WO2023136329A1 - 細胞増殖遅延剤、それを含む化粧品、及び細胞増殖を遅延させる方法 - Google Patents

細胞増殖遅延剤、それを含む化粧品、及び細胞増殖を遅延させる方法 Download PDF

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WO2023136329A1
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allose
cell
cells
phase
cell cycle
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PCT/JP2023/000825
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成 西山
啓介 三宅
明秀 吉原
健 何森
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国立大学法人 香川大学
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to cell growth retarding agents containing D-allose and/or derivatives thereof and/or mixtures thereof as active ingredients, cosmetics containing the same, and methods for delaying cell growth.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Such a cellular phenomenon is called “cell slow cycling”, which is a cell function acquired in the process of evolution to survive in a harsh environment, and it has been confirmed that a similar cell population exists in cancer.
  • Cell slow cycling Such a phenomenon of cells in which the cell cycle slowly rotates without stopping, called “cell slow cycling”, is thought to be a latent ability in the cells acquired in the process of evolution of living organisms, but there are limits to this phenomenon. This phenomenon is observed only in the situation of , and it is considered that it cannot normally occur (Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Document 5
  • the purpose of the present invention is to provide a cell growth retardant based on a new mechanism, cosmetics containing the same, and a method for delaying cell growth.
  • D-allose or a derivative thereof which is one of the rare sugars, has the effect of extending the period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle.
  • the present invention has been completed.
  • Patent Document 1 It has been reported that the rare sugar D-allose arrests the cell cycle via TXNIP and delays the G2 phase of the cell cycle (Patent Document 1 and Non-Patent Document 5). Certain allitols have been reported to have an anti-obesity effect (Patent Document 2), but all of them can extend the period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle, especially temporarily arrest the cell cycle. It is not described that the period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle can be extended, and the inventors of the present application made it clear for the first time.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the cell growth retardant according to item 1 or 2 which does not arrest the cell cycle.
  • the cell growth retarding agent according to any one of Items 1 to 4 which delays the growth of cancer cells.
  • the cell growth retardant according to any one of Items 1 to 5 which delays the growth of pancreatic cancer cells or brain tumor cells.
  • a cell growth retardant containing D-allose and/or a derivative thereof and/or a mixture thereof as an active ingredient is administered to a subject in need thereof to prolong the period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle.
  • a method of slowing cell proliferation in a subject comprising: [10] The method according to item 9, wherein the derivative of D-allose is allitol.
  • the present invention it is possible to specifically extend the period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle without arresting the cell cycle. It has become possible to reproduce the phenomenon called "slow cycling".
  • the present invention which has this action, has a wide range of applications, such as preventing age-related changes in various tissues and organs, suppressing the growth of cancer, and making it possible to use it as an anti-aging agent for the skin (e.g., cosmetics). becomes possible.
  • FIG. 8 shows cell cycle ratios (G0/1 phase, S phase, and G2/M phase) in cultured human pancreatic cancer cells PK-1 cultured according to the schedule in FIG. Evaluation of glycolysis by flux analyzer system. Evaluation of cell proliferation ability in cultured human pancreatic cancer cell PK-1. Cell proliferation ability was compared by WST-1 assay 48 hours after administration of medium alone (control), D-mannitol or allitol. Evaluation of apoptosis in cultured human pancreatic cancer cells PK-1. Percentages of apoptotic cells 48 hours after administration of medium alone (control), D-mannitol or allitol were compared by flow cytometric analysis of Annexin V-stained cells. Cell cycle delay from G0/1 phase to S phase.
  • Cultivation was performed according to the schedule shown in FIG. 8, except that D-mannitol or allitol was administered instead of D-glucose or D-allose.
  • Each graph shows the percentage of cell cycle (G0/1 phase, S phase, and G2/M phase) of cultured human pancreatic cancer cell PK-1.
  • Evaluation of glycolysis by flux analyzer system. Results of principal component analysis based on metabolome analysis of substances related to central energy metabolism in human pancreatic cancer cells PK-1 and PANC-1 cultured without administration of sugar (control) and with the addition of D-glucose or D-allose.
  • Heat map analysis results based on metabolome analysis of substances related to central energy metabolism in human pancreatic cancer cells PK-1 cultured without administration of sugar (control), with the addition of D-glucose or D-allose.
  • Gluconeogenesis in human pancreatic cancer cells PK-1 and PANC-1 cultured with no sugar administration (control), D-glucose or D-allose added, metabolites related to polyol pathway and pentose phosphate pathway (PPP) Results of heat map analysis based on metabolome analysis.
  • Substance names in black Substances that were not measured or that did not change with the addition of D-allose.
  • the present invention provides a cell growth retardant that contains D-allose and/or a derivative thereof and/or a mixture thereof as an active ingredient and prolongs the period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle.
  • the present invention may be provided as a pharmaceutical product or as a food product.
  • the food of the present invention may be, for example, a food with health claims (for example, a food for specified health use or a food with nutrient claims) or a dietary supplement.
  • the present invention administers a cell growth retardant containing D-allose and/or a derivative thereof and/or a mixture thereof as an active ingredient to a subject in need thereof, and Methods of slowing cell proliferation in a subject are provided, comprising increasing the duration of time spent in .
  • the present invention newly found that the rare sugar D-allose and/or its derivatives and/or mixtures thereof has a hitherto unknown effect of extending the period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle. It was completed by discovering
  • cell slow cycling refers to a state in which the cell cycle progresses more slowly than conventional cells without arresting the cell cycle ("cell cycle arrest"), e.g. .
  • cell cycle arrest a state in which the cell cycle progresses more slowly than conventional cells without arresting the cell cycle
  • cultured in a medium containing D-allose and/or derivatives thereof and/or mixtures thereof The cells undergoing cytotoxicity are specifically prolonged in the cell cycle, particularly in the G0/1 phase of the cell cycle, resulting in a prolonged cell cycle.
  • the term "cell cycle” refers to the cycle of events that constitute cell division, including mitosis, cytokinesis and interphase, in eukaryotes. Historically, proliferating somatic cells divided the cell cycle into a mitotic phase (M phase) and an interphase. Along with this phase (S phase), the entire cell cycle is divided into 4 phases by adding M phase to G1 phase, S phase and G2 phase, and these cycles are usually called cell cycle. Therefore, in one aspect, the cell cycle means a cycle in which genetic information doubled in the S phase is equally distributed in the M phase to replicate cells.
  • the time required for each phase of one cell cycle can be calculated by a known method. It can be calculated by measuring internal DNA content, or the like. Many cell types that have stopped proliferating leave the cell cycle in the middle of the G1 phase and shift to the G0 phase.
  • G0 phase refers to the period during which cells stop progressing through the cell cycle at the G1 phase.
  • the arrest of cell cycle progression occurs in the G1 phase, G2 phase, M phase, etc.
  • the G0 phase refers to the case of exiting the cell cycle in the G1 phase, and also according to the general definition in this specification.
  • a typical example of the G0 phase is when cells differentiate or age and stop growing. Entry and exit between the G0 and G1 phases is thought to occur prior to the checkpoint during the G1 phase.
  • CDKs, cyclins, and CDK inhibitors are known to be the main groups of factors that control cell cycle progression.
  • CDKs are the catalytic subunits of protein kinases. It can be said that it is a driving device for cell cycle progression.
  • cyclins can be said to be activators and CKIs to be inhibitors.
  • CDKs and cyclins each constitute a protein family, and the timing of promoting cell cycle progression differs depending on the combination of their subtypes.
  • mammalian somatic cells include the cyclin B-Cdc2 (CDK1) complex (Cdc2 kinase) in the M phase, the cyclin D-CDK4 complex and the cyclin E-CDK2 complex in the G1 phase, and the cyclin A-CDK2 complex in It is believed to cause S phase progression.
  • CKI is believed to inhibit the progression of G1 and S phases or induce withdrawal to G0 phase.
  • the term "period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle” refers to the time from when the G1 phase starts (i.e., when the M phase ends) to when the S phase starts (i.e., DNA synthesis starts and/or the period from the time a cell in the G0 phase enters the cell cycle (that is, the cell cycle returns from the G0 phase to the G1 phase) to the time the S phase begins.
  • D-allose can specifically prolong the duration of cell cycle G0/1 phase without arresting the cell cycle. It was found that the specific prolongation of the period of stay in the G0/1 phase of the cell cycle delays the subsequent transition to the S phase and further delays the subsequent transition to the G2/M phase.
  • the present invention exerts an effect of suppressing glycolytic activity in cells.
  • glycolysis refers to a biochemical reaction pathway that exists in a living body (cell). It refers to the metabolic process for converting into a form that is easy for living organisms to use, and refers to the same term as generally used. While it is a representative metabolic system that can occur even in an anaerobic state, it also functions as a part of aerobic respiration by transferring the obtained reducing power and pyruvate to the electron transport system and the citric acid cycle.
  • Glycolytic activity can be evaluated by measuring intracellular activity. Glycolytic activity can be assessed, for example, without limitation, by measuring the cellular oxygen consumption rate (OCR value), extracellular acidification rate (ECAR value), or OCR and ECAR values. (See Jing Zhang, and Qing Zhang, Using Seahorse Machine to Measure OCR and ECAR in Cancer Cells Methods Mol Biol. 2019; 1928: 353-363.).
  • OCR value cellular oxygen consumption rate
  • ECAR value extracellular acidification rate
  • OCR and ECAR values See Jing Zhang, and Qing Zhang, Using Seahorse Machine to Measure OCR and ECAR in Cancer Cells Methods Mol Biol. 2019; 1928: 353-363.
  • to suppress the activity of the glycolytic system means, for example, that the extracellular acidification rate (ECAR value) is controlled (for example, cells cultured in the absence of D-allose and/or allitol ), and the oxygen consumption rate (OCR value) is significantly reduced compared to a control (e.g., cells cultured in the absence of D-allose and/or allitol) may be maintained at a high level.
  • ECAR value extracellular acidification rate
  • OCR value oxygen consumption rate
  • Intracellular activity can be measured by using, for example, an extracellular flux analyzer XFe24 (for 24well) manufactured by Agilent Technologies (formerly Seahorse Bioscience), which is the main energy metabolism pathway of cells, glycolysis, and aerobic respiration by mitochondria.
  • the state of cells can be measured over time in a non-invasive and highly sensitive manner.
  • the above device is an example of a device that can measure intracellular activity, and any device or method can be used to measure intracellular activity, so the use of the device is not limited.
  • the present invention can exert the effect of prolonging the period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle, and thus can delay the growth of cancer cells.
  • Cancers to which the present invention can be applied include, for example, leukemia (e.g., acute myelogenous leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia), malignant lymphoma (Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma (e.g., adult T-cell leukemia, follicular lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma)), multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, head and neck cancer, gastrointestinal cancer (e.g., esophageal cancer, esophageal adenocarcinoma, gastric cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer), liver cancer (e.g., hepatocellular carcinoma), gallbladder/cholangio
  • the present invention can exert the effect of prolonging the period of staying in the G0/1 phase of the cell cycle, so it may be used to delay cell senescence.
  • cosmetics used for aging and protective agents for tissues or organs for transplantation in the future, application to foods and pharmaceuticals that suppress biological aging is also possible.
  • D-allose that can be used in the present invention is overwhelmingly small compared to D-glucose (glucose) that exists in large amounts in nature.
  • D-glucose D-glucose
  • monosaccharides that are the basic units of sugars (there are 34 types of monosaccharides (hexoses) with 6 carbon atoms, 16 types of aldoses, 8 types of ketoses, and 10 types of sugar alcohols), there are a large amount in nature.
  • Monosaccharides (aldoses, ketoses) and their derivatives (sugar alcohols) which exist only in trace amounts in nature, are defined as "rare sugars", in contrast to "natural monosaccharides" represented by existing D-glucose (glucose). attached.
  • D-psicose and D-allose are currently mass-producible rare sugars.
  • D-allose is a D-form of allose classified as an aldose and is a hexose.
  • Methods for obtaining "D-allose” include a method of synthesizing from D-psicose using L-rhamnose isomerase and a method of obtaining D-psicose by allowing D-xylose isomerase to act on a D-psicose-containing solution.
  • D-allose in the present invention is not limited to those methods, and may be obtained by any method such as isomerization by a chemical treatment method.
  • D-psicose which is a raw material for D-allose, is generally produced by treating fructose with an enzyme (epimerase), but is not limited thereto, and is obtained by a production method using a microorganism that produces the enzyme.
  • It may be a substance, a substance extracted from a natural substance, a substance contained in a natural substance may be used as it is, or a substance isomerized by a chemical treatment method may be used.
  • a method for purifying D-psicose using an enzyme is also known.
  • D-allose can also be used in the form of D-allose-containing syrup.
  • the D-allose-containing syrup can be obtained by appropriately mixing it with a general syrup (liquid sugar). )), it is a “food” sold at general stores and can be easily obtained.
  • a method for obtaining a D-allose-containing syrup for example, is to react a monosaccharide (D-glucose or D-fructose) with an alkali to cause a Robry-Debruyn-Van Eckenstein rearrangement reaction, a retro-aldol reaction, and a subsequent aldol reaction.
  • a monosaccharide D-glucose or D-fructose
  • the above reaction is called an alkali isomerization reaction
  • the resulting syrup containing various monosaccharides can be broadly referred to as a "rare sugar-containing syrup”
  • D-glucose and / or D-fructose is used as a raw material and alkali isomerized syrup is exemplified until the D-glucose and/or D-fructose content is 55 to 99% by mass.
  • the above-mentioned "rare sugar sweet” is a syrup containing rare sugar obtained by the method disclosed in WO 2010/113785 using isomerized sugar as a raw material, and mainly D-psicose and D - manufactured to contain allose.
  • Rare sugars contained in the rare sugar-containing syrup obtained by this method are 0.5 to 17% by mass of D-psicose and 0.2 to 10% by mass of D-allose relative to the total sugar. According to Takahashi et al. (Applied Glycoscience, Vol. 5, No. 1, 44-49 (2015)), D-psicose 5.4 g/100 g, D-sorbose 5.3 g/100 g, D-tagatose 2 0 g/100 g, D-allose 1.4 g/100 g, and D-mannose 4.3 g/100 g.
  • Raw materials used in the production of the rare sugar-containing syrup include starch, sugar, isomerized sugar, fructose, and glucose.
  • Isomerized sugar is widely regarded as a mixed sugar whose main composition is D-glucose and D-fructose in a specific composition ratio, and is generally obtained by hydrolyzing starch with an enzyme such as amylase or an acid. It also refers to a liquid sugar composed mainly of glucose and fructose obtained by isomerizing a sugar solution mainly composed of glucose with glucose isomerase or alkali.
  • fructose fructose liquid sugar those with a fructose content (percentage of fructose in sugar) of less than 50% are called “fructose fructose liquid sugar", those with a content of 50% or more and less than 90% are called “fructose liquid sugar”, and 90% or more.
  • high-fructose liquid sugar a product obtained by adding sugar to high-fructose liquid sugar in an amount not exceeding the glucose-fructose liquid sugar is called “sugar mixed fructose-glucose liquid sugar”
  • the rare sugar-containing syrup of the present invention is called Any isomerized sugar may be used as a raw material of .
  • a rare sugar-containing syrup made from D-fructose contains 5.2% D-psicose, 1.8% D-allose, 15.0% glucose, and 69.3% D-fructose.
  • the rare sugar-containing syrup made from isomerized sugar as a raw material contains 3.7% D-psicose, 1.5% D-allose, 45.9% glucose, and 37.7% D-fructose. contains 5.7% D-psicose, 2.7% D-allose, 47.4% glucose, and 32.1% D-fructose. changes.
  • D-allose may be separated and purified from these syrups and used, use of the syrup as it is is also conceivable.
  • D-allose that can be used in the present invention may be D-allose and/or its derivatives and/or mixtures thereof.
  • a compound obtained by changing the molecular structure of a certain starting compound by a chemical reaction is called a derivative of the starting compound.
  • derivative of D-allose means a compound obtained by converting the molecular structure of D-allose as a starting compound by a chemical reaction; and a compound similar to D-allose (e.g., D-glucose).
  • the "D-allose derivative” that can be used in the present invention may include allitol, which is a reduced product of D-allose.
  • allitol (D-allo-hexitol; or (2S,3S,4R,5R)-hexane-1,2,3,4,5,6-hexaol.)
  • Allitol is a sugar alcohol having 6 carbon atoms obtained by reducing D-psicose or D-allose.
  • Zina is also called “Ryobu”.
  • Patent Document 2 is known to be contained in the plant body.
  • the allitol that can be applied to the present invention may be one extracted from a plant of the genus Zina, and the existence of a catalyst containing a metal selected from elements of group 8 of the periodic table from D-psicose. Allitol produced by a hydrogenation reaction may also be used, but is not limited to these. Also, allitol applicable to the present invention may be allitol and/or its derivatives and/or mixtures thereof.
  • the derivatives of D-allose are sugar alcohols in which the carbonyl group of D-allose is an alcohol group (that is, allitol), uronic acid in which the hydroxymethyl group of D-allose is converted to a carboxyl group, D - aldonic acid in which the formyl group at the 1-position of allose is a carboxyl group, aldanoic acid in which the formyl group at the 1-position of D-allose and the hydroxymethyl group at the end of the main chain are both changed to carboxyl groups, or D-allose may be an amino sugar in which the alcohol group of is substituted with an amino group.
  • D-allose may be an amino sugar in which the alcohol group of is substituted with an amino group.
  • the derivative of D-allose is such that any hydroxy group of D-allose (e.g., 2-, 3-, 4-, 5- and/or 6-position hydroxy groups) is a hydrogen atom, a halogen atom , amino group, carboxyl group, nitro group, cyano group, lower alkyl group, lower alkoxy group, lower alkanoyl group, lower alkanoyloxy group, lower alkoxycarbonyl group, mono- or di-lower alkyl-substituted amino group, aralkyl group, aryl group or It may be a D-allose derivative substituted with a heteroaryl group.
  • any hydroxy group of D-allose e.g., 2-, 3-, 4-, 5- and/or 6-position hydroxy groups
  • any hydroxy group of D-allose is a hydrogen atom, a halogen atom , amino group, carboxyl group, nitro group, cyano group, lower alkyl group, lower alkoxy group, lower alkan
  • the "derivative of D-allose” is a compound obtained by chemically converting the molecular structure of allitol as a starting compound; , a compound obtained by converting the molecular structure of the starting compound by a chemical reaction, and having the same structure as the compound obtained by converting the molecular structure of allitol by a chemical reaction (“structural analogue of allitol" ) may be included.
  • a derivative of D-allose for example, any hydroxy group of allitol (e.g., 1-, 2-, 3-, 4-, 5- and/or 6-position hydroxy groups) is a hydrogen atom, halogen atom, amino group, carboxyl group, nitro group, cyano group, lower alkyl group, lower alkoxy group, lower alkanoyl group, lower alkanoyloxy group, lower alkoxycarbonyl group, mono- or di-lower alkyl-substituted amino group, aralkyl group, aryl or heteroaryl groups.
  • any hydroxy group of allitol is a hydrogen atom, halogen atom, amino group, carboxyl group, nitro group, cyano group, lower alkyl group, lower alkoxy group, lower alkanoyl group, lower alkanoyloxy group, lower alkoxycarbonyl group, mono- or di-lower alkyl-substituted amino group, aralkyl group, ary
  • Halogen atoms refer to fluorine, chlorine, bromine, and iodine atoms.
  • Alkyl moieties in lower alkyl groups and lower alkoxy groups, lower alkoxycarbonyl groups, and mono- or di-lower alkyl-substituted amino groups are linear, branched or cyclic C1-C6 alkyl groups, specific examples being methyl, ethyl , propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, isohexyl, cyclopropyl, cyclobutyl, 2-methylcyclopropyl, cyclopropylmethyl, cyclopentyl, cyclohexyl and the like.
  • I can.
  • Lower alkanoyl groups and lower alkanoyl moieties of lower alkanoyloxy groups are linear, branched or cyclic C1-C7 alkanoyl groups, specific examples being formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl , hexanoyl, cyclopropylcarbonyl, cyclobutylcarbonyl, 2-methylcyclopropylcarbonyl, cyclohexylcarbonyl and the like.
  • the aralkyl group is a C7-C20 aralkyl group, and specific examples include benzyl, phenethyl, ⁇ -methylbenzyl, benzhydryl, trityl, naphthylmethyl and the like.
  • the aryl group is a C6-C14 aryl group, and specific examples include phenyl and naphthyl.
  • the heteroaryl group is a C3-C8 heteroaryl group which is a monocyclic, polycyclic or condensed ring containing 1 to 4 of each of the same or different N, O and S atoms, and specific examples as 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-quinonyl, 3-quinonyl, 4-quinonyl, 5-quinonyl, 6-quinonyl, 7-quinonyl, 8-quinonyl, 2-indolyl, 3-indolyl, 4-indolyl, 5-indolyl, 6-indolyl, 7-indolyl, 2-furyl, 3-furyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-pyrrolidyl, 3-pyrrolidyl, 2-imidazolyl, 4-imidazolyl, 5- Imidazolyl, 2-oxazolyl, 4-oxazolyl, 5-oxazolyl, 2-thiazolyl, 4-
  • derivatives of D-allose that can be used in the present invention are, for example, 2-deoxy-D-allose, 5-deoxy-D-allose, 6-deoxy-D-allose, 3-deoxy-D-allose D-allose derivatives such as (3-deoxy-D-glucose) and the like may also be used.
  • D-allose and/or its derivatives and/or mixtures thereof that can be used in the present invention are interpreted to include pharmacologically acceptable salts and/or hydrates thereof.
  • food means food in general, but in addition to general food including so-called health food, it also includes food with health claims such as food for specified health use and food with nutrient function claims. Supplements (supplements, dietary supplements), feeds, food additives, etc. are also included in the food of the present invention.
  • the composition for suppressing the production of cytokines of the present invention contains a food called D-allose as an active ingredient, and includes sweeteners, seasonings, food additives, food materials, food and drink, health food and drink, and pharmaceuticals. - It may be used in the form of a quasi-drug or feed, and in either form, it is possible to suppress the production of cytokines.
  • the composition of the present invention can be administered by any administration route.
  • the route of administration includes topical administration (dermal, inhalation, enema, eye drops, ear drops, nasal, intravaginal, etc.), enteral administration (oral, tube, transinfusion, etc.), parenteral administration (intravenous, transarterial, percutaneous, intramuscular injection, etc.).
  • the dose of D-allose and/or a derivative thereof and/or a mixture thereof that can be applied as the cell growth retardant of the present invention can be appropriately adjusted as long as the dose exhibits the effects of the present invention.
  • it may be administered at 1 mg/kg body weight/day to 1000 mg/kg body weight/day, and it is also possible to adjust the dosage appropriately according to age and symptoms.
  • 1 mg/kg body weight/day to 1000 mg/kg body weight/day such as 10 mg/kg body weight/day to 800 mg/kg body weight/day, 50 mg/kg body weight/day to 500 mg/kg body weight, which can be ingested by enteral administration /day.
  • rare sugar D-allose and/or derivatives thereof and/or mixture thereof in daily diet when rare sugar D-allose and/or derivatives thereof and/or mixture thereof is used as a component of food amount can be safely taken.
  • the basis for this is that the rare sugar D-allose is an aldose, and from that aspect it is a highly safe compound that can be administered to humans.
  • the cell growth retardant of the present invention may be provided as a composition, and D-allose and/or its derivatives and/or mixtures thereof may be added as general excipients, stabilizers, preservatives, binders, disintegrants. It is formulated by blending appropriate excipients such as tablets, powders, granules, capsules, solutions, syrups, elixirs, or appropriate dosage forms such as oily or aqueous suspensions. may be provided.
  • D-allose and/or derivatives thereof and/or mixtures thereof further contain pharmaceutically acceptable additives such as fillers, extenders, binders, disintegrants. , dissolution accelerators, wetting agents, lubricants, etc. can be selected and mixed as necessary to form a formulation.
  • solid preparations can be produced by adding excipients, disintegrants, binders, lubricants, etc. to D-allose and/or its derivatives and/or mixtures thereof, mixing them, and compressing and shaping them. can be done. Lactose, starch, mannitol and the like are generally used as excipients.
  • As the disintegrant calcium carbonate, carboxymethylcellulose calcium, etc. are generally used. Gum arabic, carboxymethylcellulose, or polyvinylpyrrolidone is used as the binder. Talc, magnesium stearate, and the like are known as lubricants.
  • Tablets can be masked or coated with known coatings to make them enteric-coated preparations.
  • Ethyl cellulose, polyoxyethylene glycol, or the like can be used as the coating agent.
  • the composition of the present invention is a food (for example, medical food, food for specified health use, health supplement, health food, food with nutrient function claims, supplement, It can also be provided as a dietary supplement, herbal tea, etc.).
  • D-allose may be administered at doses of 1 mg/kg body weight/day to 1000 mg/kg body weight/day (eg, 50 mg to 50 g/day for a 50 kg adult).
  • agent of the present invention When the agent of the present invention is used as cosmetics, lotion, emulsion, foundation, lipstick, lip balm, cleansing cream, massage cream, mask, hand cream, hand powder, body shampoo, body lotion, body cream, bath cosmetics, etc. You may use it as a form.
  • ingredients that are usually used in external skin preparations such as cosmetics, pharmaceuticals, and quasi-drugs, such as antioxidants, oils, and UV protection agents, to the extent that they do not impair the effects of the present invention.
  • surfactants, thickeners, alcohols, powder components, coloring materials, aqueous components, water, various skin nutrients and the like can be appropriately blended as needed.
  • the agent of the present invention can be applied as cosmetics, quasi-drugs, etc. applied to the outer skin, and its dosage form is not limited as long as it can be applied to the skin, and is solution-based, solubilized-based, and emulsified-based. , powder dispersion system, water-oil two-layer system, water-oil-powder three-layer system, ointment, lotion, gel, aerosol, etc., can be applied.
  • Subjects to which the present invention can be applied may be animals including humans (humans, mammals such as cows, pigs, dogs and cats, birds such as chickens, etc.), and are not particularly limited.
  • D-allose a rare sugar, showed a dose-dependent cell growth inhibitory effect in cultured human brain tumor cell lines, U251 cells and U87 cells, as shown in Fig. 1.
  • Cells were cultured with DMEM, 50 mM-D glucose or 50 mM-D allose for 24 hours. The cultured cells were then harvested with trypsin, washed twice with PBS, and fixed with 70% ethanol at -20°C overnight. After washing with PBS, cells were stained with 500 ⁇ l of PI reagent for 30 min at room temperature in the dark, and after washing with PBS flow cytometry was used to monitor emission at 617 nm. The data were analyzed with Kaluza analysis software (Ver.1.2, Beckman Coulter), and the effect on the cell cycle was evaluated by changes in the ratio of cell distribution in each phase of the cell cycle.
  • CytoTell (trademark), a fluorescent probe for flow cytometry that has recently been used as a cell proliferation monitoring reagent, was taken up by brain tumor cells for 24 hours. , and 50 mM D-allose were administered and allowed to stand for 96 hours, and the attenuation of fluorescent probe intensity in each cell was evaluated (Fig. 4-1).
  • PK-1 cells 25 or 50 mM D-allose or D-glucose was added to PK-1 cells, a cultured human pancreatic cancer cell line, and after culturing for 48 hours, a WST-1 assay was performed to compare the effects on cell proliferation.
  • D-allose exhibited a cell growth inhibitory effect as shown in Figure 5 in PK-1 cells, a cultured pancreatic cancer cell line.
  • Annexin V staining was performed and assessed for apoptosis using flow cytometry, confirming that 50 mM D-allose, the dose that produced an inhibitory effect on pancreatic cancer PK-1 cells, did not produce apoptosis. (Fig. 6).
  • PK-1 cells were serum starved overnight and then fixed with 70% ethanol at ⁇ 20° C. overnight.
  • PI propidium iodide
  • RNase solution Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA
  • D-allose does not stop the cell cycle, but through the action of significantly delaying the transition from the G0/1 phase to the S phase, the overall speed of the cell cycle is delayed, leading to the effect of suppressing proliferation. It was thought that
  • Example 3 Analysis using cultured human pancreatic cancer cells>
  • D-mannitol one of sugar alcohols, was used as a control.
  • PK-1 cells 50 mM allitol or D-mannitol was added to PK-1 cells, a cultured human pancreatic cancer cell line, and after 48 hours of culture, WST-1 assay was performed to compare the effects on cell proliferation. again,
  • Allitol like D-allose, showed a cell growth inhibitory effect in PK-1 cells, a cultured pancreatic cancer cell line (Fig. 11).
  • Annexin V staining was performed and apoptosis was evaluated using flow cytometry. As a result, it was confirmed that apoptosis did not occur at 50 mM allitol, the dose that produced an inhibitory effect on the proliferation of pancreatic cancer PK-1 cells (Fig. 12).
  • Allitol like D-allose, does not arrest the cell cycle, but by significantly delaying the transition from the G0/1 phase to the S phase, slows the overall cell cycle speed and suppresses cell proliferation. It was suggested that it might be effective.
  • Example 2 an extracellular flux analyzer XFe24 (for 24well) manufactured by Agilent Technologies (formerly Seahorse Bioscience) was used to measure the oxygen consumption rate (OCR value) and extracellular acidity of cultured human pancreatic cancer PK-1 cells. The conversion rate (ECAR value) was measured, and the effect on glycolysis was also examined.
  • OCR value oxygen consumption rate
  • ECAR value extracellular acidity of cultured human pancreatic cancer PK-1 cells
  • D-allose and allitol significantly delay the transition from the G0/1 phase to the S phase by suppressing glycolysis, which leads to "cell slow cycling", resulting in cancer cell growth. It was thought that it might have an inhibitory effect.
  • Example 4 Metabolome analysis using human pancreatic cancer cell lines> No sugar (control) or 50 mM D-glucose or D-allose was added to cultured human pancreatic cancer cell lines PK-1 cells and PANC-1 (5.0 ⁇ 10 6 cells). h, 37° C., 5% CO 2 atmosphere. After that, for each cell, samples were prepared according to the protocol provided by Human Metabolome Technologies Co., Ltd.
  • PCA principal component analysis
  • heat map analysis FIGS. 16 to 19
  • pathway map analysis FIG. 20
  • Example 5 Visualization of cell cycle of human pancreatic cancer cell line PK-1 cells to which D-allose was added>
  • Human pancreatic cancer cell line PK-1 was spiked with tFucci(CA)5 (Plasmid #153521) purchased from Addgene (Massachusetts, USA) (reference: Ando R., et al., Two new coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression. bioRxiv, 2020, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.30.015156v2) to visualize the cell cycle.
  • Cells transfected with tFucci(CA)5 appear red in the G1 phase, green in the S phase, and yellow-orange in the G2/M phase when observed using a fluorescence microscope (FIG. 21). Using these cells, the influence of the presence or absence of the addition of D-allose (50 mM) on the cell cycle of human pancreatic cancer cell line PK-1 cells was observed.

Abstract

本発明は、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として含み、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させる細胞増殖遅延剤、及びそれを含有する細胞の老化を遅延させる化粧品を提供する。また、本発明は、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として含む細胞増殖遅延剤を、それを必要とする対象に投与し、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させることを含む、対象における細胞増殖を遅延させる方法を提供する。

Description

細胞増殖遅延剤、それを含む化粧品、及び細胞増殖を遅延させる方法
　本発明は、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として含む、細胞増殖遅延剤、それを含む化粧品、及び細胞増殖を遅延させる方法に関する。
　近年、細胞周期が停止（静止）するのではなく、全体的にゆっくりと周り、増殖するスピードが遅い集団が存在することがバクテリアや酵母で発見されている（非特許文献１及び２）。そのような細胞の現象は、生命体が進化の過程において、過酷な環境で生き残るために獲得された細胞機能として「細胞スローサイクリング」と呼ばれ、癌でも同様の細胞集団が存在することが確認されている（非特許文献３）。このような「細胞スローサイクリング」と呼ばれる細胞周期が停止せずにゆっくりと回る細胞の現象は、生命体が進化の過程で獲得した細胞内に潜在する能力であると考えられているものの、極限の状況のみで観察される現象であり、通常では生じ得ないと考えられている（非特許文献４）。
　そのような状況の下、近年、希少糖の一つとして知られるＤ－アロースが、癌細胞株の増殖を抑制し得ることが報告されており、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）を特異的に誘導ことにより、細胞周期タンパク質であるｐ２７ｋｉｐ１タンパク質を安定化させることで細胞周期を「停止」させる作用があること（非特許文献５）や、細胞周期の「Ｇ２期」を遅延させる効果を有することが報告されている（特許文献１）。
　また、別の希少糖の一つとして知られるアリトールには、抗脂肪蓄積抑制作用があることが知られている（特許文献２）。
特許第５３３０９７６号公報 国際公開第２０２０／１９５１０６号
Balaban　NQ., et al., Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 2004, Sep 10;305(5690):1622-5. van Dijk D., et al., Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage. Nat. Commun. 2015 Aug 13;6:7972. Roesch A, et al., A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 2010 May 14;141(4):583-94. Min M, Spencer SL. Spontaneously slow-cycling subpopulations of human cells originate from activation of stress-response pathways. PLoS Biol. 2019 Mar 13;17(3):e3000178. Hirata Y., et al., Analysis of the inhibitory mechanism of D-allose on MOLT-4F leukemia cell proliferation. J. Biosci. Bioeng. 2009 May;107(5):562-8
　本発明は、新たなメカニズムに基づく細胞増殖遅延剤、それを含む化粧品、及び細胞増殖を遅延させる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究を行なった結果、希少糖の一つであるＤ－アロースまたはその誘導体に、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させる効果を有することを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
　希少糖Ｄ－アロースが、ＴＸＮＩＰを介して細胞周期を停止させることや、細胞周期のＧ２期を遅延させることが報告されており（特許文献１及び非特許文献５）、Ｄ－アロースの誘導体であるアリトールが、抗肥満効果を有することが報告されているが（特許文献２）、いずれも、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させ得ること、特に細胞周期を一時的に停止させることなく細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させ得ることについては記載されておらず、本願発明者らによって、初めて明らかにされたものである。
　すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］　Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として含み、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させる、細胞増殖遅延剤。
［２］　Ｄ－アロースの誘導体が、アリトールである、項目１に記載の細胞増殖遅延剤。
［３］［３］　細胞周期を停止しない、項目１または２に記載の細胞増殖遅延剤。
［４］　細胞における解糖系の活性を抑制する、項目１～３のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤。
［５］　癌細胞の増殖を遅延させる、項目１～４のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤。
［６］　膵臓癌細胞、又は脳腫瘍細胞の増殖を遅延させる、項目１～５のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤。
［７］　細胞の老化を遅延させる、項目１～４のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤。
［８］　項目１～４のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤を含む、細胞の老化を遅延させる化粧品。
［９］　Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として含む細胞増殖遅延剤を、それを必要とする対象に投与し、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させること
を含む、対象における細胞増殖を遅延させる方法。
［１０］　Ｄ－アロースの誘導体が、アリトールである、項目９に記載の方法。
　本発明により、細胞周期を停止させることなく、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を特異的に延長させることが可能となり、これまで極限の状況のみで観察されると考えらえていた「細胞スローサイクリング」とよばれる現象を再現できるようになった。当該作用を有する本願発明により、様々な組織や臓器の加齢性変化を予防したり、癌の増殖を抑制したり、皮膚の抗老化剤（例えば化粧品）として利用可能とするなど、幅広く応用することが可能となる。
ヒト脳腫瘍Ｕ２５１細胞株、Ｕ８７細胞株での細胞増殖能の評価。培地のみ（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロース投与４８時間後の細胞増殖能をＷＳＴ－１アッセイにより比較した。 ヒト脳腫瘍Ｕ２５１細胞株、Ｕ８７細胞株でのアポトーシスの評価。培地のみ（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロース投与４８時間後のアポトーシス細胞の割合を、アネキシンＶ染色を行った細胞のフローサイトメトリー解析により比較した。 ヒト脳腫瘍Ｕ２５１細胞株、Ｕ８７細胞株での細胞周期の評価。培地のみ（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロース投与４８時間後の各細胞の細胞周期の割合をフローサイトメトリーにより解析して比較した。 細胞増殖モニタリング試薬である蛍光プローブＣｙｔｏＴｅｌｌ（商標）を用いた検討。 細胞増殖モニタリング試薬である蛍光プローブＣｙｔｏＴｅｌｌ（商標）を用いた検討。 培養ヒト膵癌細胞ＰＫ－１における細胞増殖能の評価。培地のみ（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロース投与４８時間後の細胞増殖能をＷＳＴ－１アッセイにより比較した。 培養ヒト膵癌細胞ＰＫ－１におけるアポトーシスの評価。培地のみ（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロース投与４８時間後のアポトーシス細胞の割合を、アネキシンＶ染色を行った細胞のフローサイトメトリー解析により比較した。 培養ヒト膵癌細胞ＰＫ－１における細胞周期の評価。培地のみ（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロース投与４８時間後の各細胞の細胞周期の割合をフローサイトメトリーにより解析して比較した。 培養ヒト膵癌細胞ＰＫ－１における細胞周期の評価。ノコダゾール５０ｎＭの存在下で１２時間培養し、細胞周期を停止させた。そこからノコダゾールを除去して細胞周期をリスタートさせると同時に、培地のみ（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロース投与（５０ｍＭ）し、経時的にサンプリングして細胞周期の割合をフローサイトメトリーにより解析した。 Ｇ０／１期からＳ期に移行する細胞周期の遅延。図８のスケジュールで培養を行った培養ヒト膵癌細胞ＰＫ－１における細胞周期（Ｇ０／１期、Ｓ期、及びＧ２／Ｍ期）の割合を示す。 フラックスアナライザーシステムによる解糖系の評価。 培養ヒト膵癌細胞ＰＫ－１における細胞増殖能の評価。培地のみ（コントロール）、Ｄ－マンニトール又はアリトール投与４８時間後の細胞増殖能をＷＳＴ－１アッセイにより比較した。 培養ヒト膵癌細胞ＰＫ－１におけるアポトーシスの評価。培地のみ（コントロール）、Ｄ－マンニトール又はアリトール投与４８時間後のアポトーシス細胞の割合を、アネキシンＶ染色を行った細胞のフローサイトメトリー解析により比較した。 Ｇ０／１期からＳ期に移行する細胞周期の遅延。Ｄ－グルコース又はＤ－アロースの代わりにＤ－マンニトール又はアリトールを投与したこと以外、図８のスケジュールで培養を行った。各グラフは、培養ヒト膵癌細胞ＰＫ－１の細胞周期（Ｇ０／１期、Ｓ期、及びＧ２／Ｍ期）の割合を示す。 フラックスアナライザーシステムによる解糖系の評価。 糖の投与なし（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロースを添加して培養したヒト膵癌細胞ＰＫ－１及びＰＡＮＣ－１における中心エネルギー代謝に関連する物質のメタボローム解析に基づく主成分解析の結果。 糖の投与なし（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロースを添加して培養したヒト膵癌細胞ＰＫ－１における中心エネルギー代謝に関連する物質のメタボローム解析に基づくヒートマップ解析の結果。 糖の投与なし（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロースを添加して培養したヒト膵癌細胞ＰＫ－１及びＰＡＮＣ－１における解糖系に関連する代謝産物のメタボローム解析に基づくヒートマップ解析の結果。 糖の投与なし（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロースを添加して培養したヒト膵癌細胞ＰＫ－１及びＰＡＮＣ－１における糖新生、ポリオールパスウェイ及びペントースリン酸パスウェイ（ＰＰＰ）に関連する代謝産物のメタボローム解析に基づくヒートマップ解析の結果。 糖の投与なし（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロースを添加して培養したヒト膵癌細胞ＰＫ－１及びＰＡＮＣ－１におけるＴＣＡ回路に関連する代謝産物のメタボローム解析に基づくヒートマップ解析の結果。 糖の投与なし（コントロール）、Ｄ－グルコース又はＤ－アロースを添加して培養したヒト膵癌細胞ＰＫ－１における中心エネルギー代謝に関連する物質のメタボローム解析に基づくパスウェイマップ解析の結果。赤字の物質名（↑）：Ｄ－アロース添加によって上昇した物質。青字の物質名（↓）：Ｄ－アロース添加によって減少した物質。黒字の物質名：非測定又はＤ－アロース添加によって変化しなかった物質。 ｔＦｕｃｃｉ（ＣＡ）５をトランスフェクト２４時間後のヒト膵癌細胞ＰＫ－１の蛍光顕微鏡像。Ｇ１期：赤、Ｓ期：緑、Ｇ２／Ｍ期：黄～オレンジ。ＮＥＢ：核膜の崩壊、ＮＥＲ：核膜の新生。 ｔＦｕｃｃｉ（ＣＡ）５をトランスフェクトし、糖の添加なし（コントロール）又はＤ－アロース添加後、０～８４時間後のヒト膵癌細胞ＰＫ－１の蛍光顕微鏡像。Ｇ１期：赤、Ｓ期：緑、Ｇ２／Ｍ期：黄～オレンジ。図中の「×」は０時間で表示されていなかった別の細胞に由来する細胞である。
　以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されない。なお、本明細書において引用されている先行技術文献は、本明細書においても援用され、その全体が本明細書において取り込まれる。
　一実施態様において、本発明は、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として含み、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させる、細胞増殖遅延剤を提供する。本発明は、医薬品として提供されるものであってもよく、食品として提供されるものであってもよい。食品としての本発明は、例えば、保健機能食品（例えば、特定保健用食品または栄養機能食品）、またはダイエタリーサプリメントであってもよい。
　一実施態様において、本発明は、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として含む細胞増殖遅延剤を、それを必要とする対象に投与し、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させること
を含む、対象における細胞増殖を遅延させる方法を提供する。
　本発明は、希少糖であるＤ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物が、これまで知られていなかった、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させる効果を有することを新たに発見したことによって完成させたものである。
　本明細書において、「細胞スローサイクリング」とは、細胞周期が停止（「細胞周期停止（cell cycle arrest)」）することなく、従来の細胞よりも細胞周期がゆっくりと進行する状態を示し、例えば、本願発明のようにＤ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を含まない培地で培養された細胞と比べて、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を含む培地で培養された細胞は、細胞周期、特に細胞周期のＧ０／１期に留まる期間が特異的に延長され、その結果、細胞周期が延長する。
　本明細書において、「細胞周期」とは、真核生物において、有糸分裂、細胞質分裂および間期を含む細胞分裂を構成する事象のサイクルをいう。歴史的には、増殖中の体細胞では細胞周期を分裂期（Ｍ期）と間期に分けていたが、ＤＮＡ合成が間期の一部で行われていることが見出されたことに伴い、この時期（Ｓ期）をはさんで、Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２期に、Ｍ期を加えて、細胞周期全体を４期に分けるようになり、通常はこのサイクルを細胞周期という。従って、１つの局面では、細胞周期は、Ｓ期に倍加した遺伝情報をＭ期に等分配して細胞を複製していくサイクルを意味する。本明細書において、１細胞周期の各期の所要時間は、公知の方法によって算出することが可能であり、例えば、生体細胞の直接観察、分裂指数、オートラジオグラフ法の導入、セルソーターによる各細胞内ＤＮＡ含量の測定などによって算出され得る。増殖を停止した多くの細胞種ではＧ１期の途中から細胞周期を離脱し、Ｇ０期へ移行する。
　本明細書において「Ｇ０期」とは、細胞が細胞周期の進行をＧ１期で止めている状態にある期間をいう。細胞周期の進行の停止は、Ｇ１期、Ｇ２期、Ｍ期などで起こるが、一般的にＧ０期はＧ１期で細胞周期を離脱した場合をさし、本明細書においても一般的な定義に従う。細胞が分化あるいは老化して増殖停止したときがＧ０期の代表例として知られる。Ｇ０期とＧ１期との出入は、Ｇ１期中におけるチェックポイントの前で起こると考えられている。
　細胞周期の進行を制御する主な因子群は、従来、ＣＤＫ、サイクリン、ＣＤＫ阻害因子（ＣＫＩ）が知られている。ＣＤＫがタンパク質リン酸化酵素の触媒サブユニットである。細胞周期進行の駆動装置であるともいえる。ＣＤＫの調節因子として、サイクリンは活性化因子であり、ＣＫＩは抑制因子ということができる。ＣＤＫとサイクリンとは、それぞれタンパク質ファミリーを構成し、それらのサブタイプの組合せに応じて細胞周期の進行を促す時期が異なる。哺乳類体細胞における代表例としては、サイクリンＢ－Ｃｄｃ２（ＣＤＫ１）複合体（Ｃｄｃ２キナーゼ）はＭ期、サイクリンＤ－ＣＤＫ４複合体およびサイクリンＥ－ＣＤＫ２複合体はＧ１期、サイクリンＡ－ＣＤＫ２複合体はＳ期の進行をもたらすとされている。ＣＫＩは、Ｇ１期とＳ期の進行の抑制あるいはＧ０期への離脱をもたらすとされている。
　本明細書において「細胞周期のＧ０／１期に留まる期間」とは、Ｇ１期が開始する時（すなわち、Ｍ期が終了する時）からＳ期が開始する時（すなわち、ＤＮＡの合成を開始する時）までの期間、及び／又は、Ｇ０期にある細胞が細胞周期に入り（すなわち、細胞周期がＧ０期からＧ１期に戻る）、Ｓ期が開始する時までの期間をいう。本願発明者らは、Ｄ－アロースは、細胞周期を停止させることなく、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を特異的に延長させ得ることを見出した。細胞周期のＧ０／１期に留まる期間が特異的に延長するために、その後のＳ期への移行が遅延し、さらにその後のＧ２／Ｍ期への移行が遅れることが見出された。
　一実施態様において、本願発明は、細胞における解糖系の活性を抑制する効果を発揮する。本明細書において「解糖系」とは、生体（細胞）内に存在する生化学反応経路であり、グルコースをピルビン酸などの有機酸に分解（異化）し、グルコースに含まれる高い結合エネルギーを生物が使いやすい形に変換していくための代謝過程をいい、一般に用いられている用語と同一のものを指す。嫌気状態でも起こりうる代謝系の代表的なものである一方で、得られる還元力やピルビン酸が電子伝達系やクエン酸回路に受け渡されることで好気呼吸の一部としても機能する。
　解糖系の活性は、細胞内活性を測定すること評価することができる。限定されるわけではないが、解糖系の活性は、例えば、細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ値）、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）、又はＯＣＲ及びＥＣＡＲ値を測定することによって評価することができる（Ｊｉｎｇ　Ｚｈａｎｇ，　ａｎｄ　Ｑｉｎｇ　Ｚｈａｎｇ，　Ｕｓｉｎｇ　Ｓｅａｈｏｒｓｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ　ｔｏ　Ｍｅａｓｕｒｅ　ＯＣＲ　ａｎｄ　ＥＣＡＲ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ＣｅｌｌｓＭｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　２０１９；１９２８：３５３－３６３．を参考のこと）。本明細書において、「解糖系の活性を抑制する」とは、例えば、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）を、コントロール（例えば、Ｄ－アロース及び／又はアリトールの非存在下で培養した細胞）と比較して有意に低下させることであってもよく、酸素消費速度（ＯＣＲ値）を、コントロール（例えば、Ｄ－アロース及び／又はアリトールの非存在下で培養した細胞）と比較して有意に高い状態に維持するものであってもよい。
　細胞内活性は、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（旧Ｓｅａｈｏｒｓｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製の細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４（２４ｗｅｌｌ用）を用いることによって細胞の主要なエネルギー代謝経路である解糖系、及びミトコンドリアによる好気呼吸の状態を、細胞に対して無侵襲・高感度に経時的計測を行うことができる。しかしながら、上記装置は細胞内活性を測定し得る装置の例示であり、細胞内活性の測定には任意の装置、方法を用いて評価することができるため、当該装置の利用に限定されない。
　一実施態様において、本発明は、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させる効果を発揮することができることから、癌細胞の増殖を遅延させ得る。本発明が適用し得る癌としては、例えば、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病）、悪性リンパ腫（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、成人Ｔ細胞白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫））、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、頭頸部癌、消化器癌（例えば、食道癌、食道腺癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌）、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、胆嚢・胆管癌、胆道癌、膵臓癌、甲状腺癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（例えば、扁平上皮非小細胞肺癌、非扁平上皮非小細胞肺癌）、小細胞肺癌）、乳癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、子宮頚癌、子宮体癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰部癌、腎癌（例えば、腎細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、膀胱癌、上部尿路癌）、前立腺癌、精巣腫瘍（例えば、胚細胞腫瘍）、骨・軟部肉腫、皮膚癌（例えば、ブドウ膜悪性黒色腫、悪性黒色腫、メルケル細胞癌）、神経膠腫、脳腫瘍（例えば、膠芽腫）、胸膜中皮腫および原発不明癌）が挙げられる。本発明を適用可能な癌細胞は、例えば、膵臓癌細胞、又は脳腫瘍細胞である。
　また、一実施態様において、本願発明は、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させる効果を発揮することができることから、細胞の老化を遅延させるために用いられてもよく、例えば、アンチエージングに用いられる化粧品や、移植用組織又は臓器の保護剤の他、将来的には、生体老化を抑制する食品や医薬品への応用も可能である。
　本発明で用いられ得るＤ－アロースは、自然界に大量に存在するＤ－グルコース（ブドウ糖）に比べて圧倒的に存在量が少ない。糖の基本単位である単糖（炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある）のうち、自然界に大量に存在するＤ－グルコース（ブドウ糖）に代表される「天然型単糖」に対して、自然界に微量にしか存在しない単糖（アルドース、ケトース）およびその誘導体（糖アルコール）を「希少糖」と定義付けられている。現在、大量生産が可能な希少糖は、Ｄ－プシコースとＤ－アロースである。Ｄ－アロースは、アルドースに分類されるアロースのＤ体であり、六炭糖である。 
　「Ｄ－アロース」を得る方法としては、Ｌ－ラムノース・イソメラーゼを用いてＤ－プシコースから合成する方法や、Ｄ－プシコース含有溶液にＤ－キシロース・イソメラーゼを作用させて得る方法などが開示されているが、本発明におけるＤ－アロースは、それらの方法に限定されず、化学的な処理方法により異性化されたものなど、何れの方法によって得られたものでもよい。Ｄ－アロースの原料となるＤ－プシコースは、フラクトースを酵素（エピメラーゼ）処理して得られる製法が一般的であるが、それに限定されず、当該酵素を生産する微生物を利用した製法により得られたものでも良いし、天然物から抽出されたものや、天然物の中に含まれるものをそのまま用いても良く、化学的な処理方法により異性化されたものでも良い。また、酵素を利用してＤ－プシコースを精製する方法は公知である。 
　Ｄ－アロースは、Ｄ－アロース含有シロップの形態で用いることもできる。Ｄ－アロース含有シロップは、一般的なシロップ（液糖）に適宜混合することでも得られるが、市販品「レアシュガースウィート」（発売元：（株）レアスウィート、販売者：松谷化学工業（株））として、一般店頭で販売されている「食品」であり、容易に入手することができる。 
　Ｄ－アロース含有シロップを得る方法は、例えば、単糖（Ｄ－グルコースやＤ－フラクトース）にアルカリを作用させ、ロブリー・ドブリュイン－ファン　エッケンシュタイン転位反応やレトロアルドール反応とそれに続くアルドール反応を起こさせ（以上の反応をアルカリ異性化反応と呼ぶ）、生じた各種単糖（希少糖含む）を含むシロップを広く「希少糖含有シロップ」と呼ぶことができ、Ｄ－グルコースおよび／もしくはＤ－フラクトースを原料として、Ｄ－グルコースおよび／もしくはＤ－フラクトース含量が５５～９９質量％になるまでアルカリ異性化したシロップが例示される。上記の「レアシュガースウィート」は、異性化糖を原料とし、国際公開第２０１０／１１３７８５号に開示される手法により得られる希少糖を含有するシロップであり、希少糖として主にＤ－プシコースおよびＤ－アロースが含まれるように製造されたものである。当該手法により得られる希少糖含有シロップに含まれる希少糖は、全糖に対する割合でＤ－プシコース０．５～１７質量％、Ｄ－アロース０．２～１０質量％である。高橋らの文献（応用糖質科学、第５巻、第１号、４４－４９（２０１５））によると、Ｄ－プシコース５．４ｇ／１００ｇ、Ｄ－ソルボース５．３ｇ／１００ｇ、Ｄ－タガトース２．０ｇ／１００ｇ、Ｄ－アロース１．４ｇ／１００ｇ、Ｄ－マンノース４．３ｇ／１００ｇが含まれるシロップであることが報告されている。 
　前記希少糖含有シロップの製造に使用される原料としては、でん粉、砂糖、異性化糖、フラクトース、グルコースなどが挙げられる。異性化糖とは、特定組成比のＤ－グルコースとＤ－フラクトースを主組成分とする混合糖として広く捉えられ、一般的には、でん粉をアミラーゼ等の酵素または酸により加水分解して得られた、主にブドウ糖からなる糖液を、グルコースイソメラーゼまたはアルカリにより異性化したブドウ糖および果糖を主成分とする液状の糖のことを指す。ＪＡＳ規格においては、果糖含有率（糖のうちの果糖の割合）が５０％未満のものを「ブドウ糖果糖液糖」、５０％以上９０％未満のものを「果糖ブドウ糖液糖」、９０％以上のものを「高果糖液糖」、およびブドウ糖果糖液糖にブドウ糖果糖液糖を超えない量の砂糖を加えたものを「砂糖混合果糖ブドウ糖液糖」とよぶが、本発明の希少糖含有シロップの原料としては、何れの異性化糖を用いても構わない。
　例えば、Ｄ－フラクトースを原料とした希少糖含有シロップは、Ｄ－プシコース５．２％、Ｄ－アロース１．８％、グルコース１５．０％、Ｄ－フラクトース６９．３％を含んでいる。また、異性化糖を原料とした希少糖含有シロップは、Ｄ－プシコース３．７％、Ｄ－アロース１．５％、グルコース４５．９％、Ｄ－フラクトース３７．７％を含み、Ｄ－グルコースを原料とすると、Ｄ－プシコース５．７％、Ｄ－アロース２．７％、グルコース４７．４％、Ｄ－フラクトース３２．１％を含んでいるが、原料および処理方法の違いにより含有糖組成は変化する。これらのシロップからＤ－アロースを分離精製して使用しても良いが、シロップのままでの使用も考えられる。 
　一実施態様において、本発明に用いられ得るＤ－アロースは、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物であってもよい。一般に、ある出発化合物から分子の構造を化学反応により変換した化合物を出発化合物の誘導体と呼称する。本明細書において、「Ｄ－アロースの誘導体」は、出発化合物としてのＤ－アロースの分子構造を化学反応により変換して得られる化合物；及び、Ｄ－アロースと類似の化合物（例えばＤ－グルコース）を出発化合物として、その出発化合物の分子構造を化学反応により変換して得られる化合物であって、Ｄ－アロースの分子構造を化学反応により変換して得られる化合物と同一の構造を有する化合物（「Ｄ－アロースの構造類似体」という。）を含む意味で用いられる。一実施態様において、本発明に用いられ得る「Ｄ－アロースの誘導体」は、Ｄ－アロースの還元物である、アリトールを含むものであってもよい。
　本明細書において、「アリトール（Ｄ－ａｌｌｏ－ヘキシトール；又は（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－ヘキサン－１，２，３，４，５，６－ヘキサオール、ともいう。）」は、ポリオール（糖アルコール）に分類される希少糖である。アリトールは、Ｄ－プシコース又はＤ－アロースを還元することで得られる炭素数６の糖アルコールであり、自然界にはほとんど存在しないが、ズイナ（ズイナ属、随菜属、学名：Ｉｔｅａ　ｓｐｐ.）（地域によってズイナのことを「リョウブ」とも呼ばれている。）の植物体に含有することが知られている（特許文献２）。従って、本発明に適用され得るアリトールは、ズイナ属の植物体から抽出されたものを用いてもよく、Ｄ－プシコースから周期律表の第８族の元素から選ばれる金属を含有する触媒の存在下、水素添加反応により製造されたアリトールを使用してもよく、これらに限定されない。また、本発明に適用され得るアリトールは、アリトールおよび／またはその誘導体および／またはその混合物であってもよい。
　本明細書において、Ｄ－アロースの誘導体は、Ｄ－アロースのカルボニル基がアルコール基となった糖アルコール（すなわち、アリトール）、Ｄ－アロースのヒドロキシメチル基がカルボキシ基に変換されたウロン酸、Ｄ－アロースの１位のホルミル基がカルボキシル基になったアルドン酸、Ｄ－アロースの１位のホルミル基と、主鎖の末端のヒドロキシメチル基がともにカルボキシル基に変わったアルダン酸、あるいはＤ－アロースのアルコール基がアミノ基で置換されたアミノ糖であってもよい。
　他の実施態様において、Ｄ－アロースの誘導体は、Ｄ－アロースの任意のヒドロキシ基（例えば、２位、３位、４位、５位及び／又は６位のヒドロキシ基）が水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルカノイル基、低級アルカノイルオキシ基、低級アルコキシカルボニル基、モノ又はジ低級アルキル置換アミノ基、アラルキル基、アリール基又はヘテロアリール基で置換されたＤ－アロース誘導体であってもよい。
　一実施態様において、「Ｄ－アロースの誘導体」は、出発化合物としてのアリトールの分子構造を化学反応により変換して得られる化合物；及び、アリトールと類似の化合物（例えばＤ－マンニトール）を出発化合物として、その出発化合物の分子構造を化学反応により変換して得られる化合物であって、アリトールの分子構造を化学反応により変換して得られる化合物と同一の構造を有する化合物（「アリトールの構造類似体」という。）を含むものであってもよい。一実施態様において、Ｄ－アロースの誘導体は、例えば、アリトールの任意のヒドロキシ基（例えば、１位、２位、３位、４位、５位及び／又は６位のヒドロキシ基）が水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルカノイル基、低級アルカノイルオキシ基、低級アルコキシカルボニル基、モノ又はジ低級アルキル置換アミノ基、アラルキル基、アリール基又はヘテロアリール基で置換されたものであってもよい。
　ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を示す。低級アルキル基及び低級アルコキシ基、低級アルコキシカルボニル基、モノ又はジ低級アルキル置換アミノ基におけるアルキル部分は、直鎖、分岐もしくは環状のＣ１～Ｃ６アルキル基を示し、具体的例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、２－メチルシクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を挙げることが出来る。
　低級アルカノイル基及び低級アルカノイルオキシ基の低級アルカノイル部分は、直鎖、分岐もしくは環状のＣ１～Ｃ７アルカノイル基を示し、具体的例としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、２－メチルシクロプロピルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル等を挙げることができる。
　アラルキル基は、Ｃ７～Ｃ２０のアラルキル基を示し、具体的例としては、ベンジル、フェネチル、α－メチルベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル等を挙げることが出来る。
　アリール基は、Ｃ６～Ｃ１４のアリール基を示し、具体的例としては、フェニル、ナフチル等を挙げることが出来る。
　ヘテロアリ－ル基は、Ｃ３～Ｃ８のヘテロアリ－ル基であって、同一または異なってＮ、Ｏ、Ｓ各原子の１～４個を含む単環、多環または縮合環であり、具体的例として、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、２－キノニル、３－キノニル、４－キノニル、５－キノニル、６－キノニル、７－キノニル、８－キノニル、２－インドリル、３－インドリル、４－インドリル、５－インドリル、６－インドリル、７－インドリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピロリジル、３－ピロリジル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、５－イミダゾリル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル等を挙げることが出来る。
　一実施態様において、本発明において用いられ得るＤ－アロースの誘導体は、例えば２－デオキシ－Ｄ－アロース、５－デオキシ－Ｄ－アロース、６－デオキシ－Ｄ－アロース、３－デオキシ－Ｄ－アロース（３－デオキシ－Ｄ－グルコース）等のＤ－アロースの誘導体等であってもよい。
　本発明において用いられ得る「Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物」は、薬理学的に許容され得るその塩または／および水和物も含まれる意味で解釈される。
　本明細書において、「食品」は、食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品をも含むものであり、さらにダイエタリーサプリメント（サプリメント、栄養補助食品）、飼料、食品添加物等も本発明の食品に包含される。本発明のサイトカインの産生を抑制するための組成物は、Ｄ－アロースという食品を有効成分とするものであり、甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品又は飼料の形態で用いられてもよく、いずれの形態で用いても、サイトカインの産生を抑制することを可能とする。
　一実施態様において、本発明の組成物は、任意の投与経路で投与することができる。投与経路としては、局所投与（皮膚上、吸入、注腸、点眼、点耳、経鼻、膣内等）、経腸投与（経口、経管、経注等）、非経口投与（経静脈、経動脈、経皮、筋肉注等）が挙げられる。
　一実施態様において、本発明の細胞増殖遅延剤として適用し得るＤ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物の用量は、本発明の効果が発揮される用量であれば、適宜調整することができるが、例えば、１ｍｇ／ｋｇ体重／日～１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日で投与されるものであってもよく、年令、症状により適宜増減することも可能である。例えば、経腸管投与で摂取可能な１ｍｇ／ｋｇ体重／日～１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、１０ｍｇ／ｋｇ体重／日～８００ｍｇ／ｋｇ体重／日、５０ｍｇ／ｋｇ体重／日～５００ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で投与されてもよい。
　希少糖Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を食品の一成分として使用した場合、日常の食生活のなかで、希少糖Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物の有効量を安全に摂取することができる。その根拠として希少糖Ｄ－アロースは、アルドースであり、その面からヒトに投与できる安全性の高い化合物である。 
　本明細書において、「医薬品」とは、医薬品及び医薬部外品を含む意味で用いられる。
　本発明の細胞増殖遅延剤は、組成物として提供されてもよく、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物は、一般的賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤等の適当な添加剤を配合し、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤や、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、または油性ないし水性の懸濁等の適宜な剤型を選んで製剤化されて提供されてもよい。
　固形製剤としては、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物は、さらに、製剤学上許容されている添加物を含み、例えば充填剤類や増量剤類、結合剤類、崩壊剤類、溶解促進剤類、湿潤剤類、または潤滑剤類等を必要に応じて選択して混合し、製剤化することができる。また、固形製剤としては、Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
　錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。 
　一実施態様において、本発明の組成物は、上述の医薬品（医薬組成物）の他に、食品（例えば、医療用食品、特定保健用食品、健康補助食品、健康食品、栄養機能食品、サプリメント、ダイエタリーサプリメント、またはハーブティなど）としても提供可能である。Ｄ－アロースは、１ｍｇ／ｋｇ体重／日～１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量（例えば、５０ｋｇの成人の場合、５０ｍｇ～５０ｇ／日）で投与されてもよい。
　本発明の剤を化粧品として用いる場合は、化粧水、乳液、ファンデーション、口紅、リップクリーム、クレンジングクリーム、マッサージクリーム、パック、ハンドクリーム、ハンドパウダー、ボディシャンプー、ボディローション、ボディクリーム、浴用化粧品等の形態として用いてもよい。
　上記成分に加えて、さらに必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品、医薬品、医薬部外品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば酸化防止剤、油分、紫外線防御剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
　本発明の剤は、外皮に適用される化粧料、医薬部外品等として適用可能であり、その剤型も皮膚に適用できるものであれば限定されず、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水－油二層系、水－油－粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。
　本発明を適用可能な対象は、ヒトを含む動物（ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類等）であってもよく、特に限定されない。
　以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜実施例１：培養ヒト脳腫瘍細胞を使用した解析＞
　培養ヒト脳腫瘍細胞株であるＵ２５１細胞又はＵ８７細胞に対し、糖の投与なし（コントロール）あるいは各濃度（３、５、１０、３０又は５０ｍＭ）のＤ－アロース又はＤ－グルコースを添加し、４８時間培養後に、ＷＳＴ－１アッセイを行い、細胞増殖に与える影響を比較した。
　その結果、希少糖であるＤ－アロースは培養ヒト脳腫瘍細胞株であるＵ２５１細胞とＵ８７細胞において、図１に示すような細胞増殖抑制作用を用量依存的に示した。
　Ｄ－アロースによる脳腫瘍細胞の増殖抑制効果のメカニズムを解析するため、アポトーシスについて、アネキシンＶ染色後の細胞をフローサイトメトリーによって評価した（図２）。
　その結果、脳腫瘍細胞増殖抑制効果を生じるＤ－アロースの用量では、アポトーシスを生じないことが明らかとなった。すなわち、Ｄ－アロースによる脳腫瘍細胞増殖抑制効果は、アポトーシスを介さないということが示された（図２）。
　そこで、Ｄ－アロースが細胞周期を停止さることにより脳腫瘍細胞の増殖抑制を生じている可能性を考え、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ解析）を使用して、細胞周期の変化を同定した（参照：Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　Ｆ，　Ｔａｋａｔａ　Ｍ，　Ｋａｍｉｔｏｒｉ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｒａｒｅ　ｓｕｇａｒ　Ｄ－ａｌｌｏｓｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＸＮＩＰ　ａｎｄ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　Ｇ１　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ２７ｋｉｐ１．　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ．　２００８；３２（２）：３７７－３８５．）。具体的には、細胞周期は、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ　（ＰＩ）／　ＲＮａｓｅ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で評価した。細胞は、ＤＭＥＭ、５０ｍＭ－Ｄグルコースまたは５０ｍＭ－Ｄアロースを用いて２４時間培養した。その後、培養した細胞をトリプシンで回収し、ＰＢＳで２回洗浄した後、－２０℃で一晩かけて７０％エタノールで固定した。ＰＢＳで洗浄した後、５００μｌのＰＩ試薬で３０分間、室温、暗室で細胞を染色し、ＰＢＳで洗浄した後、フローサイトメトリーを使用し、６１７ｎｍでの発光をモニターした。データはＫａｌｕｚａ解析ソフトウェア（Ｖｅｒ．１．２，　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析し、細胞周期への影響は、細胞周期の各相における細胞分布の割合の変化によって評価した。
　その結果、図３に示すように、脳腫瘍細胞の増殖抑制効果を生じるＤ－アロース　５０ｍＭの投与は、各脳腫瘍細胞周期の停止を誘導しなかった。すなわち、Ｄ－アロースによる脳腫瘍細胞の増殖抑制効果は、細胞周期の停止を介さないということが示された。
　次に、最近、細胞増殖モニタリング試薬として使用されているフローサイトメトリー用の蛍光プローブであるＣｙｔｏＴｅｌｌ（商標）を脳腫瘍細胞に２４時間取り込ませ、その後、糖の投与なし（コントロール）、Ｄ－グルコース　５０ｍＭ、Ｄ－アロース　５０ｍＭを投与した状態で９６時間放置し、各細胞での蛍光プローブ強度の減衰を評価した（図４－１）。
　その結果、脳腫瘍細胞増殖抑制効果を生じるＤ－アロース　５０ｍＭの投与は、著しく各脳腫瘍細胞での蛍光プローブ強度の減衰を抑制することが明らかとなった（図４－２）。
　以上の結果より、Ｄ－アロースはアポトーシスによる細胞死や細胞周期の停止を生じることなく、細胞の増殖スピードを遅延させる効果が示された。すなわち、細胞周期を停止させずに全体をゆっくりと減速させる「細胞スローサイクリング」を生じている可能性が強く考えられたため、さらなる解析を培養ヒト膵臓癌細胞株であるＰＫ－１細胞を使用して実施した。
＜実施例２：培養ヒト膵癌細胞を使用した解析＞
　培養ヒト膵癌細胞株であるＰＫ－１細胞に対し、２５もしくは５０ｍＭのＤ－アロース又はＤ－グルコースを添加し、４８時間培養後に、ＷＳＴ－１アッセイを行い、細胞増殖に与える影響を比較した。
　培養脳腫瘍細胞において得られた結果と同様、Ｄ－アロースは培養膵癌細胞株であるＰＫ－１細胞において、図５に示すような細胞増殖抑制作用を示した。
　アネキシンＶ染色を行い、フローサイトメトリーを使用してアポトーシスについて評価したが、膵癌ＰＫ－１細胞の増殖抑制効果を生じた用量である５０ｍＭのＤ－アロースでは、アポトーシスは生じていないことが確認された（図６）。
　そこで、Ｄ－アロースによる培養ヒト膵癌ＰＫ－１細胞の増殖抑制効果が細胞周期の停止を介している可能性を考え、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ解析）を使用して細胞周期の変化を同定した。具体的には、ＰＫ－１細胞を一晩血清飢餓状態にした後、７０％エタノールを用いて－２０℃で一晩固定した。細胞ＤＮＡを染色するために、遠心分離したペレット状の細胞を４５０μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）／ＲＮａｓｅ溶液（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｄａｎｖｅｒｓ，　ＭＡ，　ＵＳＡ）に再懸濁し、室温で３０分間、暗所で培養した。その後、サンプルあたり１０，０００個の細胞をフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ，　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，　ＩＮ，　ＵＳＡ）で分析した。
　その結果、膵癌ＰＫ－１細胞増殖を顕著に抑制するＤ－アロース　５０ｍＭ投与により、膵癌ＰＫ－１細胞のＧ０／Ｇ１期の割合が若干上昇する傾向が認められた（図７）。
　しかしながら、この程度のＤ－アロースによる変化が、非常に強い増殖抑制効果をもたらしたかについては疑問が残った。そこで、Ｄ－アロースが細胞周期の変化を全体的に遅延させるのではないかと考え、図８に示す検証を実施した。
　まず、培養ヒト膵癌ＰＫ－１細胞にノコダゾール５０ｎＭを１２時間作用させ、細胞周期をいったんストップさせた。その後、ノコダゾールを培養液から取り除くことにより、再び細胞周期が動き始めるため、リセットした状態から細胞周期を経時的に観察することが可能となる。このような実験条件下において、Ｄ－アロースが細胞周期のスピードに対してどのような効果を示すのかについて、詳細に検討を実施した。
　その結果、Ｄ－アロースを投与した培養ヒト膵癌ＰＫ－１細胞では、Ｇ０／１期からＳ期への移行が有意に遅延することが明らかとなった。このような遅延作用により、結果的にＧ２／Ｍ期への移行も遅延することも示された。
　以上、Ｄ－アロースは細胞周期を停止させず、Ｇ０／１期からＳ期への移行を有意に遅らせる作用を介して、細胞周期のスピードを全体的に遅延させ、増殖する抑制する効果につながるのではないかと考えられた。
　しかし、このようなＤ－アロースの効果がなぜ生じるのかについては明らかとなっていないため、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（旧Ｓｅａｈｏｒｓｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製の細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４（２４ｗｅｌｌ用）を使用して、培養ヒト膵癌ＰＫ－１細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ値）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）を測定し、解糖系に対する影響を検討した（図１０）。
　その結果、培養ヒト膵癌ＰＫ－１細胞にＤ－アロースを５０ｍＭの濃度で１６時間投与すると、その細胞の解糖系が著しく低下していることが明らかとなった。しかも、当該細胞の最大限の解糖系の能力、すなわち予備能を示す「解糖系能力」も低下させていることが示された。
＜実施例３：培養ヒト膵癌細胞を使用した解析＞
　Ｄ－アロースの誘導体にも同様に細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させる効果を有するか確かめるために、Ｄ－アロースの誘導体であるアリトールを用いて、実施例２と同様の実験を行った。コントロールとして糖アルコールの一つであるＤ－マンニトールを用いた。
　培養ヒト膵癌細胞株であるＰＫ－１細胞に対し、５０ｍＭのアリトール又はＤ－マンニトールを添加し、４８時間培養後に、ＷＳＴ－１アッセイを行い、細胞増殖に与える影響を比較した。また、
　アリトールは、Ｄ－アロースと同様、培養膵癌細胞株であるＰＫ－１細胞において、胞増殖抑制作用を示した（図１１）。
　アネキシンＶ染色を行い、フローサイトメトリーを使用してアポトーシスについて評価した。その結果、膵癌ＰＫ－１細胞の増殖抑制効果を生じた用量である５０ｍＭのアリトールでは、アポトーシスは生じていないことが確認された（図１２）。
　そこで、アリトールによる培養ヒト膵癌ＰＫ－１細胞の増殖抑制効果が細胞周期の停止を介している可能性を考え、実施例２と同様の方法によりフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ解析）を使用して細胞周期の変化を同定した。
　その結果、Ｄ－アロースの効果よりは弱いが、Ｄ－アロースを投与した時と同様にアリトールにおいても、培養ヒト膵癌ＰＫ－１細胞では、Ｇ０／１期からＳ期への移行が有意に遅延することが明らかとなった。このような遅延作用により、結果的にＧ２／Ｍ期への移行も遅延することも示された。
　アリトールも、Ｄ－アロースと同様に細胞周期を停止させず、Ｇ０／１期からＳ期への移行を有意に遅らせる作用を介して細胞周期のスピードを全体的に遅延させ、細胞増殖する抑制する効果を発揮する可能性が示唆された。
　実施例２と同様に、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（旧Ｓｅａｈｏｒｓｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製の細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４（２４ｗｅｌｌ用）を使用して、培養ヒト膵癌ＰＫ－１細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ値）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）を測定し、解糖系に対する影響も検討した。
　その結果、培養ヒト膵癌ＰＫ－１細胞にアリトールを５０ｍＭの濃度で１８時間投与すると、その細胞の解糖系が低下していることが明らかとなった。しかも、当該細胞の最大限の解糖系の能力、すなわち予備能を示す「解糖系能力」も有意に低下させていることが示された。
　以上、これまでの実験データにより、Ｄ－アロース及びアリトールは解糖系を抑制することによってＧ０／１期からＳ期への移行を有意に遅らせ、これが「細胞スローサイクリング」につながり、癌細胞の抑制作用を生じているのではないかと考えられた。
＜実施例４：ヒト膵癌細胞株を使用したメタボローム解析＞
　培養ヒト膵癌細胞株であるＰＫ－１細胞及びＰＡＮＣ－１（５．０×１０６個）に対し、糖の添加なし（コントロール）あるいは５０　ｍＭのＤ－グルコース又はＤ－アロースを添加し、１２時間、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。その後、各細胞について、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社（山形県鶴岡市、日本）が提供するプロトコールに従ってサンプルを調製し、同社が提供する解析サービス（サービス名：C-SCOPE（https://humanmetabolome.com/jpn/service/analysis/cscope/））により、中心エネルギー代謝（解糖系、ＴＣＡ回路、アミノ酸代謝、及び核酸代謝）に関連する１１６物質（表１参照）について測定し、その測定結果に基づいて、主成分解析（ＰＣＡ）（図１５）、ヒートマップ解析（図１６～図１９）及びパスウェイマップ解析（図２０）を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　主成分解析（図１５）及びヒートマップ解析（図１６～図１９）の結果より、膵癌細胞は、Ｄ－アロースを添加することにより、細胞内の代謝プロファイルが大きく変化することが明らかとなった。特にＤ－アロースを膵癌細胞に添加することにより、解糖系におけるグルコース６リン酸（Glucose 6-phosphate)及びフルクトース６リン酸（Fructose 6-phospate)を増加させる一方で、フルクトース１,6-二リン酸（Fructose 1,6-diphosphate）を減少させた。また、Ｄ－アロースの添加により、ポリオールパスウェイにおけるフルクトース１リン酸（Fructose 1-phospate)が増加していた。これらの結果より、Ｄ－アロースは、解糖系やポリオールパスウェイにおいて、これらの物質の代謝を媒介する経路に作用している可能性が示唆された（図２０）。
＜実施例５：Ｄ－アロースを添加したヒト膵癌細胞株ＰＫ－１細胞の細胞周期の可視化＞
　ヒト膵癌細胞株ＰＫ－１に、Ａｄｄｇｅｎｅ（マサチューセッツ州、米国）より購入したｔＦｕｃｃｉ（ＣＡ）５（Ｐｌａｓｍｉｄ　＃１５３５２１）（参考：Ando R., et al., Two new coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression. bioRxiv, 2020, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.30.015156v2）をトランスフェクトし、細胞周期を可視化した。ｔＦｕｃｃｉ（ＣＡ）５をトランスフェクトした細胞は、蛍光顕微鏡を用いて観察した場合、Ｇ１期では赤、Ｓ期では緑、Ｇ２／Ｍ期では黄～オレンジを呈する（図２１）。当該細胞を用いて、Ｄ－アロース（５０　ｍＭ）の添加の有無によるヒト膵癌細胞株ＰＫ－１細胞の細胞周期への影響を観察した。
　その結果、Ｄ－アロースを添加することにより、ヒト膵癌細胞株ＰＫ－１細胞のＧ１期からＳ期への移行を中心とした細胞周期が遅延することが示された（図２２）。

Claims (9)

  1. 　Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として含み、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させる、細胞増殖遅延剤。
  2. 　Ｄ－アロースの誘導体が、アリトールである、請求項１に記載の細胞増殖遅延剤。
  3. 　細胞周期を停止しない、請求項１または２に記載の細胞増殖遅延剤。
  4. 　細胞における解糖系の活性を抑制する、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤。
  5. 　癌細胞の増殖を遅延させる、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤。
  6. 　膵臓癌細胞、又は脳腫瘍細胞の増殖を遅延させる、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤。
  7. 　細胞の老化を遅延させる、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤。
  8. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞増殖遅延剤を含む、細胞の老化を遅延させる化粧品。
  9. 　Ｄ－アロースおよび／またはその誘導体および／またはその混合物を有効成分として含む細胞増殖遅延剤を、それを必要とする対象に投与し、細胞周期のＧ０／１期に留まる期間を延長させること
    を含む、対象における細胞増殖を遅延させる方法。
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