CN105695384A - 表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌及其构建方法，以临床分离的沙门氏菌为转化受体，将插入有红色荧光蛋白基因片段的质粒pFPV-mCherry，电击转化进入菌体内，从而构建能够表达红色荧光的沙门氏菌。本发明构建的重组沙门氏菌，可以对该沙门氏菌的体外、体内试验过程进行标记、示踪，解决无法在沙门氏菌试验中进行实时监测问题；重组菌可自身表达荧光蛋白，可以代替昂贵的沙门氏菌特异性抗体，不仅节约研究经费，还大大降低使用抗体所带来的假阳性；结合相关蛋白的免疫荧光染色可进行共定位，为临床分离的沙门氏菌的深入研究提供有效手段。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌及其构建方法。
背景技术
沙门氏菌属(Salmonella)是沙门氏菌病的病原体。属于肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。已发现的近千种沙门氏菌菌株，按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。除伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌和副伤寒乙杆菌引起人类的疾病外，大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒。
沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌。沙门氏菌最适繁殖温度为37℃，在20℃以上即能大量繁殖，因此，低温储存食品是一项重要的预防措施。
构建能够表达荧光蛋白的重组沙门氏菌，可为临床分离的沙门氏菌的深入研究提供有效手段。国内已有表达绿色荧光蛋白的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建方法(王芳，江苏农业研究,2001,22(3):55-58.)，该方法需将重组质粒转化入沙门氏菌中间宿主后进行阳性克隆筛选，再从阳性菌体中提取出质粒，最终转化入沙门氏菌终末宿主。该方法需要中间宿主的参与，过于繁琐，且绿色荧光标记较为常见，如果试验中需要与其他目的蛋白进行共定位，则二抗就不能再使用常见的FITC进行荧光标记。因此，有必要开发一种新型的能够表达荧光蛋白的重组沙门氏菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌及其构建方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌，所述重组沙门氏菌是用质粒pFPV-mCherry转化沙门氏菌获得的阳性克隆。
本发明还提供所述重组沙门氏菌的构建方法，将质粒pFPV-mCherry通过电击转化的方式进入沙门氏菌体内，并筛选阳性克隆。
本发明所述的沙门氏菌包括但不限于德尔卑沙门氏菌、婴儿沙门氏菌。
前述的方法，优选用抗生素---氨苄青霉素筛选阳性克隆。
前述的方法具体包括以下步骤：
步骤1：质粒pFPV-mCherry的提取；
步骤2：沙门氏菌感受态细胞的制备；
步骤3：电击转化；
步骤4：阳性克隆的筛选；
步骤5：重组菌的形态学的鉴定、生长曲线测定、遗传稳定性分析及毒力因子检测。
步骤1具体为：用质粒提取试剂盒提取质粒pFPV-mCherry，提取后测定质粒浓度，使质粒浓度达到5pg-25ng/μL。例如，使用OMEGA公司的PlasmidMiniKitII试剂盒提取质粒，提取后使用ND-2000C测定浓度，调整合适浓度，使转化时用量为1-2μL，质粒DNA含量为10pg-25ng。
步骤2具体为：
(1)使用LB培养液于37℃200rpm的摇床振荡培养沙门氏菌，测量培养液OD600值，待OD600值在0.35-0.45之间时，迅速将菌液冰浴15-30min，不时缓慢摇匀以保证菌液充分冷却；
(2)4℃以4000g离心10min，回收细胞；然后用冰冷的纯水重悬细胞后再次离心洗涤，将其中的电解质杂质洗掉，并逐步用10％甘油重悬、洗涤；最后以1ml冰冷的10％甘油重悬沉淀；
(3)稀释上述悬液后测量OD600值，用冰冷的10％甘油将其稀释至浓度为2×1010～3×1010个细胞/ml(OD600值1.0，约2.5×1010个细胞/ml)，准备电击转化。
或者，冻存在-80℃，将感受态细胞悬液按50μL/份分装到冷却的无菌0.5ml微量离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻。贮存于-80℃备用。需要用冻存的感受态细胞做电击转化时，从-80℃冰箱中取出适当的份数，待其融化后按照电击转化的操作进行。
步骤3具体为：
(1)用移液器吸取50μL新鲜制备或冻融的沙门氏菌感受态细胞于0.5ml冰冷的微量无菌离心管中，与电转化仪样品池一起放在冰上冷却；
(2)以1-2μL的体积向每个离心管中加入10pg-25ng的待转化质粒DNA，置于冰上30-60s；
(3)调节电转仪，使电脉冲为25μF，电压25kV，电阻200Ω；将感受态细胞与质粒DNA的混液加至冰冷的电击杯内，将电击杯放进电转仪中，按上述设定的参数，启动对细胞的电脉冲；仪器应显示出4-5ms具有12.5kV/cm的电场强度；
(4)脉冲结束后，迅速取出样品池，室温下加入1mlLB肉汤培养基，37℃160rpm振荡培养1h以复苏细菌；
(5)取不同体积的电击转化后的细菌，铺于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基；室温下待培养基中的液体被完全吸收，倒置琼脂培养基，于37℃培养箱培养12-16h，转化克隆即重组菌应在12-16h出现。
步骤4具体为：
(1)配制LB肉汤培养基或LB琼脂培养基，高压灭菌后待其温度降至50℃-55℃时(琼脂培养基温度不能太低，否则会凝固，故可使用恒温水浴锅以保证温度)，加入适量氨苄青霉素使其终浓度为100μg/mL；
(2)使用含有氨苄青霉素的LB液体或固体培养基培养的细菌，则为具有氨苄青霉素抗性的阳性克隆；
(3)进一步使用选择性培养基XLD/SS验证筛选，在XLD/SS培养基中加入氨苄青霉素培养的细菌为阳性克隆；或者将培养后的菌涂于载玻片上，在荧光倒置显微镜下观察，若能看到相应的荧光，则为阳性克隆。
步骤5中所述形态学的鉴定具体为：
(1)将冻存的转化成功的重组菌在含有氨苄青霉素的LB肉汤培养基中活化、传代3-4代。同时在普通LB培养基中传代培养受体沙门氏菌(即原始沙门氏菌)。
(2)将传代后的菌以合适的浓度均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。同样在普通LB琼脂培养基上涂布受体沙门氏菌，37℃恒温培养箱培养12-24h，比较菌的形态特征并拍照。
步骤5中所述生长曲线测定具体为：
(1)从-80℃冰箱中取出冻存的沙门氏菌按普通的方法活化，传代3-4代，重组菌培养的整个过程均应添加氨苄青霉素，下同。
(2)使用预置有300mLLB肉汤培养基的500mL容量的三角瓶，分别加入15mL上一步中培养的菌液，37℃恒温振荡培养，200rpm。
(3)每隔1h取出菌液，用分光光度计测定OD600值，监测生长曲线趋势，测定到对数末期即可。
(4)统计整理数据结果，并作图。
步骤5中所述遗传稳定性分析具体为：
(1)将重组菌株涂布于加有氨苄青霉素的LB琼脂平板，在37℃恒温培养16h；
(2)挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的7mLLB肉汤培养基中，去除不含质粒的阴性沙门氏菌，过夜培养(8-10h)使细菌达到生长对数中后期；
(3)然后取70μL上述菌液接种于不含抗生素的7mlLB肉汤培养基中，37℃培养12h，然后取出70μL同样接种于不含抗生素的7mlLB肉汤培养基中；
(4)重复(3)的操作8次(根据菌落计数方法，每培养12h沙门氏菌可自我复制12-13代，即可认为传代24h后可获得自我复制25代的菌；在质粒遗传稳定性的试验中，检测细菌自我复制100代或更长时质粒的稳定性)；
(5)上述的重复传代培养中，每培养12h后，稀释菌液使其达到合适的浓度后涂布于不含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，然后随机挑取200个细菌单克隆，穿刺接种于选择性LB琼脂平板上，同时设置空白(不沾菌的接种针)、阴性及阳性对照，最后统计阴性及阳性菌的个数(阴性菌不生长，只留下穿刺接种后的针孔)，计算二者比值。
步骤5中所述毒力因子检测具体为：提取重组沙门氏菌的基因组DNA为模板，根据沙门氏菌毒力因子的基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增反应，检测沙门氏菌的相关毒力基因。所述沙门氏菌毒力因子包括但不限于效应蛋白SipA、SopA、SopB、SopD及鞭毛蛋白FljB。
其中，PCR扩增反应的退火温度为55-60℃。
本发明构建的能够表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌，自我复制100代后质粒遗传稳定性在95％以上，可以对该沙门氏菌的体外、体内试验过程进行标记、示踪，解决无法在沙门氏菌试验中进行实时监测问题；重组菌可自身表达荧光蛋白，可以代替昂贵的沙门氏菌特异性抗体，不仅节约研究经费，还大大降低使用抗体所带来的假阳性；结合相关蛋白的免疫荧光染色可进行共定位，为临床分离的沙门氏菌的深入研究提供有效手段。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建表达红色荧光蛋白的婴儿、德尔卑沙门氏菌的技术路线图。
图2为本发明实施例1和2中沙门氏菌及重组沙门氏菌菌落形态比较；其中，A表示德尔卑沙门氏菌，B表示表达红色荧光蛋白的德尔卑沙门氏菌，C表示婴儿沙门氏菌，D表示表达红色荧光蛋白的婴儿沙门氏菌。
图3为本发明实施例1和2中沙门氏菌的生长曲线；其中，SD表示德尔卑沙门氏菌，SD-pFPV-mCherry表示表达红色荧光蛋白的德尔卑沙门氏菌，SI表示婴儿沙门氏菌，SI-pFPV-mCherry表示表达红色荧光蛋白的婴儿沙门氏菌。
图4为本发明实施例1和2中质粒遗传稳定性分析结果；其中，SD-pFPV-mCherry表示表达红色荧光蛋白的德尔卑沙门氏菌，SI-pFPV-mCherry表示表达红色荧光蛋白的婴儿沙门氏菌。
图5为本发明实施例1和2中沙门氏菌的毒力基因检测结果；其中，泳道1表示德尔卑沙门氏菌，泳道2表示表达红色荧光蛋白的德尔卑沙门氏菌，泳道3表示婴儿沙门氏菌，泳道4表示表达红色荧光蛋白的婴儿沙门氏菌，M为DNAMarker。
图6为本发明实施例1和2中表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌；其中，A表示表达红色荧光蛋白的德尔卑沙门氏菌，B表示表达红色荧光蛋白的婴儿沙门氏菌，标尺50μm。
图7为本发明实施例3中质粒遗传稳定性分析结果；其中，SI-pFPV-mCherry和SD-pFPV-mCherry分别为表达红色荧光蛋白的婴儿沙门氏菌和德尔卑沙门氏菌，SI-pFPV-25.1和SD-pFPV-25.1分别为表达绿色荧光蛋白的婴儿沙门氏菌和德尔卑沙门氏菌。
图8为本发明实施例4中表达绿色荧光蛋白的重组沙门氏菌SD-pFPV-25.1对IPEC-j2细胞的粘附；其中，A为白光下拍摄，B为488nm蓝色激发光下拍摄，C为A、B两图的合并图。箭头表示粘附于IPEC-j2细胞表面的重组沙门氏菌，标尺50μm。
图9为本发明实施例4中重组沙门氏菌侵入IPEC-j2细胞的结果；其中，A、B、C为空白组，D、E、F为重组德尔卑沙门氏菌攻菌组(SD-pFPV-mCherry)，G、H、I为重组婴儿沙门氏菌攻菌组(SI-pFPV-mCherry)，标尺50μm。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中质粒DNA的提取使用OMEGA公司的PlasmidMiniKitII试剂盒提取质粒pFPV-mCherry，提取后使用ND-2000C测定浓度，调整合适浓度，使转化时用量为1-2μL的体积，质粒DNA含量为10pg-25ng。质粒pFPV-mCherry购自美国Addgene公司。
实施例1表达红色荧光蛋白的德尔卑沙门氏菌(SD-pFPV-mCherry)的构建方法
本实施例以临床分离的德尔卑沙门氏菌为转化受体，将插入有红色荧光蛋白基因片段的质粒pFPV-mCherry，电击转化进入菌体内，从而构建能够表达红色荧光的沙门氏菌。测定构建的重组株的质粒遗传稳定性，并检测菌落形态、生长曲线、毒力因子较亲本株有无明显差异，即检测质粒的转入对沙门氏菌正常生物学特征有无影响。技术路线见图1。
1、感受态细胞的制备
(1)从XLD琼脂培养基上挑取一个沙门氏菌单菌落，接种于含20mlLB培养液的50ml离心管中，于37℃振荡(200rpm的摇床)培养，过夜。
(2)接种10ml上述培养液于盛有200ml预热的LB肉汤培养基的500ml锥形瓶中，于37℃振荡(200rpm)培养，1h之后，每隔20min测量一次OD600值。
(3)当OD600值达到0.4时，迅速将菌液冰浴30min，不时缓慢摇匀以保证菌液充分冷却。将无菌的50ml离心管置于冰上预冷，为下一步作准备。为获得最大效率的转化，在整个操作过程中细菌的温度不超过4℃是关键。
(4)将菌液转移至50ml离心管中(-20℃预冷)，4℃以4000g离心5min，以回收细胞。倒去培养液，用50ml冰冷的纯水重悬沉淀。(先加入少量纯水将细胞重悬，再补至50ml，以下步骤均按此法)。
(5)4℃以4000g离心10min，以回收细胞。弃掉上清，用50ml冰冷的10％甘油重悬沉淀。
(6)4℃以4000g离心10min，以回收细胞。可重复第5步，弃掉上清，回收的细胞合并为一管，用10ml冰冷的10％甘油重悬沉淀。倾倒上清液时要小心，10％甘油中的细菌沉淀附着力降低。
(7)4℃4000g离心10min，以回收细胞。小心弃掉上清液后瞬离1min，用小枪头吸掉上清液，最后加1ml冰冷的10％甘油重悬沉淀。此时细胞较为脆弱，最好轻柔摇动完成，不要用吸管吹打或振荡。
(8)用冰冷的10％甘油将其OD600调为1.0。将感受态细胞悬液按50μL/份分装到冷却的无菌0.5ml微量离心管中，封紧管口，浸入液氮中快速冰冻。贮存于-80℃备用。
2、电击转化
(1)用移液器吸取50μL新鲜制备(或冻融)的感受态细胞于0.5ml冰冷的微量无菌离心管中，与电转化仪样品池一起放在冰上冷却。
(2)以1μL的体积向每一个微型离心管中加入10ng待转化质粒DNA，置于冰上60s。
(3)调节电转仪，使电脉冲为25μF，电压2.5kV，电阻200Ω。
(4)将感受态细胞与质粒DNA的混液加至冰冷的电击杯内，轻击杯体以确保混合悬液位于电击杯底部。擦干电击槽外的冷凝水和雾气，将电击杯放进电转仪中。
(5)按上述设定的参数，启动对细胞的电脉冲。仪器应显示出4-5ms具有12.5kV/cm的电场强度。
(6)脉冲结束后，尽可能快地取出样品池，室温下加入1mlLB肉汤培养基，37℃振荡(160rpm)培养1h以复苏细菌。
(7)取700μL及300μL复苏后的细菌培养液，铺于两个含有适当抗菌素的LB琼脂培养基。室温下待培养基中的液体被完全吸收。倒置琼脂培养基，于37℃培养箱培养，转化克隆即重组菌在12h出现。
3、阳性克隆的筛选
(1)配制LB肉汤培养基或LB琼脂培养基时，高压灭菌后待其温度低于55℃以后，加入适量氨苄青霉素使其终浓度为100μg/mL。
(2)使用配制好的含有抗生素的选择性LB琼脂培养基培养，12h后长出了小菌落，即为阳性克隆。
4、形态学鉴定
(1)将冻存的转化成功的重组菌在含有氨苄青霉素的LB肉汤培养基中活化、传代3代。同时在普通LB培养基中传代培养受体沙门氏菌(即原始沙门氏菌)。
(2)将传代后的菌以合适的浓度均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。同样在普通LB琼脂培养基上涂布受体沙门氏菌，37℃恒温培养箱培养24h，比较菌的形态特征并拍照。(图2)
5、生长曲线测定
(1)从-80℃冰箱中取出冻存的沙门氏菌按普通的方法活化、传代3代，重组菌培养的整个过程均应该加氨苄青霉素，下同。
(2)使用配有300mLLB肉汤培养基的500mL容量的三角瓶，分别加入15mL上一步中培养的菌液，37℃恒温振荡培养，200rpm。
(3)每隔1h取出菌液，用分光光度计测定OD600值，不断监测生长曲线趋势，测定到14h。
(4)统计整理数据结果，并作图。(图3)
6、质粒遗传稳定性
(1)将重组菌株涂布于加有氨苄青霉素的LB琼脂平板，在37℃恒温培养16h。
(2)挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的7mLLB肉汤培养基中，筛选掉不含质粒的阴性沙门氏菌。过夜培养10h使细菌达到生长对数中后期。
(3)然后取70μL上述菌液接种于不含抗生素的7mlLB肉汤培养基中，37℃培养12h，然后取出70μl同样接种于不含抗生素的7mlLB肉汤培养基中，重复上述操作8次。
(4)上述的重复传代培养中，每培养12h后，直接分别取0.5μL、5μL、20μL、50μL涂布于多个非选择性LB琼脂培养基上(不含氨苄青霉素)，然后从其中合适的培养基中随机选择200个细菌单克隆，穿刺接种于选择性LB琼脂平板上，同时设置空白(不沾菌的接种针)、阴性及阳性对照，最后数出阴性及阳性菌的个数(阴性菌不生长，只留下穿刺接种后的针孔)，计算二者比值，即为质粒遗传稳定性。(图4)
7、毒力因子检测
采用普通PCR的方法检测沙门氏菌毒力因子，方法如下：
用2×TaqPCRMasterMix产品，根据效应蛋白SipA、SopA、SopB、SopD及鞭毛蛋白FljB的基因序列设计特异性引物，以提取的4株沙门氏菌基因组DNA为模板，检测沙门氏菌的相关毒力基因，反应体系为25μL。特异性引物序列如下(5′-3′)：
SipAF：GTCATTCGCGTGTGGATTCG
SipAR：TTCGGATGAAGCGTTGGTCA
SopAF：CTCTCCACTGACACGCTGTT
SopAR：GGCCTGCTGATTAAATGCGG
SopBF：CTTATGAGGGAAAGGGCG
SopBR：ATGCACACTCACCGTGG
SopDF：TTCGAAGATGACCTGGCACC
SopDR：GTGAGTCCTGCCATTCGACA
FljBF：GCTCCTGTCGCTTCATCGTA
FljBR：GTACAGTAACCCTTGCGGCT
PCR反应体系：
PCR反应程序：
结果检测：反应结束后取5μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。(图5)
实施例2表达红色荧光蛋白的婴儿沙门氏菌(SI-pFPV-mCherry)的构建方法
本实施例中的婴儿沙门氏菌同实施例1中的德尔卑沙门氏菌一样，均为临床分离株，属于不同血清型。本实施例中制备婴儿沙门氏菌感受态细胞、电击转化，生物学特征的鉴定等采用与实施例1中相同的步骤，最终成功构建了能够表达红色荧光蛋白的婴儿沙门氏菌，自我复制100代后质粒遗传稳定性在95％以上，与重组德尔卑沙门氏菌相似。
采用本发明提供的重组菌构建方法可以成功构建表达红色荧光蛋白的沙门氏菌，重组菌同原始菌培养形态一致，即形成中等大小、圆形、表面光滑、边缘整齐的菌落，重组菌在普通LB琼脂培养基上呈现为淡紫红色，这为判断阳性菌落提供了方便；重组菌在生长性能、毒力因子等方面不受质粒的影响，同原始菌没有差异；在荧光倒置显微镜下，以绿光激发呈现为明亮的橙黄色(图6)，自我复制100代后质粒遗传稳定性在95％以上，利用此重组菌，可以进行体外、活体试验过程标记、示踪，结合相关蛋白的免疫荧光染色可进行共定位，从而替代昂贵的沙门氏菌特异性抗体标记，且操作更加简便。
实施例3表达绿色荧光蛋白的重组沙门氏菌的构建
本实施例中使用的质粒替换为插入了绿色荧光蛋白基因片段的质粒pFPV-25.1，重组菌的构建方法采用与实施例1中相同的步骤。构建的能够表达绿色荧光蛋白的重组德尔卑沙门氏菌(SD-pFPV-25.1)和重组婴儿沙门氏菌(SI-pFPV-25.1)。这两株重组菌在菌落形态、生长性能、毒力因子方面都没有显著差异，但是自我复制100代后质粒遗传稳定性低于80％(图7)，不适合用于周期较长的试验研究，仅能用于短周期的试验项目。
实施例4表达荧光蛋白的重组沙门氏菌的应用
用实施例1-3中构建的SD-pFPV-mCherry、SI-pFPV-mCherry和SD-pFPV-25.1重组沙门氏菌，对猪空肠上皮细胞系IPEC-j2进行粘附及侵袭试验。
1、细胞爬片准备：
(1)细胞爬片首先泡酸过夜，自来水及蒸馏水冲洗干净后，用洁净纸巾包起来放入高压锅高压灭菌，待用。
(2)将洁净的细胞爬片放入75％酒精(在细胞室操作)，用时在酒精灯前使其酒精挥发，然后放入24孔细胞培养板内。
(3)加入适量IPEC-j2细胞，接种量为3万～8万个/mL。
(4)待细胞铺满爬片70％-90％时，换不完全培养基继续培养约8～12h，让细胞充分分化。
2、细胞攻菌实验：
(1)细胞分化充分后，弃掉培养液，PBS洗3次；加入用不完全培养基重悬的浓度为1×108个/ml重组沙门氏菌1mL，孵育1h后用PBS洗3次。
(2)加入终浓度100μg/ml的庆大霉素，杀除未侵入细胞内的沙门氏菌。反应1h后用PBS洗3次，将死亡的细菌充分洗掉。
(3)换为含10μg/ml庆大霉素的培养基继续培养数小时(2～8h，期间可在荧光倒置显微镜下监测细菌繁殖量，保证侵入细胞的细菌达到合适的浓度)。
3、CK-18(角蛋白18)免疫荧光染色：
(1)攻菌完成后吸掉培养液，用预冷的PBS洗3次。
(2)细胞固定，每孔加入500μL固定剂(4％多聚甲醛)冰上孵育10min，PBS洗3次。
(3)细胞透化，每孔加入500μL透化剂(即0.2％TritonX100，PBS配制)，冰上孵育7min，PBS洗3次。
(4)间接免疫荧光染色，室温下1％BSA封闭45min；4℃孵育一抗45min(一抗CK-18按1:100稀释)，PBS洗3次；室温下避光孵育二抗30min(二抗FITC按1:1000稀释)，PBS洗3次。
(5)DAPI染核，将250μLDAPI染液加入24孔细胞培养板样品孔中，避光孵育3min后PBS洗3次。
(6)封片，滴一滴抗荧光淬灭剂于载玻片上，轻轻取出细胞爬片，正面(细胞面)向下轻轻盖到载玻片上；在细胞爬片周围滴加适量中性树脂胶，静置于暗室中使中性树脂胶凝固。
(7)制备好的载玻片晾干一段时间后即可直接在荧光倒置显微镜下或激光共聚焦显微镜下观察，拍照后进行分析。
其中，粘附试验中采用实施例3的表达绿色荧光蛋白的重组德尔卑沙门氏菌，即SD-pFPV-25.1，结果见图8；侵袭试验中采用实施例1和2中构建的表达红色荧光蛋白的重组菌，即SD-pFPV-mCherry和SI-pFPV-mCherry，结果见图9。两项试验目的在于证明两种颜色的重组菌都可以用以体外细胞实验，进行定位。不同荧光的同一种沙门氏菌在毒力及生长特性方面没有差异，但遗传稳定性方面存在较大差异。
结果显示，采用本发明中表达荧光蛋白重组菌的构建方法所构建的重组德尔卑沙门氏菌和重组婴儿沙门氏菌，能够成功应用于猪空肠上皮细胞系的粘附及侵袭试验中，配合骨架蛋白角蛋白18(CK18)进行共定位，从而可以直接观察细菌是否粘附到细胞膜上或侵入细胞内。可见，表达荧光蛋白的重组沙门氏菌可以在体外、体内试验过程中进行标记、示踪，为临床分离的沙门氏菌的深入研究提供有效手段。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌，其特征在于，所述重组沙门氏菌是用质粒pFPV-mCherry转化沙门氏菌获得的阳性克隆。
2.权利要求1所述重组沙门氏菌的构建方法，其特征在于，将质粒pFPV-mCherry通过电击转化的方式进入沙门氏菌体内，并筛选阳性克隆；其中所述沙门氏菌包括德尔卑沙门氏菌、婴儿沙门氏菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用氨苄青霉素筛选阳性克隆。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：质粒pFPV-mCherry的提取；
步骤2：沙门氏菌感受态细胞的制备；
步骤3：电击转化；
步骤4：阳性克隆的筛选；
步骤5：重组菌的形态学的鉴定、生长曲线测定、遗传稳定性分析及毒力因子检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1具体为：用质粒提取试剂盒提取质粒pFPV-mCherry，提取后测定质粒浓度，使质粒浓度达到5pg-25ng/μL。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤2具体为：
(1)使用LB培养液于37℃200rpm的摇床振荡培养沙门氏菌，测量培养液OD600值，待OD600值在0.35-0.45之间时，迅速将菌液冰浴15-30min，不时缓慢摇匀以保证菌液充分冷却；
(2)4℃以4000g离心10min，回收细胞；然后用冰冷的纯水重悬细胞后再次离心洗涤，将其中的电解质杂质洗掉，并逐步用10％甘油重悬、洗涤；最后以1ml冰冷的10％甘油重悬沉淀；
(3)稀释上述悬液后测量OD600值，用冰冷的10％甘油将其稀释至浓度为2×1010～3×1010个细胞/ml，准备电击转化。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤3具体为：
(1)用移液器吸取50μL新鲜制备或冻融的沙门氏菌感受态细胞于0.5ml冰冷的微量无菌离心管中，与电转化仪样品池一起放在冰上冷却；
(2)以1-2μL的体积向每个离心管中加入10pg-25ng的待转化质粒DNA，置于冰上30-60s；
(3)调节电转仪，使电脉冲为25μF，电压25kV，电阻200Ω；将感受态细胞与质粒DNA的混液加至冰冷的电击杯内，将电击杯放进电转仪中，按上述设定的参数，启动对细胞的电脉冲；
(4)脉冲结束后，迅速取出样品池，室温下加入1mlLB肉汤培养基，37℃160rpm振荡培养1h以复苏细菌；
(5)取不同体积的电击转化后的细菌，铺于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基；室温下待培养基中的液体被完全吸收，倒置琼脂培养基，于37℃培养箱培养12-16h。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤4具体为：
(1)配制LB肉汤培养基或LB琼脂培养基，高压灭菌后待其温度降至50℃-55℃时，加入适量氨苄青霉素使其终浓度为100μg/mL；
(2)使用含有氨苄青霉素的LB液体或固体培养基培养的细菌，则为具有氨苄青霉素抗性的阳性克隆；
(3)进一步使用选择性培养基XLD/SS验证筛选，在XLD/SS培养基中加入氨苄青霉素培养的细菌为阳性克隆；或者将培养后的菌涂于载玻片上，在荧光倒置显微镜下观察，若能看到相应的荧光，则为阳性克隆。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤5中所述遗传稳定性分析具体为：
(1)将重组菌株涂布于加有氨苄青霉素的LB琼脂平板，在37℃恒温培养16h；
(2)挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的7mLLB肉汤培养基中，去除不含质粒的阴性沙门氏菌，过夜培养使细菌达到生长对数中后期；
(3)然后取70μL上述菌液接种于不含抗生素的7mlLB肉汤培养基中，37℃培养12h，然后取出70μL同样接种于不含抗生素的7mlLB肉汤培养基中；
(4)重复(3)的操作8次；
(5)上述的重复传代培养中，每培养12h后，稀释菌液使其达到合适浓度后涂布于不含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，然后随机挑取200个细菌单克隆，穿刺接种于选择性LB琼脂平板上，同时设置空白、阴性及阳性对照，最后统计阴性及阳性菌的个数，计算二者比值。
10.根据权利要求4-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤5中所述毒力因子检测具体为：提取重组沙门氏菌的基因组DNA为模板，根据沙门氏菌毒力因子的基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增反应，检测沙门氏菌的相关毒力基因；
其中，PCR扩增反应的退火温度为55-60℃。
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| CN (1) | CN105695384B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106893734A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-06-27 | 南昌大学 | 一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株及其功能验证方法 |
| CN110577962A (zh) * | 2019-10-25 | 2019-12-17 | 鲁东大学 | 携带绿荧光蛋白基因的质粒及具有该质粒的指示菌 |
| CN114645063A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-06-21 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 类鼻疽菌表达质粒、荧光标记表达质粒及其构建方法和应用 |
-
2016
- 2016-03-11 CN CN201610139590.5A patent/CN105695384B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
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| CN110577962A (zh) * | 2019-10-25 | 2019-12-17 | 鲁东大学 | 携带绿荧光蛋白基因的质粒及具有该质粒的指示菌 |
| CN114645063A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-06-21 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 类鼻疽菌表达质粒、荧光标记表达质粒及其构建方法和应用 |
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| Publication number | Publication date |
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| CN105695384B (zh) | 2019-04-23 |
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