KR102141697B1 - PI3K/mTOR 저해제 저항성 암 치료제 - Google Patents

PI3K/mTOR 저해제 저항성 암 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 암 치료제에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 PI3K/mTOR 저해제 저항성 암 치료제 및 그의 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

PI3K/mTOR 저해제 저항성 암 치료제{An anticancer agent for treating cancers resistant to PI3K/mTOR inhibitor}
본 발명은 신규 암 치료제에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 PI3K/mTOR 저해제 저항성 암 치료제 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암(cancer)은 대표적인 호발성 난치 질환으로서 사회경제적으로 큰 문제가 되고 있다. 여러 종류의 암 중에서도 특히 대장암(colorectal cancer, CRC)은 전 세계적으로 이미 환자의 수가 100만 명을 넘어섰으며, 국내의 경우 서구화된 식습관, 비만 등으로 인해 대장암의 발병률 증가 속도가 지난 10년간 가장 높게 나타났다. 더욱이 최근 인구의 급격한 고령화에 따라 대장암 환자의 발생률 및 사망률은 더욱 가파르게 증가할 것으로 예상되고 있다. 하지만 표적항암제의 개발에 막대한 비용이 투자되었음에도 불구하고, 전이성 대장암 환자의 치료는 여전히 낮은 환자 반응성의 한계를 극복하지 못하고 있다.
한편 PI3K/mTOR 경로는 세포의 증식, 성장, 생존 등을 조절하는 데에 중요한 역할을 수행하는 신호전달경로이다. 이 신호전달경로의 주요 구성 단백질인 PI3K, AKT, mTOR, KRAS 등에 유전적 변이가 발생하여 비정상적으로 기능이 과항진되는 경우 암이 발병할 수 있으며, 실제로 전체 암환자 중 약 30%에서 PI3K/mTOR 신호전달경로 상에 위치한 단백질들의 변이가 관찰된다. 현재까지 암의 증식을 억제하고자 하는 목적으로 수십 종의 PI3K/mTOR 저해제가 개발되어 임상시험 중에 있으나, 약물 처치 시 필연적으로 발생하는 약물내성 등으로 인하여 그 치료효과는 기대에 못 미치는 실정이다. 이에 따라 PI3K/mTOR 저해제에 대한 내성을 극복할 수 있는 효과적인 조합치료 전략의 개발이 요구되고 있다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2009-0090460호는 이미다조퀴놀린을 함유하는 대장암 항암제 및 방사선항암치료 보조제에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 대장암 세포에 투여하여 세포 사멸효과를 확인하였을 뿐 PI3K/mTOR 저해제에 대한 내성을 가진 대장암에 대한 치료제로는 부적합하다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 암의 치료제 및 상기 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, ⅰ) BET 저해제 및 PI3K/mTOR 저해제; 또는 ⅱ) 상기 BET 저해제가 상기 PI3K/mTOR 저해제에 공유결합된 약물 연결체를 유효성분으로 포함하는 PI3K/mTOR 저해제 대한 저항성 암의 치료용 약학적 조성물를 유효성분으로 포함하는 PI3K/mTOR 저해제 대한 저항성 암의 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 약학적으로 유효한 양의 ⅰ) BET 저해제 및 PI3K/mTOR 저해제; 또는 ⅱ) 상기 BET 저해제가 상기 PI3K/mTOR 저해제에 공유결합된 약물 연결체를 EGFR 저해제에 대한 저항성 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는, EGFR 저해제 저항성 암환자의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 피검 화합물 또는 천연물을 BET와 반응시키는 단계; 및 BET와 특이적으로 결합하는 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는, PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, BET를 발현하는 세포에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 BET의 발현을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, BET 및 상기 BET와 상호작용하는 짝단백질을 포함하는 조성물에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 BET 및 상기 짝단백질의 상호작용을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, PI3K/mTOR 저해제에 대하여 저항성 난치암의 치료효율을 획기적으로 증가시킬 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 대장암 세포의 세포 생존 능력에 대한 이중 PI3K/mTOR 억제 효과를 분석한 그래프로 상단은 BEZ235 치료에 대한 다양한 대장암(CRC) 세포의 GI50값의 그래프이고 검은색 박스는 돌연변이 유전자, MSS(microsatellite instability)-불안정성, CpG 섬 메틸화인자 표현형(CIMP) 양성 반응을 나타낸다.
도 2a는 대장암 세포의 세포 반응(cellular responses)에 대한 이중 PI3K/mTOR 억제 효과를 분석한 것으로서, IncuCyte를 사용하여 측정된 BEZ235의 표시된 농도로 처리된 다양한 CRC 세포에 대한 증식 분석 그래프이다.
도 2b는 PI 염색 및 유동 세포 계수법을 사용하여 2 또는 10일 동안 BEZ235(500nM)로 처리된 다양한 CRC 세포에 대한 세포주기 분석 그래프이다. 미처리 세포를 대조군으로 사용하였다. 데이터는 3회 생물학적 복제물의 평균±S.E.M을 나타낸다. 상기 3개의 생물학적 복제 p 값은 처리되지 않은 세포와 BEZ235 처리된 세포 사이에서 계산되었다. *, p < 0.05; **, p < 0.01; 스튜던트 t-검정법.
도 2c는 IncuCyte를 사용하여 측정된 다양한 CRC 세포에서 2 또는 10일 동안 BEZ235(500nM)로 처리된 세포의 세포 증식 곡선의 AUC에 표준화된 세포 자멸 곡선의 AUC 그래프이다.
도 2d는 Caspase-3/7 활성 분석을 사용하여 결정된 다양한 CRC 세포에서 2 또는 10일 동안 BEZ235(500nM)로 처리된 아폽토시스 세포의 그래프이다. 미처리 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 3a는 이중 PI3K/mTOR 억제가 대장암 세포에서 동적 적응성 kinome 반응을 유도함을 분석한 것으로, 2 또는 10일 동안 BEZ235(500nM)로 처리한 HCT116 세포에 대한 인산 항체 배열을 분석한 히트맵(heatmap)이다.
도 3b는 이중 PI3K/mTOR 억제가 대장암 세포에서 동적 적응성 kinome 반응을 유도함을 분석한 것으로, 2 또는 10일 동안 BEZ235(500nM)로 처리한 SW480 세포에 대한 인산 항체 배열을 분석한 히트맵(heatmap)이다. 실험 약물 치료 샘플을 각각의 DMSO-처리 대조군에 대해 표준화하였다. 2일 또는 10일째에 BEZ235- 및 DMSO-처리된 세포 사이에 유의한 차이(p < 0.05, Student's t-test)를 갖는 단백질 키나아제가 제시된다. 단백질 키나아제는 표준 키나아제 분류 계획(Standard Kinase Classification Scheme)에 따라 분류되었다.
도 3c는 1시간 동안 다양한 농도의 BEZ235로 처리된 HCT116 세포에서 PI3K/mTOR 경로의 지시된 신호 키나아제에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 3d는 BEZ235로 처리된 SW480 세포에서 PI3K/mTOR 경로의 지시된 신호 키나아제에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. AKT1 및 GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 3e는 지시된 시간(0~240 hr) 동안 BEZ235(500 nM)로 처리된 HCT116 세포에서의 포스포-항체 배열 분석으로부터 일부 상향 조절된 종양 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3f는 지시된 시간(0~240 hr) 동안 BEZ235(500 nM)로 처리된 SW480 세포에서의 포스포-항체 배열 분석으로부터 일부 상향 조절된 종양 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과이다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었다.
도 4a는 이중 PI3K/mTOR 억제가 대장암 세포에서 다양한 발암 경로와 단백질을 활성화시키는 것을 분석한 결과로 지시된 용량(1~500nM)의 BEZ235로 24시간 동안 처리된 세포에서 표시된 유전자의 mRNA 수준에 대한 정량적 RT-PCR 분석 그래프이다. 결과는 GAPDH 수준으로 정상화되었다. 데이터는 3회 생물학적 반복의 평균+S.E.M을 나타낸다. *, p <0.05; **, p <0.01; Student's t-test.
도 4b는 2 또는 10일 동안 BEZ235(500nM)로 처리된 HCT116 또는 SW480 세포의 Myc에 대한 웨스턴 블랏 결과이다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었다.
도 5a는 이중 PI3K/mTOR 억제는 대장암 세포에서 세포 노화를 유도함을 분석한 것으로 HCT116 및 SW480 세포를 BEZ235(500nM)로 2, 7 또는 10일 동안 처리한 다음 β-갈락토시다아제로 염색한 사진이다.
도 5b는 도 5a의 3회 생물학적 복제로부터 정량화한 평균+S.E.M을 분석한 그래프이다. p 값은 대조군(0 일째) 세포와 비교하여 결정하였다.
도 5c는 이중 PI3K/mTOR 억제는 대장암 세포에서 세포 노화를 유도함을 분석한 것으로 FACS 분석을 사용하여 결정한 2, 7 또는 10 일 동안 BEZ235(500 nM)로 처리한 γH2AX-양성 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 5d는 이중 PI3K/mTOR 억제는 대장암 세포에서 세포 노화를 유도함을 분석한 것으로 인산화된 p38, Chk1 및 Chk2에 대한 웨스턴 블롯, 및 BEZ235(500 nM)로 2 또는 10일 동안 처리된 세포의 총 p16 및 p21에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. GAPDH는 적재 컨트롤로 사용되었다.
도 5e는 이중 PI3K/mTOR 억제는 대장암 세포에서 세포 노화를 유도함을 분석한 것으로 U0126(1 μM, MEK 억제제) 또는 BIRB796 (1 μM, pan-p38 억제제)의 부재 또는 존재하에 다양한 CRC 세포를 BEZ235(500 nM)로 10 일간 처리한 후 β-갈락토시다아제로 염색한 사진이다.
도 5f는 도 5e의 3회 생물학적 복제로부터 정량화한 평균+S.E.M을 분석한 그래프이다.
도 5g는 이중 PI3K/mTOR 억제는 대장암 세포에서 세포 노화를 유도함을 분석한 것으로 HCT116 및 SW480 세포를 GDC-0941(1 μM, pan-PI3K 억제제) 또는 everolimus(1 μM, mTOR 억제제)로 10일 동안 처리한 다음 β-갈락토시다아제로 염색한 사진이다.
도 5h는 도 5g의 3회 생물학적 복제로부터 정량화한 평균+S.E.M을 분석한 그래프이다.
도 5i는 이중 PI3K/mTOR 억제는 대장암 세포에서 세포 노화를 유도함을 분석한 것으로 FACS 분석을 사용하여 결정된 BEZ235 GDC-0941(1 μM) 또는 everolimus(1 μM)로 10일 동안 처리된 γH2AX 양성 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 6a는 이중 PI3K/mTOR 억제-유도된 노화된 대장암 세포는 ERK- 및 p38- 조절된 세크리톰(secretome)을 발생시킴을 확인한 것으로 DMSO 또는 BEZ235(500 nM)로 10일 동안 처리된 CRC 세포의 상층액에서 지시된 사이토카인의 발현을 분석한 그래프이다.
도 6b는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 도 6a에서 획득한 더 많은 양의 가장 상향 조절된 사이토카인의 평균 스폿 픽셀 밀도를 정량화한 그래프이다.
도 6c는 이중 PI3K/mTOR 억제-유도된 노화된 대장암 세포는 ERK- 및 p38- 조절된 세크리톰(secretome)을 발생시킴을 확인한 것으로 2일 또는 10일 동안 BEZ235 (500 nM)로 처리된 세포에서 표시된 사이토카인의 단백질 분비를 분석한 그래프이다.
도 6d는 이중 PI3K/mTOR 억제-유도된 노화된 대장암 세포는 ERK- 및 p38- 조절된 세크리톰(secretome)을 발생시킴을 확인한 것으로 2일 또는 10일 동안 BEZ235(500nM)로 처리된 세포에서 표시된 사이토카인의 mRNA 발현을 분석한 그래프이다. 단백질 분비 및 mRNA 발현의 수준은 ELISA 및 정량적 RT-PCR에 의해 각각 측정되었고 p 값은 대조군(0 일째) 세포와 비교하여 결정하였으며 데이터는 평균+S.E.M을 나타낸다.
도 6e는 이중 PI3K/mTOR 억제-유도된 노화된 대장암 세포는 ERK- 및 p38- 조절된 세크리톰(secretome)을 발생시킴을 확인한 것으로 U0126(1 μM) 및 BIRB796(1 μM)의 부재 또는 존재하에 BEZ235(500 nM)로 처리된 세포에서 지시된 사이토카인의 단백질 분비를 분석한 그래프이다.
도 6f는 이중 PI3K/mTOR 억제-유도된 노화된 대장암 세포는 ERK- 및 p38- 조절된 세크리톰(secretome)을 발생시킴을 확인한 것으로 U0126(1 μM) 및 BIRB796(1 μM)의 부재 또는 존재하에 BEZ235(500 nM)로 처리된 세포에서 지시된 사이토카인의 mRNA 발현을 분석한 그래프이다. 상기 단백질 분비 또는 mRNA 발현의 수준을 ELISA 및 정량적 RT-PCR로 각각 측정하였다. p 값은 대조군 BEZ235 처리 세포와 비교하여 결정하였다.
도 7a는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 이중 억제에 대한 약물 감수성에 대한 노화 관련 세크리톰(secretome)의 영향을 분석한 것으로 평균 형광을 측정하여 10일 동안 BEZ235(500nM)로 처리된 세포에서 IL-8(즉, CXCR1 및 CXCR2) 및 MIF (즉, CD44 및 CD74)에 대한 동족 수용체의 발현 수준의 그래프 FACS 분석을 사용하여 형광강도(MFI)를 측정한 그래프이다.
도 7b는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 이중 억제에 대한 약물 감수성에 대한 노화 관련 세크리톰(secretome)의 영향을 분석한 것으로 재조합 사이토카인(100 ng/ml의 IL-8 및 MIF)으로 1 또는 6시간 동안 자극된 세포의 지시된 단백질에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 7c는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 이중 억제에 대한 약물 감수성에 대한 노화 관련 세크리톰(secretome)의 영향을 분석한 것으로 CXCR1/2 차단 항체(2.5 μg/ml)의 부재 또는 존재하에서 BEZ235 (500 nM)로 처리된 세포에서 세포 수에 대한 정상화를 위한 세포 증식 곡선의 AUC로 정상화된 아폽토시스 곡선의 AUC 그래프 또는 ISO-1(50 μM, MIF 저해제)을 7일 동안 투여했다. 상기 세포를 지시된 약물 조합으로 7일 동안 처리하고, IncuCyte를 사용하여 위상-대조 영상으로부터 세포 증식과 적색 형광(PI로 측정된 아폽토시스 세포 수)의 합류를 측정한 그래프이다.
도 7d는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 이중 억제에 대한 약물 감수성에 대한 노화 관련 세크리톰(secretome)의 영향을 분석한 것으로 CXCR1/2 차단 항체(2.5 μg/ml) 또는 ISO-1(50 μM)의 존재 또는 부재하에 7일 동안 BEZ235 (500 nM)로 처리된 아폽토시스 세포의 Caspase-3/7 활성을 분석한 그래프이다. 미처리 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 7e은 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 이중 억제에 대한 약물 감수성에 대한 노화 관련 분비체(secretome)의 영향을 분석한 것으로 CRC 세포주에서 7일간의 BEZ235 처리(대조군에 표준화된 배율 변화) 및 GI50 값, ERK1/2 활성(대조군에 대해 표준화된 배율 변화) 또는 p38 활성(대조군으로 표준화된 배수-변화)에 따른 IL-8 또는 MIF 분비 수준과의 상관관계를 보여주는 산점도(scatter plot)이다.
도 7f는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 이중 억제에 대한 약물 감수성에 대한 노화 관련 세크리톰(secretome)의 영향을 분석한 것으로 400 nM보다 크거나 작은 GI50 값을 갖는 CRC 세포주에서 7일간 BEZ235 처리(대조군으로 정상화된 배율 변화) 후 지시된 사이토카인의 평균 분비 수준을 나타내는 그래프이다.
도 8a는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 차단에 의해 유도된 노화 관련 분비체(secretome)의 기능적 역할을 분석한 유전자 발현 프로파일링에 관한 것으로 HCT116과 SW480 세포의 DEGs 사이의 중첩을 묘사하는 벤다이어그램이다. DEG의 교집합 크기의 p 값은 초고속 검정법(hypergeometric tests)을 사용하여 계산하였다.
도 8b는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 차단에 의해 유도된 노화 관련 분비체(secretome)의 기능적 역할을 분석한 유전자 발현 프로파일링에 관한 것으로 HCT116 세포에서 상향조절된 DEG 사이에서 유의하게 농축된 유전자 온톨로지 용어(GO term)에 대한 그래프이다.
도 8c는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 차단에 의해 유도된 노화 관련 분비체(secretome)의 기능적 역할을 분석한 유전자 발현 프로파일링에 관한 것으로 SW480 세포에서 상향조절된 DEG 사이에서 유의하게 농축된 유전자 온톨로지 용어에 대한 그래프이다.
도 8d는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 차단에 의해 유도된 노화 관련 분비체(secretome)의 기능적 역할을 분석한 유전자 발현 프로파일링에 관한 것으로 HCT116 세포에 표시된 유전자 세트의 유전자 세트 농축분석(GSEA) 농축 플롯을 나타낸 그래프이다.
도 8e는 대장암 세포에서 PI3K/mTOR 차단에 의해 유도된 노화 관련 분비체(secretome)의 기능적 역할을 분석한 유전자 발현 프로파일링에 관한 것으로 SW480 세포에 표시된 유전자 세트의 GSEA 농축 플롯을 나타낸 그래프이다.
도 9a는 PI3K/mTOR 억제-유도 노화가 대장암 세포에서 종양 형성 활성을 나타냄을 분석한 것으로 BEZ235(500 nM)의 부재 또는 존재하에 DMSO, CM-DMSO 또는 CM-BEZ로 처리된 CRC 세포에 대한 증식 분석 그래프이다.
도 9b는 PI3K/mTOR 억제-유도 노화가 대장암 세포에서 종양 형성 활성을 나타냄을 분석한 것으로 propidium iodide(PI) 염색 및 유동 세포 계수법을 사용하여 DMSO, CM-DMSO 또는 CM-BEZ로 처리된 세포에서 세포주기를 분석한 그래프이다. 미처리 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 9c는 PI3K/mTOR 억제-유도 노화가 대장암 세포에서 종양 형성 활성을 나타냄을 분석한 것으로 지정된 시간 동안 DMSO, CM-DMSO 또는 CM-BEZ로 처리된 세포의 상처 치유를 분석한 그래프이다.
도 9d는 도 9c의 3회 생물학적 복제로부터 정량화한 평균 + S.E.M을 나타낸 그래프이다.
도 9e는 PI3K/mTOR 억제-유도 노화가 대장암 세포에서 종양 형성 활성을 나타냄을 분석한 것으로 48시간 동안 DMSO, CM-DMSO 또는 CM-BEZ로 처리 된 세포의 시험 관내 이동 및 침윤을 분석한 그래프이다.
도 9f는 도 9e의 3회 생물학적 복제로부터 정량화한 평균+S.E.M을 나타낸 그래프이다.
도 10a는 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 저해가 아폽토시스를 유도하고 PI3K/mTOR 억제제의 치료에 대한 세포의 민감성을 분석한 것으로 지시된 약물 조합으로 처리한 CRC 세포의 증식을 분석한 그래프이다. IncuCyte를 사용하여 다중 위상-대조 영상으로부터 세포 합류를 계산함으로써 세포 증식을 시간에 따라 측정하였다.
도 10b는 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 저해가 아폽토시스를 유도하고 PI3K/mTOR 억제제의 치료에 대한 세포의 민감성을 분석한 것으로 지시된 약물 조합으로 10일 동안 처리한 세포에서 세포 수에 대한 정상화를 위한 세포 증식 곡선의 AUC에 표준화된 아폽토시스 곡선의 AUC 그래프이다. 세포를 지시된 약물 조합으로 10일 동안 처리하고, IncuCyte를 사용하여 위상-대조 영상으로부터 세포 증식과 적색 형광(PI로 측정된 아폽토시스 세포 수)의 합류를 측정하였다.
도 10c는 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 저해가 아폽토시스를 유도하고 PI3K/mTOR 억제제의 치료에 대한 세포의 민감성을 분석한 것으로 Caspase-3/7 활성 분석을 사용하여 결정된 다양한 CRC 세포에서 7일 동안 지시된 약물 조합으로 처리된 아폽토시스 세포의 그래프이다. 미처리 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 10d는 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 저해가 아폽토시스를 유도하고 PI3K/mTOR 억제제의 치료에 대한 세포의 민감성을 분석한 것으로 BEZ235(500 nM) 및 JQ1(1 μM, BET 억제제)로 동시 처리된 세포의 다중 RTK 및 신호 키나아제를 포함하는 종양 단백질의 웨스턴 블랏(1 또는 48시간 동안) 결과이다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용하였다.
도 10e는 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 저해가 아폽토시스를 유도하고 PI3K/mTOR 억제제의 치료에 대한 세포의 민감성을 분석한 것으로 JQ1(1 μM)의 부재 또는 존재하에 RTK에 대해 1일 및 사이토카인에 대해 7일 동안 BEZ235(500 nM)로 처리된 세포에서 표시된 RTK 또는 사이토카인의 mRNA 발현 수준을 나타내는 그래프이다. mRNA 발현의 수준은 정량적 RT-PCR에 의해 측정되었다.
도 10f는 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 저해가 아폽토시스를 유도하고 PI3K/mTOR 억제제의 치료에 대한 세포의 민감성을 분석한 것으로 사이토카인에 대해 10일 동안 JQ1(1 μM)의 부재 또는 존재하에 BEZ235 (500nM)로 처리된 세포에서 지시된 사이토카인의 단백질 분비의 수준을 나타내는 그래프이다. 단백질 분비의 수준은 ELISA에 의해 측정되었다. *, p < 0.05, **, p < 0.01; ***, p < 0.001; 스튜던트 t-검정법.
도 11a는 BET 억제가 다중 저항 매개 유전자의 조절 부위에 BRD4를 모집하는 것을 차단함을 분석한 것으로 지시된 세포주의 지시된 유전자에서 BRD4 및 H3K27ac의 점유를 나타내는 유전자 트랙을 분석한 그래프이다. 부위 A와 B는 ChIP-qPCR 실험에서 BRD4의 결합을 시험하기 위해 프라이머가 설계된 부위를 나타낸다.
도 11b는 BET 억제가 다중 저항 매개 유전자의 조절 부위에 BRD4를 모집하는 것을 차단함을 분석한 것으로 BEZ235(500 nM), JQ1(1 μM) 또는 이들의 조합을 8시간 동안 처리한 HCT116(상층) 및 SW480(하층) 세포의 지시된 부위에서의 BRD4 결합의 ChIP-qPCR 분석 그래프이다.
도 11c는 BET 억제가 다중 저항 매개 유전자의 조절 부위에 BRD4를 모집하는 것을 차단함을 분석한 것으로 1일 동안 JQ1(1 μM)의 부재 또는 존재하에 BEZ235(500 nM)로 처리된 세포에서 지시된 유전자의 mRNA 발현 수준을 나타내는 그래프이다. mRNA 발현의 수준은 정량적 RT-PCR에 의해 측정되었다.
도 11d는 BET 억제가 다중 저항 매개 유전자의 조절 부위에 BRD4를 모집하는 것을 차단함을 분석한 것으로 지시된 세포주의 지시된 유전자에서 BRD4 및 H3K27ac의 점유를 나타내는 유전자 트랙을 분석한 그래프이다. 부위 A와 B는 ChIP-qPCR 실험에서 BRD4의 결합을 시험하기 위해 프라이머가 설계된 부위를 나타낸다.
도 11e는 BET 억제가 다중 저항 매개 유전자의 조절 부위에 BRD4를 모집하는 것을 차단함을 분석한 것으로 BEZ235(500 nM), JQ1(1 μM), 또는 이들의 조합으로 8시간 처리한 HCT116 및 SW480 세포의 표시된 부위에서의 BRD4 결합의 ChIP-qPCR 분석 그래프이다. *, p < 0.05, **, p < 0.01; Student's t-test.
도 12a는 생체 내에서 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 억제의 항종양 효율을 분석한 것으로 표시된 약물 조합으로 치료한 마우스의 평균 체중 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12b는 생체 내에서 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 억제의 항종양 효율을 분석한 것으로 BEZ235, JQ1 또는 이들의 조합으로 처리된 HCT116 및 SW480 동종 이식편의 종양 성장 곡선을 분석한 그래프이다. *, p < 0.05, **, p < 0.01; 일원변량분석 검정법.
도 12c는 생체 내에서 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 억제의 항종양 효율을 분석한 것으로 BEZ235, JQ1 또는 이들의 조합으로 처리한 마우스에서 절제한 종양의 평균 체중을 나타내는 그래프이다. **, p < 0.01; Student's t-test.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "PI3K/mTOR"는 세포의 생존, 성장, 이동, 그리고 대사 등 중요한 세포반응을 조절하는 데에 핵심적인 역할을 수행하는 신호전달경로로 상기 신호전달경로의 기능이 비정상적으로 조절되는 경우 암이 유발된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "BET 단백질 저해제"는 미국과 유럽의 임상 시험에서 항암, 면역 억제제 및 기타 효과가 있는 약물의 한 종류로 연구에 널리 사용된다. 상기 저해제는 Bromodomain과 Extra-terminal motif(BET) 단백질 BRD2, BRD3, BRD4, BRDT의 bromodomain과 가역적으로 결합하여 BET 단백질과 아세틸화 히스톤(acetylated histones) 및 전사인자 사이의 단백질-단백질 상호작용을 방지한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체의 기능성 단편"은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 이형4량체로서의 전장 항체가 아닌 항원 결합부위가 보존된 항체의 단편을 의미하며, 이러한 항체의 기능성 단편에는 기능성 단편은 항체로부터 유래한 Fab, F(ab')2 , Fab', scFv(single chain fragment variable), 또는 단일-도메인 항체(single-domain antibody, sdAb)가 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigen-binding)으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편으로 VH-CH1 및 VL-CL의 두 펩타이드의 이량체로, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystalisable)라 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원결합 부위를 포함하는 단편으로 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab'"는 상기 Fab와 유사한 구소를 갖는 항체단편으로서 상기 F(ab')2를 환원시켜 생성되며, Fab에 비해 중쇄 부분의 길이가 약간 더 길다.
본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable)로서 항체의 Fab 중 가변영역(VH 및 VL)을 링커를 이용하여 단일쇄로 제조한 재조합 항체 단편을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single doamain antibody)"는 나노바디(nanobody)라고 지칭되며, 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사합체의 4차 구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, 경쇄가 없이 중쇄만으로 구성되는 낙타과 또는 연골어류 유래의 항체 단편(VHH, VNAR 등) 또는 nanobody, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체 유사단백질을 포함하는 개념이다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, ⅰ) BET 저해제 및 PI3K/mTOR 저해제; 또는 ⅱ) 상기 BET 저해제가 상기 PI3K/mTOR 저해제에 공유결합된 약물 연결체를 유효성분으로 포함하는 PI3K/mTOR 저해제 대한 저항성 암의 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 BET 특이적인 저해제는 BET 활성 억제제 또는 BET 발현 억제제일 수 있고 상기 BET 활성 억제제는 BET 길항 항체 또는 그의 항체 기능성 단편, BET에 특이적으로 결합하는 항체 유사체, 갈레인(gallein) 또는 GRK2i일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, Fv, sdAb, diabody 또는 triabody일 수 있고 상기 항체 유사체는 Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, nanobody, VLR 또는 VHH일 수 있으며 상기 BET 발현 억제제는 BET 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로 RNA일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 암은 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어나거나 일어나지 않은 암일 수 있고 상기 돌연변이는 KRAS 유전자의 엑손 2에서 발생한 것일 수 있으며 상기 PI3K/mTOR에 대한 저항성 암은 대장암일 수 있다.
상기 PI3K/mTOR 저해제 저항성 암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 유효물질은 상기 BEK 저해제가 상기 PI3K/mTOR 저해제와 공유결합됨으로써 하나의 단일 화합물의 형태로 제공될 수 있는데, 이러한 두 화합물의 자체의 기능을 유지하면서 이들을 공유결합에 의해 연결된 사례들은 본 발명이 속한 기술분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, Spitzer 등은 σ-2 수용체 특이적 리간드인 SV119에 항암제인 라파마이신(rapamycin)이 연결된 약물 콘주게이트(drug conjugate)가 라파마이신 단독 처리시보다 암세포의 세포자살을 더욱 촉진시키는 것으로 보고한 바 있다(Spitzer et al., Cancer Res., 71(1): 2012). 특히 이러한 작은 화합물간의 결합은 화합물에 포함된 아민기(-NH2)와 카르복실기(-COOH) 아마이드 결합을 통해 직접적으로 일어나거나, 폴리에틸렌 링커(-(CH2)n-), 폴리에틸렌옥사이드 링커(-(CH2CH2O)n-)과 같은 비활성 링커(inert linker)를 통해 연결될 수도 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 PI3K/mTOR 저해제는 PI3K/mTOR 저해 화합물, PI3K/mTOR 길항항체 또는 그의 항체 기능성 단편 또는 PI3K/mTOR에 특이적으로 결합하는 항체 유사체일 수 있고 상기 PI3K/mTOR 저해 화합물은 NVP-BEZ235, PI-103, PTEN, GSK3B, 또는 HB9일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, Fv, sdAb, diabody 또는 triabody일 수 있고 상기 항체 유사체는 Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, nanobody, VLR 또는 VHH일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 약학적으로 유효한 양의 ⅰ) BET 저해제 및 PI3K/mTOR 저해제; 또는 ⅱ) 상기 BET 저해제가 상기 PI3K/mTOR 저해제에 공유결합된 약물 연결체를 EGFR 저해제에 대한 저항성 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는, EGFR 저해제 저항성 암환자의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 피검 화합물 또는 천연물을 BET와 반응시키는 단계; 및 BET와 특이적으로 결합하는 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는, PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, BET를 발현하는 세포에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 BET의 발현을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, BET 및 상기 BET와 상호작용하는 짝단백질을 포함하는 조성물에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 BET 및 상기 짝단백질의 상호작용을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
상기 선별방법에 있어서, 상기 짝단백질은 CDK9(cyclin-dependent kinase 9), CCNT1(cyclin T1), CCNT2(cyclin T2), C15orf55(Protein NUT), HEXIM1(hexamethylene bis-acetamide inducible 1), SIPA1(signal-induced proliferation-associated 1), CDK2(cyclin-dependent kinase 2), DNER(delta/notch-like EGF repeat), PLK1(polo-like kinase 1), 또는 LGALS4(lectin, galactoside-binding, soluble, 4)일 수 있고 상기 BET 및 상기 짝단백질의 상호작용은 효모 이중 하이브리드(yeast two hybrid) 분석, 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석, 친화성 포획(affinity capture), 단백질 단편 상보 분석(protein-fragment complementation assay, PCA), 면역공침(immunocoprecipitation, IP) 분석 또는 표면 플라스몬 공명 분석(surface plasmon resonance assay)을 통해 분석될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 암환자로부터 수득한 조직 시료 또는 체액 시료로부터 BET의 발현정도를 측정하는 단계; 상기 BET의 발현수준이 정상수준보다 높게 나타난 암환자를 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성을 갖는 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 암환자의 PI3K/mTOR 저항성 예측방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 암환자로부터 수득한 조직 시료 또는 체액 시료로부터 BET의 발현정도를 측정하는 단계; 상기 BET의 발현수준이 정상수준보다 높게 발현되는 암환자를 선별하는 단계; 및 BET의 발현수준이 높은 것으로 선별된 암환자에 대하여 PI3K/mTOR 저해제 및 BET 저해제를 동시에 투여하는 단계를 포함하는, PI3K/mTOR 저항성 암의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 피검 화합물을 각각 BET 및 PI3K/mTOR과 반응시키는 단계; 및 상기 BET 및 PI3K/mTOR의 활성 부위(active site) 모두에 결합하는 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 EGFR 저해제 저항성 암에 대한 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 피검 화합물은 구조기반 의약설계(structure-based drug design)에 의해 설계된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 구조기반 의약설계는 상기 BET 및 PI3K/mTOR의 컴퓨터 모델링에 의한 3차원 구조를 이용하여 특정 구조의 화합물이 상기 BET 및/또는 PI3K/mTOR의 활성 부위에 맞게 결합하는지 여부를 확인하고, 맞지 않을 경우 당해 화합물의 구조를 컴퓨터의 도움을 통해 변경함으로써 수행될 수 있다. 이와 같이 컴퓨터의 도움에 의해 구조가 결정된 화합물은 공지의 라이브러리에 속한 화합물일 경우 구매하여 실제 활성을 갖는지 여부를 확인하는데 사용할 수 있고, 신규화합물인 경우 화합합성을 통해 합성을 하여 실제 활성을 갖는지 여부를 확인할 수 있다.
상기 피검 화합물이 실제 BET에 결합함으로써 그 활성을 억제하는 지 여부는 상술한 다양한 BET-소화합물간 상호작용 분석방법 및/또는 BET와 상호작용하는 짝단백질 간의 상호작용 분석방법을 이용하여 확인될 수 있다. 마찬가지로 상기 피검 화합물이 PI3K/mTOR의 활성을 저해하는지 여부는 피검 화합물이 BET의 활성을 저해하는지 여부를 분석하는 방법과 유사한 방법을 이용하여 분석할 수 있다. 예컨대, 상기 PI3K/mTOR과 특정 피검 화합물이 결합하는지 여부는 방사성 동위원소 표지 세포 이용 소화합물-친화성 크로마토그래피, 약물 친화 반응 표적 안정성 분석(drug affinity responsive target stability, DARTS), 산화율 이용 단백질 안정성 분석(stability of proteins from rate of oxidation, SPROX), 차등 정적 광산란(differential static light scattering DSLS) 분석, 차등 스캐닝 형광측정(differential scanning fluorometry, DSF), 또는 리간드의 차등 방사 모세관 거동 분석(differential radial capillary action of ligand assay, DraCALA)를 이용하여 수행될 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, BET를 과발현하는 PI3K/mTOR 저항성 암세포에 상기 선별된 피검 화합물을 처리하는 단계; 및PI3K/mTOR 저항성 암세포의 성장을 억제하는 피검 화합물을 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, BET 및 PI3K/mTOR을 발현하는 세포에 피검 화합물을 처리하는 단계; 및 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 GNB5 및 PI3K/mTOR의 발현을 동시에 억제하거나 그의 활성을 동시에 억제한 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 암 치료제 후보물질의 선별방법이 제공된다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 환부의 종류,적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.
본 발명의 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있고 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명자들은 유전체/단백체 데이터 분석, 세포주 실험, 이종이식 동물모델 실험을 통해 대장암세포에 PI3K/mTOR 저해제 처리시 EGFR, IGF1R, FAK, ERK 등의 암 유발 키나아제 단백질들과 IL-8, MIF 등의 사이토카인이 활성화되어 약물내성이 유발되는 것을 확인하였다. 그 후, 여러 종류의 대장암세포에 PI3K/mTOR 저해제와 후성유전학 단백질인 BET의 활성도를 억제하는 BET 저해제를 동시에 처리한 결과, 암세포의 변이 특성과 관계없이 다양한 암 유발 단백질과 사이토카인의 활성도가 일괄적으로 억제되며, 이에 따라 암세포의 성장이 강하게 억제되고 사멸이 크게 증가하는 등 PI3K/mTOR 저해제에 대한 내성이 효과적으로 극복되는 것을 관찰하였다. 특히 BET 저해제가 키나아제-저해제보다 PI3K/mTOR 저해제에 대한 내성을 극복하는 데에 더욱 효과적이라는 것을 확인하였다. 상기 BET 저해제를 대장암 환자의 돌연변이 유무에 관계없이 PI3K/mTOR 저해제에 대한 내성을 효과적으로 극복할 수 있는 표적 단백질로 제시하였고, 시스템생물학 접근을 통하여 이중 PI3K/mTOR 저해제와 후성유전학적 약물인 BET 단백질 저해제 (BET protein inhibitor)를 조합처치하는 경우 암세포의 성장이 효과적으로 억제되는 동시에 사멸이 강하게 유발되며, 더욱이 암 촉진성 사이토카인과 성장인자들의 분비 역시 효과적으로 저해되는 것을 관찰하였다. 아울러 상기 약물조합의 효능은 종양 이식 생쥐모델에서도 재확인되었다. 따라서 상기 BET 저해제를 PI3K/mTOR 저해제와 함께 조합처리 함으로써 PI3K/mTOR 신호전달경로의 비정상적 과활성화로 인하여 발병한 대장암 환자에게 적용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
일반적 방법
포스포-항체 어레이 분석(phospho-antibody array analysis)
인산화 단백질체 분석(Phosphoproteome analyses)은 제조사의 지침에 따라 1,318 단백질 항체를 포함한 Phospho Explorer Antibody Array(Full Moon BioSystems, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 요약하면, 지시된 날 동안 DMSO 또는 BEZ235로 처리된 세포로부터 수득한 세포 용해물(cell lysates)을 단백질 추출 완충액(Full Moon BioSystems, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하여 수확하였고, 항체 배열 분석 키트(Full Moon BioSystems, Sunnyvale, CA, USA)로 바이오틴화(biotinylated)하였다. 이어서, 항체 마이크로 어레이 슬라이드(antibody microarray slides)를 실온에서 30분 동안 차단 용액(Full Moon BioSystems, Sunnyvale, CA, USA)으로 처리하였고 Milli-Q 등급 수로 세척하였다. 그 후, 상기 마이크로 어레이 슬라이드를 실온에서 2시간 동안 커플링 용액(Full Moon BioSystems, Sunnyvale, CA, USA)에서 바이오틴 표지된 세포 용해물과 함께 배양하였다. 커플링 후, 상기 슬라이드를 세척 용액(Full Moon Biosystems, Inc.) 30 ml로 6회 세척하였고 Cy3-결합 스트렙타아비딘(GE Healthcare, Chalfont St. Giles , 영국)을 사용하여 결합된 바이오틴화된 단백질의 검출 전에 Milli-Q 등급 수로 세척하였다. 그런 다음, 상기 슬라이드를 GenePix 4100A 어레이 스캐너(Axon Instrument, Union City, CA, USA)를 사용하여 스캔하였고 이미지는 GenePix 7.0 소프트웨어(Axon Instrument, Union City, CA, USA)로 분석하였다. 형광 신호(fluorescence signal)는 블랭크 신호(blank signal, 항체가 없는 지점)를 제외한 각각의 항체 자리의 형광 강도로부터 수득하였고 각 포스포-특이적 항체(phospho-specific antibody)에 대해, 인산화 신호 비율 변화(△)는 하기 공식을 이용하여 계산하였다: Δ=(Ip/Inp)/(I0p/I0np); 여기서, 상기 Ip 및 Inp는 각각 실험 샘플로부터 인산화된 또한 비-인산화된 형광신호를 총 단백질로 나눈 값이고 각각의 파라미터 I0p 및 I0np는 미처리된 대조군 샘플을 나타낸다.
mRNA 서열 분석
mRNA 서열 분석을 위해 세포를 72시간 동안 노화된 세포 또는 비-노화된 세포로부터 조정된 배지(CM)로 처리하였고 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포의 총 RNA를 분리하였다. RNA 품질은 RNA 6000 나노칩(Agilent Technologies, Amstelveen, The Netherlands)을 사용하여 Agilent 2100 bioanalyzer로 평가하였고, RNA 정량은 ND-2000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 수행하였다. 그 후, 샘플 당 500 ng의 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 QuantSeq 3'-mRNA-Seq Library Preparation Kit(Lexogen GmbH, Vienna, Austria)를 사용하여 라이브러리 제조에 사용하였고, 고속통과 서열분석(high-throughput sequencing)은 NextSeq 500 (Illumina, San Diego, CA, USA)을 이용하여 single-end 75 sequencing으로 수행하였으며 데이터 분석을 위해, quantSeq 3 'mRNA-Seq 판독은 Bowtie 2(Langmead B and Salzberg SL, Nat Methods. 9(4): 357-9. 2012)를 사용하여 정렬하였다.
상기 Bowtie 2 지수는 게놈 및 전사체(transcriptome) 정렬을 위해 대표적인 전사 서열분석 또는 게놈 어셈블리 서열분석으로 생성하였다. 정렬파일(alignment file)은 전사체를 모으고 그 존재량을 추정하고, 유전자의 상이한 발현을 검출하는데 사용하였다. 차별적으로 발현된 유전자(DEGs)는 BedTools(Quinlan AR et al., Bioinformatics. 26(6):841-2. 2010)의 적용 범위를 사용하여 고유 및 다중 얼라인먼트(multiple alignments)에서 얻은 계수를 기반으로 결정하였고 상기 판독된 개수 데이터는 edgeR(Robinson MD et al., Bioinformatics. 26(1):139-40. 2010)을 사용하는 quantile-quantile 정규화 방법을 기반으로 처리하였다.
화합물 및 시약
본 발명에서 사용된 BEZ235, BIRB796, U0126, 에베로리무스(everolimus), GDC-0941, JQ1, 아자싸이티딘(azacitidine), 아나카르드산(anacardic acid), 보리노스타트(vorinostat), pinometostat, UNC669, GSK2879553, 라파티닙(lapatinib), OSI-906, 및 PND-1186은 Selleckchem(Houston, TX, USA)으로 부터 구매하였고 Propidium iodide(PI)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였으며 재조합 휴먼 IL-8 and MIF는 Peprotech(Rocky Hill, NJ, USA)에서 구매하였다. 또한, ISO-1는 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구매하였고 phospho-EGFR(Tyr869), EGFR, phospho-IGF1R(Tyr1165/1166), IGF1Rβ, p16Ink4a, p21Cip1, Myc, phospho-4E-BP1 (Ser65), rabbit IgG, 및 GAPDH에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하였다. CD74 및 phospho-FAK(Tyr910)에 대한 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA)에서, CD44, phospho-ERK(Thr202/Tyr204), phospho-AKT1(Thr308), phospho-AKT1(Ser473), phospho-p70S6K(Thr389), 및 phospho-p38(Thr180/Tyr182)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구매하였고 BRD4에 대한 항체는 Bethyl Laboratories(Montgomery, TX, USA)에서 구매하였다. 아울러, 마우스 IgG에 대한 항체 및 인간 단일클론 anti-CXCR1 및 anti-CXCR2 항체는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서, phospho-Chk1(Ser317) 및 phospho-Chk2(Thr68)에 대한 항체는 Invitrogen(Rockford, IL, USA)에서 구매하였다.
세포 배양
인간 대장암 세포주(human colorectal cancer cell lines)는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 수득한 HCT116 및 Caco-2 세포주를 제외하고 American Type Culture collection(ATCC, Manassas, Virginia, VA, USA)에서 구매하여 ATCC 및 KCLB의 지침에 따라 배양하였다.
세포 생존력 분석(cell viability assay)
세포 생존력 분석은 지시된 약물(BEZ235)의 50% 성장 억제 농도(GI50)를 결정하기 위해, 세포를 96-웰 플레이트에 파종하였고 0.1 nM 내지 1 μM 범위의 6가지 다른 농도의 약물로 처리하였고 상기 플레이트를 96시간 동안 배양한 후, 상대 세포 생존력을 측정하였다. 요약하면, WST-1 용액(Daeillab, Seoul, Korea)을 세포에 30분 ~ 2시간 동안 첨가한 후 xMarkMicroplate 흡광도 분광광도계(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 실험은 각 세포주를 대상으로 3회 수행하였고 CalcuSyn(Biosoft, Cambridge, UK)를 이용하여 GI50 값을 계산하였다. 또한 약물 조합의 조합 지수(CI)를 측정하기 위해, 상기 세포를 96-웰 플레이트에 파종한 후 6가지 상이한 농도(0.1nM ~ 1 μM)의 BEZ235 및/또는 JQ1, 라파티닙, OSI-906, PND-1186 및 U0126를 처리하였다. 개별 약물 조합의 상승 효과는 CalcuSyn(Biosoft, Cambridge, UK)을 사용하여 계산하였다. CI <1은 시너지 효과를, CI = 1은 부가효과를, CI> 1은 길항작용을 나타낸다.
세포증식 및 아폽토시스 분석
세포 증식 및 아폽토시스 측정을 위해, 상기 세포를 96-웰 플레이트에 3중으로 파종하였고 PI의 존재하에 지시된 약물 조합으로 처리하였다. 그 후, 세포를 37 ℃ 및 5% CO2 조건의 세포 배양기에 두고 IncuCyte live cell imaging system(Essen Bioscience, 미국 미네소타 주 Ann Arbor 소재)을 사용하여 모니터링하였다. 상기 장비는 세포의 고화질 위상차 이미지(phase contrast images)를 캡쳐하고 명암 기반 합류 알고리즘을 사용하여 여러 지정된 시간 지점에 걸쳐 각 이미지의 단층 합류를 계산한다. 세포 증식은 3시간마다 획득한 다중 위상-대조 영상으로부터 세포 합류를 계산함으로써 시간에 따라 측정하였다. 아폽토시스가 일어난 세포(apoptotic cells)에 대한 곡선은 적색(PI로 측정된 아폽토시스가 일어난 세포 수에 대한) 형광의 합계 백분율로부터 측정하였다. 아폽토시스 세포에 대한 곡선의 영역(AUC)은 GraphPad Prism 소프트웨어(San Diego, CA, USA)를 사용하여 세포 수에 대한 정상화를 위한 세포 증식 곡선의 면적으로 정규화하였다.
유세포 분석기(flow cytometry)
세포주기 분석(cell cycle analysis)을 위해 지시된 기간 동안 지시된 약물로 세포를 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 트립신 처리하였고 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척한 다음 70% 에탄올로 하룻밤 동안 -20℃로 고정하였다. 고정 후, RNAse a(100 μg/ml) 및 PI(50 μg/ml)를 포함하는 PBS에 세포를 재현탁하고 암실에서 37℃의 조건으로 30분간 더 배양하였다. 유세포 분석은 FACSCalibur 시스템(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 사용하여 수행하였고 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 유동 세포 계측 데이터를 수집하였으며 FlowJo 소프트웨어(Treestar, San Carlos, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포 γH2AX의 검출은 FACSCalibur 시스템(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 γH2AX 인산화 분석 키트 (Millipore, Bedford, MA, USA)를 사용하여 수행하였다. CXCR1과 CXCR2의 세포 표면 발현 분석을 위해 세포를 항-CXCR1(MAB330, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 항-CXCR2(MAB331, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) 또는 마우스 IgG 항체(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 30분 동안 처리하였고 염소 항-마우스 IgG(H+L)-Alexa Fluor 647(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 30분 동안 처리하였다. CD44 및 CD74의 세포 표면 발현 분석을 위해 세포를 항-CD44(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 및 항-CD74(Abcam, Cambridge, MA, USA) 또는 마우스 IgG 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에서 30분 동안 처리하였고 염소 항-마우스 IgG(H+L)-Alexa Fluor 488(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 30분간 처리하였고 FACScan 유동 세포 계측기(Becton Dickinson, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다.
Caspase-3/7 활성 분석
Caspase-3/7 활성은 제조사의 지침에 따라 Caspase-Glo 3/7 Assay Systems (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 결정하였다. 요약하면, 상기 세포를 96-웰 플레이트에 도말하고 지시된 약물 조합으로 지시된 시간 동안 처리하였다. 이어서, Caspase-Glo 3/7 시약을 각 웰에 첨가하였고 세포를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, Orion II Microplate Luminometer(Berthold Detection System GMBH, Pforzheim, Germany)를 사용하여 상기 각 웰의 발광 세기(luminescence intensity)를 측정하였다.
웨스턴 블랏 분석
웨스턴 블랏 분석을 위해, 세포를 용해 완충액(50 mM 트리스[pH 7.2], 250 mM NaCl, 1% NP40, 0.05 % SDS, 2 mM EDTA, 0.5% 데옥시콜산, 10% 글리세롤, 1 μg/mL 아프로티닌, 1 μg 류펩틴, 1 mM Na3VO4 및 1 mM NaF)에 용해하였고 상기 세포 용해액을 4 ℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리한 후 상층액을 이용하여 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)와 면역블로팅(immunoblotting) 분석을 수행하였다. 그 후, 단백질 용해물을 제조하였고 표준 분자 절차에 의해 웨스턴 분석을 수행하였다.
정량 실시간 PCR(quantitative real time PCR)
정량 실시간 PCR을 위하여 배양된 세포에서 제조 회사의 프로토콜(iNtRON Biotech, Seoul, Korea)에 따라 RNA-spin을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. DiaStar RT 키트 (Solgent, Daejeon, 대한민국)를 사용하여 상보성 DNA(cDNA)를 생성하기 위해 DNAse I로 20분간 처리한 약 1 μg의 RNA를 사용하였다. 그 후, cDNA, 프라이머 및 SYBR Master Mix (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)가 포함된 20 mL 반응 부피의 StepOnePlus(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)를 사용하여 시료를 분석하였다. 실험 결과는 세 가지 독립적인 실험의 평균으로 결정하였고 데이터는 각 반응에서 GAPDH mRNA에 대해 표준화되었다. 상기 정량 실시간 PCR의 증폭을 위해 사용된 프라이머 및 본 발명에서 사용한 모든 프라이머의 서열정보를 하기 표 1에 요약하였다.
유전자 염기서열(5'->3') 서열번호
EGFR F AGCTATGAGATGGAGGAAGACG 1
EGFR R GGATCCAGAGGAGGAGTATGTG 2
IGF1R F AACCCCAAGACTGAGGTGTG 3
IGF1R R TGACATCTCTCCGCTTCCTT 4
IL-8 F GTGCAGTTTTGCCAAGGAGT 5
IL-8 R CTCTGCACCCAGTTTTCCTT 6
MIF F ACAGCATCGGCAAGATCGG 7
MIF R CTCTTAGGCGAAGGTGGAGT 8
CD44 F CTGCCGCTTTGCAGGTGTA 9
CD44 R CATTGTGGGCAAGGTGCTATT 10
CD133 F AGTCGGAAACTGGCAGATAGC 11
CD133 R GGTAGTGTTGTACTGGGCCAAT 12
IRS1 F TTGGTATCTACCGCCTTTGC 13
IRS1 R AGAGTCATCCACCTGCATCC 14
HES1 F CGGACATTCTGGAAATGACA 15
HES1 R CATTGATCTGGGTCATGCAG 16
GAPDH F TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG 17
GAPDH R TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT 18
EGFR (A) F GAACCGCTCCCAACTTTCTTC 19
EGFR (A) R CACCAGCACCCGGCTT 20
EGFR (B) F GGAACACCTCCTCAGGACTATC 21
EGFR (B) R GAATCCTGGGTCATCTTCTCTCT 22
IGF1R (A) F CAGCCTGGCGTGAAAGTG 23
IGF1R (A) R CGTACTGGAAAGCCCGAAC 24
IGF1R (B) F CTGCATGTACTTCCATCCATTGAC 25
IGF1R (B) R GTCCTATGCTAACCAGGAGGTAA 26
MIF (A) F GGGACTGGAGCCCTTGAG 27
MIF (A) R TGAAGCCCAGTTCATTCCACT 28
MIF (B) F CGCAGAACCGCTCCTACAG 29
MIF (B) R GGCCGCGTTCATGTCGTAAT 30
CD44 (A) F GCTGTCTGCGAAGTGCATTG 31
CD44 (A) R TGGTGCTTCCACAGACACAT 32
CD44 (B) F CCAGCCTGCCCTCTCTTTC 33
CD44 (B) R TGAGCACACAGCAATCACAC 34
HES1 (A) F CGCCGCAGAACCTAAAGC 35
HES1 (A) R GGGCAATGACTCAGGGACT 36
HES1 (B) F GCTGGAGAGGCGGCTAAG 37
HES1 (B) R GGAAAGCAAACTGGCCATCG 38
노화 관련 β-갈락토시다아제 분석
노화 관련 β-갈락토시다아제 분석을 위하여 세포를 지시된 약물 조합으로 플라스틱 상에서 처리하였다. 그 후 상기세포를 웰 당 1 x 105 세포의 밀도로 12- 웰 플레이트에 도말하였고 제조사의 지침에 따라 Senescence β-galactosidase 염색 키트(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 사용하여 염색하였다. 노화된 세포(Senescent cells)는 광학 현미경으로 파랗게 염색된 세포로 확인하였고 무작위로 선택된 10개의 영역에서 위상차 현미경으로 영상을 촬영하였으며 β- 갈락토시다아제 양성 세포(positive cells)의 평균 비율을 결정하였다.
조건부 배지(conditioned media)
조건부 배지(CM)를 제조하기 위해, 세포를 DMSO 또는 BEZ25(500nM)로 10일 동안 처리하였다. 약물 제거 후, 세포를 새로운 접시에 옮기고 48시간 동안 새로운 배지로 배양하였다. 상기 배지를 수집하였고 4℃에서 10 분간 2000 x g의 조건으로 원심분리하여 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 그런 다음 0.22 μm 필터(Millipore, Bedford, MA, USA)를 사용하여 CM을 필터하였고 10 % FBS가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle 's Medium (DMEM)의 동일한 부피로 희석한 후 6시간 이내에 사용하였다. 치료에 의해 유도된 노화 암 세포는 방사선이나 화학 요법과 같은 스트레스가 많은 조건 하에서 성장이 억제되지만, 대사적으로 활성을 유지하고, 집합적으로 노화-관련 분비 표현형(senescence-associated secretory phenotype, SASP)으로 알려진 사이토카인(cytokines) 및 성장 인자(growth factor)를 과다하게 분비함으로써 세포 미세 환경을 조절하는데 PI3K/mTOR 억제에 의해 유도된 노화된 CRC 세포가 상기 SASP 특성을 유지하는지 결정하기 위해, 사이토카인 어레이 분석을 통하여 10일 동안 BEZ235로 처리된 세포의 상층액에서 사이토카인 발현 프로파일(expression profiles)을 분석하였다. 먼저, 세포 상층액에 존재하는 사이토카인(cytokines)의 검출은 Proteome Profiler Array Human XL Cytokine Array Kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였고 ImageJ 소프트웨어(Schneider CA et al., Nat Methods. 9(7): 671-5, 2012)를 사용하여 사이토카인의 평균 스팟 픽셀 밀도를 정량화하였다.
ELISA 분석
IL-8 및 MIF의 수준은 인간 IL-8/CXCL8 Quantikine ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 및 인간 MIF Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 각각 제조사의 지침에 따라 사용하여 평가하였다. 또한, ERK1/2 및 p38의 인산화 수준은 ERK1/ERK2(Total/Phospho) InstantOne ™ ELISA kit(eBioscience, San Diego, CA, USA) 및 p38 MAPK(Total/Phospho(Thr180/Tyr182)) InstantOneTM ELISA Kit(eBioscience, San Diego, CA, USA) 각각 제조사의 지침에 따라 사용하여 평가하였다.
Gene Set Enrichment Analysis(GSEA) 분석
GSEA 분석은 대장암 세포에서 SAS에 의해 변형된 생물학적 기능을 연구하기 위해 수행하였다. 이를 위해, 유전자는 실험군과 대조군 시료 사이에서 -log10(p 값)에 log2(배율 변화)를 곱한 점수로 계산하여 순위를 매겼다. 따라서, 가장 유의하게 상향 조절된 유전자는 높은 등급에 속하였고 상당히 하향 조절되는 유전자는 낮은 등급에 속하였다. 사전 평가된 GSEA 분석을 수행하기 위해 GSEA 소프트웨어 v3.0(Subramanian A et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102(43): 15545-15550, 2005)를 사용하였고 순열의 수는 5,000이었다. GSEA 분석에 사용된 유전자 세트는 MSigDB(Liberzon A et al., Bioinformatics. 27(12): 1739-1740, 2011)로부터 수득하였다.
ChIP-qPCR 분석
BEZ235(500 nM), JQ1(1 μM) 또는 이들의 조합으로 8시간 동안 처리한 세포를 1% 포름알데히드(formaldehyde)로 실온에서 10분간 가교(cross-linked)시킨 후 5 분 동안 125 mM 글리신(glycine)으로 중화시켰다. 그 후, PBS로 3회 세척하였고 상기 세포를 냉-용해 완충액(25 mM HEPES(pH 7.8), 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.1 % NP-40 및 프로테아제 억제제 칵테일)에서 10분 동안 용해시켰다. 이어서, 상기 세포를 얼음 위에서 초음파 완충액(50 mM HEPES(pH 7.8), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.5% 나트륨 디옥시콜레이트, 0.1% SDS 및 프로테아제 억제제 칵테일)을 이용하여 30분 동안 재현탁하였고 초음파 분쇄기(Diagenode, Denville, NJ, USA)를 사용하여 총 처리 시간 15분 동안 30초 오프 사이클의 조건으로 30초간 초음파 처리하였다. 그 후 원심분리 후 염색질 용액을 4 ℃에서 2 시간 동안 20 μl 단백질 A+G 자성 비드(Milipore, Billerica, MA, USA)로 사전 제거하였으며 20 μl 단백질 A+G 자기 비드 및 4 μg의 항-BRD4 또는 항-토끼 IgG를 첨가 후 하룻밤 동안 배양하였다. 비드를 저염 완충액, 고염 완충액, LiCl 완충액 및 TE 완충액으로 순차적으로 세척하였고, 결합된 물질(the bound materials)을 ChIP(염색질 면역 침전) 용출 완충액(100 mM NaHCO3, 1% SDS)으로 용출시켰고 교차 결합(cross-links)을 위해 65℃에서 하룻밤 동안 방치하였고 ChIP DNA를 MinElute PCR 정제 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제하였다. ChIP-qPCR은 SYBR 녹색 시약 및 ABI 7500 Real-time PCR 시스템(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 상기 부위에 결합하는 BRD4를 검출하기 위해 ChIP-qPCR 실험을 위해 BRD4 점유가 풍부한 EGFR, IGF1R 및 MIF의 TSS 영역의 상류에 대한 프라이머를 사용하였다(부위 A).
상처 치유 분석
상처 치유 분석을 위해 1x104 세포를 96-웰 플레이트에 도말하였고 세포 단층이 적어도 90%의 포화도에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 단층 세포는 피펫 팁으로 긁어낸 다음 조건부 배지(conditioned medium), 대조군 배지 또는 DMSO로 처리하였다. 그 후 세포 이동(Cell migration)은 IncuCyte에 의해 실시간으로 모니터링하였고, 상처의 폭을 측정하였다.
세포의 이동 및 세포 침입 분석
세포의 이동성 및 침습성을 측정하기 위해 세포를 24-웰 트랜스웰 플레이트(8-μm pore size, Costar, Cambridge, MA, USA)에 도말하였다. 이동 분석(migration assays)을 위해 1x105 세포를 0.1% 젤라틴 코팅 막을 가진 상단 챔버에 첨가하였다. 침입 분석(invasion assays)을 위해 챔버 삽입물을 Matrigel(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 코팅하였고 하룻밤 동안 무균 조건에서 건조시킨 다음 1×105 개의 세포를 상부 챔버에 첨가하였다. 상기 양 분석에서 세포를 무-혈청 배지에 현탁시키고 지시된 조건부 배지 또는 10% FBS를 함유하는 DMEM를 첨가한 배지를 하부 챔버 내의 화학 유인 물질(chemoattractant)로서 사용하였다. 그 후, 37℃, 5% CO2의 조건에서 48시간 동안 배양한 후 멤브레인의 상부 표면에 남아있는 비-이동성 또는 비-침습성 세포를 스크래핑(scraping)으로 제거하였다. 또한, 막의 하부 표면상의 세포를 10% 포름알데히드로 30분 동안 고정시킨 후, 0.1 % 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 그런 다음, 10개의 무작위로 선택된 필드에서 위상차 현미경으로 이미지를 촬영하였고, 필드 당 이동 또는 침입된 세포의 평균수를 정량화하였다.
In vivo 처리 분석
CRC 세포주의 정위 이식(orthotopic engraftment)을 위해 BD Matrigel Basement Membrane Matrix(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)와 PBS의 1:1 혼합물에 1x106 HCT116 및 SW480 세포를 현탁하였고 각각 HCT116 및 SW480 세포를 약 16 ~ 8 주령의 암컷 누드 마우스(Orient Bio Inc., 성남, 한국) 좌,우 피하에 주입하였다. 그 후, 이종 이식편(xenografts)을 보유한 마우스를 평균 종양 부피가 100 mm3(HCT116) 및 250 mm3(SW480)에 도달할 때 그룹당 7-8 마리의 마우스를 치료 개시 전에 종양 부피를 기준으로 네 그룹으로 무작위 선정하였다. 마우스는 경구용 위관 영양법 및/또는 50 mg/kg/일 JQ1(옥수수 기름으로 희석)에 의해 25 mg/kg/day BEZ235(NMP)/90% 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 300)을 매일 복강 내 투여하였고 종양 체적과 마우스 체중을 매일 측정하였다. 종양의 크기는 하기의 방법으로 계산하였다: 종양 크기 (mm3) = (더 긴 측정 x 짧은 측정2) x 0.5. 종양 중량은 실험 종료시 종양을 절제하여 분석하였다.
실시예 1: 이중 PI3K/mTOR 억제에 의한 대장암 세포에서 세포 증식 억제 효과
대장암(CRC) 세포에서 이중 PI3K/mTOR 억제의 효과를 평가하기 위해 현재 임상 시험중인 PI3K/mTOR의 경구로 이용 가능한 이중 억제제인 BEZ235(0.1에서 1,000 nM까지)의 다양한 농도로 다양한 인간 CRC 세포주에 처리하였고(Serra V et al., Cancer Res. 68(19): 8022-8030, 2008; Maira SM et al., Mol Cancer Ther. 7(7): 1851-1863, 2008) 96시간 동안 세포 증식을 관찰하였다. 그 결과, BEZ235의 GI50(최대 세포증식의 50% 억제 농도)은 약 170에서 710 nM 범위였고 가장 민감한 세포주는 Colo205, Colo201, HT29 및 Caco2였으며 가장 둔감한 세포주는 HCT116, SW480, SW620 및 LS180로 나타났다. 야생형(WT)과 KRAS 돌연변이군 사이의 BEZ235 처리에 대한 GI50 값에서 통계적으로 유의한 차이를 관찰하였다(p = 0.011, Mann-Whitney U test). 그러나 WT와 PIK3CA 돌연변이군 간에는 유의한 차이를 나타내지 않았다(p = 0.430; Mann-Whitney U test)(도 1 및 표 2 및 3 참조).
대장암 세포의 세포 생존 능력에 대한 이중 PI3K/mTOR 억제 효과
Cell line GI50 value
[nM]		 status
KRAS BRAF PIK3CA APC CTNNB1 FBXW7
HCT116 712.70 mut wt mut wt mut wt
SW480 645.26 mut wt wt mut wt wt
SW620 589.08 mut wt wt mut wt wt
LS180 543.63 mut mut mut wt mut wt
LS174T 522.72 mut mut mut wt mut wt
LOVO 505.88 mut wt wt mut wt wt
Colo320-DM 484.33 wt wt wt mut wt wt
HCC2998 428.07 mut wt wt mut wt mut
SW1417 384.78 wt mut wt mut wt wt
SW837 362.89 mut wt wt mut wt mut
SK-CO-1 344.93 mut wt wt mut wt wt
DLD1 327.86 mut wt mut mut wt mut
LS411N 297.38 wt mut wt mut wt wt
NCI-H716 279.24 mut wt wt wt wt wt
Colo205 250.93 wt mut wt mut wt wt
Colo201 221.48 wt mut wt mut wt wt
HT29 194.62 wt mut mut mut wt wt
Caco2 172.93 wt wt wt mut mut wt
Cell line GI50 value [nM] status
TCF7L2 TP53 ACVR2A TGFBR2 SMAD4 MSI CIMP
HCT116 712.70 wt wt mut mut wt U +
SW480 645.26 wt mut wt wt wt S -
SW620 589.08 wt mut wt wt wt S -
LS180 543.63 mut wt mut mut wt U -
LS174T 522.72 mut wt mut mut wt U -
LOVO 505.88 mut wt mut mut wt U -
Colo320-DM 484.33 wt mut wt wt wt S -
HCC2998 428.07 wt mut wt wt wt S -
SW1417 384.78 wt mut wt wt wt S -
SW837 362.89 wt mut wt wt wt S +
SK-CO-1 344.93 wt wt wt wt wt S +
DLD1 327.86 wt wt mut mut wt U +
LS411N 297.38 wt mut mut mut wt U +
NCI-H716 279.24 wt mut wt wt wt S -
Colo205 250.93 wt mut wt wt wt S +
Colo201 221.48 wt mut wt wt wt S +
HT29 194.62 wt mut wt wt mut S +
Caco2 172.93 wt mut wt wt mut S -
*BEZ235 치료에 대한 다양한 대장 암(CRC) 세포의 GI50 값을 보여주는 표. wt, 야생형; mut, 돌연변이; MSI, 마이크로 위성 불안정성; S, 안정적; 불안정적 U; CIMP, CpG 섬 메틸화 인자 표현형; +, 양성; -, 음성.
또한, CRC 세포에서 PI3K/mTOR 억제의 영향을 더 평가하기 위해, 본 발명자들은 다양한 농도(1 내지 1,000 nM)의 BEZ235를 가장 둔감한 4개(HCT116, SW480, SW620, 및 LS180) 및 가장 민감한 2개 (HT29 and Caco2) CRC 세포주에 처리하였고 생존-세포 이미징 증식 분석(live-cell imaging proliferation assay)을 사용하여 세포 성장 및 생존을 모니터링하였다. 그 결과, BEZ235의 처리는 명확한 농도 의존적인 조건에서 세포 성장이 억제됨을 관찰하였다(도 2a). 또한, BEZ235 처리는 세포주기의 G1 단계에서 세포의 적당한 농축을 유도했지만(도 2b), 단기(2일) 또는 심지어 장기(10일) 약물 처리에서 아폽토시스의 신뢰할 수 있는 지표인 caspase-3과 -7의 활성이나 아폽토시스가 증가하지 않았다(도 2c 및 2d). 상기 결과는 BEZ235의 처리는 CRC 세포의 돌연변이 상태와 관계없이 세포 독성효과보다는 세포 증식 억제효과를 나타내므로 CRC 세포가 PI3K/mTOR 차단에 대한 반응으로 아폽토시스에 대해 내성을 지니며, 약물 처리하에서 지속적인 세포 생존을 지원하기 위하여 대체 조절 메카니즘이 존재할 수 있음을 시사한다.
실시예 2: 이중 PI3K/mTOR 억제에 의한 대장암 세포에서 동적 보상 kinome 반응 유도
암 세포는 약물 처리의 치료 효과를 회피하기 위해 다중 단백질 키나아제(multiple protein kinases)의 활성화에 의해 유도되는 보상 생존-촉진 기전(compensatory survival-promoting mechanisms)을 활성화시킨다. 따라서, 본 발명자들은 PI3K/mTOR 억제하에서 CRC 세포의 생존에 기여하는 키나아제 활성의 동적 변화(dynamic changes)를 조사하기 위해, PI3K/mTOR 차단에 대해 가장 둔감한 2개의 CRC 세포주인 HCT116 및 SW480 세포의 신호 프로파일(signaling profiles)을 인산계 단백질체적(phosphoproteomic) 스케일에서 관찰하였다.
그 결과, 세포의 키나아제체(kinome)은 처리되지 않은 세포와 비교하여 증가되거나 감소된 활성을 나타내는 많은 단백질 키나아제를 가진 BEZ235 처리에 현저하게 반응하였다(도 3a 및 3b). 이는 AKT(PI3K 표적기질), mTOR, p70S6K(mTOR 기질) 및 4E-BP1(mTOR 기질)을 포함하는 PI3K/mTOR 경로의 핵심 성분의 인산화 수준은 약물 치료 기간 동안 억제된 상태로 유지되어 PI3K/mTOR 활성화는 BEZ235 처리에 의해 효과적으로 차단됨을 시사한다. 이에 반해, BEZ235는 다중 생존 단백질, 여러 RTK(EGFR, 인슐린유사 성장인자 1 수용체, IGF1R), 혈소판유도성장인자수용체(PDGFR) α/β, 혈관내피세포성장인자(VEGFR)2, HER2 및 MET 및 세포질 키나아제(FAK, ERK, PAK(p21- 활성 키나아제) 및 Paxillin(PXN))의 활성화를 유도하였다. 삼중-음성 유방암(TNBC, triple-negative breast cancer)에서 PI3K/mTOR 억제에 대한 저항성을 부여하는 전사인자(STAT) 단백질 패밀리의 신호 전달인자(signal transducer)와 활성제(activator)는 BEZ235 처리된 CRC 세포에서 활성화되지 않아서, 저항 메커니즘의 암 유형별 차이를 제시하였다. 특히 HCT116 및 SW480 CRC 세포는 PI3K/mTOR 차단시 세포반응에 약간의 가변성을 나타내었다: PDGFRα/β, VEGFR2 및 PAK는 HCT116 세포에서만 활성화되는 반면 SW480 세포에서는 HER2, MET 및 PXN이 활성화되었다(도 3a 및 3b).
기능적으로 활성화된 단백질의 유전자 및 유전자(KEGG) 경로 분석에 대한 교토 백과사전(Kyoto Encyclopedia)은 PI3K/mTOR 억제에 의해 크게 영향을 받는 몇 가지 주요 신호 경로를 밝혀냈다(표 4 및 5 참조).
CRC 세포에서 2 또는 10일째 PI3K/mTOR 차단에 의해 기능적으로 활성화된 단백질의 KEGG 경로 농축 분석 결과
카테고리 GO 용어(GO term) HCT116
개수 백분율(%) p-값
Day 2 KEGG Chemokine signaling pathway 6 3.2 9.53E-05
KEGG Colorectal cancer 5 8.1 9.00E-06
KEGG ErbB signaling pathway 7 8.0 1.90E-08
KEGG HIF-1 signaling pathway 5 5.0 1.10E-04
KEGG MARK signaling pathway 11 4.3 1.90E-11
KEGG pathway in cancer 8 2.0 3.30E-09
KEGG Rap1 signaling pathway 12 5.7 2.90E-14
KEGG Ras signaling pathway 5 2.2 5.65E-03
KEGG TNF signaling pathway 8 7.3 1.50E-09
KEGG VEGF signaling pathway 8 1.3 1.10E-11
Day10
 KEGG Chemokine signaling pathway 7 3.8 6.60E-04
KEGG Colorectal cancer 6 9.7 1.30E-05
KEGG ErbB signaling pathway 8 9.1 1.50E-07
KEGG HIF-1 signaling pathway 6 5.9 2.30E-04
KEGG MARK signaling pathway 16 6.3 4.80E-14
KEGG pathway in cancer 12 3.0 2.40E-06
KEGG Rap1 signaling pathway 17 8.0 6.10E-17
KEGG Ras signaling pathway 9 3.9 2.00E-05
KEGG TNF signaling pathway 9 8.2 3.20E-08
KEGG VEGF signaling pathway 11 18.0 3.00E-14
카테고리 GO 용어(GO term) SW480
개수 퍼센트(%) p-값
Day 2 KEGG Chemokine signaling pathway 8 4.3 4.83E-06
KEGG Colorectal cancer 4 6.5 2.62E-03
KEGG ErbB signaling pathway 8 9.1 1.29E-08
KEGG HIF-1 signaling pathway 6 5.9 4.09E-05
KEGG MARK signaling pathway 10 3.9 1.90E-07
KEGG pathway in cancer 11 2.8 9.40E-07
KEGG Rap1 signaling pathway 11 5.2 1.15E-09
KEGG Ras signaling pathway 6 2.6 4.57E-03
KEGG TNF signaling pathway 5 4.5 1.45E-03
KEGG VEGF signaling pathway 6 9.8 1.95E-06
Day10 KEGG Chemokine signaling pathway 7 3.8 1.20E-04
KEGG Colorectal cancer 7 11.3 6.10E-08
KEGG ErbB signaling pathway 10 11.4 7.30E-12
KEGG HIF-1 signaling pathway 7 6.9 2.00E-06
KEGG MARK signaling pathway 10 3.9 3.10E-07
KEGG pathway in cancer 13 3.3 6.00E-09
KEGG Rap1 signaling pathway 10 4.7 5.20E-08
KEGG Ras signaling pathway 6 2.6 5.94E-03
KEGG TNF signaling pathway 7 6.4 3.60E-06
KEGG VEGF signaling pathway 7 11.5 5.40E-08
한편, 포스포-항체 어레이 결과는 웨스턴 블랏 분석으로 확인한 결과 AKT, p70S6K 및 4E-BP1의 인산화가 BEZ235 처리에 의해 억제되었음을 관찰하였으며, BEZ235가 포스포-항체 어레이 결과와 일치하는 PI3K/mTOR 경로의 활성화를 효율적으로 차단함을 나타내었다(도 3c및 3d).
그 후, 인산화-단백질체(phosphoproteome) 분석에서 HCT116 및 SW480 세포에서 공통적으로 활성화되는 여러 종양 신호 단백질(oncogenic signaling proteins)을 검증하였다. 그 결과, BEZ235는 HCT116 및 SW480 세포에서 EGFR, IGF1R, FAK 및 ERK의 인산화를 유도하였고 AKT와 p70S6K의 활성은 약물 처리 전반에 걸쳐 억제되어 있음을 유의해야한다. 또한, PI3K/mTOR 경로의 억제는 RTK의 전사 활성화를 촉진하는 것으로 보고되었는데 BEZ235 처리 후 EGFR과 IGF1R의 발현이 실제로 증가하여 , PI3K/mTOR 억제 하에서 CRC 세포에서 RTK 활성화를 위한 전사 기작과 관련 있음을 시사하였다(도 3e와 3f).
또한, CRC 세포를 BEZ235로 처리하면 CD44, PROM1(CD133), IRS1 및 HES1을 비롯하여 이전에 전사 활성이 알려진 유전자 발현이 증가하고 다양한 유형의 암세포에서 PI3K/mTOR 경로 구성 요소의 저해에 대한 저항성이 부여되었다(도 4a). 종양단백질(oncoprotein) Myc는 종래 PI3K/mTOR 경로 억제와 관련하여 약물 내성을 매개하는 것으로 나타났는데 본 발명자들은 Myc 발현이 SW480 세포에서 증가했지만 장기간 BEZ235 처리를 통해 HCT116 세포에서 감소하는 것을 관찰하였다(도 4b) 이는 Myc가 CRC에서 PI3K/mTOR 차단에 대한 일반적인 저항 인자가 아닐 수 있음을 시사한다.
실시예 3: 이중 PI3K/mTOR 억제에 의한 대장암 세포에서 세포 노화(cellular senescence)유도 확인
본 발명자들은 암세포는 화학 요법이나 방사선 치료와 같은 불리한 조건에 적응할 수있는 고유한 가소성(plasticity)을 가지고 있기 때문에 장기적인 PI3K/mTOR 억제 시 암 세포가 어떻게 생존하는지에 대한 표현형 행동(phenotypic behaviors)을 연구하였다. 이를 위해 BEZ235 처리하에 CRC 세포의 세포행동을 모니터링하여 BEZ235 처리된 세포가 노화세포(senescent cells)의 대표적인 특징인 평평한(flattened) 세포 형태를 나타내는 것을 관찰하였다. 세포가 실제로 노화되는지 여부를 조사하기 위해 암세포에서 세포 노화의 신뢰할 수 있는 표지자인 β-갈락토시다아제 활성이 증가하는지 관찰하였다.
그 결과, BEZ235를 사용한 CRC 세포의 장기간 처리가 β-갈락토시다아제 활성을 유의하게 증가시킴을 관찰하였음으로 PI3K/mTOR 억제는 CRC 세포에서 노화를 유도하는 것을 시사한다(도 5a 및 5b). 종래의 연구들은 PI3K/mTOR 경로의 저해가 스트레스 키나아제 p38의 상류 조절자(upstream regulator)로 작용하는 DNA 손상을 유도한다는 것을 보고하였다. 또한, γH2AX(DNA에 대한 신뢰할 수 있는 표지자) 및 p38이 BEZ235-처리된 HCT116 및 SW480 세포(도 5c 및 5d)에서 증가하여 포스포-항체 어레이 결과와 일치함을 확인하였다. 상기 결과는 PI3K/mTOR 억제에 의해 유도된 DNA 손상이 CRC 세포에서 p38의 활성화를 유도할 수 있음을 시사한다. 또한, 노화-유도 신호는 주로 p16, p21, 또는 Chk1/2의 p38 매개 하류 활성화에 의해 매개되는데 본 발명자들은 p21이 HCT116 세포에서 유도되는 반면에 Chk1/2는 BEZ235 처리 후 SW480 세포에서 활성화됨을 발견했으며, 이는 상이한 세포주 사이에서 세포 반응의 다양성을 시사한다(도 5d). 또한, pan-p38 억제제인 BIRB796을 사용한 p38의 억제는 장기간의 BEZ235 처리된 CRC 세포에서 현저하게 β-갈락토시다아제의 활성을 감소시켰다(도 5e 및 5f). 또한, p38의 DNA 손상 유발성 활성화는 ERK 의존성 또는 독립적인 방식으로 일어날 수 있다고 보고되었는데 ERK 경로 억제제인 U0126을 사용하는 ERK의 억제가 β- 갈락토시다아제 활성을 유의적으로 변화시키지 않는다는 것을 관찰하였다. 이는 CRC 세포에서 PI3K/mTOR 차단 유도성 노화가 ERK 독립적 반응임을 시사한다(도 5e 및 5f). 이중 PI3K/mTOR 억제보다 덜하지만, GDC-0941(pan-PI3K 억제제) 또는 everolimus(mTOR 억제제)의 처리는 노화(도 5g 및 5h)를 유도하였고 γH2AX 활성을 증가시켰다(도 5i). 상기 결과들은 DNA 손상에 의해 유도된 p38 활성화가 CRC 세포에서 PI3K/mTOR 억제에 의해 유도된 노화 조절에 결정적임을 시사한다.
실시예 4: 이중 PI3K/mTOR 억제에 의해 유도된 노화 대장암 세포의 ERK- 및 p38-조절된 세크리톰(secretome) 발달
치료에 의해 유도된 노화 암 세포는 방사선이나 화학 요법과 같은 스트레스가 많은 조건 하에서 성장 억제되지만, 대사적으로 활성을 유지하고, 집합적으로 노화-관련 분비 표현형(SASP)으로 알려진 사이토카인(cytokines) 및 성장인자 (growth factor)를 과다하게 분비함으로써 세포 미세 환경을 조절한다. 본 발명자들은 PI3K/mTOR 억제에 의해 유도된 노화된 CRC 세포가 상기 SASP 특성을 유지 하는지를 결정하기 위해, 사이토카인 어레이를 사용하여 10일 동안 BEZ235로 처리된 세포의 상층액에서 사이토카인 발현 프로파일을 분석하였다.
그 결과, IL-8 및 MIF가 HCT116 및 SW480 세포에서 일반적으로 상향 조절되는 여러 사이토카인의 실질적인 변화를 관찰하였다(도 6a 및 6b). 또한, 사이토카인 어레이 분석 결과는 다양한 BEZ235-처리된 CRC 세포의 상층액에서 IL-8 및 MIF에 대한 ELISA 분석에 의해 입증되었는데 IL-8과 MIF 분비가 BEZ235 처리 후에 유의하게 증가한다는 것을 관찰하였다(도 6c). 상기와 같은 분비 패턴은 IL-8 및 MIF mRNA의 상향 조절에 의해 반영되었으며, 이는 이들 사이토카인이 전사적으로 조절된다는 것을 시사한다(도 6d). 또한, ERK와 p38은 세포-상황 의존적 방식(cellular-context dependent manner)에 따라 전사 또는 번역 수준에서 IL-8 및 MIF 발현의 상류 조절자(upstream regulators) 역할을 하는 것으로 알려져 있다. U0126 또는 BIRB796을 각각 사용하여 ERK 또는 p38을 억제하여 CRC 세포에서 IL-8 및 MIF의 BEZ235-유도성 전사 및 분비를 크게 감소시켰다(도 6e 및 6f). 이는 사이토카인의 상향조절이 ERK- 및 p38-의존적임을 입증하는 것이다.
또한, 분비된 사이토카인이 PI3K/mTOR 억제에 대한 CRC 세포의 저항성에 기여하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 먼저 세포가 사이토카인의 동족 수용체(cognate receptors)를 발현하는지 여부를 조사하였다: IL-8의 경우 CXCR1 및 CXCR2, MIF의 경우 CD44 및 CD74. 그 결과, CXCR2 및 CD74의 발현 수준은 HCT116 및 SW480 세포 모두에서 장기(10일) BEZ235 처리 후 유의하게 증가하였다(도 7a). 또한, IL-8 또는 MIF로 세포를 자극하면 PI3K/mTOR 차단에 반응하여 유도된 몇 가지 발암성 하류 키나아제(oncogenic downstream kinases)가 활성화되었다(도 7b). 또한, 다양한 암 유형에서 생존과 성장을 조절하는데 IL-8 및 MIF이 기능적으로 중요하다고 알려졌기 때문에 본 발명자들은 BEZ235- 처리된 CRC 세포의 세포 반응에 대한 상기 사이토카인의 억제 효과를 조사하였다. 그 결과, CXCR1/2 차단 항체 또는 ISO-1(MIF 길항제)을 사용한 IL-8 또는 MIF 활성의 억제는 BEZ235로 처리된 세포에서 아폽토시스의 유도를 증가시켰다(도 7c 및 7d).
또한, 사이토카인의 분비가 PI3K/mTOR 억제에 대한 감수성과 관련이 있는지를 평가하기 위해 다양한 CRC 세포주를 BEZ235로 처리하고 IL-8 및 MIF 분비를 측정한 결과, IL-8과 MIF의 BEZ235에 의해 유발된 전사와 분비가 GI50 값, ERK 활성화 또는 CRC 세포주의 p38 활성화와 유의성(p <0.05)이 양의 상관관계가 있음을 발견했다(도 7e, 표 6 내지 8 참조).
대장암 세포에서 PI3K/mTOR 이중 억제에 대한 약물 감수성에 대한 노화 관련 secretome의 영향
세포주 GI50 값[nM] IL-8 분비 (BEZ235-처리된 세포와 DMSO-처리된 세포 사이의 배수 - 변화) MIF 분비 (BEZ235-처리된 세포와 DMSO-처리된 세포 사이의 배수- 변화)
HCT116 712.70 5.07 ± 0.30 4.68 ± 0.27
SW480 645.26 5.71 ± 0.39 5.29 ± 0.29
SW620 589.08 5.24 ± 0.25 4.34 ± 0.18
LS180 543.63 4.70 ± 0.35 4.14 ± 0.24
LS174T 522.72 3.29 ± 0.18 2.55 ± 0.17
LOVO 505.88 4.59 ± 0.22 4.08 ± 0.09
Colo320-DM 484.33 1.98 ± 0.12 1.63 ± 0.13
HCC2998 428.07 2.69 ± 0.17 1.78 ± 0.10
SW1417 384.78 1.46 ± 0.11 3.39 ± 0.22
SW837 362.89 1.62 ± 0.13 1.91 ± 0.13
SK-CO-1 344.93 3.44 ± 0.32 2.37 ± 0.15
DLD1 327.86 1.69 ± 0.12 2.16 ± 0.13
LS411N 297.38 2.37 ± 0.12 2.88 ± 0.21
NCI-H716 279.24 3.11 ± 0.22 1.99 ± 0.14
Colo205 250.93 2.47 ± 0.13 1.61 ± 0.10
Colo201 221.48 2.05 ± 0.18 2.66 ± 0.18
HT29 194.62 3.48 ± 0.23 2.88 ± 0.19
Caco2 172.93 2.03 ± 0.15 1.58 ± 0.12
Cell line GI50 값[nM] ERK1 / 2 인산화 (BEZ235- 처리된 세포와 DMSO- 처리된 세포 사이의 배수- 변화) p38 인산화 (BEZ235- 처리된 세포와 DMSO- 처리된 세포 사이의 배수 변화)
HCT116 712.70 2.42 ± 0.13 5.91 ± 0.34
SW480 645.26 2.62 ± 0.14 5.28 ± 0.37
SW620 589.08 2.47 ± 0.15 3.82 ± 0.26
LS180 543.63 2.54 ± 0.12 4.98 ± 0.31
LS174T 522.72 3.01 ± 0.20 4.71 ± 0.29
LOVO 505.88 2.76 ± 0.16 4.83 ± 0.30
Colo320-DM 484.33 2.01 ± 0.12 4.13 ± 0.29
HCC2998 428.07 2.82 ± 0.21 4.21 ± 0.32
SW1417 384.78 2.04 ± 0.15 4.49 ± 0.30
SW837 362.89 1.89 ± 0.13 4.05 ± 0.29
SK-CO-1 344.93 2.28 ± 0.17 4.46 ± 0.38
DLD1 327.86 1.73 ± 0.10 4.31 ± 0.26
LS411N 297.38 1.76 ± 0.10 4.66 ± 0.29
NCI-H716 279.24 1.56 ± 0.08 5.11 ± 0.38
Colo205 250.93 1.48 ± 0.09 3.94 ± 0.27
Colo201 221.48 1.52 ± 0.09 3.77 ± 0.25
HT29 194.62 2.64 ± 0.17 4.24 ± 0.30
Caco2 172.93 1.81 ± 0.14 4.60 ± 0.25
다양한 CRC 세포주의 지시된 사이토카인의 GI50 값과 mRNA 발현 또는 단백질 분비 수준 사이에서 계산된 피어슨 상관 계수(Pearson correlation coefficient)
IL-8 분비 MIF 분비
GI50 value 0.715 (p = 0.0008) 0.727 (p = 0.0006)
ERK1/2 activation 0.623 (p = 0.0006) 0.498 (p = 0.035)
p38 activation 0.536 (p = 0.022) 0.539 (p = 0.021)
또한, 400 nM보다 큰 GI50 값을 갖는 CRC 세포주는 400 nM 미만의 것과 비교하여 유의하게 높은 수준의 사이토카인을 분비하였다(도 7f, 표 9 및 10 참조). 이는 사이토카인 분비 프로파일이 PI3K/mTOR 억제에 대한 약물 감수성과 밀접하게 관련되어 있음을 나타낸다. 또한, 400 nM보다 큰 GI50 값을 갖는 세포주에서 ERK1/2 활성(p38은 아님)의 활성이 400 nM 미만인 것보다 유의하게 높았으며(표 9 및 10 참조), 이는 약물 저항성과 관련된 ERK1/2 활성 또한 양의 상관관계가 있음을 시사한다.
400nM 이상의 GI50 및 400nM 미만의 다양한 CRC 세포주의 사이토카인 분비 프로파일 간의 비교(BEZ235- 처리된 세포와 DMSO- 처리된 세포 사이의 배율-변화)
IL-8 분비 MIF 분비
평균 p-값 평균 p-값
GI50 ≥ 400 nM 4.159 0.007
 3.561 0.045
GI50 < 400 nM 2.372 2.343
400 nM 이상의 GI50 및 400 nM 미만의 다양한 CRC 세포주의 키나아제 활성화 프로파일 비교(BEZ235-처리된 세포와 DMSO-처리된 세포 사이의 배율-변화)
ERK1/2 인산화 p38 인산화
평균 p-값 평균 p-값
GI50 ≥ 400 nM 2.581 0.0004 4.734 0.198
GI50 < 400 nM 1.871 4.363
상기 결과는 PI3K/mTOR 억제-유도된 노화 CRC 세포가 약물 처리에 반응하여 세포 생존에 기여하는 ERK- 및 p38- 조절된 분비를 발생 시킨다는 것을 말해준다.
실시예 5: 유전자 발현 프로파일링(gene expression profiling)
세포 노화(cellular senescence)는 세포 증식을 억제함으로써 유력한 종양 억제 과정으로 널리 간주되고 있다. 본 발명자들은 종양 미세 환경(tumor microenvironment)에서 유도된 PI3K/mTOR 억제 효과를 종합적으로 조사하기 위해, BEZ235-유도성 노화 세포(CM-BEZ) 또는 미처리 비-노화 세포(CM-DMSO)로부터의 CM으로 처리된 CRC 세포의 RNA-서열 분석을 수행하였고 DEG를 결정하였다(fold change ≥ 2, p ≤ 0.05). 그 결과, HCT116과 SW480 세포의 DEGs 사이에 유의한 중첩(overlap)을 관찰하였다(도 8a). 또한, DEGs의 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 g:프로파일러(Reimand, J. et al., Nucleic Acids Res. 44(W1):W83-89, 2016)를 사용하여 유전자 온톨로지(GO, gene ontology) 용어 분석을 수행한 결과, 상향조절된 DEGs에서는 아폽토시스의 음성 조절이 유의하게 농축되었지만 DEG가 하향조절된 경우에는 유의적인 GO텀이 농축되지 않음을 관찰하였다(도 8b 및 8c). 상기 GO 텀 분석 결과와 일치하게 GSEA는 CM-BEZ-처리된 CRC 세포의 유전자에서 증식(proliferation)의 양성조절, 성장 이동(growth migration), 상피-간엽 전이(epithelial-to-mesenchymal transition) 또는 아폽토시스의 음성 조절과 관련된 GO 유전자 세트가 농축되었음을 나타내었다(도 8d 및 8e, 표 11 및 12 참조).
HCT116 및 SW480 세포에서 유전자 온톨로지(GO, gene ontology) 유전자 세트에 대한 유전자 세트 농축분석(GSEA) 결과
카테고리 유전자 세트 명칭 HCT116
NES p-value FDR
q-value
생물학적
과정		 APOPTOTIC_MITOCHONDRIAL_CHANGES 1.47 0.017 0.081
CELL_CHEMOTAXIS 1.54 0.001 0.048
CELL_MOTILITY 1.51 <0.001 0.065
CELLULAR_RESPONSE_TO_CYTOKINE_STIMULUS 1.63 <0.001 0.014
CELLULAR_RESPONSE_TO_ENDOGENOUS_STIMULUS 1.44 <0.001 0.104
CELLULAR_RESPONSE_TO_EPIDERMAL_GROWTH
_FACTOR_STIMULUS		 1.67 <0.001 0.010
CELLULAR_RESPONSE_TO_EXTERNAL_STIMULUS 1.57 <0.001 0.036
CELLULAR_RESPONSE_TO_EXTRACELLULAR_STIMULUS 1.49 0.001 0.074
CHEMOKINE_MEDIATED_SIGNALING_PATHWAY 1.80 <0.001 <0.001
CYTOKINE_MEDIATED_SIGNALING_PATHWAY 1.63 <0.001 0.014
ENZYME_LINKED_RECEPTOR_PROTEIN_SIGNALING
_PATHWAY		 1.43 <0.001 0.109
EPIDERMAL_GROWTH_FACTOR_RECEPTOR_SIGNALING
_PATHWAY		 1.51 0.009 0.064
ERBB_SIGNALING_PATHWAY 1.39 0.035 0.139
NEGATIVE_REGULATION_OF_APOPTOTIC_SIGNALING
_PATHWAY		 1.50 0.001 0.066
NEGATIVE_REGULATION_OF_CELL_DEATH 1.66 <0.001 0.011
NEGATIVE_REGULATION_OF_INTRINSIC_APOPTOTIC
_SIGNALING_PATHWAY		 1.52 0.004 0.061
NEGATIVE_REGULATION_OF_INTRINSIC_APOPTOTIC
_SIGNALING_PATHWAY_IN_RESPONSE
_TO_DNA_DAMAGE		 1.69 0.001 0.007
NEGATIVE_REGULATION_OF_RELEASE_OF
_CYTOCHROME_C_FROM_MITOCHONDRIA		 1.43 0.041 0.110
NEGATIVE_REGULATION_OF_RESPONSE_TO
_DNA_DAMAGE_STIMULUS		 1.68 <0.001 0.007
POSITIVE_REGULATION_OF_BMP_SIGNALING_PATHWAY 1.67 <0.001 0.010
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_COMMUNICATION 1.44 <0.001 0.097
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_CYCLE 1.48 <0.001 0.079
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_CYCLE_G2_M_PHASE_TRANSITION 1.48 0.019 0.081
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_CYCLE_PROCESS 1.43 0.004 0.109
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_GROWTH 1.54 0.001 0.049
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_PROLIFERATION 1.75 <0.001 0.002
POSITIVE_REGULATION_OF_CHEMOTAXIS 1.83 <0.001 <0.001
POSITIVE_REGULATION_OF_EPITHELIAL_CELL
_MIGRATION		 1.79 <0.001 0.001
POSITIVE_REGULATION_OF_EPITHELIAL_CELL
_PROLIFERATION		 1.57 <0.001 0.035
POSITIVE_REGULATION_OF_EPITHELIAL_TO
_MESENCHYMAL_TRANSITION		 1.58 0.004 0.031
POSITIVE_REGULATION_OF_ERK1_AND_ERK2_CASCADE 1.81 <0.001 0.001
POSITIVE_REGULATION_OF_MITOTIC_CELL_CYCLE 1.55 0.002 0.048
POSITIVE_REGULATION_OF_NUCLEAR_DIVISION 1.37 0.046 0.158
POSITIVE_REGULATION_OF_PHOSPHATIDYLINOSITOL_3
_KINASE_SIGNALING		 1.42 0.025 0.113
POSITIVE_REGULATION_OF_PROTEIN_LOCALIZATION
_TO_NUCLEUS		 1.36 0.028 0.164
POSITIVE_REGULATION_OF_RESPONSE_TO_EXTERNAL
_STIMULUS		 1.64 <0.001 0.013
POSITIVE_REGULATION_OF_RESPONSE_TO_STIMULUS 1.47 <0.001 0.082
POSITIVE_REGULATION_OF_STAT_CASCADE 1.60 0.001 0.022
POSITIVE_REGULATION_OF_STEM_CELL
_DIFFERENTIATION		 1.61 0.001 0.020
POSITIVE_REGULATION_OF_STEM_CELL
_PROLIFERATION		 1.75 <0.001 0.002
PROTEIN_IMPORT_INTO_NUCLEUS_TRANSLOCATION 1.47 0.025 0.080
PROTEIN_KINASE_B_SIGNALING 1.59 0.002 0.026
PROTEIN_LOCALIZATION_TO_NUCLEUS 1.34 0.026 0.179
REGULATION_OF_ADHERENS_JUNCTION_ORGANIZATION 1.46 0.022 0.091
REGULATION_OF_CANONICAL_WNT_SIGNALING
_PATHWAY		 1.39 0.010 0.137
REGULATION_OF_CELL_ADHESION 1.54 <0.001 0.048
REGULATION_OF_CELL_CELL_ADHESION 1.51 <0.001 0.061
REGULATION_OF_CELL_CYCLE_G1_S_PHASE
_TRANSITION		 1.41 0.011 0.125
REGULATION_OF_CELL_CYCLE_PHASE_TRANSITION 1.27 0.029 0.241
REGULATION_OF_CELL_JUNCTION_ASSEMBLY 1.55 0.003 0.046
REGULATION_OF_CELL_MATRIX_ADHESION 1.74 <0.001 0.002
REGULATION_OF_CELL_SUBSTRATE_ADHESION 1.49 0.005 0.074
REGULATION_OF_CELLULAR_RESPONSE_TO
_GROWTH_FACTOR_STIMULUS		 1.34 0.015 0.179
REGULATION_OF_CHEMOTAXIS 1.78 <0.001 0.001
REGULATION_OF_EXTRINSIC_APOPTOTIC_SIGNALING
_PATHWAY		 1.44 0.008 0.100
REGULATION_OF_INTRACELLULAR_SIGNAL
_TRANSDUCTION		 1.41 <0.001 0.125
REGULATION_OF_MAP_KINASE_ACTIVITY 1.52 <0.001 0.061
REGULATION_OF_MAPK_CASCADE 1.64 <0.001 0.014
REGULATION_OF_NOTCH_SIGNALING_PATHWAY 1.41 0.034 0.127
REGULATION_OF_PHOSPHATIDYLINOSITOL_3_KINASE
_SIGNALING		 1.53 0.002 0.054
REGULATION_OF_RECEPTOR_BINDING 1.41 0.047 0.123
REGULATION_OF_RELEASE_OF_CYTOCHROME_C
_FROM_MITOCHONDRIA		 1.49 0.017 0.074
REGULATION_OF_STEM_CELL_DIFFERENTIATION 1.39 0.024 0.135
REGULATION_OF_STEM_CELL_PROLIFERATION 1.76 <0.001 0.002
REGULATION_OF_WNT_SIGNALING_PATHWAY 1.39 0.003 0.136
RESPONSE_TO_CYTOKINE 1.65 <0.001 0.012
분자 기능 CYTOKINE_ACTIVITY 1.91 <0.001 <0.001
GROWTH_FACTOR_BINDING 1.44 0.010 0.22
SW480 세포에서 유전자 온톨로지(GO, gene ontology) 유전자 세트에 대한 유전자 세트 농축 분석(GSEA) 결과
카테고리 유전자 세트 명칭 SW480
NES p-value FDR
q-value
생물학적
과정		 APOPTOTIC_MITOCHONDRIAL_CHANGES 1.53 0.012 0.073
CELL_CHEMOTAXIS 1.54 0.003 0.066
CELL_MOTILITY 1.56 <0.001 0.059
CELLULAR_RESPONSE_TO_CYTOKINE_STIMULUS 1.52 <0.001 0.079
CELLULAR_RESPONSE_TO_ENDOGENOUS_STIMULUS 1.50 <0.001 0.087
CELLULAR_RESPONSE_TO_EPIDERMAL_GROWTH
_FACTOR_STIMULUS		 1.67 0.001 0.016
CELLULAR_RESPONSE_TO_EXTERNAL_STIMULUS 1.55 <0.001 0.060
CELLULAR_RESPONSE_TO_EXTRACELLULAR_STIMULUS 1.50 0.003 0.087
CHEMOKINE_MEDIATED_SIGNALING_PATHWAY 1.60 0.003 0.041
CYTOKINE_MEDIATED_SIGNALING_PATHWAY 1.42 0.001 0.139
ENZYME_LINKED_RECEPTOR_PROTEIN_SIGNALING
_PATHWAY		 1.43 <0.001 0.133
EPIDERMAL_GROWTH_FACTOR_RECEPTOR_SIGNALING
_PATHWAY		 1.50 0.016 0.091
ERBB_SIGNALING_PATHWAY 1.45 0.029 0.118
NEGATIVE_REGULATION_OF_APOPTOTIC_SIGNALING
_PATHWAY		 1.74 <0.001 0.005
NEGATIVE_REGULATION_OF_CELL_DEATH 1.70 <0.001 0.009
NEGATIVE_REGULATION_OF_INTRINSIC_APOPTOTIC
_SIGNALING_PATHWAY		 1.79 <0.001 0.003
NEGATIVE_REGULATION_OF_INTRINSIC_APOPTOTIC
_SIGNALING_PATHWAY_IN_RESPONSE
_TO_DNA_DAMAGE		 1.66 0.001 0.020
NEGATIVE_REGULATION_OF_RELEASE_OF
_CYTOCHROME_C_FROM_MITOCHONDRIA		 1.43 0.048 0.133
NEGATIVE_REGULATION_OF_RESPONSE_TO
_DNA_DAMAGE_STIMULUS		 1.71 <0.001 0.008
POSITIVE_REGULATION_OF_BMP_SIGNALING_PATHWAY 1.44 0.046 0.129
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_COMMUNICATION 1.43 <0.001 0.136
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_CYCLE 1.71 <0.001 0.009
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_CYCLE_G2_M_PHASE_TRANSITION 1.56 0.005 0.059
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_CYCLE_PROCESS 1.70 <0.001 0.011
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_GROWTH 1.66 <0.001 0.020
POSITIVE_REGULATION_OF_CELL_PROLIFERATION 1.82 <0.001 0.001
POSITIVE_REGULATION_OF_CHEMOTAXIS 1.57 0.003 0.052
POSITIVE_REGULATION_OF_EPITHELIAL_CELL
_MIGRATION		 1.67 <0.001 0.015
POSITIVE_REGULATION_OF_EPITHELIAL_CELL
_PROLIFERATION		 1.73 <0.001 0.006
POSITIVE_REGULATION_OF_EPITHELIAL_TO
_MESENCHYMAL_TRANSITION		 1.80 <0.001 0.002
POSITIVE_REGULATION_OF_ERK1_AND_ERK2_CASCADE 1.40 0.019 0.155
POSITIVE_REGULATION_OF_MITOTIC_CELL_CYCLE 1.76 <0.001 0.004
POSITIVE_REGULATION_OF_NUCLEAR_DIVISION 1.62 0.002 0.031
POSITIVE_REGULATION_OF_PHOSPHATIDYLINOSITOL_3
_KINASE_SIGNALING		 1.41 0.041 0.148
POSITIVE_REGULATION_OF_PROTEIN_LOCALIZATION
_TO_NUCLEUS		 1.64 0.001 0.024
POSITIVE_REGULATION_OF_RESPONSE_TO_EXTERNAL
_STIMULUS		 1.50 0.001 0.088
POSITIVE_REGULATION_OF_RESPONSE_TO_STIMULUS 1.42 <0.001 0.141
POSITIVE_REGULATION_OF_STAT_CASCADE 1.67 <0.001 0.016
POSITIVE_REGULATION_OF_STEM_CELL
_DIFFERENTIATION		 1.79 <0.001 0.002
POSITIVE_REGULATION_OF_STEM_CELL
_PROLIFERATION		 1.66 0.001 0.019
PROTEIN_IMPORT_INTO_NUCLEUS_TRANSLOCATION 1.48 0.034 0.104
PROTEIN_KINASE_B_SIGNALING 1.50 0.021 0.093
PROTEIN_LOCALIZATION_TO_NUCLEUS 1.57 0.002 0.054
REGULATION_OF_ADHERENS_JUNCTION_ORGANIZATION 1.62 0.002 0.033
REGULATION_OF_CANONICAL_WNT_SIGNALING
_PATHWAY		 1.44 0.006 0.130
REGULATION_OF_CELL_ADHESION 1.53 <0.001 0.075
REGULATION_OF_CELL_CELL_ADHESION 1.40 0.002 0.152
REGULATION_OF_CELL_CYCLE_G1_S_PHASE
_TRANSITION		 1.64 <0.001 0.024
REGULATION_OF_CELL_CYCLE_PHASE_TRANSITION 1.43 0.004 0.132
REGULATION_OF_CELL_JUNCTION_ASSEMBLY 1.64 0.001 0.025
REGULATION_OF_CELL_MATRIX_ADHESION 1.69 <0.001 0.013
REGULATION_OF_CELL_SUBSTRATE_ADHESION 1.55 0.002 0.062
REGULATION_OF_CELLULAR_RESPONSE_TO
_GROWTH_FACTOR_STIMULUS		 1.60 0.001 0.041
REGULATION_OF_CHEMOTAXIS 1.47 0.006 0.108
REGULATION_OF_EXTRINSIC_APOPTOTIC_SIGNALING
_PATHWAY		 1.66 <0.001 0.020
REGULATION_OF_INTRACELLULAR_SIGNAL
_TRANSDUCTION		 1.48 <0.001 0.100
REGULATION_OF_MAP_KINASE_ACTIVITY 1.49 0.001 0.098
REGULATION_OF_MAPK_CASCADE 1.49 <0.001 0.097
REGULATION_OF_NOTCH_SIGNALING_PATHWAY 1.39 0.048 0.163
REGULATION_OF_PHOSPHATIDYLINOSITOL_3_KINASE
_SIGNALING		 1.58 0.001 0.048
REGULATION_OF_RECEPTOR_BINDING 1.54 0.007 0.069
REGULATION_OF_RELEASE_OF_CYTOCHROME_C
_FROM_MITOCHONDRIA		 1.52 0.014 0.082
REGULATION_OF_STEM_CELL_DIFFERENTIATION 1.82 <0.001 0.001
REGULATION_OF_STEM_CELL_PROLIFERATION 1.65 0.001 0.021
REGULATION_OF_WNT_SIGNALING_PATHWAY 1.37 0.012 0.178
RESPONSE_TO_CYTOKINE 1.62 <0.001 0.029
분자 기능 CYTOKINE_ACTIVITY 1.63 <0.001 0.22
GROWTH_FACTOR_BINDING 1.60 <0.001 0.23
특히, GSEA 결과는 노화 관련 CM-BEZ 처리에 의해 크게 영향을 받는 몇 가지 경로를 추가로 나타내었다(표 13 및 14 참조).
HCT116 세포에서 KEGG, BioCarta 및 Reactome 경로 데이터베이스로부터 선별된 유전자 세트에 대한 GSEA 결과
카테고리 유전자 세트 명칭 HCT116
NES p-value FDR
q-value
KEGG ADHERENS_JUNCTION 1.54 0.005 0.069
ADIPOCYTOKINE_SIGNALING_PATHWAY 1.41 0.029 0.134
CELL_CYCLE 1.37 0.027 0.181
CHEMOKINE_SIGNALING_PATHWAY 1.57 0.001 0.045
COLORECTAL_CANCER 1.48 0.015 0.088
CYTOKINE_CYTOKINE_RECEPTOR_INTERACTION 1.78 <0.001 0.001
FOCAL_ADHESION 1.44 0.004 0.115
HEDGEHOG_SIGNALING_PATHWAY 1.40 0.037 0.140
INTESTINAL_IMMUNE_NETWORK
_FOR_IGA_PRODUCTION		 1.45 0.025 0.107
JAK_STAT_SIGNALING_PATHWAY 1.64 <0.001 0.020
NEUROTROPHIN_SIGNALING_PATHWAY 1.50 0.002 0.100
NOTCH_SIGNALING_PATHWAY 1.43 0.036 0.114
PATHWAYS_IN_CANCER 1.65 <0.001 0.014
TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY 1.39 0.031 0.147
VEGF_SIGNALING_PATHWAY 1.44 0.022 0.115
Biocarta ALK_PATHWAY 1.40 0.048 0.207
BAD_PATHWAY 1.59 0.002 0.075
ERK_PATHWAY 1.60 0.002 0.108
G1_PATHWAY 1.48 0.020 0.137
GLEEVEC_PATHWAY 1.47 0.021 0.137
HIF_PATHWAY 1.50 0.012 0.135
IGF1R_PATHWAY 1.46 0.029 0.142
IL2RB_PATHWAY 1.47 0.021 0.137
P38MAPK_PATHWAY 1.47 0.021 0.157
P53_PATHWAY 1.53 0.008 0.098
RACCYCD_PATHWAY 1.50 0.015 0.135
TEL_PATHWAY 1.58 0.002 0.058
Reactome SIGNALING_BY_TGF_BETA_RECEPTOR_COMPLEX 1.56 0.006 0.173
SMAD2_SMAD3_SMAD4_HETEROTRIMER_REGULATES
_TRANSCRIPTION		 1.56 0.006 0.185
TRANSCRIPTIONAL_ACTIVITY_OF_SMAD2_SMAD3
_SMAD4_HETEROTRIMER		 1.53 0.009 0.194
SW480 세포에서 KEGG, BioCarta 및 Reactome 경로 데이터베이스로부터 선별된 유전자 세트에 대한 GSEA 결과
카테고리 유전자 세트 명칭 SW480
NES p-value FDR
q-value
KEGG ADHERENS_JUNCTION 1.60 0.003 0.033
ADIPOCYTOKINE_SIGNALING_PATHWAY 1.48 0.015 0.119
CELL_CYCLE 1.39 0.032 0.183
CHEMOKINE_SIGNALING_PATHWAY 1.38 0.018 0.179
COLORECTAL_CANCER 1.71 0.001 0.006
CYTOKINE_CYTOKINE_RECEPTOR_INTERACTION 1.60 <0.001 0.033
FOCAL_ADHESION 1.33 0.034 0.232
HEDGEHOG_SIGNALING_PATHWAY 1.40 0.047 0.184
INTESTINAL_IMMUNE_NETWORK
_FOR_IGA_PRODUCTION		 1.46 0.027 0.123
JAK_STAT_SIGNALING_PATHWAY 1.64 0.001 0.019
NEUROTROPHIN_SIGNALING_PATHWAY 1.36 0.033 0.207
NOTCH_SIGNALING_PATHWAY 1.51 0.017 0.088
PATHWAYS_IN_CANCER 1.84 <0.001 <0.001
TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY 1.39 0.045 0.183
VEGF_SIGNALING_PATHWAY 1.47 0.024 0.122
Biocarta ALK_PATHWAY 1.60 0.002 0.035
BAD_PATHWAY 1.69 <0.001 0.018
ERK_PATHWAY 1.58 0.006 0.048
G1_PATHWAY 1.57 0.007 0.049
GLEEVEC_PATHWAY 1.54 0.013 0.067
HIF_PATHWAY 1.46 0.029 0.148
IGF1R_PATHWAY 1.52 0.016 0.087
IL2RB_PATHWAY 1.66 0.002 0.021
P38MAPK_PATHWAY 1.61 0.002 0.031
P53_PATHWAY 1.65 0.001 0.020
RACCYCD_PATHWAY 1.55 0.012 0.064
TEL_PATHWAY 1.67 <0.001 0.024
Reactome SIGNALING_BY_TGF_BETA_RECEPTOR_COMPLEX 1.56 0.006 0.196
SMAD2_SMAD3_SMAD4_HETEROTRIMER_REGULATES
_TRANSCRIPTION		 1.61 0.003 0.161
TRANSCRIPTIONAL_ACTIVITY_OF_SMAD2_SMAD3
_SMAD4_HETEROTRIMER		 1.64 0.002 0.111
상기 결과는 PI3K/mTOR 억제-유도된 SAS가 CRC에서 세포 증식(cell proliferation), 성장(growth), 생존(survival) 및 이동(migration)을 포함하여 암 생물학의 주요 측면에 관련된 유전자의 발현을 활성화시킨다는 것을 시사한다.
실시예 6: PI3K/mTOR 억제에 의한 대장암 세포에서 전구-종양형성 활성
본 발명자들은 PI3K/mTOR 억제-유도된 SAS가 전구-종양형성(pro-tumorigenic) 특성을 나타내는지를 조사하기 위해, 우리는 CM-BEZ로 처리된 CRC 세포의 세포 행동을 모니터링하였다. 그 결과, BEZ235가 없거나 존재할 때 DMSO 또는 CM-DMSO로 처리한 세포와 비교할 때 세포 증식이 CM-BEZ로 처리된 세포에서 증가한다는 것을 확인하였다(도 9a). 세포주기(cell cycle) 분석은 CM-BEZ가 세포주기의 G2/M 단계에서 세포의 축적(accumulation)을 촉진하여 CM-BEZ가 CRC 세포의 증식 능력을 향상 시킨다는 것을 확인하였다(도 9b). 또한, CM-BEZ의 처리는 RNA-서열분석 결과와 일치하여 CRC 세포의 이동과 침입을 자극하였다(도 9c 내지 f, 표 11 및 12 참조). 상기 결과는 PI3K/mTOR 억제-유도된 세포 노화가 CRC 세포에서 종양 미세환경(tumor microenvironment)을 조절함으로써 전구 종양 형성 활성을 발휘한다는 것을 시사한다.
실시예 6: PI3K/mTOR 및 BET의 복합 억제에 의한 아폽토시스 유도
PI3K/mTOR 억제에 의해 유도된 노화 CRC 세포가 암의 진행을 촉진시킬 수 있는 전구-종양 형성인자(pro-tumorigenic factors)를 분비하는 능력을 보유한다는 관찰은 아폽토시스를 효과적으로 유도하여 내구성 있는 항-종양 효과를 생성할 수 있는 치료 전략을 연구하기 위한 필요성을 강조한다. PI3K/mTOR 억제에 대한 저항성에 기여하는 다중 발암성 키나아제(oncogenic kinases)의 활성을 억제 할 수 있는 단일 약물이 없으므로, 본 발명자들은 많은 신호 전달 키나아제의 공통 상류 조절인자(upstream regulators)인 전사 활성화된 RTK(예: IGF1R 및 EGFR)를 표적으로 삼는다는 가설을 세우는 것이 저항을 극복하는데 효과적이라고 생각하였다. 그러나 다양한 전사인자(TF)는 RTK의 프로모터에 결합하여 이들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있지만 TFs의 전사활성을 효과적으로 차단할 수 있는 단일 화학제제는 개발되지 않았다. 따라서 본 발명자들은 전사 수준(transcription level)에서 내성 세포 반응을 효과적으로 방지하기 위해 염색질을 변형 시키거나 연관시키는 단백질인 후성학적 인자(epigenetic factors)를 표적으로 하고 다양한 유전자의 발현을 조절하기로 결정하였다. 이를 위해 다양한 후성적 조절제(epigenetic modulators)의 다양한 저해제를 시험하였고, CRC 세포에서 PI3K/mTOR 차단에 대한 저항성을 효과적으로 억제할 수 있는 제제로 BET 계열 bromodomains(Stratikopoulos EE et al., Cancer Cell. 27(6):837-51. 2015; Delmore JE et al., Cell. 146(6):904-17. 2011)의 억제제인 JQ1을 동정하였다(표 15 및 16 참조). 또한, BEZ235와 JQ1의 병용 처리는 약물 단독 투여에 비해 세포 성장을 현저하게 억제하였고 아폽토시스를 증가시켰다(도 10a와 10b 및 표 15 및 16 참조).
대장암 세포에서 세포 반응에 대한 PI3K/mTOR 억제제와 후성적 조절제의 다양한 억제제의 병용 효과
약물 처리 세포 성장억제(%)
HCT116 SW480 SW620 LS180 HT29 Caco2
BEZ235 33.38 38.92 43.62 48.93 54.82 57.39 PI3K/mTOR 이중 저해제
JQ1 28.01 25.72 29.86 31.56 24.62 29.28 BET 저해제
BEZ+JQ1 94.18 88.52 87.82 89.44 94.12 86.02
Azacitidine 26.58 21.64 21.52 22.81 23.52 22.49 DNA 메틸기 전이효소 저해제
BEZ + Azacitidine 53.73 52.02 63.10 62.46 69.90 67.47
Anacardic acid 25.15 23.12 20.98 18.66 19.97 24.42 히스톤 아세틸기 전이효소 저해제
BEZ + Anacardic acid 49.64 56.82 66.37 65.21 73.13 70.21
Vorinostat 25.85 22.24 27.10 15.78 20.36 23.27 HDAC 저해제
BEZ + Vorinostat 56.56 45.72 59.03 66.52 76.73 74.15
Pinometostat 24.29 22.81 25.45 17.22 20.79 25.70 히스톤 아세틸기 전이효소 저해제
BEZ + Pinometostat 50.72 50.86 65.16 59.56 62.36 75.95
UNC669 29.62 19.42 24.62 20.55 22.31 32.52 메틸기 판독자 저해제
BEZ + UNC669 46.07 59.42 57.96 60.29 64.55 65.91
GSK2879552 28.58 20.68 22.49 21.87 24.23 34.94 히스톤 탈메틸효소 저해제
BEZ + GSK2879552 52.56 61.21 54.83 56.58 67.74 72.10
대장암 세포에서 세포 반응에 대한 PI3K/mTOR 억제제와 후성적 조절제의 다양한 억제제의 병용 효과
약물 처리 증가된 아폽토시스(%)
HCT116 SW480 SW620 LS180 HT29 Caco2
BEZ235 33.38 38.92 43.62 48.93 54.82 57.39 PI3K/mTOR 이중 저해제
BEZ235 12.08 14.46 16.21 11.52 15.16 13.29 PI3K/mTOR 이중 저해제
JQ1 29.77 21.35 18.45 27.33 21.27 23.48 BET 저해제
BEZ+JQ1 1472.66 1246.86 1218.46 1183.74 1560.18 1046.69
Azacitidine 44.21 64.58 52.40 20.43 62.25 54.54 DNA 메틸기 전이효소 저해제
BEZ + Azacitidine 399.93 283.64 431.23 389.54 477.72 501.54
Anacardic acid 56.20 41.25 24.05 19.24 70.76 73.19 히스톤 아세틸기 전이효소 저해제
BEZ + Anacardic acid 298.74 376.13 477.05 352.38 646.68 597.17
Vorinostat 28.92 19.79 45.74 16.39 33.75 67.85 HDAC 저해제
BEZ + Vorinostat 456.48 203.81 302.71 415.43 567.62 638.84
Pinometostat 89.57 53.73 32.43 22.94 73.39 39.25 히스톤 메틸기 전이효소 저해제
BEZ + Pinometostat 277.17 272.27 499.16 368.49 478.39 566.19
UNC669 72.78 40.94 21.64 17.99 26.24 16.09 메틸기 판독자 저해제
BEZ + UNC669 250.82 322.84 335.67 327.06 353.11 459.28
GSK2879552 101.15 26.71 27.08 23.95 40.19 34.46 히스톤 탈메틸효소 저해제
BEZ + GSK2879552 325.39 463.56 356.84 298.15 504.12 603.54
또한, CRC 세포에서 PI3K/mTOR와 BET의 결합된 억제의 분자 메카니즘을 탐색하기 위해, 본 발명자들은 약물 치료에 대한 주요 저항 중재 인자(key resistance-mediating factors)의 활성을 모니터링 하였다. 그 결과, JQ1에 의한 세포의 처리는 BEZ235에 의해 유발된 CRC 세포에서의 EGFR, IGF1R, FAK 및 ERK를 포함하는 다중 전구-생존 단백질(multiple pro-survival proteins)의 활성화를 억제하였다(도 10c 및 10d). JQ1은 BEZ235 처리 후 증가된 EGFR과 IGF1R의 총 발현 수준을 감소시켰고(도 10c 및 10d) IL-8과 MIF의 분비도 증가시켰다(도 10e). 이는 RTK와 사이토카인의 상향 조절이 BET-의존적임을 시사한다.
또한, BET 저해가 PI3K/mTOR 차단에 대한 내성을 유도하는 전사 프로그램을 어떻게 조절하는지를 더 연구하기 위해, 주로 약물 내성과 관련된 주요 단백질의 조절 기전을 연구하였다. 그 결과, JQ1 처리는 BEZ235에 의해 유도된 RTK 및 심지어 CRC 세포에서의 사이토카인의 mRNA 수준의 상향 조절을 억제한다는 것을 관찰하였고 이는 BET 계열 단백질을 표적으로 하는 것이 RTK 및 노화-관련된 사이토 카인의 전사적 활성을 방해함을 시사한다(도 10f).
한편, 다양한 키나아제 특이적 억제제의 조합 처리는 PI3K/mTOR 경로 억제제에 대한 내성을 약화시키는 것으로 나타났다. PI3K/mTOR와 BET의 복합적 억제 효과를 다른 키나아제 특이적 복합 치료와 비교하기 위해 본 발명자들은 CRC 세포를 BET, EGFR, IGF1R, FAK, p38 또는 ERK에 대해 BEZ235 및 키나아제 특이적 억제제로 처리하였다. 그 결과, BEZ235와 JQ1의 병용치료는 CRC 세포에서 다른 억제제 나 다른 억제제 조합보다 세포 사멸을 강력하게 억제하면서 세포 성장을 강력하게 억제했다. BEZ235, OSI-906(IGF1R 억제제), 및 라파티닙(EGFR 억제제)의 3가지 약물 처리는 세포 성장을 더욱 효율적으로 억제하고 아폽토시스를 증가시켰지만 이중 BEZ235/JQ1 치료보다 적게 나타났으며, 이는 BET 억제제가 RTK 뿐만 아니라 CRC 세포에서 PI3K/mTOR 억제에 대한 저항성에 기여할 수 있는 추가 유전자 또는 단백질의 활성화를 억제한다는 것을 시사한다(표 17 및 18). BEZ235 및 BIRB796과의 조합처리는 BEZ235- 유도된 성장 억제를 감소 시켰지만, 아폽토시스를 증가시켰음으로 이는 CRC 세포가 증가된 증식에 대한 TIS의 억제로부터 이익을 얻을 수 있지만, 동시에 전구 생존 SAS의 감소로 인해 생존 능력을 잃어버릴 수 있음을 시사한다.
PI3K/mTOR 억제제와 다양한 키나아제 특이적 억제제의 복합 치료가 대장암 세포의 세포 반응에 미치는 영향
약물 처리 세포 성장억제(%)
HCT116 SW480 SW620 LS180 HT29 Caco2
BEZ235 34.53 39.69 43.23 46.61 53.43 57.39 PI3K/mTOR 이중 저해제
JQ1 29.75 27.55 28.72 33.57 26.01 30.40 BET 저해제
BEZ+JQ1 94.42 89.04 87.16 88.84 95.64 87.97
Lapatinib 21.17 23.45 22.95 29.49 21.78 22.17 EGFR/HER2 저해제
BEZ + Lapatinib 62.39 67.77 64.30 66.75 63.78 63.95
OSI-906 22.72 27.82 23.88 22.52 24.52 31.70 IGF1R 저해제
BEZ + OSI-906 66.05 62.24 67.57 65.44 61.75 70.53
PND-1186 22.95 22.60 31.26 25.95 22.99 25.28 FAK 저해제
BEZ + PND 63.89 68.33 70.81 68.77 73.63 76.76
BIRB796 0.34 0.81 0.46 0.13 0.92 0.67 Pan-p38 저해제
BEZ + BIRB 22.18 28.84 35.10 37.78 44.90 47.93
U0126 23.61 21.48 26.53 22.93 23.40 24.06 MEK 저해제
BEZ + U0126 67.75 65.84 68.92 60.64 72.97 73.84
Lapatinib + OSI-906 26.45 30.65 24.74 33.63 25.14 41.61
BEZ + Lapatinib + OSI-906 82.31 77.94 79.03 80.04 85.66 81.03
PI3K/mTOR 억제제와 다양한 키나아제 특이적 억제제의 복합 치료가 대장암 세포의 세포 반응에 미치는 영향
약물 처리 증가된 아폽토시스(%)
HCT116 SW480 SW620 LS180 HT29 Caco2
BEZ235 13.39 15.45 14.47 12.44 13.13 15.27 PI3K/mTOR 이중 저해제
JQ1 28.74 25.17 20.29 33.17 27.51 31.53 BET 저해제
BEZ + JQ1 1531.71 1278.58 1176.34 1210.01 1623.06 1038.76
Lapatinib 38.71 50.79 47.23 39.96 46.11 51.38 EGFR/HER2 저해제
BEZ + Lapatinib 365.92 394.46 304.23 443.73 421.97 436.47
OSI-906 44.20 40.22 30.08 47.93 37.40 42.26 IGF1R 저해제
BEZ + OSI-906 396.91 348.70 439.21 378.76 470.04 452.04
PND-1186 25.97 28.16 35.45 50.42 44.62 59.52 FAK 저해제
BEZ + PND 324.73 439.66 462.92 449.35 588.71 521.45
BIRB796 12.78 16.71 11.65 10.22 13.16 12.65 Pan-p38 저해제
BEZ + BIRB 235.63 242.11 222.49 208.12 180.13 162.05
U0126 39.67 27.31 42.02 54.30 51.01 45.03 MEK 저해제
BEZ + U0126 377.44 359.92 386.22 343.04 502.45 538.70
Lapatinib + OSI-906 144.45 131.86 103.56 195.14 124.88 165.88
BEZ + Lapatinib + OSI-906 897.35 966.31 779.93 1002.34 913.42 927.83
한편, 노화 세포는 성장 억제 상태로 남아 있지만, 세포 사멸에 매우 강한 것으로 알려져 있다(Perez-Mancera PA et al., Nat Rev Cancer. 14(8):547-58. 2014). 추가 약물 투여의시기가 조합 약물 요법의 효능을 결정하는 중요한 요소이기 때문에 본 발명자들은 세포를 BEZ235와 JQ1로 동시 또는 순차적으로 처리하고 세포 반응을 관찰했다. 그 결과, BEZ235 및 JQ1을 7일간 동시에 처리하는 것이 BEZ235를 7일 동안 연속 투여하는 것보다 세포 사멸을 유발하는데 더 효과적이었고 이어서 CRC 세포에서 추가로 7일 동안 추가적으로 JQ1을 투여하였다. 이는 항암 효과를 높이기 위해 세포가 노화되기 전에 병용 요법을 사용해야 함을 시사한다(표 19).
대장암 세포에서 PI3K/mTOR 및 BET의 동시 또는 순차적 억제가 아폽토시스 유도에 미치는 영향
세포주 증가된 아폽토시스(%)
BEZ235와 JQ1의 동시 처리 BEZ235를 7일 동안 순차적으로 처리한 다음 추가로 7일-JQ1 투여
HCT116 1571.46 487.83
SW480 1215.74 414.92
SW620 1202.66 647.26
LS180 1247.15 723.02
HT29 1604.57 717.54
Caco2 1043.83 876.61
상기 결과는 BET를 표적으로 삼는 것은 PI3K/mTOR 억제에 의해 유도된 RTK 및 그의 다운스트림 종양 신호 전달 키나아제의 피드백 활성화를 감소시키고 PI3K/mTOR 및 BET의 조합된 억제는 CRC에서 세포 성장 및 전구-종양 형성 SAS를 억제하면서 아폽토시스를 효과적으로 유발하는 것을 의미한다.
실시예 7: BET 억제에 의한 다중 저항 매개 유전자의 조절 영역에 BRD4를 모집의 차단
BET 억제제는 다른 bromodomain 포함 서브 패밀리(subfamilies)에 비해 BET 계열 단백질(BRD2, BRD3, BRD4 및 BRDT)에 대한 높은 특이성을 나타내며 히스톤에서 아세틸화된 라이신 잔기(acetylated lysine residues)와의 결합을 억제한다. CRC 세포의 BET 저해를 결정짓는 분자 메카니즘을 더 연구하기 위해 다양한 종류의 암의 병인에 핵심 역할을 하는 BET 단백질 계열의 일원인 BRD4의 결합에 대한 염색질 면역 침전 시퀀싱(ChIP-seq) 분석을 수행하였다. 상기 분석은 공개적으로 이용 가능한 데이터를 사용하여 수많은 유전자의 추정된 영역에서 주목할 만한 치료 표적으로 간주되었다. RD4와 H3K27ac의 풍부한 축적(enriched occupancy)은 HCT116과 SW480 세포에서 EGFR, IGF1R 및 MIF의 전사 시작 부위(TSS)의 상류 조절 영역에서 관찰되었으며, 이는 상기 유전자가 BRD4의 직접적인 표적일 수 있음을 시사한다(도 11a). 또한, IL-8 유전자에서 BRD4 및 H3K27ac가 풍부한 영역은 관찰되지 않았다(도 11a) 이는 IL-8 활성이 BRD4에 의해 간접적으로 조절되고, BET 억제가 부분적으로 ERK 억제를 통해 IL-8 활성화를 억제할 수 있음을 시사한다(도 10c).
또한, 본 발명자들은 EGFR, IGF1R 및 MIF가 CRC 세포에서 BRD4에 의해 직접 조절되는지를 확인하기 위해, CRC 세포주에서 ChIP-qPCR 실험을 수행하였다. 상기 부위(부위 A)에 결합하는 BRD4를 검출하기 위해 ChIP-qPCR 실험을 위해 BRD4 점유가 풍부한 EGFR, IGF1R 및 MIF의 TSS 영역의 상류에 대한 프라이머를 사용하였다.그 결과, HCT116 및 SW480 세포의 A 부위에서 BRD4 점유가 IgG 대조군보다 높다는 것을 관찰했지만, ChIP-서열 분석 결과 BRD4 결합이 없는 영역(부위 B)에서는 농축이 관찰되지 않았다. 또한, CRC 세포를 JQ1로 처리하면 BRD4가 유전자의 조절 영역에 결합하는 것이 효과적으로 방지되었다(도 11b).
한편, BET 저해가 다양한 유전자의 전사 활성화를 감소시키는 것으로 알려져 있기 때문에 BET 저해가 CRC 세포에서 BEZ235 처리에 의해 상향조절되는 다른 저항 매개 유전자의 발현을 조절할 수 있는지 더 연구하였다(도 4b). 그 결과, JQ1 처리가 CD44 및 HES1의 mRNA 수준의 BEZ235-유도된 상향 조절을 억제한다는 것을 관찰하였다(도 11c). 또한, BRD4 및 H3K27ac의 풍부한 농축(Enriched occupancy)은 HCT116 및 SW480 세포에서 상기 유전자(부위 A)의 TSS 상류의 별개의 조절 영역에서도 관찰되었으며, BRD4의 직접 표적으로서의 유전자의 가능성을 더욱 시사한다(도 11d). 또한, 예상대로, BRD4의 점유율은 A 부위의 대조군에 비해 증가했지만 JQ1은 BRD4를 유전자의 TSS와 효과적으로 분리시켰다. BRD4 결합이 존재하지 않는 지역(부위 B)에서는 농축이 관찰되지 않았다(도 11e). 상기 결과는 RTKs와 사이토카인을 포함한 다양한 저항 매개 유전자(resistance-mediating genes)가 CRC 세포에서 BRD4에 의해 직접적으로 조절되며 BET 억제는 BRD4를 상기 유전자의 조절 영역으로부터 대체시킴으로써 PI3K/mTOR 억제에 의해 유도되는 보상 생존 촉진 메카니즘(compensatory survival-promoting mechanisms)을 억제할 수 있음을 시사한다.
실시예 8: 생체 내( in vivo ) PI3K/mTOR 및 BET의 조합 처리 효과
본 발명자들은 PI3K/mTOR 및 BET의 조합 저해가 생체 내에서 강력한 항-종양 활성을 나타내는지를 조사하기 위해, CRC 세포로 이식된(engrafted) 동물에서 BEZ235 및/또는 JQ1의 처리효과를 평가하였다. 이를 위해 HCT116 및 SW480 세포를 누드 마우스의 후면에 피하 주사하여 100 mm3(HCT116) 및 250 mm3(SW480)의 평균 크기로 성장시켰다. 그 후, 매일 25 mg/kg/day의 BEZ235 및/또는 50 mg/kg/day의 JQ1으로 상기 마우스를 처리하였다. 그 결과, 상기 마우스 체중의 유의한 감소는 관찰되지 않았으므로 실험동물은 상기 약물 조합의 처리를 견딜 수 있음을 시사한다 (도 12a). 또한, BEZ235와 JQ1을 병용처리하면 이종 이식 마우스에서 종양의 성장이 현저히 억제되어 PI3K/mTOR 및 BET의 복합적 억제가 CRC 치료에 효과적인 치료 전략이 될 수 있음을 시사한다(도 12b 및 12c).
결론적으로, 시스템생물학 접근을 통하여 이중 PI3K/mTOR 저해제와 후성유전학적 약물인 BET 단백질 저해제(BET protein inhibitor)를 조합 처리하는 경우 암세포의 성장이 효과적으로 억제되는 동시에 사멸이 강하게 유발되며, 더욱이 암촉진성 사이토카인과 성장인자들의 분비 역시 효과적으로 저해되는 것을 관찰하였고 상기 약물조합의 효능은 종양 이식 마우스모델에서도 재확인되었다. 따라서 상기 결과는 PI3K/mTOR 저해제와 BET 단백질 저해제의 약물조합이 효과적인 대장암 치료 전략으로 활용될 수 있음을 시사한다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> An anticancer agent for treating cancers resistant to PI3K/mTOR inhibitor <130> PD17-5603 <150> KR 10-2017-0157527 <151> 2017-11-23 <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR F <400> 1 agctatgaga tggaggaaga cg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR R <400> 2 ggatccagag gaggagtatg tg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1R F <400> 3 aaccccaaga ctgaggtgtg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1R R <400> 4 tgacatctct ccgcttcctt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 F <400> 5 gtgcagtttt gccaaggagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 R <400> 6 ctctgcaccc agttttcctt 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIF F <400> 7 acagcatcgg caagatcgg 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIF R <400> 8 ctcttaggcg aaggtggagt 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 F <400> 9 ctgccgcttt gcaggtgta 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 R <400> 10 cattgtgggc aaggtgctat t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD133 F <400> 11 agtcggaaac tggcagatag c 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD133 R <400> 12 ggtagtgttg tactgggcca at 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS1 F <400> 13 ttggtatcta ccgcctttgc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS1 R <400> 14 agagtcatcc acctgcatcc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HES1 F <400> 15 cggacattct ggaaatgaca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HES1 R <400> 16 cattgatctg ggtcatgcag 20 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F <400> 17 tgatgacatc aagaaggtgg tgaag 25 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R <400> 18 tccttggagg ccatgtgggc cat 23 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR (A) F <400> 19 gaaccgctcc caactttctt c 21 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR (A) R <400> 20 caccagcacc cggctt 16 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR (B) F <400> 21 ggaacacctc ctcaggacta tc 22 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR (B) R <400> 22 gaatcctggg tcatcttctc tct 23 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1R (A) F <400> 23 cagcctggcg tgaaagtg 18 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1R (A) R <400> 24 cgtactggaa agcccgaac 19 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1R (B) F <400> 25 ctgcatgtac ttccatccat tgac 24 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1R (B) R <400> 26 gtcctatgct aaccaggagg taa 23 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIF (A) F <400> 27 gggactggag cccttgag 18 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIF (A) R <400> 28 tgaagcccag ttcattccac t 21 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIF (B) F <400> 29 cgcagaaccg ctcctacag 19 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIF (B) R <400> 30 ggccgcgttc atgtcgtaat 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 (A) F <400> 31 gctgtctgcg aagtgcattg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 (A) R <400> 32 tggtgcttcc acagacacat 20 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 (B) F <400> 33 ccagcctgcc ctctctttc 19 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 (B) R <400> 34 tgagcacaca gcaatcacac 20 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HES1 (A) F <400> 35 cgccgcagaa cctaaagc 18 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HES1 (A) R <400> 36 gggcaatgac tcagggact 19 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HES1 (B) F <400> 37 gctggagagg cggctaag 18 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HES1 (B) R <400> 38 ggaaagcaaa ctggccatcg 20

Claims (23)

  1. ⅰ) BET 저해제 및 PI3K/mTOR 저해제; 또는
    ⅱ) 상기 BET 저해제가 상기 PI3K/mTOR 저해제에 공유결합된 약물 연결체를 유효성분으로 포함하는 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저해제 대한 저항성 대장암의 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 BET 특이적인 저해제는 BET 활성 억제제 또는 BET 발현 억제제인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 BET 활성 억제제는 BET 길항 항체 또는 그의 기능성 단편, BET에 특이적으로 결합하는 항체 유사체, 갈레인(gallein) 또는 GRK2i인, 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항체 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, Fv, sdAb, diabody 또는 triabody인, 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 항체 유사체는 Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, nanobody, VLR 또는 VHH인, 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 BET 발현 억제제는 BET 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로 RNA인, 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 PI3K/mTOR 저해제는 PI3K/mTOR 저해 화합물, PI3K/mTOR 길항항체 또는 그의 항체 기능성 단편 또는 PI3K/mTOR에 특이적으로 결합하는 항체 유사체인, 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 PI3K/mTOR 저해 화합물은 NVP-BEZ235, PI-103, PTEN, GSK3B, 또는 HB9인, 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 항체 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, Fv, sdAb, diabody 또는 triabody인, 약학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 항체 유사체는 Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, nanobody, VLR 또는 VHH인, 약학적 조성물.
  14. 약학적으로 유효한 양의 ⅰ) BET 저해제 및 PI3K/mTOR 저해제; 또는 ⅱ) 상기 BET 저해제가 상기 PI3K/mTOR 저해제에 공유결합된 약물 연결체를 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 대장암에 걸린 인간을 제외한 포유동물 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 암 치료방법.
  15. 피검 화합물 또는 천연물을 BET와 반응시키는 단계; 및
    BET와 특이적으로 결합하는 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는, KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 대장암 치료제 후보물질의 선별방법..
  16. BET를 발현하는 단리된 세포에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및
    아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 BET의 발현을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 대장암 치료제 후보물질의 선별방법.
  17. BET 및 상기 BET와 상호작용하는 짝단백질을 포함하는 조성물에 피검 화합물 또는 천연물을 처리하는 단계; 및
    아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 BET 및 상기 짝단백질의 상호작용을 유의하게 억제한 피검 화합물 또는 천연물을 선별하는 단계를 포함하는 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 대장암 치료제 후보물질의 선별방법.
  18. 대장암환자로부터 수득한 조직 시료 또는 체액 시료로부터 BET의 발현정도 및 KRAS 유전자의 돌연변이 여부를 측정하는 단계;
    상기 BET의 발현수준이 정상수준보다 높게 나타나고 상기 KRAS 유전자가 돌연변이된 대장암환자를 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성을 갖는 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 대장암 환자의 PI3K/mTOR 저항성 예측방법.
  19. 대장암에 걸린 인간을 제외한 포유동물 개체로부터 수득한 조직 시료 또는 체액 시료로부터 BET의 발현정도 및 KRAS 유전자의 돌연변이 여부를 측정하는 단계;
    상기 BET의 발현수준이 정상수준보다 높게 발현되고 상기 KRAS 유전자가 돌연변이된 개체를 선별하는 단계; 및
    BET의 발현수준이 높고 KRAS 유전자의 돌연변이가 발생한 것으로 선별된 개체에 대하여 PI3K/mTOR 저해제 및 BET 저해제를 동시에 투여하는 단계를 포함하는, KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저항성 암의 치료방법.
  20. 피검 화합물을 각각 BET 및 PI3K/mTOR과 반응시키는 단계; 및
    상기 BET 및 PI3K/mTOR의 활성 부위(active site) 모두에 결합하는 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저해제 저항성 대장암에 대한 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 피검 화합물은 구조기반 의약설계(structure-based drug design)에 의해 설계된 것인, KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저해제 저항성 암에 대한 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    BET를 과발현하고 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저항성 대장암세포에 상기 선별된 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
    PI3K/mTOR 저항성 대장암세포의 성장을 억제하는 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 단계를 추가로 포함하는, KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저해제 저항성 대장암에 대한 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  23. BET 및 PI3K/mTOR을 발현하고 KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 단리된 세포에 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
    아무 것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 BET 및 PI3K/mTOR의 발현을 동시에 억제하거나 그의 활성을 동시에 억제한 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, KRAS 유전자에 돌연변이가 일어난 PI3K/mTOR 저해제에 대한 저항성 대장암 치료제 후보물질의 선별방법.
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