CN1436850A - dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法。本发明通过RT－PCR获取目标病毒基因组中某一基因的全长或部分核苷酸序列的cDNA，并分别插入到含有内含子的pBlue SK的两端，构建该基因片段的反向重复，继而将含有内含子的反向重复片段插入到植物表达载体pBIN438上，重组载体通过三亲交配的方法导入农杆菌菌株，获得农杆菌介导的植物抗病毒载体。该载体经农杆菌介导法转化烟草叶盘，对所得转基因植物进行供体病毒和相关病毒的抗性检测表明，使用本发明所获载体转化植株后可获得对相应植物病毒免疫的植株。

Description

dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种植物抗病毒基因工程的方法，更具体地说，本发明涉及一种dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法。

背景技术

植物病毒作为一类侵染植物的主要病原物，在全世界范围内引起农作物、果树、花卉、牧草、药用植物的病害，造成产量和品质的下降，甚至形成毁灭性危害。据不完全统计，全世界每年因植物病毒病害所造成的产量损失就大约占粮食总产量的10％。有效地控制病毒的危害是农业生产的当务之急。

迄今为止，几乎没有能有效地从感染病毒的植物上去除病毒的化学药剂。有些化学药剂(如嘌呤、嘧啶类似物)能减缓病毒的增殖，但无根治之效，而且药剂对作物有伤害作用。因此，病毒病主要以预防为主。目前，生产上所采用的传统方法，如对农具和土壤消毒、组织脱毒法等，费时、费力，且植物在田间种植时，也易再次被病毒侵染，导致“旧病复发”。而抗病毒育种所面临的最大障碍是，不但绝大多数病毒的天然抗性基因资源严重不足，并且存在育种周期长、抗性基因的遗传不稳定以及不能解决某些品种间的远缘杂交的种间障碍等问题。

1985年，Sanford和Johnston提出了来源于病原抗性(PDR)的概念。1986年，Beachy研究组首次证实，表达烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白的转基因植物对其供体病毒TMV产生抗性，随后出现了许多抗病毒转基因报道，所转基因包括外壳蛋白、移动蛋白、复制酶蛋白基因或它们基因的翻译产物以及非翻译序列。获得的转基因植物在阻止或降低病毒侵染方面均收到了一定的效果，遗憾的是较难获得对相关病毒产生免疫的植株。

我国现有的抗病毒基因工程的方法，也仍然处于利用传统的病毒基因的翻译产物或非翻译序列介导的抗病毒基因工程阶段，所得转基因植株的抗性频率不高，且很难达到免疫。本发明在利用源于病原的抗性概念的基础上，结合最新的发现，即双链RNA(dsRNA)或自我互补的发夹RNA(dsRNA)是RNA沉默机制的重要激发子，能导致动植物体内与其序列同源的目标基因的高度的、特异性降解，利用已有的含有221bp大豆内含子(Intron)的pBlue SK载体，构建了一种反向重复的植物抗病毒载体，因它转入植物体内后，能转录出一种dsRNA结构，因此也可以说是一种dsRNA介导的植物抗病毒载体。本发明所构建的载体，即利用ToMV MP全基因cDNA所构建的ToMV MP dsRNA载体和利用CMV-Fny的部分复制酶cDNA所构建的CMV-Fny dsRNA载体转入植物以后，所得转基因植物体，对供体病毒(前者对ToMV，后者对CMV)产生免疫。

发明内容

本发明的目的是提供一种dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法。

dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法，其步骤为：

1)以RNA为模板，设计特异性引物，通过RT-PCR扩增目标基因；

2)将目标基因克隆至pGEM-T或pGEM-T Easy或pUCm-T载体上；

3)在载体上酶切目标基因分别插入至含有内含子的pBlue SK的两端，构建反向重复克隆；

4)将pBlue SK上含有内含子的反向重复片段切下，插入至植物表达载体pBIN438，并将重组植物表达载体导入大肠杆菌细胞；

5)通过三亲交配的方法把大肠杆菌细胞中带有反向重复片段的植物表达载体pBIN438通过三亲交配的方法导入农杆菌EHA105；

6)将含有pBIN438上的农杆菌菌液与50-200倍不含任何抗生素的MSs液体培养基混匀，将所得菌液进行叶盘转基因，并获得转基因植株；

7)利用Southern blot和供体病毒及相关病毒对转基因植株的攻毒分析获得单拷贝的免疫的转基因植株。

本发明的优点：

1)以往的植物抗病毒基因工程几乎都是将目标病毒的某个基因的全部或部分核苷酸序列的cDNA插入植物表达载体，以此来获取抗性转基因植株，此法所得到的抗性转基因植株的频率较低，且抗性程度不高。而本发明所采用的dsRNA介导的植物抗病毒基因工程所获的转基因植株能对同源性的相关病毒产生免疫，并且也较易获得抗性植株。

2)传统的植物抗病毒基因工程所获的转基因植株的抗性，大多是通过蛋白介导的，不但抗性程度不高，并且可能存在与同源的野生病毒和相关病毒发生重组的风险，而本发明所采用的dsRNA介导的植物抗病毒基因工程所得转基因植株，其抗性是由RNA介导的，更确切地说是由本发明所构建的植物抗病毒载体转入植物以后在体内转录形成dsRNA，dsRNA被植物体内的Dicer酶降解成21-25nt的dsRNA介导的，转基因的mRNA不存在或存在量很少，因此不存在类似于传统的植物抗病毒载体转化所引起的重组方面的风险。

3)本发明所采用的dsRNA介导的植物抗病毒基因工程，其所构建的植物抗病毒载体中内含子两端的反向重复DNA片段可以完全对称，也可以不完全对称，其插入位点可以紧贴内含子，也可以存在一些碱基间隔，插入片断长度范围也较大，为0.1-0.9kb，这就导致构建载体的方便和随意。

4)本发明所采用的dsRNA介导的植物抗病毒基因工程，适用性广，适用于任何病毒。

具体实施方式

以番茄花叶病毒(ToMV)移动蛋白(MP)基因和黄瓜花叶病毒(CMV)-Fny部分复制酶(Rep)基因为例来阐述dsRNA介导植物抗病毒基因工程的方法。

实施例1 ToMV MP全长dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法1 ToMV MP全长基因dsRNA植物表达载体pBIN438的构建1.1 RT-PCR扩增ToMV MP全长基因及序列测定

根据ToMV MP基因(登录号AJ006991)的序列设计特异性引物，其序列为：5′引物：5′CC GGATCCATGGCTCTAGTTGTTAAAG-3′(下划线为BamH I酶切位点)3′引物：5′-TTAATACGAATCAGAATCCGCG-3′

采用免疫捕获PCR(Immunocapture PCR，IC-PCR)方法扩增基因，操作步骤如下：在0.5ml PCR管中加入稀释200倍的ToMV抗血清200μL(用ELISA包被缓冲液稀释)，37℃放置2h，倒尽包被液，用PBST洗3次，每次3min，加入200μLToMV病叶研磨汁液离心上清(0.2g鲜叶+2ml病叶研磨，3000rpm离心2min)，37℃放置2h或4℃过夜，倒尽抗原液，用PBST洗3次，再用ddH₂O洗1次，洗毕作短暂离心，吸去管底余液，接着往管中加入ddH₂O 19μL、5×RT buffer 8μL、10mno/L dNTP 4μL、100mmol/L DTT 4μL、20μmol/L3′primer 2μL、稍离心混匀后置84℃变性4min，迅速置冰上3min，然后往管中加入AMV(200U/μL，Promega)2μL、RNasin(23U/μL)1μL，反应总体积40μL，稍离心混匀后置42℃反转录1h。

取10μL反转录产物加入10×PCR buffer 5μL、10mmol/L dNTP 1μL、20μmol/L 5′primer 1μL、20μmol/L 3′primer 1μL、Taq plus I(5u/uL，Sangon)0.5μL、ddH₂O 31.5μL，反应总体积50μL，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45sec，46℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35次，最后一次循环后，72℃补平10min。PCR结束后，取5μl反应产物进行1％琼脂糖电泳。

回收PCR产物，分别连接到pGEM-T easy和pUCm-T载体上，连接产物转化E.coli DH5α，提取重组质粒，经PCR及酶切鉴定阳性克隆。重组质粒pGEM-Teasy用Pharmacia公司的ALF全自动测序仪测定序列，证明所得阳性克隆确为ToMV MP。至此，我们已获得了ToMV MP基因。1.2 ToMV MP反向重复pBlue SK载体的构建1.2.1 pBlue SK载体上正向MP基因的插入

用Apa I和Sal I将pGEM-T easy上的ToMV MP片段(正向)切下，并将其连接到含有内含子的pBlue SK载体上的相应酶切位点。随后对其进行PCR和酶切两种方法验证。PCR反应所用引物为MP的5′端引物和内含子的3′端引物。酶切反应所用酶为ApaI和PstI。PCR和酶切反应均能获得约为1.0Kb片段的为目的克隆。1.2.2 pBlue SK载体上反向MP基因的插入

用PstI和XbalI将pUCm-T上的ToMV MP片段(反向)切下，并将其连接到含有内含子和正向ToMV MP片段的pBlue SK载体上的相应酶切位点。随后对其进行PCR和酶切两种方法验证。PCR反应所用引物为MP的5′端引物和内含子的5′端引物。酶切反应所用酶为HindIII和XbalI，PCR和酶切反应均能获得约为1.0Kb片段的克隆为阳性克隆。

至此，ToMV MP的反向重复片段已构建到pBlue SK上。1.3.ToMV MP反向重复植物表达载体pBIN438的构建

用BamH I将上面所得的含有ToMV MP全长反向重复的pBlue SK载体和pBIN438空载体切开，随后对切下的反向重复序列进行割胶回收，对切开的pBIN438进行去磷酸化，以免BamH I单酶切的pBIN438载体发生自连，从而提高筛选阳性克隆的困难。去磷酸化的反应体系和操作步骤为：pBIN438 DNA片段20μL，10×碱性磷酸化酶缓冲液5μL，CIP 0.3μL，ddH₂O 25μL.混匀稍离心，37℃水浴30分钟，之后，再加CIP 0.3μL，再37℃水浴30分钟，70℃水浴10分钟灭活。随后对其用无水乙醇沉淀，再将沉淀溶于20μL的ddH₂O中。用T4DNA连接酶对适当比例的ToMV MP全长反向重复片段和酶切且已去磷酸化的pBIN438载体，也同样用PCR和酶切的方法验证，PCR反应所用引物仅为MP5′端引物。反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，循环35次，最后一次循环后，72℃补平10min。用BamH I对重组体pBIN438酶切。对PCR和酶切产物均用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查，发现均有约1.8Kb的特异性条带出现。说明含有内含子的反向重复的ToMV MP基因已克隆到pBIN438上，至此，pBIN438植物表达载体已构建成功。2重组植物表达载体pBIN438的农杆菌转化

将所得的ToMV MP反向重复的植物表达载体通过三亲交配的方法导入农杆菌宿主细胞，植物表达载体pBIN438需要通过辅助质粒pROK2013的介导才能进入农杆菌EHA105。PBIN438载体接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养；EHA105接种5ml含Sm(50mg/ml)YEP液体培养基，28℃下200rpm培养48小时；辅助质粒pROK2013接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养。各取400μl pBIN438载体，EHA105，pROK2013菌液，颠倒混匀后，6000rpm 30秒收集菌液，收集的菌体用200μl ddH₂O悬浮，用玻璃涂棒涂布于没有抗性的YEP固体培养基平板进行三亲交配，28℃培养24小时后，用玻璃涂棒在生长出来的菌斑上蘸一下，随即连续涂布三块含有Km(50mg/ml)和Sm(50mg/ml)的YEP固体培养基平板，以此得到含有pBIN438载体的EHA105的单菌落，长出单菌落后用特异性引物对其进行PCR鉴定，获得重组农杆菌pBIN438载体(EHA105)。3目的基因转化烟草

3.1取温室栽培烟草植株的叶片，用蒸馏水冲洗1遍后，70％乙醇洗涤45秒，0.1％升汞消毒2-3min，无菌水冲洗5遍，用无菌滤纸吸干水分。

3.2受体材料预培养：将无菌叶片切去叶片边缘及主脉后再切成小块(0.5×0.5cm²)，接种在MSs培养基上进行预培养，2-3d后，叶片切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

3.3农杆菌侵染：从接种含有pBIN438农杆菌的YEP平板上挑取单菌落，接种到YEP(含Rif、Sm、Km各100μg/ml)液体培养基中，当农杆菌生长到OD600为0.5时，用含有适当浓度农杆菌菌液的MSs液体培养基(不含激素6-BA)，感染叶盘5～10min，其间不时轻轻晃动。取出叶盘置于无菌滤纸上吸去附着的菌。

3.4共培养及选择培养：将侵染过的叶盘放置在MSs培养基上，25℃暗培养2d后，转移到含有500μg/ml Car和100μg/ml Km的MSs培养基上，每两周换一次培养基。

3.5生根培养：待不定芽长到2～3cm时，45度角切去芽基部的任何愈伤组织并将切下的小芽，转移到含有Car 500μg/ml和Km150μg/ml的生根培养基MSr上，等有5-8条主根后，将无菌苗开盖在25℃培养锻炼3d，移栽到土壤中。4.转ToMV MP基因烟草对ToMV和TMV抗性的分析

经卡那霉素抗性筛选、PCR检测、Southern和Northern杂交分析均为阳性的植株最终确定为转基因植株。以这些转基因烟草植株为材料，对抗病性进行研究。

鉴于番茄花叶病毒(ToMV)和烟草花叶病毒(TMV)同属烟草花叶病毒属，核苷酸序列同源性为74％。所以我们对转ToMV MP基因的烟草植株分别进行了ToMV和TMV的攻毒试验，同时以非转基因普通烟接种同样的病毒作对照，观察发病症状，并且对系统侵染的叶片(TMV在普通烟上是系统症状)定期做间接ELISA，以测定病毒浓度，对症状为局部枯斑(ToMV在普通烟上是局部枯斑)的叶片，记录枯斑数。

接种方法：将感染了两种病毒的烟草病叶少许置于研钵中，加入适量接种缓冲液，充分研磨，用喷粉器将金刚砂(200～400目)撒至待接种植株的表面；用手指蘸取少许研磨液，均匀涂抹于叶表，用清水冲洗接种过的叶片，将植株放于22-25℃温室。

间接ELISA方法：

每一周对接种的转基因烟草和非转基因对照烟草植株采样，经间接ELISA实验测定其病毒含量。其操作步骤如下：

1)取接种株的新叶约0.02g，加1ml包被液研磨得粗汁液加入微量反应板(100μl/孔)，于37℃2.5h后放入4℃过夜；

2)PBST洗三次，3min/次；

3)加封闭液(5％脱脂牛奶+PBST缓冲液)100μl/孔，37℃封闭0.5h；

4)加入ToMV单抗，1：10000，100μl/孔，37℃1.5h；

5)PBST洗三次，3min/次；

6)加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(Sigma)100μl/孔，37℃1h；

7)PBST洗三次，3min/次；

8)加入底物硝基苯磷酸脂钠盐(Sigma)显色，室温放置至显色完全后在550型酶联免疫检测仪(BIO-RAD)测各孔在405nm的OD值。测定时每个样品均设3次重复。

对所得47株转ToMV MP基因的转基因烟草植株和2株非转基因普通烟草植株所进行的ToMV的攻毒试验，症状观察结果表明：2株非转基因普通烟对ToMV都高度敏感，接种叶上枯斑数平均为65个，在所考察的47株转基因烟草中，有23株(约占转基因总数的50％)转基因烟草对ToMV产生免疫，接种叶上枯斑数为0，有16株(约占转基因总数的34％)转基因植株表现出很大程度的抗病性，接种叶上的平均枯斑数为13个，有8株(约占转基因总数的16％)转基因烟草植株高度感病，发病程度与非转基因对照相比有一定的差距，但平均枯斑数也高达40个。

对所得47株转ToMV MP基因的转基因烟草和2株非转基因普通烟草进行TMV攻毒试验，症状观察结果表明：所有对ToMV有抗性的植株，对TMV均有一定的抗性；但抗性程度均不强。所测ELISA值，也与症状观察结果类似。这说明DsRNA介导的病毒抗性是同源依赖的，仅适用于供体病毒或与其核苷酸序列高度同源的病毒。5转基因烟草植株的分子检测5.1 CTAB法抽提植物基因组DNA

a.取约5g烟草叶片，在液氮中研磨成粉末；

b.将粉末转移到50ml的离心管中，加入2倍体积(W/V)预热的2×CTAB提取缓冲液，温和混匀；

c.65℃保温90min，期间不时摇动，使其充分混匀；

d.用等体积的24∶1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃7500rpm离心10min，回收水(上)相；

e.在回收的水相中，加入1/10体积的65℃的10×CTAB提取液，颠倒混匀；

f.用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，离心，回收水(上)相；

g.重复(5)操作一次；

h.取上清，加入0.7倍体积的异戊醇，混匀，室温放置20min，沉淀DNA；

i.用玻棒捞出DNA沉淀，转入含5ml75％乙醇、0.2mol/NaAC溶液的离心管中，冰上放置20min；

j.捞出DNA沉淀，转入含5ml75％乙醇溶液的离心管中，冰上放置5min；

k 将DNA转入干净的离心管中，干燥后，加入适量的TE溶解于DNA。

1.取2μl DNA样品在0.7％琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取10μl稀释20倍，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀，检测DNA含量及质量。剩余的-20℃贮存备用。5.2转基因烟草的PCR分析

取CTAB法提取的，卡那霉素抗性阳性的烟草植株的基因组DNA约100ng，同时以构建的重组质粒pBIN438的扩增产物为阳性对照，以非转基因普通烟草的CTAB法提取的基因组DNA的扩增产物为阴性对照，进行PCR扩增，PCR反应所用引物仅为ToMV MP 5′端引物。反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，循环35次，最后一次循环后，72℃补平10min。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查，发现均有约1.8Kb的特异性条带出现。其结果表明，在所得的47株转基因植株中，就有47株能扩增出约1.8Kb的特异性条带，阳性率为100％。5.3转基因烟草的Southern分析

将PCR检测阳性、生长正常的转基因植株，随机挑取7株及1株非转基因普通烟采用CTAB法提取植物基因组DNA，之后取20μg DNA，用HindIII酶切过夜后，用1％的琼脂糖凝胶电泳，之后用毛细管转移法转移到硝酸纤维素滤膜上，以[α-³²P]dCTP标记的ToMV MP基因为探针，按Sambrook等(1989)的方法进行Southern杂交，以鉴定目的基因是否整合进烟草基因组中及整合的拷贝数。结果表明各转基因植株均有阳性带出现，在7株转基因植株中，有5株为单拷贝，2株为双拷贝，而非转基因植株则没有相应的阳性带出现。5.4转基因烟草的Northern分析

为了分析转基因烟草中目的基因在转录水平上的表达情况，任意选取5株PCR和Southern杂交均为阳性的转基因烟草植株和1株非转基因普通烟为对照，以[α-³²P]dCTP标记的ToMV MP基因为探针，按常规方法进行Northern blot分析。结果表明这5株转基因植株都有特异性的RNA杂交带出现，表明这5株转基因植株的目的基因均已获得了了正常转录，而非转基因烟草对照中则没有特异的转录产物。实施例2 CMV-Fny部分Rep基因DsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法1 CMV-Fny部分Rep基因HairpinRNA植物表达载体pBIN438的构建1.1 RT-PCR扩增CMV-Fny部分Rep基因及序列测定

根据CMV-Fny基因(登录号D00355)的序列设计特异性引物，其序列为：5′引物：5′-CG

GATAACTAAGTGGTGG-3′(下划线为SalI酶切位点)3′引物：5′-CG

CCAGACTTCTTGTATTTC-3′(下划线为Cla I酶切位点)

采用与ToMV MP基因同样的免疫捕获PCR方法扩增目的基因，随后将回收的PCR产物连接到pUCm-T载体上，连接产物转化E.coli DH5α，提取重组质粒，经PCR及酶切鉴定阳性克隆。①正向CMV-Fny部分Rep基因的PCR反应体系为：模板1μL，加入10×PCR buffer 5μL、10mmol/L dNTP 1μL、20μmol/LT7primer 1μL、20μmol/L 3′primer 1μL、Taq plus I DNA聚合酶(5U/μL，Sangon)0.5μL、ddH₂O 40.5μL，反应总体积50μL。②反向CMV-Fny部分Rep基因的PCR反应体系为：模板1μL，加入10×PCR buffer 5μL、10mmol/L dNTP 1μL、20μmol/LT7primer 1μL、20μmol/L 5′primer 1μL、Taq plus I DNA聚合酶(5U/μL，Sangon)0.5μL、ddH₂O 40.5μL，反应总体积50μL，混匀后进行PCR扩增。扩增条件均为：94℃预变性3min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，循环35次，最后一次循环后，72℃补平10min。PCR结束后，取5μl反应产物进行1％琼脂糖电泳。对有500bp大小条带出现的克隆再进行酶切鉴定。对所得正向克隆用Sal I和Cla I酶切，酶切体系为：质粒DNA 3μL，Sal I和Cla I各1μL，10×buffer D 2μL，ddH₂O 13μL，对所得反向克隆用Pst I和BamH I酶切，酶切体系为：质粒DNA 3μL，Pst I和BamH I各1μL，10×buffer 2μL，ddH₂O 13μL，混匀后，都37℃酶切1-3h。酶切完毕，均用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果。对PCR和酶切均有约500bp特异性条带出现的(正向或反向)克隆之一用Pharmacia公司的ALF全自动测序仪测定序列，证明所得阳性克隆确为CMV-Fny部分复制酶(Rep)基因。至此，我们已获得了CMV-Fny部分复制酶(Rep)基因(正向和反向)。1.2 CMV-Fny部分Rep基因反向重复pBlue SK载体的构建1.2.1 pBlue SK载体上正向CMV-Fny部分Rep基因的插入

将含有内含子的pBlue SK载体和含有正向CMV-Fny部分Rep基因的pUCm-T的阳性克隆均用Sal I和Cla I酶切，具体方法略，随后将Sal I和ClaI酶切开的pBlue SK载体和pUCm-T载体上切下的Rep基因片段相连，用PCR和酶切两种方法同时验证。PCR反应所用引物为CMV-Fny部分Rep基因的5′端引物和内含子的3′端引物。酶切所用酶为Sal I和PstI。PCR和酶切反应均能获得约为700bp片段的克隆为阳性克隆。1.2.2 pBlue SK载体上反向CMV-Fny部分Rep基因的插入

将含有内含子和正向CMV-Fny部分Rep基因的重组pBlue SK质粒和含有反向CMV-Fny部分Rep基因的pUCm-T的阳性克隆均用Pst I和BamH I酶切，具体方法略，随后将Pst I和BamH I酶切开的pBlue SK和从pUCm-T载体上切下的片段相连，随后对其进行PCR和酶切验证。PCR反应所用引物为CMV-Fny部分复制酶(Rep)基因的的5′端引物和内含子的3′端引物。酶切反应所用酶为HindIII和PstI。PCR和酶切反应均能获得约为700bp片段的克隆为阳性克隆。

至此，CMV-Fny部分Rep基因的反向重复片段已构建到pBlue SK上。1.3 CMV-Fny部分Rep基因的反向重复植物表达载体pBIN438的构建

用BamH I和Sal I将含有CMV-Fny部分Rep基因的反向重复片段的pBlueSK载体和pBIN438空载体切开，随后对切下的反向重复序列和pBIN438空载体进行割胶回收和连接，继而用PCR和酶切两种方法验证，PCR反应所用引物仅为CMV-Fny部分Rep基因的5′端引物。反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1.5min，循环35次，最后一次循环后，72℃补平10min。用BamH I和Sal I对重组体pBIN438酶切。对PCR和酶切产物均用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查，发现均有约1.2Kb的特异性条带出现。说明含有内含子的CMV-Fny部分Rep基因的反向重复的片段已克隆到pBIN438上，至此，pBIN438植物表达载体已构建成功。2重组植物表达载体pBIN438的农杆菌转化

具体方法与实施例1相同。3目的基因转化烟草

具体方法与实施例1相同。4转CMV-Fny部分Rep基因烟草对CMV-RB，CMV-Fny和CMV-P1抗性的分析

鉴于CMV-RB，CMV-Fny和CMV-P1是番茄花叶病毒(CMV)的三个株系，其核苷酸序列同源性较高，所以我们对转CMV-Fny部分Rep基因的烟草植株分别进行了CMV-RB，CMV-Fny和CMV-P1的攻毒试验，同时以非转基因普通烟接种同样的病毒作对照，观察发病症状，并且对系统侵染的叶片(CMV的三个不同株系在普通烟上都是系统症状)定期做间接ELISA，以测定病毒浓度。

其接种方法和间接ELISA方法与实施例1相同。

对所得40株转CMV-Fny部分Rep基因烟草基因的转基因烟草植株和2株非转基因普通烟草植株所进行的CMV-Fny的攻毒试验，症状观察结果表明：2株非转基因普通烟对CMV-Fny都高度敏感，为系统花叶，在所考察的40株转基因烟草中，有15株(约占转基因总数的37％)转基因烟草对CMV-Fny产生免疫，有10株(约占转基因总数的25％)转基因植株表现出很大程度的抗病性，接种叶和系统叶片上表现出轻微的花叶症状，有15株(约占转基因总数的37％)转基因烟草植株高度感病，发病程度与非转基因对照相比差别不明显，产生重花叶症状。

对所得40株转CMV-Fny部分Rep基因的转基因烟草植株和2株非转基因普通烟草植株所进行的CMV-RB，和CMV-P1的攻毒试验，症状观察结果也表明：对CMV-Fny免疫的植株，对CMV-RB和CMV-P1也免疫；对CMV-Fny有抗性的植株，对CMV-RB和CMV-P1也有抗性，产生轻花叶症状；对CMV-Fny敏感的植株，对CMV-RB和CMV-P1也敏感，产生重花叶症状。所测ELISA值，也与症状观察结果类似。5转基因烟草植株的分子检测5.1 CTAB法抽提植物基因组DNA5.2 转基因烟草的PCR分析

取CTAB法提取的，卡那霉素抗性阳性的烟草植株的基因组DNA约100ng，同时以所构建的相应的重组质粒pBIN438的扩增产物为阳性对照，以非转基因普通烟草的CTAB法提取的基因组DNA的扩增产物为阴性对照，进行PCR扩增，PCR反应所用引物仅为CMV-Fny部分Rep基因的5′引物。反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，循环35次，最后一次循环后，72℃补平10min。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查，发现均有约1.2Kb的特异性条带出现。其结果表明，在所得的40株转基因植株中，就有40株能扩增出约1.2Kb的特异性条带，阳性率为100％。5.3 转基因烟草的Southern分析

将PCR检测阳性、生长正常的转基因植株，随机挑取7株及1株非转基因普通烟采用CTAB法提取植物基因组DNA，之后取20μg DNA，用BamH I酶切过夜后，用1％的琼脂糖凝胶电泳，之后用毛细管转移法转移到硝酸纤维素滤膜上，以[α-³²P]dCTP标记的CMV-Fny部分Rep基因为探针，按Sambrook等(1989)的方法进行Southern杂交，以鉴定目的基因是否整合进烟草基因组中及整合的拷贝数。结果表明各转基因植株均有阳性带出现，在7株转基因植株中，有6株为单拷贝，1株为双拷贝，而非转基因植株则没有相应的阳性带出现。5.4转基因烟草的Northern分析

为了分析转基因烟草中目的基因在转录水平上的表达情况，任意选取5株PCR和Southern杂交均为阳性的转基因烟草植株和1株非转基因普通烟为对照，以[α-³²P]dCTP标记的CMV-Fny部分Rep基因为探针，按常规方法进行Northernblot分析。结果表明这5株转基因植株都有特异性的RNA杂交带出现，表明这5株转基因植株的目的基因均已获得了了正常转录，而非转基因烟草对照中则没有特异的转录产物。6.转CMV-Fny部分Rep基因对CMV-RB，CMV-Fny和CMV-P1免疫的烟草攻毒前后的Northern blot比较和21-25nt的小RNA检测6.1 转CMV-Fny部分Rep基因对CMV-RB，CMV-Fny和CMV-P1免疫的烟草攻毒前后的Northern blot比较

CMV-RB，CMV-Fny和CMV-P1在普通烟上的症状均为系统花叶，所以我们以转CMV-Fny部分Rep基因，对CMV-Fny免疫的转基因烟草为例进行攻CMV-Fny前后的Northern blot比较，所用探针为[α-³²P]dCTP标记的构建反向重复载体的CMV-Fny部分Rep基因。5株转基因植株(4株对CMV-Fny免疫，1株对CMV-Fny敏感)和1株非转基因对照植株分别在CMV-Fny攻毒前后用TRIZOL进行了总RNA的提取和杂交分析。以紫外分光光度计所测的吸光度值，来控制上样量(以每泳道加20μg总RNA为宜)。

Northern blot分析表明，4株对CMV-Fny免疫的转基因植株在攻毒前后，mRNA的表达丰度有很大差异，攻毒后其mRNA的量急剧下降，而非转基因植株和所考察的那1株对CMV-Fny敏感的植株则在攻毒后mRNA的量明显上升。6.2转CMV-Fny部分Rep基因对CMV-RB，CMV-Fny和CMV-P1免疫的烟草的21-25nt的小RNA检测6.2.1小RNA的提取

对Northern blot分析的5株转基因植株(其中4株对CMV-Fny免疫，1株对CMV-Fny敏感)和1株非转基因烟草进行了CMV-Fny攻毒，取上部叶片进行小RNA的杂交分析。

小RNA的抽提的具体步骤为：a.使用TRIZOL，抽提要考察的转基因植物和1株非转基因烟草中的总RNA。b.去除总RNA中的大分子量的核酸分子，具体做法是：将所抽提的总RNA用无菌水或TE65℃溶解(65℃一方面可以促进25nt的小RNA分子与大分子量的RNA和DNA的分离，同时也有助于小RNA的溶解)，等沉淀溶解后立即置于冰上，加入PEG(MW＝8000)至终浓度为5％，加入NaCL至终浓度为0.5％，混匀，30分钟后，10000×g离心10分钟，以沉淀除去大的核酸分子，上清中则重要含有tRNA、小的RNA和约25ntRNA。加入3倍体积的无水乙醇于PEG上清液中，-20℃放置至少2hour，10000×g离心10分钟，上清则为25ntRNA，接着将其溶于甲酰胺溶液中。6.2.2杂交分析

所用胶的成分为15％的聚丙烯酰胺，7M尿素，0.5×TBE。将所得的甲酰胺样品65℃加热5分钟，立即置冰上，加入1/3体积的4×上样液(＝2×TBE，40％蔗糖，0.1％的溴酚蓝)，小RNA的上样量在50μg以上。在0.5×TBE中100-500V电泳至胶的底部，沿溴酚蓝的边和加样孔处将凝胶切下，用毛细管转移法将其转移至尼龙膜上，以[α-³²P]dCTP标记的体外转录的CMV-Fny的RNA为探针按常规Northern blot方法进行杂交。

实验结果表明，4株对CMV-Fny免疫的转基因植株约在21-25nt处有特异性条带出现，而非转基因植株和对CMV-Fny敏感的植株均没有特异性条带出现。这一结果证明21-25nt和转基因植物的抗病性相伴随发生，是dsRNA介导的植物抗病毒的标志。

Claims (1)

1.一种dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法，其特征在于它的步骤为：

1)以RNA为模板，设计特异性引物，通过RT-PCR扩增目标基因；

2)将目标基因克隆至pGEM-T或pGEM-T Easy或pUCm-T载体上；

3)在载体上酶切目标基因分别插入至含有内含子的pBlue SK的两端，构建反向重复克隆；

4)将pBlue SK上含有内含子的反向重复片段切下，插入至植物表达载体pBIN438，并将重组植物表达载体导入大肠杆菌细胞；

5)通过三亲交配的方法把大肠杆菌细胞中带有反向重复片段的植物表达载体pBIN438通过三亲交配的方法导入农杆菌EHA105；

6)将含有pBIN438上的农杆菌菌液与50-200倍不含任何抗生素的MSs液体培养基混匀，将所得菌液进行叶盘转基因，并获得转基因植株；

7)利用Southern blot和供体病毒及相关病毒对转基因植株的攻毒分析获得单拷贝的免疫的转基因植株。