果与PCR、荧光检测结果一致(图9D)。

不同年份不同地区分离菌株检测：

(1)对2018-2019年间，从江西省、陕西省、江苏省、安徽省、贵州省、湖北省、四川省、湖南省、云南省、河南省、上海11个省、直辖市，不同油菜种植地区采集的油菜发病茎秆上分离保存的175个菌株进行活化。首先通过ITS基因PCR扩增进行验证，接着，用实施例1方法快速提取菌丝DNA并进行基于Lb actin设计优化的RPA-Cas12a-FQ检测，检测结果与传统的PCR检测结果进行对比。

(2)将12个由海关提供的Lm DNA样品、8个Lbb DNA样品和4个Lbc DNA样品进行随机打乱。分别进行基于ITS基因PCR扩增验证、基于Lm actin的RPA-Cas12a-FQ荧光检测和基于Lb actin的RPA-Cas12a-FQ荧光检测。

将24个待测样品进行随机打乱，包括12个由海关提供的Lm样品(2、5、9、12、13、16、17、18、21、22、23、24)、8个Lbb样品(1、4、6、7、10、14、15、19)和4个Lbc样品(3、8、11、20)分别进行基于ITS基因PCR扩增验证、基于Lm actin的RPA-Cas12a-FQ荧光检测和基于Lb actin的RPA-Cas12a-FQ荧光检测，荧光检测结果与PCR检测结果保持一致(图11)。

上述结果说明本发明开发的RPA-Cas12a-FQ荧光检测技术可以用于田间不同菌株的快速检测且较为准确便捷。

Claims (10)

1.一种基于RPA-Cas12a的油菜黑胫病快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测样品的基因组DNA；

合成油菜黑胫病病原菌中靶标基因的RPA上下游引物，利用所述RPA上下游引物对待测样品的基因组DNA进行靶标基因的RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；

利用所述RPA扩增产物、Cas12a蛋白、crRNA及核酸探针建立RPA-Cas12a检测体系，反应后得到反应产物；

通过荧光检测法或试纸条检测法进行鉴定：

荧光检测法：将所述反应产物用紫外光照射，若呈现荧光，则判定为阳性，表明样品中含有包括靶标基因的油菜黑胫病病原菌；若未呈现荧光，则判定为阴性，表明样品中不含有包括靶标基因的油菜黑胫病病原菌；

试纸条检测法：将所述反应产物用Cas12a核酸检测试纸条进行检测，若呈现两条带T+C，则判定为阳性，表明样品中含有包括靶标基因的油菜黑胫病病原菌；若呈现一条带C，则判定为阴性，表明样品中不含有包括靶标基因的油菜黑胫病病原菌。

2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述靶标基因为油菜黑胫病病原菌的actin基因。

3.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于，

所述actin基因的RPA上下游引物为：F：CCATCAACCCCAAGTCCAACCGTGAGAAGA，R：TTCAAGACCAAGCACAGAAGGCTGGAAAAGAG；

RPA-Cas12a检测体系中crRNA为以下任一种：

(1)LbaT1，见SED ID NO.6；

(2)LmaT2，见SED ID NO.2；

(3)LmaT3，见SED ID NO.3；

(4)LmaT4，见SED ID NO.4；

(5)LmaT5，见SED ID NO.5。

4.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述靶标基因为油菜黑胫病病原菌的无毒基因，所述无毒基因为AvrLm2、AvrLm(4-7)、AvrLm(5-9)、AvrLm6或AvrLm11；

所述无毒基因为AvrLm2时，RPA扩增引物为：F：CTGAATTGGACGAGATTTGCCAGCAATACAA，R：，GTAGTTCGAATCTGTGAACGCACTGAGGGA；crRNA选自Avr2-T1或Avr2-T2，Avr2-T1见SED IDNO.7，Avr2-T2见SED ID NO.8；

所述无毒基因为AvrLm(4-7)时，RPA扩增引物为：F：GTTACAACGACAAGCTTATTTAACAATCAA，R：GTTACTTTGTTACAATCATTCAAAGCTTCA；crRNA选自Avr(4-7)T2、Avr(4-7)T3、Avr(4-7)T4或Avr(4-7)T5，Avr(4-7)T2见SED ID NO.9，Avr(4-7)T3见SED ID NO.10，Avr(4-7)T4见SED ID NO.11，Avr(4-7)T5见SED ID NO.12；

当所述无毒基因为AvrLm(5-9)时，RPA扩增引物为：F：TCCTAATCTACTTAAAACTCCTTCTCTTCA，R：TTATAGAATTGCCCTTTACGGACATATAAC；crRNA选自Avr(5-9)T1、Avr(5-9)T2、Avr(5-9)T3或Avr(5-9)T4，Avr(5-9)T1见SED ID NO.13，Avr(5-9)T2见SED ID NO.14，Avr(5-9)T3见SED ID NO.15，Avr(5-9)T4见SED ID NO.16；

当无毒基因为AvrLm6时，RPA扩增引物为：F：GATCCCACATATTCACTTCACATTCTTAAC，R：CTAGTAACATACTAAAAACAAATCTGCCTC；crRNA选自Avr6-T1、Avr6-T2或Avr6-T4，Avr6-T1见SEDID NO.17，Avr6-T2见SED ID NO.18，Avr6-T4见SED ID NO.19；

当无毒基因为AvrLm11时，RPA扩增引物为：F：GTTTCTTGCTTCCTATATTTTCTGCTACTC，R：TAAAATTCAGACCTACTTATGGATCTGGTA，crRNA为Avr11-T4，见SED ID NO.20。

5.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，提取待测样品的基因组DNA的具体操作过程为：取疑似发病组织，加入TE缓冲液充分研磨，放入定量滤纸或whatmanNO.1滤纸，充分吸收研磨液后转移至洗涤缓冲液中洗涤，将滤纸转移到RPA扩增体系中进行扩增；所述洗涤缓冲液中含有10mM、pH＝8.0Tris及0.1％Tween-20。

6.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，RPA扩增反应体系为：向冻干酶球中加入29.5μL Buffer、上下游引物各2.4μL、MgOAc 2.5μL，ddH₂O补齐至45μL。

7.根据权利要求6所述的快速检测方法，其特征在于，10μL RPA扩增反应体系中加入2μL待测样品基因组DNA，在37℃下反应10～30min。

8.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，

适用于荧光检测法的反应产物为RPA-Cas12a-FQ，获得方法如下：将100nM Cas12a、200nM crRNA、3μM ssDNA-FQ、1×Buffer 2.1、2μL RPA扩增产物混合，ddH₂O补齐至10μL，混匀，在37℃下反应20min，得到反应产物RPA-Cas12a-FQ；所述ssDNA-FQ的序列为5’-荧光基团-TTATT-荧光猝灭基团-3’；

适用于试纸条检测法的反应产物为RPA-Cas12a-FB，获得方法如下：将200nM Cas12a、500nM crRNA、500nM ssDNA-FB、1×Buffer 2.1、2μL RPA扩增产物混合，ddH₂O补齐至10μL，混匀，在37℃下反应20min，得到反应产物RPA-Cas12a-FB；所述ssDNA-FB的序列为5’-荧光基团-TTATTTTATTTTATT-Biotin-3’。

9.根据权利要求8所述的快速检测方法，其特征在于，

所述荧光基团选自HEX、JOE、TET、ROX、TAMRA或FAM；

所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或MGBNFQ。

10.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，

所述快速检测方法用于区分高同源性油菜黑胫病病原菌近缘种或亚种；或

所述快速检测方法用于油菜黑胫病病原菌的无毒基因的分布频率检测。