CN116356080A - 一种检测锦鲤疱疹病毒的rpa-lfd引物、探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域，公开了一种检测锦鲤疱疹病毒的RPA‑LFD引物、探针及试剂盒。本发明提供了一种检测锦鲤疱疹病毒的试剂，其具有较高的灵敏度和特异性，最低检测限为101copy/μL，检测效果稳定，与鲤浮肿病毒(CEV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV‑2)以及锦鲤(鲤)易感染细菌嗜水气单胞菌，无交叉反应。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测锦鲤疱疹病毒的RPA-LFD引物、探针及试剂盒。
背景技术
锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV)又称鲤疱疹病毒3型(Cyprinidherpesvirus
3.CyHV-3)，是具有囊膜的双链DNA病毒，病毒颗粒直径为167～200nm，基因组全长达295kbp，共编码164个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，是目前已知基因组最大的疱疹病毒。锦鲤疱疹病毒是引起鲤(Cyprinus carpio Linnaeus)、锦鲤及其变种患上锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease，KHVD)的病原，致死率高达80％以上，该病已在中国、日本、德国、比利时、英国、法国和波兰等多个国家和地区暴发流行，对全球鲤鱼养殖产业及锦鲤观赏鱼产业造成了巨大的经济损失。
鲤鱼，属于鲤形目，鲤科，对水体环境适应性强，是我国淡水养殖传统的优良品种，也是世界范围内重要的淡水养殖品种。锦鲤色彩艳丽、泳姿雄然，具有极高的的观赏和饲养价值，有着“观赏鱼之王”的美誉。目前，随着人们生活水平的提高，对鲤鱼及锦鲤的需求也越来越大。
但就鲤或锦鲤养殖的现状而言，存在许多问题，比如规模小而分散、养殖技术不规范等，此外病害防治技术落后，携带病原现象普遍，在锦鲤进出口和锦鲤大赛过程中，都存在疫病扩散的风险。因此，针对鲤或锦鲤开展快检试剂盒研究，为疫病监测和预警提供必要的技术支持，是目前锦鲤健康养殖和进出口贸易的迫切需求。相关技术中，尚未有一种对无需杀锦鲤、肉眼可观察锦鲤疱疹病毒感染情况的检测方法。因此，开发一种简单、快速、肉眼可视化的现场快速检测方法及试剂盒对于锦鲤疱疹病毒的监测和预警防控具有重要的意义。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种试剂。
本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种非诊断目的地检测锦鲤疱疹病毒的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种试剂，包含引物对和/或探针；
所述引物对为引物对1、引物对2、引物对3中任一种；
所述探针为探针1、探针2、探针3、探针4、探针5、探针6中任一种；
所述引物对1包含上游引物1F和下游引物1R，1F的序列为：5’-CTCCACCTCGTTCTTGTAACATATCTATCC(SEQ ID No.2)-3’；1R的序列为：5’-GCAAGTGTTTCGTGTTT CGGTAGTTTAG(SEQ ID No.5)-3’；
所述引物对2包含上游引物2F和下游引物2R，2F的序列为：5’-CCTCGTTCTTGTAACATATCTATCCTGTGATG(SEQ ID No.3)-3’；2R的序列为：5’-TTAAAGTATTGGACGCAAAGTCGCTCAG(SEQ ID No.6)-3’；
所述引物对3包含上游引物3F和下游引物3R，3F的序列为：5’-CTCGTTCTTGTAACATATCTATCCTGTGAT(SEQ ID No.4)-3’；3R的序列为：5’-GTTTCGTGTTTCGGTAGTTTAGTTTTTGTT(SEQ ID No.7)-3’；
所述探针1的序列为：gtgtgtgtggaaccaataaaattgtgcgactTgaaTatggttgtacgggtt(SEQ ID No.12)；
所述探针2的序列为：tggaaccaataaaattgtgcgacttgaataTggTtgtacgggttttttt(SEQ IDNo.13)；
所述探针3的序列为：aacccgtacaaccatattcaagtcgcacaaTttTattggttccacacac(SEQ ID No.14)；
所述探针4的序列为：cccgtacaaccatattcaagtcgcacaattTtaTtggttccacacacac(SEQ ID No.15)；
所述探针5的序列为：ccgtacaaccatattcaagtcgcacaatttTatTggttccacacacacc(SEQ ID No.8)；
所述探针6的序列为：tacaaccatattcaagtcgcacaattttatTggTtccacacacaccatc(SEQ IDNo.9)。
所述引物对(引物对1、引物对2、引物对3)是基于锦鲤疱疹病毒保守序列设计得到，扩增片段大小为150bp左右。
优选地，所述上游引物(1F、2F、3F)的5’端修饰有如下基团：Biotin(生物素)、生物素-TEG或C3-spacer；进一步优选地，所述上游引物(1F、2F、3F)的5’端修饰有Biotin。
优选地，所述引物对为引物对1、引物对2或引物对3；进一步优选地，所述引物对为引物对1。
优选地，所述探针(探针1、探针2、探针3、探针4、探针5、探针6)的5’端标记有荧光基团。
优选地，所述荧光基团包含FAM(5/6-羧基荧光素)、TET(四氯-6-羧基荧光素)、VIC(绿色荧光蛋白)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)、Cy5(花菁染料)、ROX(羧基-X-罗丹明)中的至少一张；进一步优选地，所述荧光基团包含FAM。
优选地，所述探针(探针1、探针2、探针3、探针4、探针5、探针6)的3’端修饰有聚合酶延伸阻断基团。
优选地，所述阻断基团包含胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG、双脱氧核苷酸、C3-spacer中的至少一种；进一步优选地，所述阻断基团包含C3-spacer。
优选地，所述探针(探针1、探针2、探针3、探针4、探针5、探针6)可以选择将TX XT或TXXXT(其中T为碱基胸腺嘧啶，X为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T))结构中任意一个X替换为dSpacer(其为THF，代表四氢呋喃分子(Tetrahydrofuran spacer))。
优选地，所述探针1的第33、34或35位碱基替换为dSpacer。
优选地，所述探针2的第32或33位碱基替换为dSpacer。
优选地，所述探针3的第32或33位碱基替换为dSpacer。
优选地，所述探针4的第32或33位碱基替换为dSpacer。
优选地，所述探针5的第32或33位碱基替换为dSpacer。
优选地，所述探针6的第32或33位碱基替换为dSpacer。
优选地，上述探针依据的序列根据上述引物对设计，根据扩增序列中TXXT和TXXXT结构设计，探针序列长度为46bp～52bp，将探针的5’端标记荧光基团，3’端标记聚合酶延伸阻断基团，THF代替2个T碱基之间的任一碱基。
优选地，所述探针为探针5或探针6；进一步优选地，所述探针为探针5。
上述探针序列和引物对识别位点不能重叠，避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。
优选地，所述试剂包含引物对和探针：
所述引物对为引物对1，所述探针为探针6；或
所述引物对为引物对2，所述探针为探针6；或
所述引物对为引物对1，所述探针为探针5；或
所述引物对为引物对2，所述探针为探针5；或
所述引物对为引物对3，所述探针为探针5。
优选地，所述试剂用于检测锦鲤疱疹病毒。
优选地，所述试剂的检测对象为锦鲤(Cyprinus carpio koi)。
本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，包含本发明第一个方面的试剂。
优选地，所述试剂盒还包含：RPA-LFD扩增试剂、侧流层析检测试纸条、阳性标准品中的至少一种；进一步优选地，所述试剂盒还包含RPA-LFD扩增试剂、侧流层析检测试纸条(横向流动试纸条)和阳性标准品。
优选地，所述RPA-LFD扩增试剂包含RPA-LFD酶、再水化缓冲液和醋酸镁中的至少一种；进一步优选地，所述RPA-LFD扩增试剂包含RPA-LFD酶、再水化缓冲液和醋酸镁。
优选地，所述RPA-LFD酶包含核酸内切酶、重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶中的至少一种；进一步优选地，所述RPA-LFD酶包含核酸内切酶、重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶。
优选地，所述酶为酶干粉混合物。
优选地，所述酶干粉混合物为冻干粉末形式，当然，可以根据实际需要，选择本领域任何可替代制剂形式。
优选地，所述试剂盒用于检测锦鲤疱疹病毒。
优选地，所述试剂盒的检测对象为锦鲤(Cyprinus carpio)。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的试剂和/或第二个方面的试剂盒在(1)～(3)中任一种中的应用：
(1)非诊断目的地检测锦鲤疱疹病毒；
(2)制备检测锦鲤疱疹病毒的产品；
(3)筛选药物，所述药物用于预防锦鲤疱疹病毒感染、防治锦鲤疱疹病毒病、和/或抑制锦鲤疱疹病毒的复制、表达。
优选地，所述筛选药物为体外非治疗目的。
优选地，所述产品包含试剂盒、试剂套装。
本发明的第四个方面，提供一种非诊断目的地检测锦鲤疱疹病毒的方法，包含采用本发明第一个方面的试剂和/或本发明第二个方面的试剂盒的步骤。
优选地，所述方法包含采用本发明第二个方面的试剂盒的步骤，具体如下：将待测样品、RPA-LFD扩增试剂、引物对、探针混合，反应，滴入侧流层析检测试纸条，判读结果。
优选地，所述待测样品为锦鲤血清或锦鲤的DNA。
优选地，所述反应的条件为35～39℃反应10～30min。
优选地，滴入侧流层析检测试纸条前反应产物采用等体积PBS或者双蒸水进行稀释。
优选地，所述试纸条对照线有条带而检测线无条带，则不含有锦鲤疱疹病毒；所述试纸条对照线和检测线都有条带，则待测样品中含有锦鲤疱疹病毒。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测锦鲤疱疹病毒的试剂，其具有较高的灵敏度和特异度，最低检测限为101copy/μL，检测效果稳定，与鲤浮肿病毒(CEV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)以及锦鲤(鲤)易感染细菌嗜水气单胞菌，无交叉反应。
本发明提供了一种检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒，锦鲤血清可以直接用于检测，无需杀鱼，无需提取组织DNA，不需要借助仪器，检测结果肉眼可视化，适用于无实验操作经验的养殖户现场快速检测锦鲤疱疹病毒。
附图说明
图1是不同RPA-LFD引物探针组合的检测结果图：其中，1表示阳性对照、2表示空白对照、3是引物对1(1F、1R)和Probe 6组合、4是引物对2(2F、2R)和Probe 6组合、5是引物对1(1F、1R)和Probe 5组合、6是引物对2(2F、2R)和Probe 5组合、7是引物对3(3F、3R)和Probe5组合。
图2是实施例3的试剂盒的灵敏度检测结果图：其中，1是阳性对照、2是阴性对照、3是浓度为100copy/μL的阳性标准质粒、4是浓度为101copy/μL的阳性标准质粒、5是浓度为102copy/μL的阳性标准质粒、6是浓度为103copy/μL的阳性标准质粒、7是浓度为104copy/μL的阳性标准质粒、8是浓度为105copy/μL的阳性标准质粒。
图3是实施例3的试剂盒的特异性检测结果图：其中，1是锦鲤疱疹病毒(KHV)、2是阴性对照(双蒸水)、3是鲤浮肿病毒(CEV)、4是鲤春病毒血症病毒(SVCV)、5是鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、6是嗜水气单胞菌。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
核酸释放剂购自珠海宝锐生物科技有限公司。再水化缓冲液、酶干粉混合物、醋酸镁溶液均购自杭州众测生物科技有限公司、再水化缓冲液为杭州众测生物科技有限公司的产品-Abuffer、醋酸镁溶液为杭州众测生物科技有限公司的产品-B buffer、酶干粉混合物为杭州众测生物科技有限公司的产品-干粉管。横向流动试纸条购自武汉君诺德生物技术有限公司。
实施例1样品DNA获取方式
1.利用购自珠海宝锐生物科技有限公司的核酸释放剂获取鱼体血液DNA，具体如下：
(1)收集来自中国水产科学研究院珠江水产研究所养殖基地健康锦鲤及广东各地锦鲤养殖场中已由PCR方法验证为锦鲤疱疹病毒病感染锦鲤的血液，血液静置30分钟后3000rpm离心1分钟，获取血清并保存于中国水产科学研究院珠江水产研究所实验室-80冰箱中。
(2)吸取5uL血清至50uL核酸释放剂中，置于沸水中5分钟。
(3)吸取5uL上清即可得到鱼体血液DNA。
上述方法用于说明：1)血清可用于RPA-LFD检测，这样就不用杀鱼取组织；2)不用细胞或组织基因组DNA提取试剂盒也可以获取DNA，这样省钱又省力。
2.利用天根生化科技(北京)有限公司的细胞、组织(鳃/肾)基因组DNA提取试剂盒，依据试剂盒说明书提取鱼体组织或细胞培养液中DNA。
OIE推荐的检测锦鲤疱疹病毒的方法是提取鱼体鳃或肾组织中DNA，然后PCR检测，如实施例6中的PCR对照方法；本申请的RPA-LFD方法检测锦鲤疱疹病毒的样品不仅可以是上述血清，也可以是鱼体组织或细胞培养液中DNA。
实施例2引物和探针的筛选和验证
1.保守序列的选择
从NCBI基因库中下载KHV-T、KHV-U、KHV-I的全基因组序列，用geneious prime软件进行序列比对，比对出三株病毒中基因序列完全一致的序列，即为保守的序列。
确定的保守序列如下：
5’-ttaatatctcctgttttttttaaagtattggacgcaaagtcgctcagagcaagtgtttcgtgtttcggtagtttagtttttgttaaaaaaaaacc cgtacaaccatattcaagtcgcacaattttattggttccacacacaccatcacaggatagatatgttacaagaacgaggtggagcggctgacacgacgggcgcacccagtagattatgcgcaggaggaggaggcggcggaccgtacagctcgtactgggccatcctgaaccccgtgagacagggacgacacaccgcctggtaagactcggcgcctccaacctggaccaggtccgtgccctgagagattctgacggtgaagggtgcgtcgcgcatcttgcacttcatgcacaccgccgtcagcttgtccagcttgtccgccatgggcaccaacgccgtcacctgcttgaagggctgctgcataaagtccccgtccagcgccgccacgatcacgtacttgcccgcggtcagcagctgcacgactccctcgtagaggtcggggaagaactgtccctcgtcgacggccacggcgtcgtattcctccagacgctgcatcacctcgtacaggtaacccgcggagatggccgggtaggtcgcgccgctgtgcatggccaccttggactcttcggtgtagcgctggtctatggcgtgcttgacggcgatgcagcgtcgcccgctgtaggacagacgctccagccgcctgcagctctctgtgctcttgcccgcgaacatgggtccgatcaccagttccagcatagccatcctttttcagagtgtgcggcggtggtgcggctgcgagataaagagaggcgtagggcccgcagcgcggctctaggagctgcgcgaaacctcgcgattaagtggttg-3’(SEQ ID No.1)。
2.筛选RPA-LFD探针和引物
KHV毒株保守性很强，KHV-T、KHV-U、KHV-I的全基因组序列基本一致，选取三株病毒中一致序列中的900bp设计多对引物和探针，利用NCBI和primer premier引物设计软件筛选出得分最高的3对引物，查找3对引物扩增序列中的TXXT和TXXXT结构设计探针。进一步利用oligo软件计算引物和探针结合的自由能，选取自由能最较小的引物及探针组合。选取结果为引物对1和probe6组合、引物对2和probe6组合，引物对1和probe5组合、引物对2和probe5组合、引物对3和probe5组合，探针和引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成后进行筛选。
引物和探针的设计要求：
(1)引物扩增片段长度为150bp，引物长度25bp～35bp，探针长度46bp～52bp，扩增序列包括探针序列；
(2)引物5’端的dNTP避免鸟嘌呤，引物与引物之间不超过三个以上连续互补配对碱基；
(3)上游引物和下游引物避免形成发卡结构或其他二级结构；
(4)将和探针反向的引物的5’端标记Biotin，将探针的5’端标记荧光基团，3’端标记聚合酶延伸阻断基团，THF代替2个T碱基之间的任一碱基；
(5)选择引物和探针结合自由能低的探针引物组合；
(6)THF之前不能少于30个碱基，THF之后不少于15个碱基；
探针序列和引物识别位点不能重叠，避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基，尤其是引物的3'端与探针不能有超过10个连续的互补碱基。利用生物软件根据引物得分、引物探针结合△G自由能等综合评价引物探针组合，选取出5对最优组合，选取结果为引物对1和probe6组合、引物对2和probe6组合，引物对1和probe5组合、引物对2和probe5组合、引物对3和probe5组合。
获得的引物和探针序列如下：
其中，上游引物F包括：
1F：5’-CTCCACCTCGTTCTTGTAACATATCTATCC(SEQ ID No.2)-3’，其中，5’端修饰有Biotin；
2F：5’-CCTCGTTCTTGTAACATATCTATCCTGTGATG(SEQ ID No.3)-3’，其中，5’端修饰有Biotin；
3F：5’-CTCGTTCTTGTAACATATCTATCCTGTGAT(SEQ ID No.4)-3’，其中，5’端修饰有Biotin；
下游引物R包括：
1R：5’-GCAAGTGTTTCGTGTTTCGGTAGTTTAG(SEQ ID No.5)-3’；
2R：5’-TTAAAGTATTGGACGCAAAGTCGCTCAG(SEQ ID No.6)-3’；
3R：5’-GTTTCGTGTTTCGGTAGTTTAGTTTTTGTT(SEQ ID No.7)-3’；
探针包括：
Probe 5：5’-ccgtacaaccatattcaagtcgcacaatttTatTggttccacacacacc(SEQ IDNo.8)-3’，其中，5’端标记有FAM，第33个碱基替换为dSpacer，3’端修饰有C3Spacer；
Probe 6：5’-tacaaccatattcaagtcgcacaattttatTggTtccacacacaccatc(SEQ IDNo.9)-3’，其中，5’端标记有FAM，第32个碱基替换为dSpacer，3’端修饰有C3Spacer；
其中，引物中的Biotin代表生物素。探针中的FAM代表5/6-羧基荧光素，dSpacer指代THF，表示四氢呋喃连接子，C3Spacer表示阻断聚合酶延伸的基团。
4.筛选最佳引物探针组合
对筛选出的5对引物探针组合进行优选处理。
均以1011copy/μL阳性标准质粒为模板(空白对照加入等量水)，依次加入以下表1中的组分进行扩增。
表1RPA-LFD扩增体系
其中，引物和探针组合具体为：引物1F、1R和probe6组合、引物2F、2R和probe6组合，引物1F、1R和probe5组合、引物2F、2R和probe5组合、引物3F、3R和probe5组合；其中，阳性标准质粒的构建方法如下：依据上述KHV保守片段，设计出扩增标准质粒的引物序列为：F：5'-GAGTCTTACCAGGCGGTGTG–3'(SEQ ID No.10)；R：5'-AGGACCAGACGTCGCTAATG-3'(SEQID No.11)；利用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞、组织基因组DNA提取试剂盒提取感染KHV-GZ1301株病毒的细胞液的DNA，利用上述引物进行PCR扩增。纯化PCR扩增产物并连接至PMD-19T载体，连接产物转化至E.coli感受态细胞，筛选阳性克隆并扩大培养，提取质粒并测序验证。结果获得浓度为1011copy/μL阳性质粒。
5对引物探针组合进行RPA-LFD扩增的条件为：37℃扩增20分钟，将扩增产物加入等体积双蒸水进行稀释，滴入横向流动试纸条样品孔，同时以KHV-GZ1301作为阳性对照(已在文献：李莹莹,王庆,曾伟伟,潘厚军,王英英,刘春,梁红茹,石存斌,吴淑勤.锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定[J].水产学报,2014,38(08):1159-1166.中公开)，水作为空白对照。观察各引物探针组合的显色时间及条带强弱，记录试纸条中检测线显色时间。检测结果见表1及图1。结果判定最优组合为引物1F、1R和probe5组合，该引物探针组合结果为阳性而且显色时间最早。
表1：不同引物探针组合的显色时间
表1中：1是引物对1(1F、1R)和Probe 6组合、2是引物对2(2F、2R)和Probe 6组合、3是引物对1(1F、1R)和Probe 5组合、4是引物对2(2F、2R)和Probe 5组合、5是引物对3(3F、3R)和Probe5组合。
实施例3一种检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒及其使用方法
一种检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒，包含检测锦鲤疱疹病毒的引物对、检测锦鲤疱疹病毒的探针、酶干粉混合物、再水化缓冲液、醋酸镁溶液和横向流动试纸条，其中，检测锦鲤疱疹病毒的引物对为实施例2中的1F和1R，检测锦鲤疱疹病毒的探针为实施例2中的Probe 5。
上述检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)在酶干粉混合物中加入再水化缓冲液Abuffer 25μL；
(2)加入RPA-LFD扩增的2μmol/L上游引物1F、2μmol/L下游引物1R各2μL；
(3)加入RPA-LFD扩增的探针0.6μL；
(4)加入12.9μL水及5μLDNA样本；
(5)在干粉管的盖子上加入醋酸镁溶液B buffer 2.5μL，混匀并短暂离心；
(6)将离心后的溶液体系置于37℃下反应20min；
(7)将扩增产物加入等体积双蒸水进行稀释，滴在横向流动试纸条上判读结果；
其中，获取DNA样本的方式为：
(1)利用购自珠海宝锐生物科技有限公司的核酸释放剂获取鱼体血液、组织或细胞培养液中DNA；
(2)利用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞、组织基因组DNA提取试剂盒提取鱼体血液、组织或细胞培养液中DNA。
实施例4检测锦鲤疱疹病毒试剂盒的灵敏度
检测实施例3的试剂盒的灵敏度，具体方法如下：
(1)将实施例2构建的阳性标准质粒用双蒸水进行梯度稀释，利用浓度为100copy/μL、101copy/μL、102copy/μL、103copy/μL、104copy/μL、105copy/μL的阳性标准质粒进行灵敏度检测，并同时设置阳性对照(1011copy/μL的阳性标准质粒)和阴性对照(水)；
(2)在酶干粉混合物中加入再水化缓冲液Abuffer 25μL；
(3)加入RPA-LFD扩增的2μmol/L上游引物1F、2μmol/L下游引物1R各2μL；
(4)加入RPA-LFD扩增的探针0.6μL；
(5)加入12.9μL水及5μLDNA样本(不同浓度的阳性标准质粒)；
(6)在干粉管的盖子上加入醋酸镁溶液B buffer 2.5μL，混匀并短暂离心；
(7)将离心后的溶液体系置于37℃下反应20min；
(8)将扩增产物加入等体积双蒸水进行稀释，滴在横向流动试纸条上判读结果；
结果如图2所示：实施例3的试剂盒的检测最低限为101copy/μL。
实施例5检测锦鲤疱疹病毒试剂盒的特异性
检测实施例3的试剂盒的特异性，具体方法如下：
(1)提取锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤浮肿病毒(CEV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、嗜水气单胞菌的DNA，提取鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RNA并利用反转录试剂盒获得DNA；
(2)在酶干粉混合物中加入再水化缓冲液Abuffer 25μL；
(3)加入RPA-LFD扩增的2μmol/L上游引物1F、2μmol/L下游引物1R各2μL；
(4)加入RPA-LFD扩增的探针0.6μL；
(5)加入12.9μL水及5μLDNA样本；
(6)在干粉管的盖子上加入醋酸镁溶液B buffer 2.5μL，混匀并短暂离心；
(7)将离心后的溶液体系置于37℃下反应20min；
(8)将扩增产物加入等体积双蒸水进行稀释，滴在横向流动试纸条上判读结果；
结果如图3所示：实施例3的试剂盒仅对锦鲤疱疹病毒有显示检测线，对鲤浮肿病毒(CEV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)和嗜水气单胞菌均无，说明该试剂盒具有很强的特异性。
实施例6应用锦鲤疱疹病毒试剂盒检测样品
应用实施例3的试剂盒检测样品，具体方法如下：
(1)随机选取保存于中国水产科学研究院珠江水产研究所实验室的健康锦鲤及感染锦鲤疱疹病毒的锦鲤血清或组织样品，共选取10个样品，样品按照实施例1获取血清DNA或提取组织中DNA，其中血清DNA用于RPA-LFD检测，组织DNA用于PCR检测(PCR检测依照OIE推荐的PCR方法)。
(2)在酶干粉混合物中加入再水化缓冲液A buffer 25μL；
(3)加入RPA-LFD扩增的2μmol/L上游引物1F、2μmol/L下游引物1R各2μL；
(4)加入RPA-LFD扩增的探针0.6μL；
(5)加入12.9μL水；
(6)加入5μLDNA样本，同时设置阳性对照(1011copy/μL阳性标准质粒)和空白对照(水)；
(7)在干粉管的盖子上加入醋酸镁溶液B buffer 2.5μL，混匀并短暂离心；
(8)将离心后的溶液体系置于37℃下反应20min；
(9)将扩增产物加入等体积双蒸水进行稀释，滴在横向流动试纸条上判读结果；
结果如表2所示，RPA-LFD检测结果与PCR检测结果一致，说明无需杀鱼，锦鲤血清也可用于锦鲤疱疹病毒的检测。
表2：临床样品检测结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种试剂，包含引物对和/或探针；
所述引物对为引物对1、引物对2、引物对3中任一种；
所述探针为探针1、探针2、探针3、探针4、探针5、探针6中任一种；
所述引物对1包含上游引物1F和下游引物1R，1F的序列为：5’-CTCCACCTCGTTCTTGTAACATATCTATCC(SEQ ID No.2)-3’；1R的序列为：5’-GCAAGTGTTTCGTGTTTCGGTAGTTTAG(SEQ ID No.5)-3’；
所述引物对2包含上游引物2F和下游引物2R，2F的序列为：5’-CCTCGTTCTTGTAACATATCTATCCTGTGATG(SEQ ID No.3)-3’；2R的序列为：5’-TTAAAGTATTGGACGCAAAGTCGCTCAG(SEQID No.6)-3’；
所述引物对3包含上游引物3F和下游引物3R，3F的序列为：5’-CTCGTTCTTGTAACATATCTATCCTGTGAT(SEQ ID No.4)-3’；3R的序列为：5’-GTTTCGTGTTTCGGTAGTTTAGTTTTTGTT(SEQ ID No.7)-3’；
所述探针1的序列为：gtgtgtgtggaaccaataaaattgtgcgactTgaaTatggttgtacgggtt(SEQID No.12)；
所述探针2的序列为：tggaaccaataaaattgtgcgacttgaataTggTtgtacgggttttttt(SEQIDNo.13)；
所述探针3的序列为：aacccgtacaaccatattcaagtcgcacaaTttTattggttccacacac(SEQIDNo.14)；
所述探针4的序列为：cccgtacaaccatattcaagtcgcacaattTtaTtggttccacacacac(SEQIDNo.15)；
所述探针5的序列为：ccgtacaaccatattcaagtcgcacaatttTatTggttccacacacacc(SEQIDNo.8)；
所述探针6的序列为：tacaaccatattcaagtcgcacaattttatTggTtccacacacaccatc(SEQIDNo.9)。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：
所述1F、2F和/或3F的5’端修饰有如下基团：生物素、生物素-TEG或C3-spacer。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：
所述探针1、探针2、探针3、探针4、探针5和/或探针6的5’端标记有荧光基团；
优选地，所述探针1、探针2、探针3、探针4、探针5和/或探针6的3’端修饰有聚合酶延伸阻断基团；
优选地，所述探针1、探针2、探针3、探针4、探针5和/或探针6将TXXT或TXXXT结构中任意一个X替换为THF，其中，T为胸腺嘧啶，X为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；
优选地，所述探针1的第33、34或35位碱基替换为THF；
所述探针2的第32或33位碱基替换为THF；或
所述探针3的第32或33位碱基替换为THF；或
所述探针4的第32或33位碱基替换为THF；或
所述探针5的第32或33位碱基替换为THF；或
所述探针6的第32或33位碱基替换为THF。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：
所述引物对为引物对1、引物对2或引物对3；
优选地，所述探针为探针5或探针6。
5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：
所述试剂包含引物对和探针：
所述引物对为引物对1，所述探针为探针6；或
所述引物对为引物对2，所述探针为探针6；或
所述引物对为引物对1，所述探针为探针5；或
所述引物对为引物对2，所述探针为探针5；或
所述引物对为引物对3，所述探针为探针5。
6.一种试剂盒，包含权利要求1～5任一项所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包含：RPA-LFD扩增试剂、侧流层析检测试纸条、阳性标准品中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：
所述RPA-LFD扩增试剂包含RPA-LFD酶、再水化缓冲液和醋酸镁中的至少一种；
优选地，所述RPA-LFD酶包含核酸内切酶、重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶中的至少一种。
9.权利要求1～5任一项所述的试剂和/或权利要求6～8任一项所述的试剂盒在(1)～(3)中任一种中的应用：
(1)非诊断目的地检测锦鲤疱疹病毒；
(2)制备检测锦鲤疱疹病毒的产品；
(3)筛选药物，所述药物用于预防锦鲤疱疹病毒感染、防治锦鲤疱疹病毒病、和/或抑制锦鲤疱疹病毒的复制、表达。
10.一种非诊断目的地检测锦鲤疱疹病毒的方法，包含采用权利要求1～5任一项所述的试剂和/或权利要求6～8任一项所述的试剂盒的步骤。
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| CN (1) | CN116356080A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108103246A (zh) * | 2018-02-01 | 2018-06-01 | 上海海洋大学 | 用于检测ii型鲤疱疹病毒的rpa试剂盒及其专用引物和探针 |
| CN109628640A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-16 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的rpa-lfd引物、方法和试剂盒 |
| CN109913583A (zh) * | 2018-12-30 | 2019-06-21 | 广州动佰生物科技有限公司 | 一种快速检测锦鲤疱疹病毒的引物及其方法 |
| CN114182047A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-03-15 | 浙江省农业科学院 | 一种可视化快速检测中华鳖出血综合症病毒tshsv的rt-rpa试剂盒、引物及探针 |
-
2023
- 2023-04-14 CN CN202310404356.0A patent/CN116356080A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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