KR20160131118A - 상이한 결합 특징을 전시하는 vl 항원 결합 단백질 - Google Patents

상이한 결합 특징을 전시하는 vl 항원 결합 단백질 Download PDF

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KR20160131118A
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로버트 밥
아쉬크 라피크
타미 티. 후앙
에르강 쉬
린 맥도날드
앤드류 제이. 머피
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

중쇄 불변 영역과 융합된, 체성으로 초돌연변이된 경쇄 가변 도메인을 비롯한 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 내포하는 결합 단백질을 만들고, 확인하고, 단리하고 및/또는 만들기 위한 방법이 제공된다. 소형 분자에 특정한 예시적인 결합 단백질 역시 제공된다.

Description

상이한 결합 특징을 전시하는 VL 항원 결합 단백질{VL ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에, 2014년 3월 21일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/968,896, 2014년 12월 5일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/088,117, 그리고 2014년 11월 13일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/079,078에 우선권을 주장하고, 이들 각 출원은 본원에 참조로서 편입된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로, 소형 분자에 결합하는 VL 항원 결합 단백질에 관계하고 및/또는 VL 항원 결합 단백질 상호작용을 특징짓고 이러한 특징화로부터 도출된 정보를 이용하여 VL 항원 결합 단백질을 군으로 분류하는 것에 관계하고, 이들 군은 전통적인 항체에 의해 전시되지 않는 결합 특징을 갖는 항원 결합 VL 단백질의 선별을 위한 보도로서 이용될 수 있다.
배경
항체는 생물학적 진단학 및/또는 요법에 대한 유망한 양상으로서 부상하였다. 가령, 중화 항체는 병원체가 확립되고 감염에 이르기 전에 이를 가로막고 비활성화시킬 수 있다. 길항성 항체는 예로서, 종양 진행 또는 자가면역에서 유력한 조절장애된 신호전달을 간섭할 수 있고, 그리고 효현성 항체는 면역 반응을 증강하는데 이용될 수 있다. 이들 능력은 항체의 에피토프에 대한 특정한 인식 및 친화성, 항체가 결합하는 항원성 부위에 부분적으로 기초된다. 하나의 표적 항원에 대하여 다수의 항체가 산출될 수 있고, 그리고 각 항체는 친화성 및 에피토프 인식 중에서 어느 하나 또는 둘 모두의 면에서 실제적으로 변할 수 있다. 추가적으로, 전통적인 항체-기초된 설계가 제한될 수 있는데, 그 이유는 전통적인 항체에서 항원 결합 부위가 모든 항원에 충분히 적합한 것은 아니기 때문이다. 본 발명은 면역글로불린-기초된 치료적 설계의 향상 및 다각화가 여전히 요구된다는 인식을 포괄한다.
요약
본원에서 설명된 다양한 양상 및 구체예는 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 내포하는 결합 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 본원에서 인식된 다양한 문제를 해결할 수 있고 및/또는 놀라운 결과를 제공할 수 있다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초된다. 가령, 유전체가 (i) 재배열되지 않은 인간 경쇄 유전자 분절 (가령, VL 및 JL 유전자 분절)을 내포하는 면역글로불린 중쇄 좌위; 그리고 (ii) 재배열되지 않은 인간 경쇄 유전자 분절 (가령, VL 및 JL 유전자 분절)을 내포하는 면역글로불린 경쇄 좌위 둘 모두를 포함하는 비인간 동물은 전통적인 인간화 비인간 동물로부터 획득하기 어려웠던 더욱 다양화된 레퍼토리의 항원 결합 단백질, 예를 들면, VL 결합 단백질을 제공할 수 있다. 본원에서 개시된 유전적으로 조작된 동물에서 산출된 VL 항원 결합 단백질은 전통적인 항체에 의해 달성될 수 있는 것보다 더욱 높은 친화성으로 소형 분자에 결합하고, 그리고 또한, 전통적인 항체에 의해 전시되는 것들과 상이한 하나 또는 그 이상의 결합 특징 또는 특성을 전시할 수 있다.
일반적으로, 본원에서 개시된 바와 같은 VL 항원 결합 단백질은 소형 분자에 특이적으로 결합하고 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 하이브리드 면역글로불린 사슬을 포함한다. VL 항원 결합 단백질은 또한, 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 연관되어 소형 분자에 특이적으로 결합하는 결합 포켓을 형성한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 연관되어 결합 포켓을 형성하는 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인으로 본질적으로 구성되는 항원 결합 단백질을 제공하고, 여기서 항원 결합 단백질은 소형 분자에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 중쇄 불변 도메인에 작동가능하게 연결된다. 이러한 하이브리드 VL-CH 면역글로불린 사슬은 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 경쇄 가변 (VL) 유전자 분절 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절로부터 유래된다. 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 경쇄 불변 도메인 (VL-CL)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 구체예에서, VL 항원 결합 단백질의 각 사슬은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절에 의해 인코딩된 및/또는 이것으로부터 유래된 아미노산 서열을 결여한다.
일부 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 4-1, Vκ 1-5, Vκ 3-15, Vκ 3-20, 그리고 Vκ 1-33으로 구성된 군에서 선택되는 인간 Vκ 유전자 분절로부터 유래된 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Jκ 1, Jκ 3, Jκ 4 및 Jκ 5로 구성된 군에서 선택되는 Jκ 유전자 분절로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 1-5 유전자 분절로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 1-5 유전자 분절로부터 유래되고, 그리고 두 번째 면역글로불린 경쇄 도메인은 Vκ 3-20 유전자 분절로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 1-5 유전자 분절, 그리고 Jκ 3, Jκ 4 및 Jκ 5로 구성된 군에서 선택되는 Jκ 유전자 분절로부터 유래된다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 4-1 유전자 분절로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 4-1 유전자 분절 및 Jκ 1 유전자 분절로부터 유래된다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 4-1 유전자 분절로부터 유래되고, 그리고 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 4-1 또는 Vκ 3-20 유전자 분절로부터 유래된다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 3-20 유전자 분절로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 3-20 유전자 분절 및 Jκ 1 또는 Jκ 2 유전자 분절로부터 유래된다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 3-20 유전자 분절로부터 유래되고, 그리고 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 4-1 또는 Vκ 1-5 유전자 분절로부터 유래된다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 3-15 유전자 분절로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 3-15 유전자 분절 및 Jκ 5 유전자 분절로부터 유래된다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 3-15 유전자 분절로부터 유래되고, 그리고 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 Vκ 1-39 유전자 분절로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 가변 도메인은 표 A에서 진술된 바와 같은 개별 Vκ1:Jκ1 Vκ2:Jκ2 유전자 분절로부터 유래된다.
Figure pct00001
일부 구체예에서, 하이브리드 VL-CH 면역글로불린 사슬의 CDR3 길이는 경쇄 불변 도메인에 연결된 가벼운 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL-CL)의 CDR3 길이보다 짧다. 일부 구체예에서, 하이브리드 면역글로불린 경쇄의 CDR3은 경쇄의 CDR3보다 최소한 하나의 아미노산 짧다. 다른 구체예에서, CDR3 길이는 최소한 2개의 아미노산에 의해 다르다. 다른 구체예에서, CDR3 길이는 최소한 3개의 아미노산에 의해 다르다. 다른 구체예에서, CDR3 길이는 최소한 4개의 아미노산에 의해 다르다. 일부 구체예에서, 하이브리드 면역글로불린 사슬의 CDR3은 길이에서 6개 아미노산이고, 그리고 경쇄의 CDR3은 길이에서 약 9개 아미노산이다.
일부 일정한 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 비인간 동물로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 비인간 동물로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, CH3, CH4, 그리고 이들의 조합에서 선택된다. 일부 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, 그리고 CH3을 포함한다.
일부 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 생쥐 및 쥐에서 선택되는 설치류로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 VL 항원 결합 단백질은 면역글로불린 경쇄와 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질보다 높은 친화성으로 소형 분자에 결합한다. 일부 구체예에서, VL 항원 결합 단백질은 50 nM보다 적은 KD로 소형 분자에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, VL 항원 결합 단백질의 KD는 40 nM보다 적다. 추가 구체예에서, VL 항원 결합 단백질의 KD는 30 nM보다 적다. 다른 구체예에서, VL 항원 결합 단백질의 KD는 20 nM보다 적다. 다른 구체예에서, VL 항원 결합 단백질의 KD는 10 nM보다 적다.
한 양상에서, 본원에서 개시된 바와 같은 소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 항원 결합 단백질의 하이브리드 면역글로불린 사슬 또는 경쇄의 가변 도메인을 인코딩하는 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자를 포함하는 세포 또는 핵산, 그리고 이런 세포 또는 핵산을 획득하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 구체예에서, 소형 분자에 특정한 VL 항원 결합 단백질을 획득하기 위한 방법이 제공되고, 이들 방법은 소형 분자에 결합하는 VL 항원 결합 단백질의 하나 또는 그 이상의 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함하고 및/또는 인코딩하는 세포 또는 핵산 서열을 획득하는 것을 포함할 수 있다. 이들 방법은 일반적으로, 본원에서 개시된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터, 소형 분자에 결합하는 VL 결합 단백질 및/또는 VL 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 단리하는 것을 포함하고, 여기서 VL 결합 단백질은 소형 분자에 특이적으로 결합한다.
본원에서 개시된 유전적으로 조작된 비인간 동물은 예로서, 포유동물 및 특정 구체예에서, 설치류 (가령, 생쥐, 쥐, 또는 햄스터)를 포함한다. 일부 구체예에서, 비인간 동물은 조류, 예를 들면, 닭을 포함한다. 다양한 구체예에서, 설치류는 생쥐 및 쥐에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 비인간 동물의 유전체는 (i) 재배열되지 않은 인간 경쇄 유전자 분절 (가령, VL 및 JL 유전자 분절)을 내포하는 면역글로불린 중쇄 좌위 및 (ii) 재배열되지 않은 인간 경쇄 유전자 분절 (가령, VL 및 JL 유전자 분절)을 내포하는 면역글로불린 경쇄 좌위 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예에서, (i)의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절은 유전체 내에 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위에서 존재한다. 일부 구체예에서, 비인간 동물은 모든 내인성 기능적 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 결여한다. 일부 구체예에서, 비인간 동물은 모든 내인성, 기능적 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 결여하고, 그리고 비인간 동물은 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 일정한 구체예에서, Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 모두 유전체 내에 이소성으로 배치된다.
일부 구체예에서, (ii)의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절은 비인간 동물의 내인성 면역글로불린 경쇄 좌위에서 존재한다. 일부 일정한 구체예에서, 내인성 면역글로불린 경쇄 좌위는 κ 경쇄 좌위이다.
일부 구체예에서, (i)의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절은 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이다. 일부 구체예에서, (ii)의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절은 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이다. 일부 구체예에서, (ii)의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 분절은 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이고, 그리고 경쇄 불변 영역 핵산 서열은 생쥐 Cκ 영역 핵산 서열 또는 쥐 Cκ 영역 핵산 서열이다.
일부 구체예에서, 비인간 동물은 소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 항원 결합 단백질을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 림프구, 예를 들면, NK 세포, T 세포 또는 B 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 하이브리드 VL-CH 사슬을 포함하는 VL 결합 단백질을 발현한다. 일부 구체예에서, VL 결합 단백질은 2개의 동일한 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, VL 결합 단백질은 이질성 서열을 갖는 2개의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 동물로부터 단리된 세포는 B 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 기억 B 세포이다.
소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 항원 결합 단백질의 하이브리드 면역글로불린 사슬 또는 경쇄의 가변 도메인을 인코딩하는 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자를 포함하는 핵산 또한, 예로서 본원에서 개시된 비인간 동물로부터 단리된 세포로부터, 소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 결합 단백질의 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 첫 번째와 두 번째 핵산 서열을 확인함으로써 단리될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 세포 및/또는 핵산을 획득하는 방법은 (a) 비인간 동물을 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자로 면역화하고, 여기서 비인간 동물은 이의 유전체 내에, (i) 비인간 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절, 그리고 (ii) 비인간 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절을 포함하고, (b) 면역화된 비인간 동물로부터 세포를 단리하고, 여기서 세포는 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 첫 번째와 두 번째 핵산 서열을 포함하고; 그리고 (c) 세포로부터, 소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 결합 단백질의 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 첫 번째 및 두 번째 핵산 서열을 확인하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 비인간 동물을 면역화하는 것은 비인간 동물을 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자로 기폭하고, 비인간 동물이 일정한 기간 동안 안정하도록 허용하고, 그리고 상기 동물을 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자로 재면역화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 기간은 며칠, 최소한 1 주, 최소한 2 주, 최소한 3 주, 최소한 4 주, 또는 최소한 1 개월이다. 일부 구체예에서, 비인간 동물을 면역화하는 것은 비인간 동물이 면역 반응을 시작하도록 허용하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포는 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 또는 유세포분석법을 통해 획득된다. 일부 구체예에서, 세포는 면역화된 비인간 동물의 조직으로부터 획득되고, 그리고 여기서 조직은 비장, 림프절, 혈액 및 골수로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 림프구를 암 세포와 융합하여, 예로서 하이브리도마를 만드는 것을 더욱 포함한다. 일부 일정한 구체예에서, 암 세포는 골수종 세포이다. 따라서, 하이브리도마 및 그것으로부터 단리된 핵산 또한 본원에서 제공되고, 여기서 하이브리도마는 소형 분자에 특정한 VL 결합 단백질을 발현한다.
일부 구체예에서, 소형 분자에 특정한 VL 항원 결합 단백질을 만들기 위한 방법은 또한, 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 소형 분자에 특이적으로 결합하는 이합체로서 발현하는데 적합한 발현 시스템에서 소형 분자에 특정한 VL 항원 결합 단백질의 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 첫 번째 및 두 번째 핵산을 발현하는 것을 포함할 수 있다.
(a) 유전체 내에: (i) 비인간 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절, 그리고 (ii) 비인간 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절; 그리고 (b) 소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 항원 결합 단백질을 포함하는 비인간 동물 역시 제공된다.
일부 구체예에서, 비인간 동물은 참조 비인간 동물보다 2-배 또는 그 이상, 예를 들면, 최소한 3-배, 최소한 4-배, 최소한 5-배, 최소한 6-배, 최소한 7-배, 최소한 8-배, 최소한 10-배, 또는 20-배 또는 그 이상의 항원-양성 B 세포를 전시한다. 일부 구체예에서, 참조 비인간 동물은 면역화 시에 키메라 항체를 발현하는데, 여기서 키메라 항체는 인간 VH 도메인 및 생쥐 CH 도메인을 포함하는 중쇄 및 인간 VL 도메인 및 생쥐 CL 도메인을 갖는 경쇄를 갖는다. 일부 일정한 구체예에서, 참조 비인간 동물은 야생형 비인간 동물이다. 일부 구체예에서, 면역화는 비인간 동물을 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자로 기폭하고, 비인간 동물이 일정한 기간 동안 안정하도록 허용하고, 그리고 상기 동물을 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자로 재면역화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 기간은 며칠, 최소한 1 주, 최소한 2 주, 최소한 3 주, 최소한 4 주, 또는 최소한 1 개월이다. 일부 구체예에서, 항원-양성 B 세포는 기억 B 세포이다.
일부 구체예에서, 비인간 동물은 참조 비인간 동물보다 최소한 2-배, 최소한 3-배, 최소한 4-배, 또는 최소한 5-배 또는 그 이상의 항체 역가를 전시한다. 일부 일정한 구체예에서, 참조 비인간 동물은 유전적으로 변형된 생쥐이고, 이것은 면역화 시에 키메라 항원 결합 단백질을 발현하고, 그리고 키메라 항원 결합 단백질은 인간 VH 도메인 및 생쥐 CH 도메인을 내포하는 중쇄, 그리고 인간 VL 도메인 및 생쥐 CL 도메인을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 일정한 구체예에서, 참조 비인간 동물은 야생형 비인간 동물이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 소형 분자는 합텐이고 담체에 연결된다. 일부 일정한 구체예에서, 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 전복 (Concholepas concholepas) 헤모시아닌 (CCH), 소 혈청 알부민 (BSA), 양이온화된 소 혈청 알부민 (cBSA), 또는 난백알부민을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 소형 분자는 분자량이 6 kDa보다 적은 유기 화합물이다.
한 양상에서, 전통적인 항체에 의해 전시되지 않는 결합 특징을 전시하는 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질을 확인하고 및/또는 단리하는 방법, 이렇게 확인되고 및/또는 단리된 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질, 이들을 인코딩하는 핵산, 및/또는 이들을 발현하는 숙주 세포가 본원에서 개시된다.
한 구체예에서, 항원에 특이적으로 결합할 때, 본원에서 개시된 바와 같이 항원에 또한 특이적으로 결합하는 전통적인 항체에 의해 전시되지 않는 독특한 결합 특징을 전시하는 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질을 확인하는 방법은 (a) 항원에 특이적으로 결합하는 복수의 면역글로불린 단백질 각각의 하나 또는 그 이상의 결합 특징을 프로파일링하고, 여기서 복수의 면역글로불린 단백질은 VL 항원 결합 단백질 및 전통적인 항체를 포함하고, 여기서 각 VL 항원 결합 단백질은 (i) 하나 또는 그 이상의 경쇄 가변 영역 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 (ii) 하나 또는 그 이상의 중쇄 불변 영역 유전자 분절로부터 유래된 불변 도메인을 포함하는 하이브리드 면역글로불린 사슬을 포함하고, 여기서 각 전통적인 항체는 하나 또는 그 이상의 중쇄 가변 영역으로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 하나 또는 그 이상의 경쇄 가변 영역 유전자 분절로부터 유래된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하고; (b) 복수의 면역글로불린 단백질을 각 면역글로불린 단백질의 최소한 하나의 결합 특징에 근거하여 하나 또는 그 이상의 군으로 비닝 (binning)하고, 여기서 유사한 결합 특징을 전시하는 VL 항원 결합 단백질 및 전통적인 항체는 동일한 군으로 비닝되고; 그리고 (c) 모든 또는 실제적으로 모든 VL 항원 결합 단백질을 포함하는 군을 확인하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 면역글로불린 단백질 각각의 하나 또는 그 이상의 결합 특징은 차별적 항원 붕괴에 의해 프로파일링된다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방법은 복수의 면역글로불린 단백질 각각에 의해 결합된 항원의 하나 또는 그 이상의 에피토프를 지도화하는 것을 더욱 포함하고; 여기서 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 면역글로불린 단백질은 동일한 기능적 군으로 비닝된다. 일부 구체예에서, 복수의 면역글로불린 단백질 각각에 의해 결합된 항원의 하나 또는 그 이상의 에피토프를 지도화하는 것은 교차 차단 검정, 항원 돌연변이체의 알라닌 스캐닝, 펩티드 블롯, 펩티드 개열 분석, 에피토프 절제, 에피토프 추출, 항원의 화학적 변형, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 에피토프 지도화 검정을 포함한다.
본원에서 개시된 방법에서, 복수의 항원 결합 단백질의 하나 또는 그 이상의 결합 특징은 고체 표면 위에 고정된 항원을 이용하여 결정된다. 일부 구체예에서, 고체 표면은 바이오센서 칩 또는 폴리스티렌 비드를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원은 고정 후 및 프로파일링에 앞서 변형된다. 변형은 화학 약품 (가령, 트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀 염산염 (TCEP●HCl)/요오드아세트아미드, N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)/에탄올아민, 요오드아세트아미드 및 히드라진, p-히드록시페닐글리옥살 (HPG), 과산화수소, N-브로모숙신이미드, N-아세틸이미다졸, 테트라니트로메탄, 아르사닐릭산, 단실 염화물, 글루타르알데히드, 닌히드린, 디에틸피로카보네이트 (DEPC), 술포숙신이미딜 아세트산염 (술포-NHS-아세트산염), 폴리에틸렌 글리콜 5000 (PEG-5000), 7-히드록시쿠마린-3-카르복실산, 숙신이미딜 에스테르, 그리고 이들의 조합) 및/또는 효소 (가령, 돼지 트립신, 엔도프로테이나아제 Glu-C, 엔도프로테이나아제 Asp-N, 키모트립신, 엔도프로테이나아제 Lys-C, 그리고 엔도프로테이나아제 Arg-C, 펩신, 파파인, 서몰리신, 서브틸리신, 프로테아제 K, 브로멜라인 술피드릴 특정한 프로테아제 (피신), 그리고 이들의 조합)로 달성될 수 있다.
본원에서 개시된 방법에 따른 비닝은 주성분 분석 (PCA) 및/또는 계층적 군집화를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 2가지 주성분이 데이터를 제공하기 위해 선별된다. 한 구체예에서, 비닝은 주성분 분석을 포함한다. 다른 구체예에서, 비닝은 계층적 군집화를 포함한다. 다른 구체예에서, 비닝은 주성분 분석 및 계층적 군집화 둘 모두를 포함한다. 비닝은 앞서 설명된 바와 같이 화학적으로 및/또는 효소적으로 교란된/변형된 항원 표면의 패널에 대한 각 면역글로불린 단백질의 결합 신호 강도를 포함하는 하나 또는 그 이상의 결합 프로필에 근거될 수 있다. 이런 비닝 결과는 일군의 면역글로불린 단백질에 대한 다른 전형적인 검정 데이터, 예를 들면, 연합 상수, 해리 상수, 평형 상수, 다양한 종으로부터 항원 동족체 또는 동일한 종의 관련된 패밀리 구성원을 향한 결합 특이성, 기능적 활성 데이터 (가령, 리간드 차단, 항원 인산화 및/또는 세포 내로 항원 내재화를 차단하는 능력) 또는 이들의 임의의 조합에 맞추어 정렬될 수 있다. 차별적 항원 붕괴 결합 데이터로부터 도출된 "나무-표", 예를 들면, 계층적 군집화 계통수로서 전시될 수 있는 정렬 결과는 각 면역글로불린 단백질에 대한 다른 다양한 검정 데이터에 맞추어 정렬되고, 저장통 (bin)을 공유하는 면역글로불린 단백질 사이에서 행동 패턴을 드러내는데 이용될 수 있다.
본원에서 개시된 바와 같은 일부 프로파일링 방법은 (d) 모든 또는 실제적으로 모든 VL 항원 결합 단백질을 포함하는 것으로 확인된 기능적 군에서 비닝된 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질을 단리하고 및/또는 (e) 단리된 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질이 전통적인 항체에 의해 인식되지 않는 항원의 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합한다는 것을 확증하는 것을 더욱 포함한다. 단리된 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질이 전통적인 항체에 의해 인식되지 않는 항원의 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합한다는 확증은 고처리량 경쟁적 결합 단백질 검정을 포함할 수 있다.
아미노산 서열 및/또는 이를 인코딩하는 핵산 서열은 본원에서 개시된 프로파일링 방법에 따라 단리된 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질 중에서 한 가지에 대해 결정될 수 있다. 따라서, 본원에서 개시된 프로파일링 방법에 따라 단리된 VL 항원 결합 단백질, 이렇게 확인되고 및/또는 단리된 VL 항원 결합 단백질의 하이브리드 면역글로불린 사슬의 가변 영역의 CDR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산, 그리고 이런 핵산을 발현하는 숙주 세포 또한 본원에서 제공된다.
전통적인 항체에 차폐되고 하나 또는 그 이상의 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질에 의해 인식되는 항원의 하나 또는 그 이상의 에피토프를 확인하는 방법 역시 본원에서 제공되고, 상기 방법은 본원에서 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 전통적인 항체에 의해 인식되지 않은 항원의 에피토프에 결합하는 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질을 확인하고, 그리고 (b) 확인된 하나 또는 그 이상의 항원 특이적 항원 결합 단백질에 의해 인식되는 하나 또는 그 이상의 에피토프를 지도화하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 특질, 목적 및 이점은 다음의 상세한 설명에서 명확하다. 하지만, 상세한 설명이 본 발명의 본 발명의 구체예를 지시하긴 하지만, 제한이 아닌 단지 예시에 의하여 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 발명의 범위 내에 다양한 변화와 변형은 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
다음의 도면으로 구성되는, 본원에서 포함된 도면은 제한이 아닌 단지 예시를 목적으로 한다.
도면 1은 위쪽에서 생쥐 중쇄 좌위의 계통도 (일정한 비율 아님), 그리고 아래쪽에서 인간 κ 경쇄 좌위의 계통도 (일정한 비율 아님)를 도해한다. 생쥐 중쇄 좌위는 길이에서 약 3 Mb이고, 그리고 대략 200개 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절, 13개 중쇄 다양성 (DH) 유전자 분절 및 4개 중쇄 연결 (JH) 유전자 분절뿐만 아니라 인핸서 (Enh) 및 중쇄 불변 (CH) 영역을 내포한다. 인간 κ 경쇄 좌위는 각각, 약 440 kb 및 600 kb에 걸쳐 있는 반대 극성의 원위 및 근위 콘틱 내로 중복된다. 이들 두 콘틱 사이에, Vκ 유전자 분절이 없는 것으로 생각되는 약 800 kb의 DNA가 있다. 인간 κ 경쇄 좌위는 약 76 Vκ 유전자 분절, 5 Jκ 유전자 분절, 인트로닉 인핸서 (Enh) 및 단일 불변 영역 (Cκ)을 내포한다.
도면 2는 생쥐 중쇄 좌위 내로 40개 인간 Vκ 및 5개 인간 Jκ 유전자 분절의 진행성 삽입을 위한 예시적인 표적화 전략을 보여준다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선별 카세트는 재조합효소 인식 부위 (R1, R2 등)가 도시된다. 생쥐 CH 영역에 작동가능하게 연결된 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 포함하는 변형된 생쥐 중쇄 좌위는 아래쪽에 도시된다.
도면 3은 생쥐 중쇄 좌위 내로 인간 Vλ 및 인간 Jλ 유전자 분절 (또는 4개 인간 Jλ 유전자 분절)의 진행성 삽입을 위한 예시적인 표적화 전략을 보여준다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선별 카세트는 재조합효소 인식 부위 (R1, R2 등)가 도시된다. 생쥐 CH 영역에 작동가능하게 연결된 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절 (1개 또는 4개)을 포함하는 변형된 생쥐 중쇄 좌위는 아래쪽에 도시된다.
도면 4는 KOH 생쥐 (MAID 1713/1242) 및 VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐 (VI3)로부터 획득된 항원-양성 항체 (또는 VL 항원 결합 단백질)의 총수 (왼쪽) 및 백분율 (오른쪽)을 보여준다.
도면 5는 KOH 생쥐 (MAID 1713/1242) 및 VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐 (VI3)로부터 획득된 항원 B에 특정한 항체의 상대적 결합 동역학을 보여준다.
도면 6은 차별적 항원 붕괴 (DAD)에 의해 결정될 때 전형적인 항원 A-특이적 항체 (○)와 상이한 최소한 하나의 결합 특징을 전시하는 항원 C-특이적 VL 항원 결합 단백질 (●)의 클러스터를 강조하는, 당단백질인 항원 C에 특정한 739개 결합 단백질의 2차원 주성분 분석 (PCA) 플롯을 제공한다.
도면 7은 (A) 하이브리드 사슬 또는 (B) 경쇄에서 항원 A (▧), 항원 B (■), 또는 항원 C (□)에 특정하고 일정한 CDR3 아미노산 길이 (x 축)를 갖는 VL 결합 단백질의 숫자 (총수; y 축)를 제공한다.
정의
본 발명은 설명된 특정 방법 및 실험적 조건에 한정되지 않는데, 그 이유는 이런 방법 및 조건이 변할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 것을 목적으로 하고 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되는데, 그 이유는 본 발명의 범위가 청구범위에 의해 규정되기 때문이다.
달리 규정되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 용어 및 관용구는 용어 또는 관용구가 이용되는 문맥으로부터 반대로 명확하게 지시되거나 또는 명확하게 드러나는 경우가 아니라면, 이들 용어 및 관용구가 당분야에서 획득한 의미를 포함한다. 비록 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법과 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있지만, 특정 방법과 재료가 하기에 설명된다. 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로서 편입된다.
"항원 결합 단백질," "결합 단백질," "면역글로불린 단백질" 또는 기타 유사한 것은 체성으로 돌연변이될 수 있고, 항원 (또는 이의 에피토프 부분)을 인식하고 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 모노- 또는 중합성 펩티드 분자, 예를 들면, 면역 반응 및 특히, 친화성 성숙된 면역글로불린 분자의 생산을 유도할 수 있는 물질을 지칭한다. 항원 결합 단백질은 VL 항원 결합 단백질 및 전통적인 항체를 포괄한다. 항원 결합 단백질의 "항원 결합 부위"는 항원에 결합하는 항원 결합 단백질의 영역을 지칭한다.
"VL 항원 결합 단백질," "항원 결합 VL 단백질," "VL 결합 단백질" 또는 기타 유사한 것은 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된, 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 단백질을 지칭한다. "VL 항원 결합 단백질"은 VL 결합 단백질이 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 2개의 경쇄 가변 도메인을 포함하도록, 경쇄를 더욱 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 한 구체예에서, VL 항원 결합 단백질의 최소한 2개의 경쇄 가변 도메인은 동계이다. 일부 구체예에서, 2개의 경쇄 가변 도메인 각각은 경쇄 가변 영역 (VL) 유전자 분절 및/또는 경쇄 연결 영역 (JL) 유전자 분절에 의해 인코딩되거나 또는 이것으로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 2개의 경쇄 가변 도메인 중에서 하나는 하이브리드 면역글로불린 사슬의 부분일 수 있고, 그리고 2개의 경쇄 가변 도메인 중에서 다른 것은 면역글로불린 경쇄 (L)의 부분일 수 있다. 이런 VL 결합 도메인은 예로서, 본원에서 전체적으로 참조로서 편입되는, 2011년 8월 2일자 제출된 U.S. 특허 공개 번호 20120096572에서 설명되었다.
용어 "항체," "전통적인 항체," "전형적인 항체," "항원 결합 항체," 또는 기타 유사한 것은 일반적으로, (i) 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절, 중쇄 다양성 (DH) 유전자 분절 및/또는 중쇄 연결 (JH) 유전자 분절로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 및 (ii) 경쇄 가변 (VL) 유전자 분절 및/또는 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절로부터 유래된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 부위를 최소한 포함하는 면역글로불린 단백질을 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 항체의 VH 및 VL 도메인은 동계이다. 따라서, 용어 항체, 전통적인 항체, 전형적인 항체, 또는 기타 유사한 것은 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 단편 항원 결합 (Fab) 영역, F(ab')2 단편 등을 포괄한다. 이런 용어는 또한, 사합체성 분자, 예를 들면, 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 면역글로불린 무거운 (H) 사슬 및 2개의 면역글로불린 가벼운 (L) 사슬을 갖는 분자를 포괄한다.
각 중쇄는 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된 더욱 보존된 영역이 산재되는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 초가변성의 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각 중쇄와 경쇄 가변 도메인은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로서 약칭될 수 있다; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로서 약칭될 수 있다). 용어 "높은 친화성" 항체는 표적 에피토프에 대하여 약 10-9 M 또는 그 이하 (가령, 약 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 또는 약 1 x 10-12 M)의 KD를 갖는 항체를 포함한다. 한 구체예에서, KD는 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, BIACORE™에 의해 계측된다; 다른 구체예에서, KD는 ELISA에 의해 계측된다.
본원에서 관심되는 하나 또는 그 이상의 값에 적용될 때 용어 "대략"은 언급된 참조값과 유사한 값을 포함한다. 일정한 구체예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되지 않으면 또는 문맥으로부터 달리 명백하지 않으면 언급된 참조값의 어느 한쪽 방향으로 (보다 크거나 또는 보다 적은) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하의 범위에 들어가는 값의 범위를 포함한다 (이런 숫자가 가능한 값의 100%를 초과할 경우를 제외하고).
용어 "생물학적으로 활성"은 생물학적 시스템에서, 시험관내에서 또는 생체내에서 (가령, 생물체 내에) 활성을 갖는 임의의 작용제의 특징을 포함한다. 가령, 생물체 내에 존재할 때, 상기 생물체 내에서 생물학적 효과를 갖는 작용제는 생물학적으로 활성인 것으로 고려된다. 특정 구체예에서, 단백질 또는 폴리펩티드가 생물학적으로 활성인 경우에, 단백질 또는 폴리펩티드의 최소한 하나의 생물학적 활성을 공유하는 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 부분은 전형적으로 "생물학적으로 활성" 부분으로서 지칭된다.
소형 분자의 문맥에서 용어 "담체", 예를 들면, 소형 분자에 부착된 담체는 소형 분자가 연계되어 소형 분자를 면역원성이 되게 만들 수 있는 거대분자, 일반적으로 단백질을 지칭한다.
용어 "동계"는 "와 동계"의 의미에서 이용될 때 (가령, 두 번째 VL 도메인과 "동계"인 첫 번째 VL 도메인), 본 발명에 따라서 생쥐에 의해 만들어진 동일한 결합 단백질로부터 2개의 VL 도메인 사이에 관계에 대한 언급을 포함하는 것으로 의도된다. 가령, 본 발명의 구체예에 따라서 유전적으로 변형되는 생쥐, 예를 들면, VH, DH 및 JH 영역이 VL 및 JL 영역으로 대체되는 중쇄 좌위를 갖는 생쥐는 첫 번째 인간 VL 도메인과 융합된 동일한 생쥐 CH 영역 (가령, IgG 아이소타입)으로 만들어진 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬, 그리고 두 번째 인간 VL 도메인과 융합된 동일한 생쥐 CL 영역으로 만들어진 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬을 갖는 항체-유사 결합 단백질을 만든다. 생쥐에서 클론 선택 동안, 첫 번째 및 두 번째 인간 VL 도메인은 단일 항체-유사 결합 단백질의 문맥에서 함께 나타나는 클론 선택 과정에 의해 선별되었다. 따라서, 단일 항체-유사 분자 내에 클론 선택 과정의 결과로서 함께 나타나는 첫 번째와 두 번째 VL 도메인은 "동계"인 것으로 지칭된다. 대조적으로, 첫 번째 항체-유사 분자에서 나타나는 VL 도메인 및 두 번째 항체-유사 분자에서 나타나는 VL 도메인은 첫 번째 및 두 번째 항체-유사 분자가 동일한 중쇄를 갖지 않으면 (즉, 첫 번째 인간 중쇄 영역에 융합된 VL 도메인 및 두 번째 인간 중쇄 영역에 융합된 VL 도메인이 동일하지 않으면), 동계가 아니다.
관용구 "상보성 결정 영역," 또는 용어 "CDR"은 면역글로불린 분자 (가령, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 두 프레임워크 영역 사이에 정상적으로 (즉, 야생형 동물에서) 나타나는 생물체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예로서, 생식계열 서열 또는 재배열된 또는 재배열되지 않은 서열에 의해, 그리고 예로서, 미경험 또는 성숙 B 세포 또는 T 세포에 의해 인코딩될 수 있다. CDR은 체성으로 돌연변이되고 (가령, 동물의 생식계열에서 인코딩된 서열로부터 변한다), 인간화되고, 및/또는 아미노산 치환, 부가, 또는 결실로 변형될 수 있다. 일부 상황 (가령, CDR3의 경우)에서, CDR은 예로서, 서열을 스플라이싱하거나 또는 연결한 (가령, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합) 결과로서, 인접하지 않지만 (가령, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) B 세포 핵산 서열에서 인접하는 2개 또는 그 이상 서열 (가령, 생식계열 서열)에 의해 인코딩될 수 있다.
용어 "필적하는"은 서로 동일하지 않을 수도 있지만 관찰된 차이 또는 유사성에 근거하여 결론이 합리적으로 도출될 수 있도록 그들 사이에 비교를 허용할 만큼 충분히 유사한 2개 또는 그 이상의 작용제, 실체, 환경, 일단의 조건 등을 포함한다. 당업자는 문맥에서, 필적하는 것으로 고려되기 위해 임의의 소정의 환경에서 2개 또는 그 이상의 이런 작용제, 실체, 환경, 일단의 조건 등에 대해 어느 정도의 동일성이 필요한 지를 이해할 것이다.
보존성 아미노산 치환을 설명하기 위한 용어 "보존성"은 유사한 화학적 성질 (가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 기를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 관심되는 기능적 성질, 예를 들면, 리간드에 결합하는 수용체의 능력을 실제적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 기의 실례는 지방족 측쇄, 예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 그리고 이소류신; 지방족-히드록실 측쇄, 예를 들면, 세린 및 트레오닌; 아미드-내포 측쇄, 예를 들면, 아스파라긴 및 글루타민; 방향족 측쇄, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 그리고 트립토판; 염기성 측쇄, 예를 들면, 리신, 아르기닌, 그리고 히스티딘; 산성 측쇄, 예를 들면, 아스파르트산 및 글루타민산; 그리고 황-내포 측쇄, 예를 들면, 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 보존성 아미노산 치환 기는 예로서, 발린/류신/이소류신, 페닐알라닌/티로신, 리신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타민산염/아스파르트산염, 그리고 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 예로서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에서 이용된 바와 같이, 알라닌으로 단백질 내에 임의의 선천적 잔기의 치환일 수 있다. 일부 구체예에서, 보존성 치환은 본원에 참조로서 편입되는 Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45에서 개시된 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 양성 값을 갖는 것이다. 일부 구체예에서, 치환은 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 비음성 값을 가지면, "중간 정도로 보존성"인 것으로 간주된다.
일부 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 내에 잔기 위치는 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환에 의해 다르다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 기능적 단편 (가령, 예로서 B 세포로부터 발현 및 분비를 허용하는 단편)에서 잔기 위치는 아미노산 서열이 본원에서 열거되는 경쇄와 동일하지 않지만, 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환에 의해 다르다.
"차별적 항원 붕괴"의 문맥을 벗어나 이용될 때 용어 "붕괴"는 DNA를 방해하는 (가령, 상동성 재조합을 통해) 이벤트의 결과를 포함한다. 일부 구체예에서, 붕괴는 DNA 서열(들)의 결실, 삽입, 전도, 변형, 대체, 치환, 또는 이들의 임의의 조합을 달성하거나 또는 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 DNA 내에 코딩 서열(들)에서 돌연변이, 예를 들면, 미스센스, 넌센스, 또는 프레임시프트 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합의 도입을 달성하거나 또는 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 세포에 내인성인 유전자 또는 유전자 좌위에서 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 삽입은 세포 또는 유전체 내에 내인성 부위 내로 전체 유전자 또는 유전자의 단편, 예를 들면, 엑손의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 삽입은 그들이 삽입되는 내인성 서열의 것과 상이한 기원인 서열을 도입할 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물 (가령, 유전자에 의해 인코딩된 단백질)의 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물 (가령, 인코딩된 단백질)의 서열을 변경할 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물 (가령, 인코딩된 단백질)을 절두하거나 또는 단편화할 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물을 확장할 수 있다; 일부 이런 구체예에서, 붕괴는 융합 단백질의 어셈블리를 달성할 수 있다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준에 영향을 줄 수 있지만 활성에는 영향을 주지 않는다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물의 활성에 영향을 줄 수 있지만 수준에는 영향을 주지 않는다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준에 대한 어떤 유의미한 효과도 가질 수 없다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물의 활성에 대한 어떤 유의미한 효과도 가질 수 없다. 일부 구체예에서, 붕괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준 또는 활성 중에서 어느 하나에 대한 어떤 유의미한 효과도 가질 수 없다.
관용구 "내인성 좌위" 또는 "내인성 유전자"는 붕괴 (가령, 본원에서 설명된 바와 같은 결실, 삽입, 전도, 변형, 대체, 치환, 또는 이들의 조합)의 도입에 앞서 부모 또는 참조 생물체에서 발견되는 유전자 좌위를 포함한다. 일부 구체예에서, 내인성 좌위는 자연에서 발견되는 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 내인성 좌위는 야생형이다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 내인성 좌위를 내포하는 참조 생물체는 야생형 생물체이다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 내인성 좌위를 내포하는 참조 생물체는 가공된 생물체이다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 내인성 좌위를 내포하는 참조 생물체는 실험실-교배된 생물체 (야생형 또는 가공되는 지의 여부에 상관없이)이다.
관용구 "내인성 프로모터"는 예로서, 야생형 생물체에서 내인성 유전자와 자연적으로 연관되는 프로모터를 포함한다.
관용구 "에피토프 결합 단백질"은 최소한 하나의 CDR을 갖고, 그리고 에피토프를 선별적으로 인식할 수 있는, 예를 들면, 약 1 마이크로몰 또는 그 이하인 KD (가령, 약 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 또는 약 1 x 10-12 M인 KD)로 에피토프에 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 치료적 에피토프 결합 단백질 (가령, 치료 항체)은 나노몰 또는 피코몰 범위에 있는 KD를 빈번하게 필요로 한다.
예로서, 기능적 폴리펩티드에 관하여 "기능적"은 선천적 단백질과 정상적으로 연관된 최소한 하나의 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 사례에서, 기능적 면역글로불린 유전자 분절은 재배열된 면역글로불린 유전자 서열을 산출하기 위한 생산적 재배열을 할 수 있게 하는 가변성 유전자 분절을 포함할 수 있다.
관용구 "기능적 단편"은 발현되고, 분비되고, 그리고 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프 결합 단백질의 단편을 포함한다. 특정한 인식은 최소한 마이크로몰 범위, 나노몰 범위, 또는 피코몰 범위에 있는 KD를 갖는 것을 포함한다.
관용구 "유전자 분절" 또는 "분절"은 (무거운 또는 가벼운) 가변 (V) 유전자 분절, 다양성 (D) 유전자 분절, 또는 (무거운 또는 가벼운) 연결 J 유전자 분절에 대한 언급을 포함하는데, 이것은 재배열 (예로서, 내인성 재조합효소에 의해 매개됨)에 참여하여 재배열된 V/J 또는 재배열된 V/D/J 유전자 서열을 형성할 수 있는 면역글로불린 좌위에서 (가령, 인간 및 설치류 내에) 재배열되지 않은 서열을 포함하고, 이들은 각각 하나 또는 그 이상의 (무거운 또는 가벼운) 불변 (C) 유전자 분절에 작동가능하게 연결될 수 있다. 달리 지시되지 않으면, V, D 및 J 분절은 12/23 규칙에 따라 V/J 재조합 또는 V/D/J 재조합을 허용하는 재조합 신호 서열 (RSS)을 포함한다. 유전자 분절은 또한, (무거운 또는 가벼운) 불변 영역 유전자 분절에 대한 언급을 포함하는데, 이것은 아이소타입 변환을 유발하는 부위 특이적 재조합을 허용하는 스위치 영역으로서 알려져 있는 반복성 DNA를 불변 영역 유전자 분절의 5' 단부에서 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 예로서, 생식계열 조직화에서 하나의 중쇄 불변 영역 유전자 분절 또는 중쇄 불변 영역 유전자 분절의 클러스터를 포함할 수 있고, 이의 클러스터는 바람직하게는, 각 중쇄 불변 영역 유전자 분절의 5'에서, 부위 특이적 재조합에 의한 아이소타입 변환을 허용하는 스위치 영역을 또한 포함할 수 있다. 달리 지시되지 않으면, 분절은 그들이 자연에서 연관되는 서열 또는 이들의 기능적 등가물 (가령, V 분절의 경우에 프로모터(들) 및 리더(들))을 더욱 포함한다.
면역글로불린 핵산 서열에 관하여 용어 "생식계열"은 자손에 전달될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
관용구 "면역글로불린 중쇄," "중쇄," 또는 기타 유사한 것은 일반적으로, 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 중쇄 불변 (CH) 도메인을 포함하는 전장 면역글로불린 단백질을 지칭하고, 그리고 CH1 도메인을 결여하고 임의선택적으로, 힌지 영역을 부가적으로 결여하는 중쇄를 포함한다. 면역글로불린 중쇄 서열은 임의의 생물체로부터 유래될 수 있다.
"중쇄 가변 도메인"은 바람직하게는, 재배열된 중쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되거나 또는 이것으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 도메인을 지칭하는데, 이것은 일반적으로, 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절 (또는 이의 부분), 중쇄 다양성 (DH) 유전자 분절 (또는 이의 부분), 그리고 중쇄 연결 (JH) 유전자 분절 (또는 이의 부분)으로부터 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 중쇄 가변 영역 유전자 서열, 예를 들면, 재배열된 VH,-DH- JH 유전자 서열은 재배열되지 않은 VH, DH 및 JH 유전자 분절, 바람직하게는 생식계열 재배열되지 않은 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 레퍼토리로부터 유래되고, 생산적 유전자 재배열을 겪을 수 있다, 예를 들면, 연결하여 인프레임 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 형성할 수 있다. VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 또는 JH 유전자 분절은 설치류 (가령, 생쥐, 쥐 등) 및 인간을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 생물체로부터 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절, 또는 JL 유전자 분절을 포함한다. 체성 돌연변이 (가령, VH, DH 및/또는 JH 유전자 분절의 생식계열 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산)를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 그리고 이를 인코딩하는 재배열된 중쇄 가변 영역 유전자는 상관없이, 생산적으로 재배열되어 첫 번째 사례에서, 예를 들면, 항원-매개된 증식에 앞서 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 유전자를 형성하는 생식계열 VH, DH 및/또는 JH 유전자 분절, 또는 이들의 부분으로부터 유래되는 것으로 고려될 수 있다.
면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 전형적으로, 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDRs) 및 4개의 중쇄 프레임워크 (FR) 영역, 예를 들면, 달리 명시되지 않으면, FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4를 포함한다. VH 도메인은 또한, 중쇄의 N 말단으로부터 중쇄 불변 도메인의 N 말단으로 연장하는 (N 말단으로부터 C 말단으로) 중쇄의 부분을 지칭할 수 있다.
중쇄 불변 도메인 (CH)은 바람직하게는, 임의의 생물체로부터 중쇄 불변 영역 유전자 분절, 또는 이의 부분에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 도메인을 지칭하는데, 예시적인 중쇄 불변 영역 유전자 분절은 각각, IgM, IgD, IgG, IgA, 또는 IgE 중쇄 불변 도메인을 인코딩하는 Cμ 유전자 분절, Cδ 유전자 분절, Cγ (가령, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4) 유전자 분절, Cα (가령, Cα1, Cα2) 유전자 분절, 또는 Cε 유전자 분절을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 전형적인 중쇄 불변 영역 유전자 분절은 전형적으로, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, CH3 도메인, 임의선택적으로 CH4 도메인 (가령, IgM 또는 IgE의 경우에), 그리고 임의선택적으로 막경유 (M) 도메인 (가령, 림프구 상에서 막-결합된 면역글로불린의 경우에)을 각각 인코딩하는 엑손을 포함한다. CH 도메인은 또한, 기능적 CH1 영역을 결여하고, 그리고 기능적 힌지 영역을 임의선택적으로 부가적으로 결여하는 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 도메인을 지칭할 수 있다. 일반적으로, CH 도메인은 또한, 외측 FR4로부터 중쇄의 C 말단으로 연장하는 (N 말단 측면으로부터 C 말단 측면으로) 중쇄의 부분을 지칭할 수 있다. CH 도메인은 또한, 외측 FR4로부터 하이브리드 사슬의 C 말단으로 연장하는 (N 말단 측면으로부터 C 말단 측면으로) 하이브리드 사슬의 부분을 지칭할 수 있다.
C 말단으로부터 마이너 편차, 예를 들면, 1개, 2개, 3개 또는 여러 아미노산의 절두를 갖는 중쇄 불변 도메인은 관용구 "중쇄 불변 도메인"뿐만 아니라 서열 변형, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 치환을 갖는 중쇄 불변 도메인에 의해 포괄될 것이다. 아미노산 치환은 예로서 (면역글로불린 불변 도메인, 예를 들면, 인간 IgG 불변 도메인의 EU 넘버링에 관하여), 228, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, 그리고 439에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에서 만들어질 수 있다.
가령, 그리고 제한됨 없이, 중쇄 불변 도메인은 증강된 혈청 반감기 (언급된 변형(들)이 없는 동일한 중쇄 불변 도메인과 비교하여)를 전시하고, 그리고 위치 250 (가령, E 또는 Q); 250 및 428 (가령, L 또는 F); 252 (가령, L/Y/F/W 또는 T), 254 (가령, S 또는 T) 및 256 (가령, S/R/Q/E/D 또는 T)에서 변형; 또는 428 및/또는 433 (가령, L/R/ P/Q 또는 K) 및/또는 434 (가령, H/F 또는 Y)에서 변형; 또는 250 및/또는 428에서 변형; 또는 307 또는 308 (가령, 308F, V308F) 및 434에서 변형을 갖도록 변형될 수 있다. 다른 실례에서, 변형은 428L (가령, M428L) 및 434S (가령, N434S) 변형; 428L, 259I (가령, V259I) 및 308F (가령, V308F) 변형; 433K (가령, H433K) 및 434 (가령, 434Y) 변형; 252, 254 및 256 (가령, 252Y, 254T 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (가령, T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 변형 (가령, 308F 또는 308P)을 포함할 수 있다. 잔기는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 다른 무제한적 실례에서, 중쇄 불변 도메인은 단백질 A에 대한 변화된 친화성을 전시하도록 변형될 수 있는데, 이것은 이중특이적 항체의 단리에서 유용할 수 있다 (가령, 본원에서 전체적으로 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 8,586,713을 참조한다).
용어 "이종성"은 상이한 공급원으로부터 작용제 또는 실체를 포함한다. 가령, 특정 세포 또는 생물체 내에 존재하는 폴리펩티드, 유전자, 또는 유전자 산물에 관하여 이용될 때, 상기 용어는 유관한 폴리펩티드, 유전자, 또는 유전자 산물이 1) 인간의 손에 의해 가공되었고; 2) 인간의 손을 통해 (가령, 유전공학에 의해) 세포 또는 생물체 (또는 이의 전구체) 내로 도입되었고; 및/또는 3) 유관한 세포 또는 생물체 (가령, 유관한 세포 유형 또는 생물체 유형)에 의해 자연적으로 생산되거나 또는 이것 내에 존재하지 않는다는 것을 명료하게 한다.
용어 "숙주 세포"는 이종성 (가령, 외인성) 핵산 또는 단백질이 도입된 세포를 포함한다. 당업자는 본 발명을 읽어 본 후에, 이런 용어가 특정 개체 세포를 포함할 뿐만 아니라 상기 세포의 자손을 포함하는데 이용된다는 것을 이해할 것이다. 일정한 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이런 자손은 실제로, 부모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 여전히 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함되는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이거나 또는 이를 포함한다. 일반적으로, 숙주 세포는 이러한 세포가 지정되는 삶의 왕국에 상관없이, 이종성 핵산 또는 단백질을 제공받고 및/또는 생산하는데 적합한 임의의 세포이다. 본 발명에 따라서 숙주 세포로서 활용될 수 있는 예시적인 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포 (단일-세포 또는 복수-세포), 세균 세포 (가령, 대장균 (E. coli), 바실루스 (Bacillus) 종, 스트렙토미세스 (Streptomyces) 종 등의 균주), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포 (가령, 사카로미세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베 (S. pombe), 피치아 파스토리스 (P. pastoris), 피치아 메타놀리카 (P. methanolica) 등), 식물 세포, 곤충 세포 (가령, SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni) 등), 비인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합, 예를 들면, 예로서, 하이브리도마 또는 쿠아드로마를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 쥐, 또는 생쥐 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 진핵이고 다음의 세포에서 선택된다: CHO (가령, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (가령, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (가령, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (가령, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 그리고 전술한 세포로부터 유래된 세포주. 일부 구체예에서, 세포는 하나 또는 그 이상의 바이러스 유전자, 예를 들면, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (가령, PER.C6™ 세포)를 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 단리된 세포이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 조직의 일부이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 생물체의 일부이다.
당분야에서 이해되는 용어 "인간화"는 구조 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열)이 비인간 동물에서 자연적으로 발견되고 인간에서 자연적으로 발견되는 상응하는 이형으로부터 식별가능한 유관한 핵산 또는 단백질의 이형과 실제적으로 또는 동등하게 상응하는 부분을 포함하고, 그리고 구조가 비인간-동물 이형에서 존재하는 것들과 상이하고 그 대신에 인간 이형에서 발견되는 필적하는 구조와 더욱 가깝게 상응하는 부분을 또한 포함하는 핵산 또는 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, "인간화" 유전자는 인간 폴리펩티드 (가령, 인간 단백질 또는 이의 부분 - 가령, 이의 특징적인 부분)의 것과 실제적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 것이다. 한 가지 실례를 들자면, 막 수용체의 경우에, "인간화" 유전자는 아미노산 서열이 인간 세포외 부분의 것과 동일하거나 또는 실제적으로 동일하고, 그리고 나머지 서열이 비인간 (가령, 생쥐) 폴리펩티드의 것과 동일하거나 또는 실제적으로 동일한 세포외 부분을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화 유전자는 인간 유전자의 DNA 서열의 최소한 일부를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 유전자는 인간 유전자에서 발견되는 전체 DNA 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 단백질은 인간 단백질에서 나타나는 부분을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 인간화 단백질은 전체 서열이 인간 단백질에서 발견되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예 (예로서, 인간화 단백질이 전체 서열이 인간 단백질에서 발견되는 아미노산 서열을 갖는 일부 구체예 포함)에서, 인간화 단백질은 비인간 동물의 내인성 좌위로부터 발현되는데, 이러한 내인성 좌위는 단백질을 인코딩하는 유관한 인간 유전자의 동족체 또는 오르소로그에 상응한다.
서열의 비교와 관련하여 용어 "동일성"은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 계측하는데 이용될 수 있는 당분야에서 공지된 다수의 상이한 알고리즘 중에서 한 가지에 의해 결정될 때 동일성을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 동일성은 10.0의 열린 갭 페널티, 0.1의 연장 갭 페널티를 이용한 ClustalW v. 1.83 (느린) 정렬을 이용하여, 그리고 Gonnet 유사성 매트릭스 (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 이용하여 결정된다. 용어 "동일성"은 중합성 분자 사이에, 예를 들면, 핵산 분자 (가령, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이에 및/또는 폴리펩티드 분자 사이에 전반적인 관련성을 포함한다. 일부 구체예에서, 중합성 분자는 그들의 서열이 최소한 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일하면, 서로에 "실제적으로 동일한" 것으로 고려된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 어떤 잔기가 상이한 서열에서 서로에 "상응"하는 지를 고려할 때 다른 서열에 비하여 한 서열에서 지정된 길이의 갭을 허용하는 것을 포함함으로써, 그들의 상동성 정도를 결정하기 위해 서열의 비교를 허용하는 다양한 알고리즘이 가용하다. 2개의 핵산 서열 사이에 동일성 퍼센트의 계산은 예로서, 최적 비교 목적으로 이들 두 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다 (가령, 최적 정렬을 위해 첫 번째 및 두 번째 핵산 서열 중에서 한 가지 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 그리고 비교 목적을 위해 비-상응하는 서열이 무시될 수 있다). 일정한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 실제적으로 100%이다. 상응하는 뉴클레오티드 위치에서 뉴클레오티드는 이후 비교된다. 첫 번째 서열에서 위치가 두 번째 서열에서 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 이들 분자는 상기 위치에서 동일하다. 이들 두 서열 사이에 퍼센트 동일성은 이들 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 숫자, 그리고 각 갭의 길이를 고려하여, 이들 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 숫자의 함수이다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 퍼센트 동일성을 결정하는데 유용한 대표적인 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램은 예로서, Meyers 및 Miller의 알고리즘 (CABIOS, 1989, 4: 11-17)을 포함하는데, 이것은 PAM120 가중 잔기 테이블, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 이용하여 ALIGN 프로그램 (이형 2.0) 내로 통합되었다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 퍼센트 동일성은 대안으로, 예로서 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 이용한 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
용어 "단리된"은 (1) 초기에 생산될 때 (자연에서 및/또는 실험적 세팅인지에 상관없이) 연관되었던 성분 중에서 최소한 일부로부터 분리되고, 및/또는 (2) 인간의 손에 의해 설계된, 생산된, 제조된, 및/또는 제조된 물질 및/또는 실체를 포함한다. 단리된 물질 및/또는 실체는 이들이 초기에 연관되었던 다른 성분 중에서 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 이상으로부터 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 이상 순수하다. 물질은 다른 성분이 실제적으로 없으면 "순수"하다. 일부 구체예에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 물질은 일정한 다른 성분, 예를 들면, 예로서, 하나 또는 그 이상의 담체 또는 부형제 (가령, 완충액, 용매, 물 등)와 합동된 이후에도 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 고려될 수 있다; 이런 구체예에서, 물질의 퍼센트 단리 또는 순도는 이런 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 한 가지 실례를 들자면, 일부 구체예에서, 자연에서 발생하는 생물학적 중합체, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 a) 이의 기원 또는 파생의 출처에 의해서 자연에서 이의 선천적 상태에서 이를 동행하는 성분 중에서 일부 또는 전부와 연관되지 않고; b) 자연에서 이를 생산하는 종으로부터 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실제적으로 없고; c) 자연에서 이를 생산하는 종이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템에 의해 발현되거나 또는 만약 그렇지 않으면, 이러한 시스템으로부터 성분과 연관될 때, "단리된" 것으로 고려된다. 따라서, 예로서, 일부 구체예에서, 화학적으로 합성되거나 또는 자연에서 이를 생산하는 세포 시스템과 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 고려된다. 대안으로 또는 부가적으로, 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 정제 기술에 종속된 폴리펩티드는 a) 이것이 자연에서 연관되고; 및/또는 b) 이것이 초기에 생산될 때 연관되었던 다른 성분으로부터 분리된 정도까지, "단리된" 폴리펩티드인 것으로 고려될 수 있다.
"경쇄 가변 도메인"은 바람직하게는 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되거나 또는 이것으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 도메인을 지칭하는데, 이것은 일반적으로, 경쇄 가변 (VL) 유전자 분절 (또는 이의 부분) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절 (또는 이의 부분)로부터 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 경쇄 가변 영역 유전자 서열, 예를 들면, 재배열된 VL -JL 유전자 서열은 재배열되지 않은 VL 및/또는 재배열되지 않은 JL 유전자 분절, 바람직하게는 생식계열 재배열되지 않은 VL 유전자 분절 및/또는 생식계열 재배열되지 않은 JL 유전자 분절의 레퍼토리로부터 유래되고, 생산적 유전자 재배열을 겪을 수 있다, 예를 들면, 재배열하여 인프레임 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 형성할 수 있다. VL 유전자 분절 또는 JL 유전자 분절은 설치류 (가령, 생쥐, 쥐 등) 및 인간을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 생물체로부터 VL 유전자 분절 또는 JL 유전자 분절을 포함한다. 체성 돌연변이 (가령, VL 및/또는 JL 유전자 분절의 생식계열 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산)를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 그리고 이를 인코딩하는 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자는 상관없이, 생산적으로 재배열되어 첫 번째 사례에서, 예를 들면, 항원-매개된 증식에 앞서 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 유전자를 형성하는 생식계열 VL 및 JL 유전자 분절, 또는 이들의 부분으로부터 유래되는 것으로 고려될 수 있다.
면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 전형적으로, 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDRs) 및 4개의 프레임워크 (FR) 영역, 예를 들면, 달리 명시되지 않으면, FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4를 포함한다. VL 도메인은 또한, 경쇄의 N 말단으로부터 경쇄의 경쇄 불변 도메인의 N 말단으로 연장하는 (N 말단으로부터 C 말단으로) 경쇄의 부분을 지칭할 수 있다. VL 도메인은 또한, 하이브리드 사슬의 N 말단으로부터 하이브리드 사슬의 중쇄 불변 도메인의 N 말단으로 연장하는 (N 말단으로부터 C 말단으로) 하이브리드 사슬의 부분을 지칭할 수 있다.
경쇄 불변 도메인 (CL)은 바람직하게는, 임의의 생물체로부터 경쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열, 예를 들면, 하지만 제한 없이, Cκ 또는 Cλ 유전자 분절, 예를 들면, 설치류 또는 인간 Cκ 또는 Cλ 유전자 분절에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 도메인을 지칭한다. 이런 Cκ 또는 Cλ 도메인은 당분야에서 널리 공지된다. 일반적으로, CL 도메인은 또한, FRL4 외부로부터 경쇄의 C 말단으로 연장하는 (N 말단으로부터 C 말단으로) 경쇄의 부분을 지칭할 수 있다.
관용구 "마이크로몰 범위"는 1-999 마이크로몰을 의미하는 것으로 의도된다; 관용구 "나노몰 범위"는 1-999 나노몰을 의미하는 것으로 의도된다; 관용구 "피코몰 범위"는 1-999 피코몰을 의미하는 것으로 의도된다.
관용구 "면역글로불린 하이브리드 사슬," "하이브리드 사슬," "하이브리드 면역글로불린 사슬," 또는 기타 유사한 것은 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로, 경쇄 가변 도메인 (이것은 체성으로 돌연변이되거나 또는 되지 않을 수 있다) 및 중쇄 불변 도메인을 포함하는 면역글로불린 단백질을 지칭한다. 일반적으로, 하이브리드 사슬은 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 인코딩된다. 하이브리드 면역글로불린 사슬의 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 일반적으로, 경쇄 가변 (VL) 유전자 분절 (또는 이의 부분) 및 경쇄 연결 (VJ) 유전자 분절로부터 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 하이브리드 사슬 가변 도메인을 인코딩하는 경쇄 가변 영역 유전자 서열, 예를 들면, 재배열된 VL -JL 유전자 서열은 재배열되지 않은 VL 및 JL 유전자 분절, 바람직하게는 생식계열 재배열되지 않은 VL 및 JL 유전자 분절의 레퍼토리로부터 유래되는데, 이들은 (a) 생산적 유전자 재배열을 겪을 수 있고, 예를 들면, 재배열하여 인프레임 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 형성할 수 있고, 그리고 (b) 하나 또는 그 이상의 중쇄 불변 영역 유전자 분절, 예를 들면, 불변 영역 유전자 분절들 또는 한 불변 영역 유전자 분절의 재배열되지 않은 클러스터에 작동가능하게 연결된다.
관용구 "비인간 동물"은 인간이 아닌 척추동물 생물체를 포함한다. 일부 구체예에서, 비인간 동물은 원구류, 경골어, 연골 어류 (가령, 상어 또는 가오리), 양서류, 파충류, 포유동물, 또는 조류이다. 일부 구체예에서, 비인간 포유동물은 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소, 또는 설치류이다. 일부 구체예에서, 비인간 동물은 설치류, 예를 들면, 쥐 또는 생쥐이다.
관용구 "핵산"은 가장 넓은 의미에서, 올리고뉴클레오티드 사슬 내로 통합되거나 또는 통합될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 포스포디에스테르 연쇄를 거쳐 올리고뉴클레오티드 사슬 내로 통합되거나 또는 통합될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥으로부터 명백한 바와 같이, 일부 구체예에서, "핵산"은 하나 또는 그 이상의 개별 핵산 잔기 (가령, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 포함한다; 일부 구체예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 포함한다.
"작동가능하게 연결된"은 또한, 작동가능하게 연결된 성분이 그들의 의도된 방식으로 기능하는 관계를 지칭한다. 한 사례에서, 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 적절한 전사 조절을 유지하기 위해 조절 서열 (가령, 프로모터, 인핸서, 사일런서 서열 등)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 사례에서, 면역글로불린 가변 영역 (또는 V(D)J 분절)의 핵산 서열은 재배열된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자 서열 내로 서열 사이에 적절한 재조합을 허용하기 위해, 면역글로불린 불변 영역의 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 임의의 중합체 사슬을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 이것이 인간의 손의 작용을 통해 설계되고 및/또는 생산된다는 점에서 가공되는 아미노산 서열을 갖는다.
용어 "재조합"은 재조합 수단에 의해 설계된, 가공된, 제조된, 발현된, 창출된 또는 단리된 폴리펩티드 (가령, 본원에서 설명된 바와 같은 B 세포 활성화 인자 단백질), 예를 들면, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 폴리펩티드, 재조합, 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드 (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자도입된 동물 (가령, 생쥐)로부터 단리된 항체 (가령, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370을 참조한다) 또는 선별된 서열 요소를 서로에 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조된, 발현된, 창출된 또는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 구체예에서, 이런 선별된 서열 요소 중에서 하나 또는 그 이상은 자연에서 발견된다. 일부 구체예에서, 이런 선별된 서열 요소 중에서 하나 또는 그 이상은 인실리코 설계된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 이런 선별된 서열 요소는 예로서, 자연 또는 합성 공급원으로부터 공지된 서열 요소의 돌연변이유발 (가령, 생체내 또는 시험관내)로부터 발생한다. 가령, 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 관심되는 공급원 생물체 (가령, 인간, 생쥐 등)의 유전체에서 발견되는 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열이 폴리펩티드 서열로부터 유래하고 이들에 관련되긴 하지만, 생체내에서 비인간 동물의 유전체 내에 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이도록, 돌연변이유발 (가령, 시험관내에서 또는 생체내에서, 예를 들면, 비인간 동물에서)로부터 발생한 아미노산 서열을 갖는다.
용어 "참조"는 관심되는 작용제 또는 값이 비교되는 표준 또는 대조 작용제 또는 값을 설명하기 위해 본원에서 이용된다. 일부 구체예에서, 참조 작용제는 시험되고 및/또는 참조값은 관심되는 작용제 또는 값의 시험 또는 결정과 실제적으로 동시에 결정된다. 일부 구체예에서, 참조 작용제 또는 값은 실재적인 매체에서 임의선택적으로 구현된 역사적인 참조이다. 전형적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 작용제 또는 값은 관심되는 작용제 또는 값을 결정하거나 또는 특징짓는데 활용된 것들에 필적하는 조건 하에 결정되거나 또는 특징화된다. 일부 구체예에서, 대조 또는 "참조" 비인간 동물 (가령, 생쥐)은 본원에서 제공되고, 그리고 유전체가 전통적인 면역글로불린 분자 (즉, 동계 VH 및 VL 도메인을 갖는 면역글로불린)를 발현하는 유전적으로 조작된 비인간 동물을 포함한다. 일부 일정한 구체예에서, 대조 유전적으로 조작된 비인간 동물은 VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐 (가령, 본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 8,502,018 및 8,642,835를 참조한다) 및/또는 "ULC 생쥐" (US 2011-0195454A1, US 2012-0021409A1, US 2012-0192300A1, US 2013-0045492A1, US 2013-0185821A1 및 US 2013-0302836A1을 참조한다; 이들 출원은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다)를 포함한다.
용어 "대체"는 숙주 좌위 (가령, 유전체 내에)에서 발견되는 "대체된" 핵산 서열 (가령, 유전자)이 상기 좌위로부터 제거되고 상이한, "대체" 핵산이 그 자리에서 위치되는 과정을 포함하기 위해 본원에서 이용된다. 일부 구체예에서, 대체된 핵산 서열 및 대체 핵산 서열은 예로서, 이들이 서로에 상동하고 및/또는 상응하는 요소 (가령, 단백질-코딩 요소, 조절 요소 등)를 내포한다는 점에서 서로에 필적한다. 일부 구체예에서, 대체된 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 스플라이스 공여 부위, 스플라이스 수용 부위, 인트론, 엑손, 비번역 영역 (UTR) 중에서 하나 또는 그 이상을 포함한다; 일부 구체예에서, 대체 핵산 서열은 하나 또는 그 이상의 코딩 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 대체 핵산 서열은 대체된 핵산 서열의 동족체이다. 일부 구체예에서, 대체 핵산 서열은 대체된 서열의 오르소로그이다. 일부 구체예에서, 대체 핵산 서열은 인간 핵산 서열이거나 또는 이를 포함한다. 대체 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 또는 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 구체예에서, 대체된 핵산 서열은 설치류 서열 (가령, 생쥐 서열)이거나 또는 이를 포함한다. 이렇게 배치된 핵산 서열은 이렇게 배치된 서열을 획득하는데 이용된 공급원 핵산 서열의 일부인 하나 또는 그 이상의 조절 서열 (가령, 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'-비번역 영역 등)을 포함할 수 있다. 가령, 다양한 구체예에서, 대체는 이렇게 배치된 핵산 서열 (이종성 서열 포함)로부터 유전자 산물의 생산을 유발하지만, 내인성 서열의 발현을 유발하지 않는 이종성 서열로 내인성 서열의 치환이다; 대체는 내인성 서열에 의해 인코딩된 단백질과 유사한 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 내인성 유전체 서열의 대체이다 (가령, 내인성 유전체 서열은 가변 도메인을 인코딩하고, 그리고 DNA 단편은 하나 또는 그 이상의 인간 가변 도메인을 인코딩한다). 다양한 구체예에서, 내인성 유전자 또는 이의 단편은 상응하는 인간 유전자 또는 이의 단편으로 대체된다. 상응하는 인간 유전자 또는 이의 단편은 대체되는 내인성 유전자 또는 이의 단편의 오르소로그이거나 또는 이것과 구조 및/또는 기능에서 실제적으로 유사하거나 또는 동일한 인간 유전자 또는 단편이다.
관용구 "소형 분자"는 분자량이 담체의 부재에서, 크기에서 약 6 킬로달톤 (kD)보다 적고, 그리고 자연 공급원으로부터 추출되거나 또는 합성적으로 생산될 수 있는 유기 화합물을 포함한다 (생체이물). "소형 분자"는 또한, 무기 원자, 예를 들면, 복합화된 금속을 더욱 포함하는 유기 화합물을 포함할 수 있다. "소형 분자"는 합텐, 예를 들면, 전통적인 면역글로불린 형식에서 항원 결합 단백질에 결합할 수 있지만 적응성 면역 반응을 이끌어낼 수 없는 분자를 지칭할 수 있다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 담체의 부재에서, 약 5 kD, 4 kD, 3 kD, 약 2 kD, 또는 약 1 kD보다 적다. 일부 구체예에서, 소형 분자의 분자량은 담체의 부재에서, 본원에서 설명된 바와 같이 1 kD 내지 6 kD 범위에서 변한다. 일부 구체예에서, 소형 분자의 분자량은 담체의 부재에서, 1.5 kD보다 적다. 일부 일정한 구체예에서, 소형 분자의 분자량은 담체의 부재에서, 본원에서 설명된 바와 같이 1400 달톤 (D)보다 적거나, 1300 D보다 적거나, 1200 D보다 적거나, 1100 D보다 적거나, 1000 D보다 적거나, 900 D보다 적거나, 800 D보다 적거나, 700 D보다 적거나, 600 D보다 적거나, 500 D보다 적거나, 400 D보다 적거나, 300 D보다 적거나, 200 D보다 적거나, 또는 100 D보다 적다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 담체의 부재에서, 약 800 달톤 (D), 약 600 D, 약 500 D, 약 400 D, 약 300 D, 약 200 D, 또는 약 100 D보다 적다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 담체의 부재에서, 약 2000 g/mol보다 적거나, 약 1500 g/mol보다 적거나, 약 1000 g/mol보다 적거나, 약 800 g/mol보다 적거나, 또는 약 500 g/mol보다 적다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 중합체가 아니다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 중합성 모이어티를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 단백질 또는 폴리펩티드가 아니다 (가령, 올리고펩티드 또는 펩티드가 아니다). 일부 구체예에서, 소형 분자는 폴리뉴클레오티드가 아니다 (가령, 올리고뉴클레오티드가 아니다). 일부 구체예에서, 소형 분자는 다당류가 아니다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 다당류를 포함하지 않는다 (가령, 당단백질, 프로테오글리칸, 당지질 등이 아니다). 일부 구체예에서, 소형 분자는 지질이 아니다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 조정 작용제이다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 생물학적으로 활성이다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 검출가능하다 (가령, 최소한 하나의 검출가능한 모이어티를 포함한다). 일부 구체예에서, 소형 분자는 치료제이다).
관용구 "체성으로 초돌연변이된"은 클래스 전환을 겪은 B 세포로부터, 체성으로 핵산 서열에 의해 인코딩된 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 대한 참조를 포함하고, 여기서 클래스 전환된 B 세포에서 면역글로불린 가변 영역의 핵산 서열 (가령, 경쇄 가변 도메인을 인코딩하거나 또는 경쇄 CDR 또는 FR 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열)은 클래스 전환에 앞서 B 세포에서 핵산 서열과 동일하지 않다, 예를 들면, 예로서, 클래스 전환을 겪지 않은 B 세포 및 클래스 전환을 겪은 B 세포 사이에 CDR 또는 프레임워크 핵산 서열에서 차이가 난다. "체성으로 돌연변이된"은 또한, 친화성-성숙되지 않은 B 세포에서 상응하는 면역글로불린 가변 영역 서열 (즉, 생식계열 세포의 유전체 내에 서열)과 동일하지 않은, 친화성-성숙된 B 세포로부터 그렇게 함으로써 인코딩된 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 대한 참조를 포함한다. 관용구 "체성으로 돌연변이된"은 또한, 관심되는 에피토프에 B 세포의 노출 후 B 세포로부터 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열에 대한 참조를 포함하고, 여기서 상기 핵산 서열은 관심되는 에피토프에 B 세포의 노출에 앞서 상응하는 핵산 서열과 상이하다. 관용구 "체성으로 돌연변이된"은 항원 공격에 대한 응답으로 동물, 예를 들면, 인간 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 갖는 생쥐에서 산출되었고, 그리고 이런 동물에서 내재적으로 작동하는 선별 과정으로부터 발생하는 면역글로불린으로부터 서열을 포함한다.
용어 "실제적으로"은 관심되는 특징 또는 성질의 전체 또는 근전 한도 또는 정도를 전시하는 정성적 조건을 포함한다. 생물학 분야에서 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 설사 있다 하더라도 드물게, 완결에 이르고 및/또는 완전하게 진행하거나 또는 절대적 결과를 달성하거나 또는 방지한다는 것을 이해할 것이다. 용어 "실제적으로"은 이런 이유로, 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적 결여를 포착하기 위해 본원에서 이용된다.
관용구 "실제적인 상동성"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이에 비교를 포함한다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 두 서열은 그들이 상응하는 위치에서 상동성 잔기를 내포하면, 일반적으로 "실제적으로 상동성"인 것으로 고려된다. 상동성 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 대안으로, 상동성 잔기는 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징을 갖는 비동일한 잔기일 수 있다. 가령, 당업자에 의해 널리 공지된 바와 같이, 일정한 아미노산은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로 분류된다. 동일한 유형의 다른 아미노산에 대한 한 아미노산의 치환은 종종, "상동성" 치환인 것으로 고려될 수 있다. 전형적인 아미노산 범주화는 표 1 및 2에서 요약된다.
당분야에서 널리 공지된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 상업적인 컴퓨터 프로그램에서 가용한 것들을 비롯한 다양한 알고리즘 중에서 한 가지, 예를 들면, 뉴클레오티드 서열의 경우에 BLASTN, 그리고 아미노산 서열의 경우에 BLASTP, 갭트 BLAST 및 PSI-BLAST를 이용하여 비교될 수 있다. 예시적인 이런 프로그램은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 그리고 Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에서 설명된다. 상동성 서열을 확인하는 것에 더하여, 전술한 프로그램은 전형적으로 상동성의 정도의 시도를 제공한다. 일부 구체예에서, 두 서열은 그들의 상응하는 잔기의 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기의 유관한 스트레치에 걸쳐 상동성이면, 실제적으로 상동성인 것으로 고려된다. 일부 구체예에서, 유관한 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 구체예에서, 유관한 스트레치는 최소한 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 또는 그 이상의 잔기이다. 일부 구체예에서, 유관한 스트레치는 완전한 서열을 따라서 인접한 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 유관한 스트레치는 완전한 서열을 따라서 불연속적 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 유관한 스트레치는 최소한 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 잔기이다.
알라닌 Ala A 비극성 중성 1.8
아르기닌 Arg R 극성 양성 -4.5
아스파라긴 Asn N 극성 중성 -3.5
아스파르트산 Asp D 극성 음성 -3.5
시스테인 Cys C 비극성 중성 2.5
글루타민산 Glu E 극성 음성 -3.5
글루타민 Gln Q 극성 중성 -3.5
글리신 Gly G 비극성 중성 -0.4
히스티딘 His H 극성 양성 -3.2
이소류신 Ile I 비극성 중성 4.5
류신 Leu L 비극성 중성 3.8
리신 Lys K 극성 양성 -3.9
메티오닌 Met M 비극성 중성 1.9
페닐알라닌 Phe F 비극성 중성 2.8
프롤린 Pro P 비극성 중성 -1.6
세린 Ser S 극성 중성 -0.8
트레오닌 Thr T 극성 중성 -0.7
트립토판 Trp W 비극성 중성 -0.9
티로신 Tyr Y 극성 중성 -1.3
발린 Val V 비극성 중성 4.2
모호한 아미노산 3-문자 1-문자
아스파라긴 또는 아스파르트산 Asx B
글루타민 또는 글루타민산 Glx Z
류신 또는 이소류신 Xle J
특정되지 않거나 또는 알려지지 않은 아미노산 Xaa X
관용구 "실제적인 동일성"은 아미노산 또는 핵산 서열 사이에 비교를 포함한다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 두 서열은 그들이 상응하는 위치에서 동일한 잔기를 내포하면, 일반적으로 "실제적으로 동일성"인 것으로 고려된다. 당분야에서 널리 공지된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 상업적인 컴퓨터 프로그램에서 가용한 것들을 비롯한 다양한 알고리즘 중에서 한 가지, 예를 들면, 뉴클레오티드 서열의 경우에 BLASTN, 그리고 아미노산 서열의 경우에 BLASTP, 갭트 BLAST 및 PSI-BLAST를 이용하여 비교될 수 있다. 예시적인 이런 프로그램은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 그리고 Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에서 설명된다. 동일한 서열을 확인하는 것에 더하여, 전술한 프로그램은 전형적으로 동일성의 정도의 시도를 제공한다. 일부 구체예에서, 두 서열은 그들의 상응하는 잔기 중에서 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기의 유관한 스트레치에 걸쳐 동일성이면, 실제적으로 동일성인 것으로 고려된다. 일부 구체예에서, 유관한 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 구체예에서, 유관한 스트레치는 최소한 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 잔기이다.
관용구 "표적화 벡터" 또는 "표적화 구조체"는 표적화 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 표적화 영역은 표적 세포, 조직 또는 동물에서 서열과 동일하거나 또는 실제적으로 동일하고, 그리고 상동성 재조합을 거쳐 세포, 조직 또는 동물의 유전체 내에서 위치 내로 표적화 구조체의 통합을 제공하는 서열을 포함한다. 부위 특이적 재조합효소 인식 부위 (가령, loxP 또는 Frt 부위)를 이용하여 표적을 정하는 표적화 영역 역시 포함된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 표적화 구조체는 특히 관심되는 핵산 서열 또는 유전자, 선별가능 마커, 제어 및 또는 조절 서열, 그리고 이런 서열을 수반하는 재조합을 보조하거나 또는 조장하는 단백질의 외인성 첨가를 통해 매개된 재조합을 허용하는 다른 핵산 서열을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 표적화 구조체는 관심되는 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 더욱 포함하고, 여기서 관심되는 유전자는 내인성 서열에 의해 인코딩된 단백질과 유사한 기능을 갖는 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 인코딩하는 이종성 유전자이다.
핵산 서열에 관하여 용어 "재배열되지 않은"은 동물 세포의 생식계열에서 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 변형되지 않은 비인간 동물에서 B 세포 발달 동안, 재배열되지 않은 유전자 분절의 첫 번째 재배열은 프로-B 세포를 산출하는, 중쇄 좌위에서 DH 및 JH 유전자 분절의 연결이다. 차후 재배열은 중쇄 좌위에서 VH-DHJH 연결, 그리고 생산적이면, 경쇄 가변 영역 유전자 분절의 재배열, 예를 들면, 경쇄 좌위 내에서 VL 유전자 분절 및 JL 유전자 분절의 연결을 포함한다. 재배열은 연결이 인프레임 ("생산적")이면, "생산적"인 것으로 고려된다. 한 대립형질에서 생산적 재배열은 대립유전자 배제, 예를 들면, 다른 대립형질의 침묵을 유발할 수 있다. "재배열되지 않은"은 또한, 중쇄 불변 영역 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 경쇄 가변 영역 유전자를 형성하는 생산적 재배열을 겪을 수 있는 재배열되지 않은 VL 및 JL 유전자 분절을 지칭하고, 이런 작동가능한 연쇄는 하이브리드 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 유전자를 유발하고, 이것은 또한, 하나 또는 그 이상의 내인성 중쇄 대립형질의 대립유전자 배제 및/또는 하나 또는 그 이상의 내인성 경쇄 좌위에서 경쇄 가변 영역 유전자 분절의 재배열을 유발할 수 있다.
관용구 "가변 도메인"은 N 말단으로부터 C 말단으로 (달리 지시되지 않으면) 순서에서 다음의 아미노산 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 (필요에 따라 변형됨)의 아미노산 서열을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
용어 "변이체"는 참조 실체와 유의미한 구조적 동일성을 보여주지만, 참조 실체와 비교하여 하나 또는 그 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준에서 참조 실체와 구조적으로 다른 실체를 포함한다. 많은 구체예에서, 변이체는 또한, 이의 참조 실체와 기능적으로 다르다. 일반적으로, 특정 실체가 참조 실체의 "변이체"인 것으로 적절하게 고려되는 지의 여부는 참조 실체와의 구조적 동일성의 정도에 근거된다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 실체는 일정한 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 변이체는 정의에 의해, 하나 또는 그 이상의 이런 특징적인 구조적 요소를 공유하는 상이한 화학적 실체이다. 몇 가지 실례를 들자면, 소형 분자는 특징적인 코어 구조적 요소 (가령, 거대고리 코어) 및/또는 하나 또는 그 이상의 특징적인 펜던트 모이어티를 가질 수 있고, 따라서 소형 분자의 변이체는 코어 구조적 요소 및 특징적인 펜던트 모이어티를 공유하지만 다른 펜던트 모이어티에서 및/또는 코어 내에 존재하는 결합의 유형에서 (단일 대 이중, E 대 Z, 기타 등등) 다른 것이고, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대하여 지정된 위치를 갖고 및/또는 특정 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있고, 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대하여 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 가령, 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 중추에 공유 부착된 화학적 모이어티 (가령, 탄수화물, 지질 등)에서 하나 또는 그 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 최소한 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%인 전반적인 서열 동일성을 보여준다. 대안으로 또는 부가적으로, 일부 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 최소한 하나의 특징적인 서열 요소를 참조 폴리펩티드와 공유하지 않는다. 일부 구체예에서, 참조 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중에서 하나 또는 그 이상을 공유한다. 일부 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 생물학적 활성 중에서 하나 또는 그 이상을 결여한다. 일부 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 비교하여 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 보여주다. 많은 구체예에서, 관심되는 폴리펩티드는 관심되는 폴리펩티드가 특정 위치에서 적은 숫자의 서열 변경을 제외하고 부모의 것과 동일한 아미노산 서열을 가지면, 부모 또는 참조 폴리펩티드의 "변이체"인 것으로 고려된다. 전형적으로, 변이체 내에 잔기 중에서 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만이 부모와 비교하여 치환된다. 일부 구체예에서, 변이체는 부모와 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 치환된 잔기를 갖는다. 종종, 변이체는 매우 적은 숫자 (가령, 5, 4, 3, 2, 또는 1개보다 적은) 숫자의 치환된 기능적 잔기 (즉, 특정 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 갖는다. 게다가, 변이체는 전형적으로, 부모와 비교하여 5, 4, 3, 2, 또는 1개보다 많지 않은 부가 또는 결실을 갖고, 그리고 종종 부가 또는 결실을 갖지 않는다. 게다가, 임의의 부가 또는 결실은 전형적으로 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6개보다 적고, 그리고 통상적으로 약 5, 약 4, 약 3, 또는 약 2개 잔기보다 적다. 일부 구체예에서, 부모 또는 참조 폴리펩티드는 자연에서 발견되는 것이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 관심되는 특정 폴리펩티드의 복수의 변이체는 특히, 관심되는 폴리펩티드가 감염체 폴리펩티드일 때, 통상적으로 자연에서 발견될 수 있다.
용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 벡터는 그들이 숙주 세포, 예를 들면, 진핵 및/또는 원핵 세포에서 연결되는 핵산의 염색체외 복제 및/또는 발현을 할 수 있다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 주도할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
용어 "야생형"은 "정상적인" (돌연변이된, 병든, 변경된 등과 대조적으로) 상태 또는 배경에서 자연에서 발견되는 바와 같은 구조 및/또는 활성을 갖는 실체를 포함하는 이의 당분야에서 이해되는 의미를 갖는다. 당업자는 야생형 유전자 및 폴리펩티드가 종종 복수의 상이한 형태 (가령, 대립형질)에서 존재한다는 것을 인지할 것이다.
일정한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 그 중에서도 특히, 경쇄 가변 도메인 (가령, VL 영역)을 인코딩하는 인간 유전 물질을 갖는 유전적으로 조작된 비인간 동물을 이용하는 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 이런 비인간 동물은 예로서, 인간 VL 도메인, 그리고 전통적인 면역글로불린 형식을 회피하는 항원 결정인자에 결합하는, 이런 인간 VL 도메인 내에 포함된 상보성 결정 영역 (CDRs)의 생산 및 단리에 유용하다. 이런 비인간 동물은 독특한 항원 결합 특징을 전시하는 인간 VL 도메인의 산출 및 친화성 성숙을 위한 신규한 생체내 시스템을 제공하는 것으로 예기된다. 이런 항원-결합 단백질은 자연 면역글로불린을 피할 수 있는 외래 항원을 인식하는 능력을 갖는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비인간 동물은 대조 유전적으로 변형된 비인간 동물과 비교하여 항원에 결합하는 동계 인간 VL 도메인을 산출할 수 있다; 일부 구체예에서, 이런 비인간 포유동물은 구조에서 면역글로불린과 유사한 결합 단백질을 발현하지만, 임의의 중쇄 가변 서열을 여전히 결여하는 B 세포 개체군을 발달시키고 및/또는 갖는다. 일부 구체예에서, 이런 비인간 동물에 의해 발현된 항원 결합 단백질은 항원 결합 부분이 인간 VL 도메인을 배타적으로 포함하는 것으로 특징화된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비인간 동물은 비인간 동물 및 이종성 종 (가령, 인간)으로부터 유전 물질을 내포하는 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위를 포함하고, 그리고 비인간 동물 및 이종성 종 (가령, 인간)으로부터 유전 물질을 내포하는 내인성 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위 및 재배열되지 않은 인간 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질의 발현은 비인간 면역글로불린 유전 물질 (가령, 비인간 면역글로불린 프로모터 및/또는 인핸서)의 제어 하에 있다.
본 발명의 다양한 양상이 다음의 섹션에서 상세하게 설명된다. 섹션의 이용은 본 발명을 제한하는 것으로 의미되지 않는다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 양상에 적용될 수 있다.
소형 분자에 특정한 면역글로불린-유사 결합 단백질
한 양상에서, 소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 항원 결합 단백질이 제공된다. 본원에서 설명된 VL 항원 결합 단백질 양상은 하나 또는 그 이상의 중쇄 불변 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 바람직하게는 재배열되지 않은 및 더욱 바람직하게는 인간, JL 유전자 분절 (또는 이의 부분)과 함께 재배열된 바람직하게는 재배열되지 않은 및 더욱 바람직하게는 인간, VL 유전자 분절 (또는 이의 부분)을 포함하거나 또는 이것으로부터 유래된 하이브리드 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 하이브리드 사슬을 포함하는 VL 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쇄 유전자 분절의 재배열 시에, 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 서열과 융합된 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 재배열된 뉴클레오티드 서열이 획득된다. 이러한 서열은 중쇄 불변 도메인과 융합된 경쇄 가변 도메인을 갖는 하이브리드 면역글로불린 사슬을 인코딩한다. 따라서, 한 구체예에서, 하이브리드 면역글로불린은 N 말단으로부터 C 말단으로 VL 도메인 및 CH 도메인으로 본질적으로 구성된다. 한 구체예에서, CH 도메인은 CH1 영역, 힌지, CH2 영역, CH3 영역, 그리고 임의선택적으로 CH4 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, CH1 도메인은 기능적 CH1 도메인을 결여하고, 예를 들면, CH1 도메인을 전체적으로 또는 부분적으로 결여하고, 그리고 힌지 영역을 부가적으로 결여할 수 있다.
일부 구체예에서, VL 항원 결합 단백질은 소형 분자에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 하이브리드 면역글로불린 사슬을 포함하고, 여기서 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, VL 항원 결합 단백질은 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 연관되어 소형 분자에 특이적으로 결합하는 결합 포켓을 형성할 수 있다. 한 양상에서, 연관되어 결합 포켓을 형성하는 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인으로 본질적으로 구성되는 항원 결합 단백질이 제공되고, 여기서 항원 결합 단백질은 소형 분자에 특이적으로 결합한다.
한 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이다. 한 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 면역글로불린 경쇄 도메인은 설치류로부터 유래된다. 한 구체예에서, 설치류는 생쥐 또는 쥐에서 선택된다.
다양한 구체예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 VL 항원 결합 단백질, 예를 들면, 본원에서 개시된 유전적으로 변형된 비인간 동물, 예를 들면, 생쥐에 의해 생산된 것들은 평균적으로 전통적인 항체보다 작을 수 있고, 그리고 더욱 작은 크기와 연관된 이점을 소유한다. 더욱 작은 크기는 최소한 부분적으로, VH 도메인 내에 정상적으로 존재하는 DH 영역에 의해 인코딩된 아미노산 서열의 부재를 통해 실현된다. 더욱 작은 크기는 또한, 예로서 Vκ 영역 및 Jκ 영역으로부터 유래되는 CDR3의 형성에서 실현될 수 있다.
한 구체예에서, 경쇄 가변 도메인은 인간 면역글로불린 경쇄와 중쇄 가변 도메인으로부터 형성되는 인간 항원 결합 단백질의 결합 포켓보다 높은 친화성으로 소형 분자에 결합한다.
한 구체예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 인간 경쇄 가변 도메인이다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 도메인의 결합 포켓은 인간 면역글로불린 경쇄와 중쇄 가변 도메인으로부터 형성되는 인간 항체의 결합 포켓보다 높은 친화성으로 소형 분자에 결합한다.
한 구체예에서, 첫 번째 경쇄 가변 도메인은 첫 번째 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 연결된다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 비인간 동물로부터 유래된다. 한 구체예에서, 비인간 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 생쥐 또는 쥐에서 선택된다. 한 구체예에서, 비인간 동물은 닭이다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, CH3, CH4, 그리고 이들의 조합에서 선택된다. 한 구체예에서, 첫 번째 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, 그리고 CH3을 포함한다.
한 구체예에서, 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 두 번째 면역글로불린 경쇄 불변 영역에 연결된다. 한 구체예에서, 두 번째 면역글로불린 경쇄 불변 영역은 비인간 동물로부터 유래된다. 한 구체예에서, 비인간 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 생쥐 또는 쥐에서 선택된다. 한 구체예에서, 비인간 동물은 닭이다.
한 구체예에서, VL 항원 결합 단백질은 2개의 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, VL 항원 결합 단백질은 이질성 서열을 갖는 2개의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
소형 분자에 결합하는 VL 항원 결합 단백질은 본원에서 개시된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 획득되거나, 또는 소형 분자로 면역화 후 이런 동물로부터 단리된 세포 및/또는 핵산으로부터 유래될 수 있다.
V L 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 비인간 동물
면역글로불린 경쇄 가변 도메인과 융합된 중쇄 불변 도메인을 갖는 하이브리드 면역글로불린 사슬을 포함하는 VL 항원 결합 단백질을 발현하는 비인간 동물이 제공된다. 게다가, 하이브리드 사슬을 VL 항원 결합 단백질의 일부로서 발현하기 위해 비인간 동물, 예를 들면, 쥐 및 생쥐를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 설치류를 유전적으로 변형하는 복수의 전략이 제공되는데, 여기서 하이브리드 사슬은 CH 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 VL 영역을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되거나 또는 이것으로부터 유래된다. 이런 유전적으로 변형된 비인간 동물은 일부 전통적인 항체의 사합체성 구조를 갖지만, 전통적인 항체와 비교하여 독특한 결합 특징을 전시하는 VL 항원 결합 단백질의 개체군을 산출하기 위한 공급원을 대표한다.
본원에서 설명된 변형된 비인간 동물은 하이브리드 사슬과 짝짓기되어 항체-유사한, 예를 들면, 사합체성일 수 있는 VL 항원 결합 단백질을 만드는 동계 경쇄를 또한 포함하는 VL 항원 결합 단백질을 산출할 수 있지만, 여기서 중쇄 (또는 중쇄의 쌍) 대신에 VL 항원 결합 단백질은 CH 도메인에 융합된 VL 도메인 - VH 도메인 아님 -을 포함하는 하이브리드 사슬 (또는 하이브리드 사슬의 쌍)을 포함한다.
다양한 구체예에서, 변형된 비인간 동물은 하이브리드 사슬의 VL 도메인이 경쇄의 VL 도메인에 비하여 증강된 정도의 체세포 초돌연변이를 전시하는 VL 항원 결합 단백질을 만든다. 일부 구체예에서, 하이브리드 사슬의 VL 영역은 CL 영역과 융합된 VL 영역보다 약 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배, 3.5-배, 4-배, 4.5-배, 또는 5-배 또는 그 이상의 체세포 초돌연변이를 전시한다. 일부 구체예에서, 변형된 비인간 동물, 예를 들면, 생쥐는 항원에 대한 응답으로 하이브리드 사슬의 VL 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질의 개체군을 전시하고, 여기서 VL 항원 결합 단백질의 개체군은 동일한 항원에 대한 응답으로 야생형 생쥐에 의해 전시된, 항원 결합 단백질, 예를 들면, 경쇄의 VL 도메인의 개체군에서 관찰된 것보다 하이브리드 사슬의 VL 도메인에서 약 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배, 3.5-배, 4-배, 4.5-배, 5-배 또는 그 이상의 체세포 초돌연변이의 평균을 전시한다.
한 구체예에서, 하이브리드 사슬의 VL 도메인에서 체세포 초돌연변이는 CDR3에서 하나 또는 그 이상 또는 2개 또는 그 이상의 N 부가를 포함한다. 다양한 구체예에서, VL 항원 결합 단백질은 내인성 경쇄 좌위, 예를 들면, 재배열되어 중쇄 불변 영역 유전자와 작동가능하게 연결된 재배열된 가변 영역 유전자를 형성하는 VL 및 인간 JL 유전자 분절로부터 재배열된 경쇄에 대해 자연에서 관찰되는 것보다 더욱 큰 숫자의 N 부가를 포함하는 면역글로불린 경쇄 서열에 의해 인코딩된 가변 도메인을 포함하는 하이브리드 사슬을 포함하고, 여기서 재배열된 경쇄 가변 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 또는 그 이상의 N 부가를 포함한다.
한 양상에서, 면역글로불린 하이브리드 사슬 좌위를 포함하는 비인간 동물, 예를 들면, 생쥐가 제공된다. 한 구체예에서, 하이브리드 사슬 좌위는 내인성 중쇄 좌위 내에 창출되고, 여기서 내인성 생쥐 면역글로불린 중쇄 좌위에서 하나 또는 그 이상의 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 유전자 분절, 중쇄 다양성 (DH) 유전자 분절, 그리고 중쇄 연결 (JH) 유전자 분절이 하나 또는 그 이상의 경쇄 가변 영역 (VL) 유전자 분절 및 하나 또는 그 이상의 경쇄 연결 영역 (JL) 유전자 분절로 대체된다. 한 양상에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위를 대체하는 하이브리드 사슬 좌위를 포함하는 비인간 동물이 제공된다, 예를 들면, 한쪽 또는 양쪽 중쇄 좌위의 모든 또는 실제적으로 모든 내인성 VH, DH 및 JH 유전자 분절이 내인성 생쥐 CH 유전자와 재조합하여 VL 유전자 분절, JL 유전자 분절 및 내인성 생쥐 CH 유전자로부터 유래되는 재배열된 유전자를 형성할 수 있는 내인성 중쇄 좌위에서 재배열된 VL 유전자 서열을 형성하는 하나 또는 그 이상의 VL 유전자 분절 및 하나 또는 그 이상의 JL 유전자 분절로 대체된다.
비인간 동물은 또한, 일부 전통적인 항체의 사합체성 구조와 유사하지만 결합 특징에서 다른 결합 단백질, 예를 들면, VL 항원 결합 단백질의 발현을 유발하고, 그리고 비인간 동물의 세포의 막 표면 상에서 상기 VL 항원 결합 단백질의 발현을 유발하는 면역글로불린 좌위의 인간화를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비인간 동물은 항원에 결합하는, VL 항원 결합 단백질의 하이브리드 및 경쇄 중에서 하나 또는 둘 모두에서 인간 VL 도메인을 산출할 수 있다; 일부 구체예에서, 이런 비인간 포유동물은 임의의 VH, DH 및/또는 JH 유전자 분절 서열에 의해 인코딩되지 않거나 또는 이들로부터 유래되지 않는 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질을 발현하는 B 세포 개체군을 발달시키고 및/또는 갖는다. 일부 구체예에서, 이런 비인간 동물에 의해 발현된 VL 항원 결합 단백질은 항원 결합 부분이 배타적으로 인간 VL 도메인을 포함하는 것으로 특징화된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비인간 동물은 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위에서 비인간 동물 및 이종성 종 (가령, 인간)으로부터 유전 물질을 포함하고, 그리고 내인성 면역글로불린 경쇄 좌위에서 비인간 동물 및 이종성 종 (가령, 인간)으로부터 유전 물질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 분절 및/또는 인간 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 하이브리드 사슬 좌위 및 바람직하게는, 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 분절 및/또는 인간 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함한다. 일부 구체예에서, VL 항원 결합 단백질의 발현은 비인간 면역글로불린 유전 물질 (가령, 비인간 면역글로불린 프로모터 및/또는 인핸서)의 제어 하에 있다.
한 구체예에서, VL 분절은 인간 VL이다. 한 구체예에서, JL 분절은 인간 JL이다. 특정한 구체예에서, VL 및 JL 분절은 인간 VL 및 인간 JL 분절이다.
한 구체예에서, 모든 또는 실제적으로 모든 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 최소한 6개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 최소한 하나의 Jκ 유전자 분절로 대체된다. 한 구체예에서, 모든 또는 실제적으로 모든 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 최소한 16개의 인간 Vκ 유전자 분절 (인간 Vκ) 및 최소한 하나의 Jκ 유전자 분절로 대체된다. 한 구체예에서, 모든 또는 실제적으로 모든 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 최소한 30개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 최소한 하나의 Jκ 유전자 분절로 대체된다. 한 구체예에서, 모든 또는 실제적으로 모든 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 최소한 40개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 최소한 하나의 Jκ 유전자 분절로 대체된다. 한 구체예에서, 최소한 하나의 Jκ 유전자 분절은 2, 3, 4, 또는 5개의 인간 Jκ 유전자 분절을 포함한다.
한 구체예에서, VL 분절은 인간 Vκ 분절이다. 한 구체예에서, 인간 Vκ 분절은 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5 및 1-6을 포함한다. 한 구체예에서, Vκ 분절은 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 1-16을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 Vκ 분절은 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 및 2-30을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 Vκ 분절은 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 및 2-40을 포함한다.
한 구체예에서, VL 분절은 인간 Vκ 분절이고, 그리고 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6, 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15 및 1-16을 포함한다. 한 구체예에서, Vκ 분절은 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 및 2-30을 더욱 포함한다. 한 구체예에서, Vκ 분절은 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 및 2-40을 더욱 포함한다.
한 구체예에서, VL 분절은 인간 Vλ 분절이고, 그리고 인간 λ 경쇄 좌위의 클러스터 A의 단편을 포함한다. 특정한 구체예에서, 인간 λ 경쇄 좌위의 클러스터 A의 단편은 hVλ3-27로부터 hVλ3-1까지 연장한다.
한 구체예에서, VL 분절은 인간 λ 경쇄 좌위의 클러스터 B의 단편을 포함한다. 특정한 구체예에서, 인간 λ 경쇄 좌위의 클러스터 B의 단편은 hVλ5-52로부터 hVλ1-40까지 연장한다.
한 구체예에서, VL 분절은 클러스터 A의 유전체 단편 및 클러스터 B의 유전체 단편을 포함하는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 클러스터 A의 최소한 하나의 유전자 분절 및 클러스터 B의 최소한 하나의 유전자 분절을 포함한다.
한 구체예에서, VL 분절은 클러스터 B의 최소한 하나의 유전자 분절 및 클러스터 C의 최소한 하나의 유전자 분절을 포함한다.
한 구체예에서, VL 분절은 hVλ 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 및 3-12를 포함한다. 특정한 구체예에서, VL 분절은 Vλ3-12으로부터 Vλ3-1까지 걸쳐 있는 인간 λ 경쇄 좌위의 인접한 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 인접한 서열은 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 hVλs를 포함한다. 특정한 구체예에서, hVλs는 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 및 3-12를 포함한다. 특정한 구체예에서, hVλs는 Vλ3-12로부터 Vλ3-1까지 걸쳐 있는 인간 λ 좌위의 인접한 서열을 포함한다.
한 구체예에서, hVλs는 13 내지 28개 또는 그 이상의 hVλs를 포함한다. 특정한 구체예에서, hVλs는 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25 및 3-27을 포함한다. 특정한 구체예에서, hVλs는 Vλ3-27로부터 Vλ3-1까지 걸쳐 있는 인간 λ 좌위의 인접한 서열을 포함한다.
한 구체예에서, VL 분절은 29 내지 40개 hVλs를 포함한다. 특정한 구체예에서, VL 분절은 Vλ3-29로부터 Vλ3-1까지 걸쳐 있는 인간 λ 좌위의 인접한 서열, 그리고 Vλ5-52로부터 Vλ1-40까지 걸쳐 있는 인간 λ 좌위의 인접한 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 유전적으로 변형된 생쥐에서 hVλ1-40 및 hVλ3-29 사이에 모든 또는 실제적으로 모든 서열은 자연에서 (가령, 인간 개체군에서) hVλ1-40 유전자 분절의 하류 (3' 번역되지 않은 부분의 하류)에 발견되는 대략 959 bp의 인간 λ 서열, 제한 효소 부위 (가령, PI-SceI), 그 이후에 자연에서 발견되는 hVλ3-29 유전자 분절의 상류에 대략 3,431 bp의 인간 λ 서열로 본질적으로 구성된다.
한 구체예에서, Jκ는 인간이고, 그리고 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 특정한 구체예에서, Jκ는 Jκ1 내지 Jκ5를 포함한다.
한 구체예에서, VL 분절은 인간 Vλ 분절이고, 그리고 Jκ 유전자 분절은 12-mer 스페이서를 갖는 RSS를 포함하고, 여기서 RSS는 Jκ 유전자 분절의 상류 단부에서 병치된다. 한 구체예에서, VL 유전자 분절은 인간 Vλ이고, 그리고 VLH 좌위는 2개 또는 그 이상의 Jκ 유전자 분절을 포함하고, 이들은 각각 12-mer 스페이서를 갖는 RSS를 포함하고, 여기서 RSS는 각 Jκ 유전자 분절의 상류 단부에서 병치된다.
특정한 구체예에서, VL 분절은 Vκ4-1로부터 Vκ2-40까지 인간 κ 좌위에 걸쳐 있는 인접한 인간 κ 유전자 분절을 포함하고, 그리고 JL 분절은 Jκ1로부터 Jκ5까지 인간 κ 좌위에 걸쳐 있는 인접한 유전자 분절을 포함한다.
한 구체예에서, VL 분절이 Vλ 분절이고 VL 분절 및 J 분절 사이에 DH 분절이 존재하지 않는 경우에, VL 분절은 하류에서 23-mer RSS와 측면에서 접하고 (즉, 하류 측면 상에 병치), 그리고 Jκ 분절 (존재하면) 또는 Jλ 분절 (존재하면)은 상류에서 12-mer RSS와 측면에서 접한다 (즉, 상류 측면 상에서 병치).
한 구체예에서, V 유전자 분절이 Vκ 유전자 분절이고 V 유전자 분절 및 J 유전자 분절 사이에 DH 유전자 분절이 존재하지 않는 경우에, Vκ 유전자 분절은 각각 하류 측면 상에서 12-mer RSS와 병치되고, 그리고 Jκ 분절 (존재하면) 또는 Jλ 분절 (존재하면)은 각각 상류 측면 상에서 23-mer RSS와 병치된다.
한 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 변형된 면역글로불린 좌위를 포함하는 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 전능성 세포, 다능성 세포, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS), 그리고 ES 세포에서 선택된다. 한 구체예에서, ES 세포는 인간 κ 경쇄 유전자 분절로 생쥐 κ 경쇄 유전자 분절의 원지 대체를 더욱 내포하는 129S6/SvEvTac 및 C57BL/6NTac 이형접합성 배아로부터 유래된 F1 ES 라인 (F1H4; Valenzuela et al. 2007, 상기)이다 (가령, 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 6,596,541 및 8,642,835를 참조한다). 한 구체예에서, 유전자 변형은 유전체가 50% BALB/c[Tac], 25% C57BL/6N[Tac], 그리고 25% 129S4/SvJae(V17)를 포함하는 하이브리드 ES 세포주에서 수행된다.
특정한 구체예에서, 세포는 생쥐 세포, 예를 들면, 생쥐 ES 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 변형된 면역글로불린 좌위에 대해 동형접합성이다. 한 구체예에서, 세포는 쥐 세포, 예를 들면, 쥐 ES 세포이다 (본원에서 전체적으로 참조로서 편입된 US-2014-0310828-A1을 참조한다).
소형 분자
한 구체예에서, 소형 분자는 합텐이고, 그리고 소형 분자는 담체에 연결된다. 한 구체예에서, 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 전복 (Concholepas concholepas) 헤모시아닌 (CCH), 소 혈청 알부민 (BSA), 양이온화된 소 혈청 알부민 (cBSA), 또는 난백알부민을 포함한다. 한 구체예에서, 소형 분자는 분자량이 6 kDa보다 적은 유기 화합물이다.
일부 구체예에서, 소형 분자는 큰 담체에 부착될 때에만 면역 반응을 이끌어내고, 담체 또는 다른 어쥬번트를 결여하는 점을 제외하고 다른 면에서 필적하는 조건 하에, 예를 들면, 어쥬번트의 부재에서 면역원 단독으로서 이용될 때 유용한 또는 유의미한 면역 반응을 생산하지 않는다는 점에서 합텐이다. 합텐의 실례는 항생제, 농약, 제초제, 살충제, 약물, 비타민, 스테로이드, 호르몬, 독소, 폭발물, 그리고 염료를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다 (가령, Gunther, S. et al., SuperHapten: a comprehensive database for small immunogenic compounds, Nucleic Acids Res., 2007, D906-910을 참조하고, 이것은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다). 합텐 및 상응하는 합텐-담체 접합체의 포괄적인 목록은 또한, 합텐 데이터베이스 (Singh, M. et al., Bioinformatics, 2006, 22:253-255)에서 발견될 수 있는데, 이것은 월드와이드웹 (www) 상에서 URL "imtech.res.in/raghava/haptendb/"에서 인터넷을 통해 접근가능하다.
일부 구체예에서, 담체는 합텐에 결합하고 합텐이 면역 반응을 유도할 수 있게 하는 거대분자이다. 일부 구체예에서, 담체는 분비성 단백질 또는 세포 표면 단백질이다. 일부 구체예에서, 담체는 중합체이다. 일부 구체예에서, 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)이다. 일부 구체예에서, 담체는 전복 (Concholepas concholepas) 헤모시아닌 (CCH)의 정제된 제조물이다. 일부 구체예에서, 담체는 소 혈청 알부민 (BSA)이다. 일부 구체예에서, 담체는 선천적 BSA를 과잉 에틸렌디아민으로 변형하여, 음성으로 하전된 카르복실 기를 양성으로 하전된 일차 아민으로 본질적으로 캡핑함으로써 제조되는 양이온화된 BSA (cBSA)이다. 일부 구체예에서, 담체는 난백알부민이다.
일부 구체예에서, 소형 분자는 자연 스테로이드이다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 4개의 고리에서 배열된 17개 탄소 원자의 분자 구조에 의해 특징화되는 스테로이드이다. 본원에서 설명된 바와 같은 스테로이드의 실례는 호르몬 및 알칼로이드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 스테로이드는 강심 스테로이드 (CTS)이다. 일부 구체예에서, CTS는 Na+/K+-ATPase의 저해제이다. CTS의 실례는 카르데노리드 (내인성 오우아베인), 부파디에노리드, 부팔린, 마리노부파게닌 (MBG), 그리고 텔로시노부파긴을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 합텐은 마리노부파게닌 (MBG)이고, 그리고 담체는 소 혈청 알부민이다. 일부 구체예에서, 스테로이드는 코티솔이다.
일부 구체예에서, 소형 분자는 파라티온, 말라티온, 테트라에틸피로인산 (TEPP), 4,6-디니트로-o-크레졸 (DNOC), 메타시드, 데메톤 (시스텍스), 클로르단, 톡사펜, 앨드린, 벤젠 헥사클로라이드, 린데인, 디엘드린, 로테논, 페스텍스, 디클로로디페닐트리클로로에탄 (DDT), 셀레늄 화합물 (실로시드), 아연 인화물 (Zn3P2), 스트리크닌 화합물, 와파린, 그리고 삼산화비소를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 독약 또는 유독성 물질이다.
일부 구체예에서, 소형 분자는 혈액 뇌 장벽을 교차하고 중추신경계에 작용하는 정신작용제 또는 향정신성 물질이고, 여기서 이것은 뇌 기능에 영향을 주고, 지각, 기분, 의식, 인지 및 행동에서 변화를 유발한다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 카페인, 니코틴, 암페타민, 그리고 코카인을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 자극제이다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 모르핀, 코데인, 헤로인, 펜타닐, 메타돈, 그리고 옥시코돈을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 아편유사제 알칼로이드이다. 일부 구체예에서, 소형 분자는 시야 및 소리를 비롯한 감각 지각을 왜곡하는 환각제이다. 환각제의 실례는 메스칼린, 실로시빈, 디메틸트립타민 (DMT), 리세르그산 디에틸아미드 (LSD), 디메톡시메틸암페타민 (DOM 또는 "STP"), 메틸렌디옥시메탐페타민 (MDMA 또는 "엑스터시")을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 소형 분자는 아세틸콜린, 노르에피네프린, 에피네프린, 도파민, 세로토닌, 글루타민산염, 글리신, 그리고 감마-아미노부티르산 (GABA)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 신경전달물질이다.
일부 구체예에서, 소형 분자는 포스콜린, 솔라마진, 크로신, 대마초 화합물, 아편 알칼로이드, 진세노사이드, 베르베린, 세노사이드, 페오니플로린, 글리시리진, 깅골산, 아코니틴 알칼로이드, 그리고 바이칼린을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
핵산 구조체, 세포 및 이들을 만드는 방법
한 양상에서, 소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 결합 도메인의 가변 도메인을 인코딩하는 핵산, 그리고 상기 핵산을 발현하는 세포가 제공된다.
한 양상에서, 인간 치료제의 제조를 위한 세포주를 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 생쥐로부터 핵산 서열의 용도가 제공된다. 한 구체예에서, 인간 치료제는 인간 중쇄 불변 서열과 융합된 인간 경쇄 가변 서열 (가령, 인간 Vλ 또는 인간 Vκ 분절로부터 유래된)을 포함하는 결합 단백질이다. 한 구체예에서, 인간 치료제는 인간 λ 또는 κ 면역글로불린 경쇄인 첫 번째 폴리펩티드, 그리고 인간 중쇄 불변 서열과 융합된 인간 Vλ 또는 인간 Vκ 가변 서열을 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 포함한다.
한 양상에서, 인간 CH 도메인과 융합된 체성으로 돌연변이된 인간 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유류 세포를 포함하는 발현 시스템이 제공된다.
한 구체예에서, 발현 시스템은 인간 CL 도메인과 융합된 면역글로불린 VL 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함하고, 여기서 인간 CL 도메인과 융합된 VL 도메인은 인간 CH 도메인과 융합된 VL 도메인과 동계 경쇄이다.
한 구체예에서, 적합한 세포는 B 세포, 하이브리도마, 쿠아드로마, CHO 세포, COS 세포, 293 세포, HeLa 세포, 그리고 바이러스 핵산 서열을 발현하는 인간 망막 세포 (가령, PERC.6™ 세포)에서 선택된다.
한 양상에서, 본원에서 개시된 바와 같은 비인간 동물로부터 세포 또는 핵산을 단리하는, 결합 단백질을 만들기 위한 방법이 제공되고, 여기서 세포 또는 핵산은 소형 분자에 결합하는 VL 결합 단백질을 포함하거나 또는 인코딩한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 VL 영역 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 CH 영역을 인코딩하는 유전자와 인프레임 클로닝하여 인간 결합 단백질 서열을 형성하고, 인간 결합 단백질 서열을 적합한 세포에서 발현하는 것을 더욱 포함한다.
한 구체예에서, 비인간은 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자로 면역화되었고, 그리고 CH 영역에 융합된 VL 영역은 소형 분자의 에피토프에 특이적으로 결합한다 (가령, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위에서 KD로). 한 구체예에서, CH 영역에 융합된 VL 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 생쥐에서 체성으로 돌연변이된다.
한 양상에서, 소형 분자에 결합하는 항원 결합 단백질을 만들기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 비인간 동물을 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자로 면역화하고, 여기서 비인간 동물은 자신의 생식계열에서 (i) 비인간 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절, 그리고 (ii) 비인간 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절을 포함하고; (b) 비인간 동물이 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자에 대한 면역 반응을 시작하도록 허용하고; (c) 면역화된 비인간 동물로부터 세포 (가령, 림프구)를 단리하고, 여기서 상기 세포는 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 포함하고; (d) 짝짓기될 때, 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자에 특이적으로 결합하는 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 확인하고; 그리고, (e) 소형 분자에 결합하는 첫 번째와 두 번째 경쇄 가변 도메인의 이합체를 포함하는 항원 결합 단백질을 형성하기 위해 항원 결합 단백질을 발현하는데 적합한 발현 시스템에서 (d)의 핵산 서열을 발현하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포 (가령, B-세포)는 동물로부터 (가령, 비장 또는 림프절로부터) 회수된다. 이들 세포는 불멸 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 골수종 세포주와 융합될 수 있고, 그리고 이런 하이브리도마 세포주는 면역화에 이용된 항원에 특정한 하이브리드 중쇄를 내포하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하기 위해 선별검사되고 선택된다.
한 구체예에서, 면역화는 생쥐를 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자로 기폭하고, 비인간 동물이 일정한 기간 동안 안정하도록 허용하고, 그리고 상기 동물을 소형 분자 또는 담체에 연결된 소형 분자로 재면역화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 기간은 며칠, 최소한 1 주, 최소한 2 주, 최소한 3 주, 최소한 4 주, 또는 최소한 1 개월이다.
한 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 생쥐에서 만들어진 면역글로불린 가변 영역 (VR) (가령, 인간 JL과 융합된 인간 VL 서열을 포함)이 제공된다. 특정한 구체예에서, 면역글로불린 VR은 Vκ 분절 및 Vλ 분절에서 선택되는 생식계열 인간 유전자 분절로부터 유래되고, 여기서 VR은 재배열된 서열이 체성으로 초돌연변이되는 생쥐로부터 재배열된 서열에 의해 인코딩된다. 한 구체예에서, 재배열된 서열은 1 내지 5개의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 재배열된 서열은 최소한 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 재배열된 서열은 10개보다 많은 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 재배열된 서열은 하나 또는 그 이상의 인간 또는 생쥐 중쇄 불변 영역 서열 (가령, 인간 또는 생쥐 CH1, 힌지, CH2, CH3, 그리고 이들의 조합에서 선택됨)과 융합된다.
한 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 생쥐에서 만들어진 결합 단백질의 면역글로불린 가변 도메인 아미노산 서열이 제공된다. 한 구체예에서, VR은 하나 또는 그 이상의 인간 또는 생쥐 중쇄 불변 영역 서열 (가령, 인간 또는 생쥐 CH1, 힌지, CH2, CH3, 그리고 이들의 조합에서 선택됨)과 융합된다.
한 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 생쥐로부터 유래된 핵산 서열에 의해 인코딩된 경쇄 가변 도메인이 제공된다.
한 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 생쥐에서 만들어지거나, 또는 본원에서 설명된 바와 같은 생쥐에서 만들어진 서열로부터 유래된 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편 (가령, Fab, F(ab)2, scFv)이 제공된다.
이중특이적-결합 단백질
면역글로불린 경쇄 가변 도메인과 융합된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 면역글로불린-유사 결합 단백질뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인에 융합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 도메인에 융합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 갖는 결합 단백질이 제공된다. 이런 결합 단백질을 발현하는 세포, 이들을 만드는 생쥐, 그리고 관련된 방법 및 조성물 역시 제공된다.
본원에서 설명된 결합 단백질, 그리고 이들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다중특이적 결합 단백질, 예를 들면, 이중특이적 결합 단백질을 제조하는데 이용될 수 있다. 이러한 양상에서, CH 영역과 융합된 첫 번째 VL 도메인으로 본질적으로 구성되는 첫 번째 폴리펩티드는 CH 영역과 융합된 두 번째 VL 도메인으로 본질적으로 구성되는 두 번째 폴리펩티드와 연관될 수 있다. 첫 번째 VL 도메인 및 두 번째 VL 도메인이 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 경우에, 2개의 VL 도메인을 이용하여 이중특이적-결합 분자가 만들어질 수 있다. CH 영역은 동일하거나 상이할 수 있다. 한 구체예에서, 예로서, CH 영역 중에서 하나는 단백질 A 결합 결정인자를 제거하기 위해 변형될 수 있고, 반면 다른 중쇄 불변 영역은 이렇게 변형되지 않는다 (본원에 전체적으로 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 8,586,713 B2를 참조한다). 이러한 특정 배열은 예로서, 동종이합체의 혼합물 (가령, 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩티드의 동종이합체)로부터 이중특이적 결합 단백질의 단리를 단순화한다.
한 양상에서, 인간 λ 또는 κ 경쇄 가변 도메인 및 인간 또는 생쥐 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 단백질을 비롯하여, 하나 또는 그 이상의 κ 및/또는 λ 경쇄 가변 영역 면역글로불린 서열 및 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 단백질을 만들기 위한 핵산 구조체, 세포, 배아, 생쥐, 그리고 방법이 제공된다.
한 양상에서, 전장 중쇄 면역글로불린 가변 도메인으로부터가 아닌 경쇄 (즉, 카파 (κ) 및/또는 람다 (λ)) 면역글로불린 가변 도메인으로부터 유래되는 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질이 설명된다. 유전적으로 변형된 생쥐를 비롯하여, 결합 단백질을 만들기 위한 방법 및 조성물 역시 제공된다.
한 양상에서, 본원에서 설명된 방법과 조성물은 이중특이적-결합 단백질을 만드는데 이용된다. 이러한 양상에서, CH 영역에 융합되는 첫 번째 VL 및 CH 영역에 융합되는 두 번째 VL은 각각 독립적으로, 동일한 아이소타입의 인간 IgG 서열 (가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)과 인프레임으로 클로닝된다. 첫 번째 VL은 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하고, 그리고 두 번째 VL은 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합한다. 첫 번째와 두 번째 에피토프는 상이한 항원 상에, 또는 동일한 항원 상에 있을 수 있다.
한 구체예에서, 첫 번째 VL에 융합된 CH 영역의 IgG 아이소타입 및 두 번째 VL에 융합된 CH 영역의 IgG 아이소타입은 동일한 아이소타입이지만, 한 IgG 아이소타입이 최소한 하나의 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 다르다. 한 구체예에서, 최소한 하나의 아미노산 치환은 이러한 치환을 결여하는 중쇄와 비교하여, 이러한 치환을 보유하는 중쇄가 단백질 A에 결합할 수 없거나 또는 실제적으로 결합할 수 없게 만든다.
한 구체예에서, 첫 번째 CH 영역은 IgG1, IgG2, 그리고 IgG4에서 선택되는 인간 IgG의 첫 번째 CH3 도메인을 포함한다; 그리고 두 번째 CH 영역은 IgG1, IgG2, 그리고 IgG4에서 선택되는 인간 IgG의 두 번째 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 두 번째 CH3 도메인은 단백질 A에 대한 두 번째 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 변형을 포함한다 (전체적으로 참조로서 편입되는 US 특허 8,586,713 B2를 참조한다).
한 구체예에서, 두 번째 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 435R 변형을 포함한다. 다른 구체예에서, 두 번째 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 436F 변형을 더욱 포함한다.
한 구체예에서, 두 번째 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 그리고 V422I로 구성된 군에서 선택되는 변형을 포함하는 인간 IgG1의 것이다.
한 구체예에서, 두 번째 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 N384S, K392N, 그리고 V422I로 구성된 군에서 선택되는 변형을 포함하는 인간 IgG2의 것이다.
한 구체예에서, 두 번째 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 그리고 V422I로 구성된 군에서 선택되는 변형을 포함하는 인간 IgG4의 것이다.
한 구체예에서, 결합 단백질은 본원에서 언급된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 변형을 갖는 CH 영역을 포함하고, 여기서 결합 단백질의 불변 영역은 인간에서 비면역원성이거나 또는 실제적으로 비면역원성이다. 특정한 구체예에서, CH 영역은 인간에서 면역원성 에피토프를 제공하지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정한 구체예에서, 결합 단백질은 야생형 인간 중쇄에서 발견되지 않는 CH 영역을 포함하고, 그리고 CH 영역은 T-세포 에피토프를 산출하는 서열을 포함하지 않는다.
한 구체예에서, Fc 도메인은 변경된 Fc 수용체 결합을 갖도록 변형될 수 있는데, 이것은 차례로, 작동체 기능에 영향을 준다. Fc 도메인을 포함하는 가공된 중쇄 불변 영역 (CH)은 키메라일 수 있다. 따라서, 키메라 CH 영역은 하나 이상의 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래된 CH 도메인을 합동한다. 가령, 키메라 CH 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH3 도메인의 부분 또는 전부와 합동된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH2 도메인의 부분 또는 전부를 포함한다. 키메라 CH 영역은 또한, 키메라 힌지 영역을 내포할 수 있다. 가령, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "하부 힌지" 서열 (EU 넘버링에 따라 위치 228 내지 236의 아미노산 잔기)와 합동된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "상부 힌지" 아미노산 서열 (EU 넘버링에 따라 위치 216 내지 227의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 키메라 힌지 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기 및 인간 IgG2 하부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다.
일정한 요법의 경우에, Fc 도메인은 Fc-내포 단백질 (가령, 항체)의 원하는 약동학적 성질에 영향을 주지 않으면서, 정상적인 Fc 작동체 기능 중에서 전부 또는 일부를 활성화시키거나, 또는 어느 것도 활성화시키지 않도록 가공될 수 있다. 키메라 CH 영역을 포함하고 변경된 작동체 기능을 갖는 단백질의 실례에 대해, 2014년 1월 31자 제출된 US 출원 번호 14/170,166을 참조하고, 이것은 전체적으로 본원에 편입된다.
프로파일링 결합 특징, 비닝, 그리고 관련된 방법론
VL 항원 결합 단백질이 특히, 본원에서 개시된 바와 같은 하이브리드 면역글로불린 유전자를 포함하는 비인간 동물에서 산출되면, 항원에 특이적으로 결합할 때 하나 또는 그 이상의 독특한 또는 상이한 결합 특징, 다시 말하면, 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 전형적인 또는 전통적인 항체에 의해 전시되지 않는 결합 특징을 전시할 수 있다는 예상치 못한 발견이 본원에서 개시된다. 이런 VL 항원 결합 단백질의 확인 및/또는 단리는 항원에 대한 이런 항원-특이적 VL 항원 결합 단백질의 결합 특징을 평가하는 방법을 포함하고, 그리고 또한, 이들 결합 특징을 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 전형적인 또는 전통적인 항체의 결합 특징에 비교하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예는 하나 또는 그 이상의 상이한 결합 특징을 전시하는 VL 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 단리하고, 그리고 임의선택적으로, 핵산 서열을 발현하는 것을 더욱 포함한다.
일반적인 개요로서, 항원 결합 단백질의 결합 특징을 프로파일링하는 방법은 (a) 결합, 바람직하게는 특이적 결합을 허용하는 조건 하에 항원 특이적 결합 단백질을 항원 (이의 단편 및/또는 이의 변형된 단편 포함)과 접촉시키고, 그리고 (b) 항원 (또는 이의 단편 및/또는 이의 변형된 단편) 및 결합 단백질 사이에 형성된 결합 단백질-항원 복합체 (존재하면)를 검출하는 것을 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 특징"은 감수성, 특이성, 결합능, 친화성 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 널리 공지된 계측가능한 성질 중에서 임의의 한 가지를 지칭한다. 당업자는 이들 일반적인 결합 특징이 특이적 결합 특징, 예를 들면, 에피토프 특이성, 연합 상수, 해리 상수, 평형 상수 등의 조합의 결과일 수 있다는 것을 인식할 것이다. 결합 프로필은 이런 결합 특징 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상을 포함한다.
"특이적으로 결합한다," "특이적 결합," "특이적으로 결합한다," "항원 특이적" 또는 기타 유사한 것은 생리학적 조건 하에 상대적으로 안정된 항원과의 복합체를 형성하는 항원 결합 단백질을 지칭한다. 특이적 결합은 중간 내지 높은 수용력과 함께 통상적으로 낮은 친화성을 갖는 비특이적 결합으로부터 구별되는 높은 친화성 및 낮은 내지 중간 수용력에 의해 특징화된다. 전형적으로, 결합은 연합 상수 KA가 106M-1보다 높을 때 특이적인 것으로 고려된다. 필요하면, 비특이적 결합은 결합 조건을 변화시킴으로써 특이적 결합에 실제적으로 영향을 주지 않으면서 감소될 수 있다. 적절한 결합 조건, 예를 들면, 항원 결합 단백질의 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합에 허용된 시간, 차단제 (가령, 혈청 알부민, 우유 카제인)의 농도 등은 일과적인 기술을 이용하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
항원에 대해 지향된 다수의 항원 결합 단백질을 프로파일링하는 방법은 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 일과적인 교차 차단 검정, 에피토프 지도화, 알라닌 스캐닝 돌연변이체, 펩티드 블롯 (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), 펩티드 개열 분석, 에피토프 절제, 그리고 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형 (Tomer (2000) Protein Science: 9:487-496)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일반적으로, 이들 방법은 표면 상에서 항원 (또는 변형된 단편을 비롯한 이의 단편)의 고정을 포함할 수 있다.
일반적으로, 항원 또는 이의 단편을 고정시키고, 결합하고 및/또는 연결하는데 적합한 고체 또는 반고체 지지체 (및 고체 지지체가 항체를 고정시키는데 적합하게 만드는 변형)는 당분야에서 널리 공지된다. 고체 지지체의 무제한적 실례는 바이오센서 칩 어레이, 비드 (가령, 폴리스티렌 비드, 자화된 비드), 마이크로웰 평판 등을 포함한다. 따라서, 예로서, 실리카 껍질에서 에워싸인 CdSe-CdS 코어-껍질 나노결정은 항원 또는 이의 단편에 연계하기 위해 쉽게 유도체화될 수 있다 (Bruchez et al. (1998) Science 281: 2013-2016). 유사하게, 고도로 형광 양자점 (아연 황화물-캡핑된 카드뮴 셀렌화물)이 극히 민감한 생물학적 검출에서 이용을 위해 생체분자에 공유적으로 연계되었다 (Warren and Nie (1998) Science 281: 2016-2018). 형광으로 표지화된 비드는 Luminex 및 Quantum Dot로부터 상업적으로 가용하다. 이에 더하여, 패드, 필름, 나노웰, 또는 미세유체 통로 또한, 고체 지지체로서 역할을 할 수 있다.
일부 구체예에서, 항원 또는 이의 단편 (이의 변형된 단편 포함)은 고체 또는 반고체 표면, 예를 들면, 폴리비닐리덴 이플루오르화물, 니트로셀룰로오스, 아가로오스, 및/또는 폴리아크릴아미드 겔 패드 상에 고정되거나, 결합된 또는 연결될 수 있다. 알데히드, 폴리리신, 또는 동종기능성 교차연결제로 활성화된 유리 슬라이드 역시 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원(들) 또는 이의 단편(들)은 3차원 어레이, 예를 들면, Mirzabekov et al., Nucleic Acids Res 24(15): 2998-3004 (1996)에서 설명된 3차원 폴리아크릴아미드 겔 패드 마이크로어레이에서 배열될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항원 (들) 또는 이의 단편(들)은 또한, 바이오센서 칩 표면, 폴리스티렌 비드 또는 기타 유사한 것 위에 고정될 수 있다.
항원 결합을 위한 방법 및 조건은 당분야에서 널리 공지되고 본원에서 더욱 설명된다. 또한, 항원 결합 단백질 복합체를 검출하기 위한 방법 및 조건이 당분야에서 널리 공지된다. 항원 결합 단백질 복합체의 검출은 정성적 및/또는 정성적일 수 있다. 예로서, 한 세트에서 다중성 (일반적으로, 큰 다중성)의 결합 단백질의 결합 역시 검출될 수 있다. 항원 결합 단백질 복합체를 검출하기 위한 방법은 예로서, ELISA, 형광 면역검정, 웨스턴 및 반점 블롯, 면역침전, 경쟁자 폴리펩티드를 이용한 경쟁 검정, 그리고 초점 면역검정, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술, 다중 검출 검정 등을 포함한다.
차별적 항원 붕괴
바람직한 구체예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 프로파일링 방법은 거대분자 내로 일련의 독립된 안정된 변화의 도입 후 거대분자에 대항하여 두 결합 단백질의 반응 패턴 (가령, 결합 프로필) 사이에 유사성의 정도가 이들 두 결합 단백질에 의해 결합된 거대분자의 에피토프 사이에 유사성의 정도를 반영한다는 원리에 부분적으로 기초된다. 거대분자에서 변화가 만들어진 후에 이런 거대분자 상호작용을 평가하는 것은 당분야에서 변형-보조된 프로파일링 (MAP), 항원 구조-기초된 항체 프로파일링 (ASAP) 또는 차별적 항원 붕괴 (DAD)로서 알려진 방법이다. DAD는 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 또는 이들의 단편에 대한 각 항원 결합 단백질의 결합 프로필의 유사성에 따라, 동일한 항원에 대해 지향된 다수의 항원 결합 단백질을 분류하는 방법이다 (US 특허 출원 공개 번호 2004/0101920, 본원에서 특이적으로 전체적으로 참조로서 편입됨; 또한, Shi et al. (2006) J. Immunol. Methods 314:9-20)을 참조한다). 각 범주는 다른 범주에 의해 대표된 결합 특징 (가령, 에피토프)와 명백하게 상이한, 또는 부분적으로 중복되는 결합 특징 (가령, 에피토프)을 반영할 수 있다. 이러한 기술은 유전적으로 동일한 항원 결합 단백질의 신속한 여과를 허용하고, 따라서 특성화가 유전적으로 상이한 항원 결합 단백질에 집중될 수 있다. DAD는 본 발명의 VL 항원 결합 단백질을, 전통적인 항체와 비교하여 독특한 결합 특징을 전시하는 항원 결합 단백질의 군, 예를 들면, 전형적인 항체에 차폐된 에피토프에 결합하는 VL 항원 결합 단백질로 분류하는데 이용될 수 있다.
바람직하게는, 항원 단백질은 바이오센서 칩 표면 또는 폴리스티렌 비드 위에 고정될 수 있다. 친화성-기초된 바이오센서는 생물학적 분자, 예를 들면, 항체, 수용체, 리간드, 효소, 탄수화물, 또는 핵산을 고체-상태 전자 공학 및 용액 상 생물학 사이에 인터페이스에서 신호 변환기로서 이용한다. 이들 생체분자 상호작용의 내재하는 인식 성질은 고도의 감수성 및 선택성을 갖는 바이오센서에 의해 관찰되고 계측될 수 있다 (검토를 위해, Baird and Myszka (2001) J. Molecular Recognition, 14:261-268을 참조한다).
바이오센서의 이용의 이점은 데이터를 실시간으로 수집하고, 따라서 결합 반응에 관한 상세한 정보를 신속하게 제공하는 능력을 포함하고, 그리고 두 번째, 상호작용 생체분자 사이에 결합 반응은 결합 반응이 관찰되기 위해, 예로서, 형광 또는 방사성 라벨로 생체분자의 표지화를 필요로 하지 않는다. 대부분의 확립된 바이오센서 기기 및 기술은 현재 Biacore AB (Uppsala, Sweden)에 의해 제공된다. Biacore 기기 (모형 1000, 2000, 그리고 3000)는 96-웰 평판으로부터 직접적으로 표본을 수용할 수 있는 완전히 자동화된, 센서 칩-기초된 SPR 장치이다. 이들 기기 중에서 한 가지 내로 도킹될 때, 칩으로 불리는 센서 표면은 개별적으로 또는 일련으로 작동될 수 있는 4개의 독립된 흐름 셀로 분할된다. 이러한 흐름 셀 형상은 완충액이 센서 표면 위를 연속적으로 통과하도록 허용하고, 따라서 완충액을 위한 피분석물 용액을 교환할 때 시간 소모적 세척 단계에 대한 필요를 경감한다. 이에 더하여, 연속적 흐름 시스템은 리간드가 결합 계측 과정의 지속 기간 동안 일정한 피분석물 농도에 노출되도록 담보한다. 게다가, 각 센서 칩 상에서 4개의 흐름 셀의 이용가능성은 사용자가 3개의 상이한 표본을 고정시키고 동일한 센서 칩 내에 참조 표면을 유지하도록 허용한다. Biacore 2000 및 3000 모형은 4개의 모든 흐름 셀 내에 결합 상호작용을 동시에 모니터링할 수 있다. 일련으로 각 표면에 피분석물의 전달은 즉시 참조 감산 및 향상된 데이터 품질을 허용한다 (Myszka (1999) J. Mol. Recogn. 12:279-284; Rich et al. (2000) Curr. Opin. Biotechnol. 11:54-71). 다른 바이오센서, 예를 들면, Affinity Sensors에 의한 IASYS® 기구, Nippon Laser Electronics에 의한 SPR670, Analytical μSystems에 의한 Bio-Suplar II, 그리고 Texas Instruments에 의한 SPREETATM 역시 본 발명의 방법을 실시하는데 이용될 수 있다.
폴리스티렌 비드는 예로서, 검정, 예를 들면, 다중 LUMINEXTM 검출 검정 (Luminex Corp., TX)으로 처리될 수 있다. 최대 100개 상이한 유형의 비드로 다중 분석을 처리하는 LUMINEXTM의 능력으로 인해, LUMINEXTM은 다양한 변형을 갖는 거의 무제한적 항원 표면을 제공하고, 항체 에피토프 프로파일링에서 향상된 분해능을 유발한다.
항원 구조의 변형 또는 변경은 항원 단백질의 특정 아미노산 잔기의 측쇄를 특이적으로 변형하는 경향이 있는 화학적 처리에 의해, 또는 효소적 처리에 의해 달성될 수 있다. 모든 변형은 바람직하게는, 표면, 예를 들면, 바이오센서 표면, 폴리스티렌 비드 등 위에 고정되는 항원에서 수행된다. 많은 상이한 유형의 항원성 변형은 한 가지 방식으로 변형된 항원을 포함하는 각 표면 또는 비드로 수행될 수 있다. 전형적으로, 비변형된 항원이 고정되는 적절한 대조 표면이 분석 내에 포함될 수 있다.
화학적 변경 또는 변형을 달성하는데 적합한 화학물질의 무제한적 실례는 숙신이미딜 에스테르 및 이들의 유도체, 일차 아민-내포 화합물, 히드라진 및 카르보히드라진, 유리 아미노산, 길이에서 2 내지 20개 잔기를 내포하는 동종- 및 이형-올리고펩티드, 트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀 염산염 (TCEP●HCl)/요오드아세트아미드, N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)/에탄올아민, 요오드아세트아미드 및 히드라진, p-히드록시페닐글리옥살 (HPG), 과산화수소, N-브로모숙신이미드, N-아세틸이미다졸, 테트라니트로메탄, 아르사닐릭산, 단실 염화물, 글루타르알데히드, 닌히드린, 디에틸피로카보네이트 (DEPC), 술포숙신이미딜 아세트산염 (술포-NHS-아세트산염), 폴리에틸렌 글리콜 5000 (PEG-5000), 그리고 7-히드록시쿠마린-3-카르복실산, 숙신이미딜 에스테르를 포함한다. 당업자는 여전히 많은 다른 화학물질이 DAD를 실시하는데 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
항원의 효소적 변경 또는 변형을 달성하는데 적합한 효소, 구체적으로 프로테아제의 무제한적 실례는 변형된 돼지 트립신, 엔도프로테이나아제 Glu-C, 엔도프로테이나아제 Asp-N, 키모트립신, 엔도프로테이나아제 Lys-C, 그리고 엔도프로테이나아제 Arg-C, 펩신, 파파인, 서몰리신, 서브틸리신, 프로테아제 K, 브로멜라인, 그리고 술피드릴-특이적 프로테아제 (피신)를 포함한다. 다시 한 번, 당업자는 다른 프로테아제가 본 발명의 방법을 실시하는데 이용될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
SPR 기술을 이용할 때, 결합은 각 센서 칩의 1개의 비변형된 표면 및 3개의 변형된 표면을 포함하는 모든 표면 상에서 항원 결합 단백질 복합체를 동시에 계측하는 것을 허용하는 실험적 세팅을 이용하여 공명 단위 (RU)로서 계측될 수 있다. 정규화된 반응은 대조 (변형되지 않은) 센서 표면에 대한 3개의 변형된 표면 각각으로부터 결합 반응의 백분율로서 계산될 수 있다. 이런 이유로, 각 표본의 9가지 반응 데이터 (%)는 1개의 비변형된 표면 및 3개의 상이한 변형된 표면을 각각 내포하는 3개의 별도로 제조된 센서 칩 위에서 각 표본을 이동시킴으로써 수집될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 항원은 폴리스티렌 비드에 고정될 수 있다. 비변형된 및 비변형된 항원을 포함하는 비드는 당분야에서 널리 공지된 방법에 따라 산출된다. 예로서, 다중 검출 검정, 예를 들면, 예로서 LUMINEXTM 검출 검정을 이용하여, 항원 결합 단백질 복합체가 평균 형광 강도로서 계측될 수 있고, 그리고 정규화된 반응이 계산될 수 있다.
비닝
특정하고 특수한 적용에서, 본 발명은 항원 결합 단백질, 예를 들면, VL 항원 결합 단백질 및 전형적인 항체, 그리고 이들이 지향되는 항원 사이에 상호작용을 평가하기 위한 방법을 제공하고, 항원 결합 단백질을, 형제로 불리는 구성원이 항원, 예를 들면, 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원에 대한 독특한 및 유사한 결합 특징 또는 프로필을 전시하는 기능적 군 (또한, 클러스터 또는 저장통으로 불림)으로 분류하기 위한 신속한 방법을 실시가능하게 한다. 결합 특징 또는 프로필의 유사성에 근거하여 군집되는 결합 단백질은 유사한 결합 특징을 갖는, 예를 들면, 동일한 에피토프 또는 유사한 에피토프에 결합하는 것으로 고려된다. 이들 클러스터는 임의선택적으로, 매트릭스 형식에서, 또는 계통수로서 "나무" 형식에서, 또는 컴퓨터-판독가능한 형식에서, 또는 임의의 데이터-입력-장치-호환성 형식에서 전시될 수 있다. 클러스터에 관한 정보는 매트릭스, 계통수로부터 또는 컴퓨터 또는 다른 연산 장치에 의해 포착될 수 있다. 데이터 수집은 시각, 수동, 자동화, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "저장통 (bin)"은 본 발명의 방법에 따라 변형된/교란된 항원 표면의 패널에 유사한 결합 프로필을 갖는 것으로 확인된 결합 단백질의 클러스터를 지칭하는 명사로서 이용될 수 있다. 용어 "저장통"은 또한, 본 발명의 방법을 실시하는 것을 지칭하는 동사로서 이용될 수 있는데, 이것은 검정에 의해 산출된 데이터의 임의의 분석을 포함한다.
본원에서 설명된 바와 같이, 비닝은 하나 또는 그 이상의 결합 특징, 예를 들면, 이들이 인식하는 에피토프에 근거하여 결합 단백질을 군화 (grouping)하는 과정이다. 더욱 구체적으로, 비닝은 에피토프 인식 성질에 근거하여 결합 단백질을 군집화 (clustering)하고 상이한 결합 프로필을 갖는 결합 단백질의 저장통을 확인하기 위한 연산적 과정과 합동된, 상이한 결합 단백질의 에피토프 인식 성질을 식별하기 위한 방법 및 시스템을 포함한다. 따라서, 구체예는 본원에서 논의된 바와 같은 결합 단백질의 에피토프 결합 성질을 결정하기 위한 검정, 그리고 이런 검정으로부터 산출된 데이터를 분석하기 위한 과정을 포함한다.
비닝은 1) 예로서, 시각 검사에 의해 결합 특징을 군화하고 전시된 각 항원 결합을 등급 매겨진 막대로서 (가령, 각 변형된 항원 표면으로부터 대조의 백분율로서) 처리하거나; 2) 각 결합 단백질 매트릭스의 결정인자 값을 계산하고 모든 계산된 결정인자를 군으로 분류하거나 (참조: "Calculus--One and Several Variables" 6th Edition by Salas and Einar, pp 715-717, 1990); 또는 3) 이들 방법에 의해 산출된 결합 프로필 데이터에 패턴 인식 알고리즘 및 관련된 생물정보학적 소프트웨어를 적용하고 결합 단백질을 기능적 군으로 분류하는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
한 구체예에서, 항원 결합 단백질 복합체에 대한 정규화된 반응 프로필은 적절한 통계학적 소프트웨어를 이용하여 군으로 조직화될 수 있다. 군화는 또한, 각 반응 매트릭스의 결정인자를 계산하고, 그 이후에 결정인자를 군으로 분류하고, 그리고 가능하면, 각 군의 계조화된 컬러 막대 칼럼 (프로필)을 시각적으로 검사하여 군화 결과를 실증함으로써 달성될 수 있다. 전체 "군화 과정"은 생물정보학적 패턴 인식 또는 데이터 마이닝 연산 소프트웨어에 의해 달성될 수 있다. 이런 소프트웨어의 무제한적 실례는 DNA 마이크로어레이 분석에 의해 일과적으로 이용되는 상업적으로 가용한 프로그램, 예를 들면, J-express (DeNova, Inc. Vancouver, British Columbia), Stanford Gene Cluster Software (Stanford University, Calif.), StatSoft of Statistica, 또는 당업자에 의해 개발된 다른 적합한 비상업적인 프로그램을 포함한다.
다양한 기술이 앞서 설명된 바와 같이 산출된 프로필을 시각화하는데 이용될 수 있다. 인간 관찰자가 의미있는 비교를 하기 위해, 이들 프로필이 제공되는 공간은 이해될 수 있어야 한다. 비록 높은 차원 공간에서 의미있는 경향 또는 클러스터를 시각화하는 것이 어려울 수 있긴 하지만, 한 구체예는 동일한 2 또는 3차원 공간에서 다른 잠재적으로 의미있는 결합 특질을 보는 것이 가능하지 않을 수도 있지만, 특정 프로필에 가장 유관한 것으로 예상되는 2 또는 3차원 (결합 특징)을 포함한다.
다양한 기술이 이러한 문제를 해소하는데 이용될 수 있다. 이런 기술은 더욱 낮은 차원 공간을 창출하는데, 여기서 개별 차원은 데이터의 2개 또는 그 이상의 특질을 포획한다. 이런 기술의 실례는 주성분 분석 (PCA), 선형 및 비선형 판별 분석, 다차원 척도화, 그리고 사영 추적 기술을 포함한다. 특히 바람직한 접근법은 PCA의 이용을 수반한다. PCA는 데이터 세트가 다차원 공간에서 최대 변이를 보여주는 벡터 (차원)를 결정한다. 첫 번째 주성분은 데이터에서 최대 변이의 방향을 보여준다. 두 번째 주성분은 데이터에서 두 번째 최대 변이의 방향을 보여주고, 기타 등등이다. 개체는 자신의 데이터를 묘사하는데 적합한 가능한 많은 주성분을 선별할 수 있다. 전형적으로, 첫 번째 1개, 2개 또는 3개의 주성분이 인간 관찰자에 데이터를 제공하기 위해 선별된다. 주성분 분석은 Jackson, J. E. (1991) A User Guide to Principal Components. New York: John Wiley and Sons; 그리고 Jolliffe, I. T. (1986) Principal Component Analysis. New York: Springer-Verlag에서 더욱 충분히 설명되고, 이들 둘 모두 모든 점에서 본원에 참조로서 편입된다.
주성분 분석을 수행하기 위한 다양한 상업적으로 가용한 도구가 가용하다. PCA를 수행하기 위한 예시적인 통계학적 연산 패키지는 Seattle, Wash.의 Insightful Corporation (이전에 MathSoft) 또는 St. Louis, Mo의 Partek Corporation, 예를 들면, Partek Genomic Suite Software로부터 가용할 수 있다. 주성분 분석은 단순한 방식으로 정량적 결합 프로필에 적용될 수 있다. 하지만, 일반적으로, 프로필 데이터 세트의 주성분 분석을 하기 전에 이들 프로필 데이터 세트를 정규화하는 것이 필요할 것이다. 이것은 프로필의 개별 특질을 포함하는 다양한 스칼라가 대단히 상이한 규모로 존재하기 때문이다. 이들 다양한 특질을 의미있는 PCA 분석을 위한 필적하는 규모로 야기하기 위해, 데이터를 정규화하는 변환을 수행할 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 각 차원은 상기 차원을 따라서 모든 데이터를 고려하고, 데이터의 평균을 감산하고, 그리고 표준 편차에 의해 나눗셈함으로써 척도화된다. 이것은 정규화를 위해 데이터를 효과적으로 환산한다.
바람직한 구체예에서, 차별적 항원 붕괴로부터 산출된 데이터는 다음의 방식으로 정규화될 수 있다. 미가공 데이터는 변형된 항원 표면 (또는 비드 세트)에 대한 항원 결합 단백질의 결합 신호를 변형되지 않은 항원 표면 (또는 비드 세트)에 대한 동일한 항원 결합 단백질의 결합 신호로 나눗셈함으로써 정규화될 수 있다. 차후에, 소정의 표면 (또는 비드 세트)에 대한 모든 값은 상기 표면 (또는 비드 세트)에 대한 모든 결합 단백질로부터 평균 값에 의해 나눗셈될 수 있다. 최종적으로, 모든 값은 로그 2를 베이스로서 이용하여 변환될 수 있다.
다른 구체예에서, 결합 프로필은 고처리량 경쟁적 결합 단백질 검정, 예를 들면, 다중화된 경쟁적 항체 비닝 (MCAB) 검정에 의해 산출되고, 그리고 입력 데이터는 경쟁적 패턴 인식 (CPR) 과정을 이용하여 분석되는데, 이들 둘 모두 U.S. 특허 번호 8,568, 992 (본원에서 전체적으로 편입됨)에서 설명된다.
결합 프로필, 예를 들면, 신호 강도의 정규화 시에, 다양한 널리 공지된 연산적 접근법이 복잡한 데이터에서 근원적인 패턴을 확인하는데 이용될 수 있다. 큰 생물학적 데이터 세트의 분석에 귀중한 것으로 입증된 한 가지 접근법은 계층적 군집화이다. 이러한 방법을 적용할 때, 결합 단백질은 그들의 비유사성 값에 근거하여 내포된 부분집합의 엄격한 계층 내로 강제될 수 있다. 예시적인 구체예에서, 가장 낮은 비유사성 값을 갖는 결합 단백질의 쌍이 먼저 함께 군화된다. 그 다음 가장 작은 비유사성 (또는 평균 비유사성) 값을 갖는 결합 단백질의 쌍 또는 클러스터(들)가 그 다음 함께 군화된다. 이러한 과정은 1개의 클러스터가 남을 때까지 반복적으로 반복된다. 이러한 방식으로, 결합 단백질은 그들의 결합 프로필이 다른 결합 단백질과 비교하여, 얼마나 유사한 지에 따라 군화된다. 한 구체예에서, 결합 단백질은 계통수 (dendrogram) (때때로 "계통수 (phylogenetic tree)"로 불림)로 군화되는데, 이의 분지 길이는 두 결합 단백질의 결합 패턴 사이에 유사성의 정도를 나타낸다. 두 결합 단백질 사이에 긴 분지 길이는 이들이 아마도 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 지시한다. 짧은 분지 길이는 두 결합 단백질이 아마도 동일한 에피토프에 대해 경쟁한다는 것을 지시한다.
본원에서 개시된 방법에 따라 확인된 기능적 군은 동일한 기능적 군에서 결합 단백질이 독특한 또는 상이한 결합 특징을 공유해야 한다는 원리에 따라 널리 공지된 방법을 이용하여 실증될 수 있다. 한 구체예에서, 단일 저장통에서 결합 단백질의 독특한 또는 상이한 결합 특징은 항원의 동일한 에피토프(들)에 대한 저장통 결합 또는 경쟁의 결합 단백질을 유발하고, 여기서 상이한 기능적 군을 나타내는 결합 단백질은 항원의 동일한 에피토프(들)에 결합하거나 또는 경쟁하지 않아야 한다. 이러한 구체예에서, ELISA, 경쟁 검정, 에피토프 지도화 검정, 펩티드 어레이 등이 본원에서 결정된 저장통을 실증하는데 모두 이용될 수 있다.
저장통 또는 기능적 군은 저장통이 최소한 90%, 바람직하게는 최소한 95%, 더욱 바람직하게는 최소한 98%, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 99% VL 단백질을 포함할 때, 모든 또는 실제적으로 모든 VL 항원 결합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 저장통은 100% VL 항원 결합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 충분한 숫자의 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질 및 전통적인 항체가 의미있는 비교 및 비닝을 위해 프로파일링된다. 한 구체예에서, VL 항원 결합 단백질을 발현하고 항원으로 면역화되는 비인간 동물의 혈청에서 또는 혈청으로부터 단리된 결합 단백질은 프로파일링되고, 그리고 동일한 항원으로 면역화되는 대조 비인간 동물의 혈청에서 또는 혈청으로부터 단리된 결합 단백질의 결합 프로필과 비교된다. 한 구체예에서, 면역화는 기폭하는, 다시 말하면, 항원을 비인간 동물에 처음 투여하고, 비인간 동물이 일정한 기간, 예를 들면, 며칠, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주 등 동안 안정되도록 허용하고, 그리고 상기 항원을 비인간 동물에 1회 또는 그 이상 재투여하는 것을 포함한다.
실시예
다음 무제한적 실시예는 당업자에게 본원에서 설명된 비인간 동물을 만들고 이용하는 방법에 관한 완전한 개시와 설명을 제공하고 이의 이해를 보조하기 위해 진술되고, 그리고 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않고, 또한 이들은 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 이들 실시예는 당업자에게 널리 공지된 전통적인 방법 (분자 클로닝 기술 등)의 상세한 설명을 포함하지 않는다. 이용된 숫자 (가령, 양, 온도 등)에 대하여 정확도를 담보하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차와 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 분율은 중량에 의한 분율이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도 (℃)이고, 그리고 압력은 대기압이거나 또는 이에 가깝다.
실시예 1. 변형된 면역글로불린 좌위를 갖는 비인간 동물의 산출
본 실시예는 (a) 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위; 그리고 (b) 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 좌위를 내포하는 비인간 동물의 면역글로불린 좌위를 가공하는 예시적인 방법을 예증한다.
뮤린 면역글로불린 중쇄 좌위 내로 인간 경쇄 V 및 J 유전자 분절 (가령, Vκ 및 Jκ)의 삽입을 위한 예시적인 표적화 벡터의 작제가 아래에 설명된다. 도면 2는 상동성 재조합을 이용하여 뮤린 면역글로불린 중쇄 좌위 내로 삽입을 위한 복수의 인간 κ 경쇄 유전자 분절을 내포하는 4개의 예시적인 표적화 벡터를 도해한다.
다양한 표적화 구조체는 생쥐 유전체 세균 인공 염색체 (BAC) 라이브러리를 변형하는 VELOCIGENE® 유전공학 기술을 이용하여 만들어졌다 (가령, US 특허 번호 6,586,251 및 Valenzuela, D.M., Murphy, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Poueymirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorsky, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L., Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Dominguez, M.G., Noguera, I., Torres, R., Macdonald, L.E., Stewart, A.F., DeChiara, T.M., Yancopoulos, G.D. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659를 참조한다). 생쥐 BAC DNA는 재배열되지 않은 인간 VL 및 JL 유전자 분절의 차후 삽입을 위해 내인성 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 결실시키는 상동성 재조합에 의해 변형될 수 있다. 대안으로, 내인성 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 기능적 가변 영역을 형성하는 내인성 유전자 분절의 재조합이 저해되도록 (가령, 유전자 분절의 전도 또는 붕괴에 의해), 무손상 및 비활성화된 상태로 남겨질 수 있다.
유전체가 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 좌위를 내포하는 유전적으로 변형된 생쥐, 그리고 이들을 만드는 방법은 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2012-0096572 A1에서 설명된다. 도면 2에서 보여지는 바와 같이, 4개의 표적화 벡터가 당분야에서 인정된 표준 분자 기술을 이용하여, 40개 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절을 비활성화된 생쥐 중쇄 좌위 (가령, 결실된 내인성 VH, DH 및 JH 유전자 분절) 내로 순차적으로 삽입하기 위해 가공되었다. 표 3은 각 표적화 벡터 내에 포함된 인간 DNA의 크기를 진술하는데, 이것은 생쥐 면역글로불린 중쇄 좌위 내로 삽입을 위한 다양한 인간 κ 경쇄 유전자 분절을 내포한다. 수많은 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이 표적화 벡터 내에 포함될 수 있다. 도면 2에서 진술된 예시적인 표적화 벡터는 생식계열 인간 κ 경쇄 좌위의 근위 콘틱에서 자연적으로 발견되는 인간 κ 경쇄 유전자 분절을 포함한다 (도면 1). 4가지 모든 표적화 벡터의 연속적인 삽입 후 결과의 내인성 중쇄 좌위는 도면 2의 아래쪽에서 도시된다.
표적화
벡터		 인간 κ 서열의 크기 부가된 인간 κ 유전자 분절
Vκ Jκ
1 ~110.5 kb 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6 1 - 5
2 ~140 kb 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11,
1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 1-16		 -
3 ~161 kb 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21,
1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26,
1-27, 2-28, 2-29, 2-30		 -
4 ~90 kb 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35,
2-36, 1-37, 2-38, 1-39, 2-40		 -
유사한 접근법을 이용하여, 뮤린 중쇄 불변 영역의 배경에서 인간 경쇄 가변 도메인의 다른 조합이 작제될 수 있다. 추가 경쇄 가변 도메인은 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로부터 유래될 수 있다. 다양한 숫자의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 인간 DNA를 포함하는 예시적인 표적화 벡터는 도면 3에서 진술된다.
인간 λ 경쇄 좌위는 1,000 kb를 넘어 연장하고, 그리고 가변 (V) 또는 연결 (J) 분절을 인코딩하는 80여개의 유전자를 내포한다. 인간 λ 경쇄 좌위의 70개 Vλ 유전자 분절 사이에서, 공개된 보고서에 따르면 30 내지 38개쯤이 기능적 유전자 분절인 것으로 보인다. 70개 Vλ 서열은 3개의 클러스터에서 배열되는데, 이들 모두 상이한 V 유전자 패밀리 군 (클러스터 A, B 및 C)의 상이한 구성원을 내포한다. 인간 λ 경쇄 좌위 내에서, 모든 관찰된 Vλ 도메인 중에서 절반 이상이 유전자 분절 1-40, 1-44, 2-8, 2-14 및 3-21에 의해 인코딩된다. 7개의 Jλ 유전자 분절이 있는데, 이들 중에서 단지 4개만 전반적으로 기능적 Jλ 유전자 분절 Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7로서 간주된다. 일부 대립형질에서, 다섯 번째 Jλ-Cλ 유전자 분절 쌍은 보고된 바에 따르면, 가성 유전자 (Cλ6)이다. 본원에서 설명된 바와 같이, 하이브리드 중쇄 좌위 내로 복수의 인간 Jλ 유전자 분절의 통합은 데노보 합성에 의해 작제될 수 있다. 이러한 방식으로, 생식계열 형상에서 복수의 인간 Jλ 유전자 분절을 내포하는 유전체 단편은 복수의 인간 Vλ 유전자 분절로 가공되고 중쇄 불변 영역의 배경에서 정상적인 V-J 재조합을 허용한다. 복수의 Jλ 유전자 분절을 포함하는 예시적인 표적화 벡터는 도면 3에서 도시된다 (표적화 벡터 1').
경쇄 가변 도메인을 중쇄 불변 영역과 연계하는 것은 비인간 동물에서 인간 VL 영역을 갖는 독특한 VL 항원 결합 단백질을 산출하기 위한 다양성의 잠재적으로 풍부한 공급원을 나타낸다. 생쥐에서 인간 λ 경쇄 좌위 (또는 앞서 설명된 바와 같은 인간 κ 좌위)의 이러한 다양성을 활용하는 것은 독특한 하이브리드 중쇄의 가공을 결과하고, 그리고 유전적으로 변형된 동물의 면역 레퍼토리에 대한 결합 단백질의 다른 차원 및 치료제의 산출을 위한 차세대 플랫폼으로서 이들의 차후 이용을 발생시킨다.
앞서 설명된 표적화 벡터는 VL 항원 결합 단백질 (즉, 생쥐 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 경쇄 유전자 분절)을 발현하는 키메라 생쥐를 산출하기 위해, 생쥐 배아 줄기 (ES) 세포를 전기천공하여 변형된 ES 세포를 창출하는데 이용된다. 재배열되지 않은 인간 경쇄 유전자 분절의 삽입을 내포하는 ES 세포는 정량적 PCR 검정, TAQMAN® (Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48)에 의해 확인된다. 특정한 프라이머 세트 및 프로브는 인간 서열 및 연관된 선별 카세트의 삽입, 생쥐 중쇄 서열의 상실 및 내인성 중쇄 좌위에 측면에서 접하는 생쥐 서열의 체류를 위한 설계이다.
인간 경쇄 유전자 분절 (가령, Vκ 및 Jκ)을 보유하는 ES 세포는 인간 경쇄 유전자 분절의 삽입에 의해 도입된 임의의 바람직하지 않은 선별 카세트를 제거하기 위해 재조합효소를 발현하는 구조체로 형질감염될 수 있다. 임의선택적으로, 선별 카세트는 재조합효소를 발현하는 생쥐에 교배에 의해 제거될 수 있다 (가령, US 6,774,279, 이것은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다). 임의선택적으로, 선별 카세트는 생쥐에서 유지된다.
앞서 설명된 표적화된 ES 세포는 공여자 ES 세포로서 이용되고, 그리고 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 생쥐 배아 내로 도입된다 (가령, US 특허 번호 7,294,754 및 Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007). F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol 25, 91-99를 참조한다). 생쥐 면역글로불린 중쇄 좌위에서 인간 경쇄 유전자 분절을 독립적으로 보유하는 VELOCIMICE® (공여자 ES 세포로부터 완전히 유래된 F0 생쥐)는 내인성 면역글로불린 중쇄 좌위에서 독특한 인간 경쇄 유전자 분절의 존재를 검출하는 대립형질 검정 (Valenzuela et al., 상기)의 변형을 이용한 유전자형분석에 의해 확인된다. 새끼는 유전자형분석되고, 그리고 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 좌위에 이형접합성 또는 동형접합성인 새끼는 VL-내포 중쇄의 발현을 특징짓기 위해 선별된다.
생쥐 중쇄 좌위 내로 인간 κ 경쇄 유전자 분절의 도입은 인간 κ 경쇄 유전자 분절로 생쥐 κ 경쇄 유전자 분절의 원지 대체를 더욱 내포하는 129S6/SvEvTac 및 C57BL/6NTac 이형접합성 배아로부터 유래된 F1 ES 라인 (F1H4; Valenzuela et al. 2007, 상기)에서 수행되었다 (가령, 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 6,596,541 및 8,642,835를 참조한다).
중쇄 좌위에서 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절을 내포하는 유전적으로 조작된 중쇄 좌위를 포함하는 생쥐 (KOH 생쥐: MAID1713: 40개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절; MAID1994: 40개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절, 그리고 통합된 Adam6 유전자)가 앞서 설명된 바와 같이 산출되었다. 간단히 말하면, KOH 생쥐에서, 모든 내인성 기능적 중쇄 가변적 유전자 분절은 결실되고 40개의 재배열되지 않은 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 분절로 대체되었는데, 이들은 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
동형접합성 VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐 (VI3; 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 8,642,835 및 U.S. 특허 번호 8,502,018 B2를 참조한다)는 동형접합성 KOH 생쥐 (MAID1713 또는 MAID 1994) 생쥐에 교배되어 변형된 경쇄 대립형질 및 KOH 대립형질에 이형접합성인 생쥐가 생산되었다. 이러한 교배로부터 산출된 F1 이형접합성 생쥐는 서로에 교배되어 각 대립형질에 동형접합성인 생쥐 (MAID1713HO 1242HO, MAID1994HO 1242HO)가 획득되었다. 이런 생쥐는 면역글로불린의 구조와 유사한 구조를 갖지만, 이런 결합 단백질이 중쇄 가변 도메인을 결여한다는 점에서 상이한 VL 항원 결합 단백질을 발현한다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 좌위에서 유전적으로 변형된 대립형질의 존재는 앞서 설명된 특정한 프로브 및 프라이머를 이용한 TAQMAN™ 선별검사 및 핵형분석에 의해 확증되었다. 동형접합성 KOH 생쥐는 모든 내인성 가변 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절이 결실된 생쥐 중쇄 좌위 내로 본원에서 설명된 바와 같은 재배열되지 않은 인간 경쇄 유전자 분절 (가령, 인간 Vκ 및 Jκ)의 삽입, 그리고 모든 생쥐 Vκ 및 Jκ 유전자가 결실된 생쥐 카파 (κ) 경쇄 좌위 내로 재배열되지 않은 인간 경쇄 유전자 분절 (가령, 인간 Vκ 및 Jκ)의 삽입을 포함한다. 일부 구체예에서, KOH 생쥐는 통합된 Adam6 유전자를 더욱 포함한다.
유전체가 (i) 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이 내인성 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되도록, 40개의 재배열되지 않은 인간 Vκ 및 5개의 Jκ 유전자 분절의 삽입을 내포하는 면역글로불린 중쇄 대립형질, 그리고 (ii) 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이 내인성 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되도록, 40개의 재배열되지 않은 인간 Vκ 및 5개의 Jκ 유전자 분절의 삽입을 내포하는 면역글로불린 경쇄 대립형질을 포함하는 생쥐는 MAID1713/1242, "KOH 생쥐"로서 지칭된다 (전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2012-0096572 A1을 참조한다). 이들 및 또한, 통합된 생쥐 Adam6 유전자를 갖는 생쥐는 MAID1994/1242로서 지칭된다 (본원에서 전체적으로 참조로서 편입되는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2013-0212719 A1을 참조한다).
실시예 2. V L 항원 결합 단백질의 산출 및 특성화
본 실시예는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하고 중쇄 가변 도메인을 결여하는 면역글로불린-유사 분자 (앞서 설명된 바와 같이)를 발현하도록 특이적으로 가공된 생쥐로부터 항원 결합 단백질의 생산을 설명한다. 본 실시예는 소형 분자 (가령, 스테로이드 및 자연 산물 알칼로이드)에 특정한 예시적인 항원 결합 단백질의 산출을 특이적으로 예증하는데, 이들 단백질은 (i) 면역글로불린 경쇄 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드, 그리고 (ii) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드를 내포한다.
VL 항원 결합 단백질은 유전체가 내인성 중쇄와 경쇄 불변 영역 각각에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 경쇄 유전자 분절 (가령, VL 및 JL 유전자 분절)을 각각 내포하는 면역글로불린 중쇄와 경쇄 좌위를 포함하는 유전적으로 변형된 생쥐로부터 획득된다. 이런 생쥐는 야생형 및/또는 대조 유전자 변형된 생쥐와 비교하여, 비단백질성 표적에 대한 항원 결합 단백질을 만들기 위한 견실한 생체내 시스템을 제공한다.
면역화
일반적으로, 본원에서 설명된 바와 같은 생쥐는 항원으로 공격되고, 그리고 세포 (가령, B-세포)가 상기 동물로부터 (가령, 비장 또는 림프절로부터) 회수된다. 이들 세포는 불멸 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 골수종 세포주와 융합될 수 있고, 그리고 이런 하이브리도마 세포주는 면역화에 이용된 항원에 특정한 하이브리드 중쇄를 내포하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하기 위해 선별검사되고 선택된다. 하이브리드 중쇄 및 경쇄의 인간 Vκ 영역을 인코딩하는 DNA는 단리되고 바람직한 불변 영역, 예를 들면, 중쇄 및/또는 경쇄에 연결될 수 있다. 생쥐 중쇄 불변 영역에 융합된 인간 Vκ 유전자 분절의 존재로 인해, 독특한 항체-유사 레퍼토리가 생산되고, 그리고 면역글로불린 레퍼토리의 다양성이 창출된 독특한 항체-유사 형식의 결과로서 극적으로 증가된다. 이것은 면역화 시에 항원 특이적 레퍼토리에 부가된 수준의 다양성을 부여한다. 결과의 클로닝된 서열이 차후에, 세포, 예를 들면, CHO 세포에서 생산될 수 있다. 대안으로, 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질 또는 가변 도메인을 인코딩하는 DNA가 항원 특이적 림프구 (가령, B 세포)로부터 직접적으로 단리될 수 있다 (전체적으로 참조로서 편입되는 US 7,582,298 B2를 참조한다).
초기에, 인간 Vκ 영역 및 생쥐 불변 영역을 갖는 높은 친화성 VL 항원 결합 단백질이 단리된다. 앞서 설명된 바와 같이, VL 항원 결합 단백질은 친화성, 선택성, 에피토프 등을 비롯한 바람직한 특징에 대해 특징화되고 선별된다. 생쥐 불변 영역은 본 발명의 재배열되지 않은 하이브리드 중쇄 좌위로부터 체성으로 돌연변이된 인간 Vκ 도메인을 내포하는 독특한 완전 인간 VL 항원 결합 단백질을 산출하기 위해 원하는 인간 불변 영역으로 대체될 수 있다. 적합한 인간 불변 영역은 예로서, 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4 또는 대안으로, Cκ 또는 Cλ를 포함한다.
KOH 생쥐의 별개의 코호트는 자연 산물 알칼로이드 (항원 A) 및 스테로이드 (항원 B)로 별개로 면역화되었다. "VI3" (VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐, U.S. 특허 번호 8,642,835 및 U.S. 특허 번호 8,502,018 B2를 참조한다) 및 "ULC" 생쥐 (US 2011-0195454A1, US 2012-0021409A1, US 2012-0192300A1, US 2013-0045492A1, US 2013-0185821A1 및 US 2013-0302836A1을 참조한다; 이들 출원은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다)의 별개의 코호트 역시 필적하는 면역 반응 프로필을 제공하기 위해 면역화되었다.
간단히 말하면, 항원 A는 KLH에 접합되고 KOH, VI3 및 ULC 생쥐를 면역화시키기 위한 면역원으로서 이용되었다. 항원 B의 경우에, BSA 접합체가 KOH 및 VI3 균주를 면역화시키기 위한 면역원으로서 이용되었다. 면역전 혈청은 면역화의 개시에 앞서 생쥐로부터 수집되었다. 면역원은 풋패드 (f.p.) 주사를 통해 25 μl의 용적에서 어쥬번트로서 10 μg의 CpG 올리고뉴클레오티드 (Invivogen)와 혼합된, 초기 기폭 면역화를 위한 2.35 μg의 접합체에서 투여되었다. 차후에, 생쥐는 동일한 루트를 통해, 총 6회 추가 접종 동안 3, 6, 11, 13, 17, 20 일자에 어쥬번트로서 10 μg의 CpG 및 25 μg의 Adju-Phos (Brenntag)와 함께 2.35 μg의 개별 면역원이 추가 접종되었다. 생쥐는 각각, 4번째 및 6번째 추가 접종 후 15 및 22 일자에 채혈되었다. 항혈청은 항원 A의 KLH 접합체에 대한 역가에 대해 검정되었다. 항원 B의 경우에, 역가는 BSA 접합 항원 B 및 BSA에서 검정되었다. KOH 생쥐의 경우에, 6회 추가 접종의 완결 후, 생쥐는 4 내지 5 주의 휴식기가 허용되었고, 그 이후에 이들 면역원으로 4회 추가 접종이 투여되었다. 생쥐는 채혈되고 항혈청 역가가 검정되었다.
원하는 면역 반응이 달성될 때, 비장세포가 수확되고, 그리고 이들의 생존력을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성하기 위해 생쥐 골수종 세포와 융합된다. 하이브리도마 세포주는 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질을 생산하는 세포주를 확인하기 위해 선별검사되고 선택된다. 이러한 기술을 이용하여, 여러 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질 (즉, 생쥐 중쇄와 경쇄 불변 도메인의 배경에서 인간 Vκ 도메인을 소유하는 결합 단백질)이 획득된다.
대안으로, 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질은 본원에서 특이적으로 전체적으로 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 7,582, 298에서 설명된 바와 같이, 골수종 세포에 융합 없이 항원-양성 B 세포로부터 직접적으로 단리된다. 이러한 방법을 이용하여, 여러 완전 인간 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질 (즉, 인간 Vκ 도메인 및 인간 불변 도메인을 소유하는 항체)이 획득되었다.
항혈청 역가 결정
면역원에 대항하여 혈청 역가는 표준 ELISA에 의해 결정되었다. 다음은 상기 검정을 상세하게 설명한다. 96-웰 마이크로역가 평판 (Thermo Scientific)은 4℃에서 하룻밤 동안 인산염 완충된 식염수 (PBS, Irvine Scientific)에서 항원 A (치환된 방향족 자연 산물 알칼로이드) 또는 항원 B (스테로이드)의 어느 한쪽 BSA 접합체로 2 μg/ml에서 코팅되었다. 그 다음날, 평판은 평판 세정기 (Molecular Devices)를 이용하여, 0.05% Tween 20 (PBS-T, Sigma-Aldrich)을 내포하는 인산염 완충된 식염수로 4회 세척되었다. 평판은 이후, PBS에서 250 μl의 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma-Aldrich)으로 차단되고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 이들 평판은 이후, PBS-T로 4회 세척되었다. 면역화된 생쥐로부터 혈청 및 면역전 혈청은 1:300 또는 1:1000에서 시작하여 0.5% BSA-PBS에서 3-배 계열 희석되고, 차단된 평판에 2중으로 첨가되고, 그리고 이후, 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 마지막 2개의 웰은 빈 채로 남겨지고 두 번째 항체 대조 (배경 대조)로서 이용되었다. 이들 평판은 평판 세정기에서 PBS-T로 다시 한 번 4회 세척되었다. 염소 항생쥐 IgG-Fc- 양고추냉이 과산화효소 (HRP) 접합된 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)가 이후, 1:5000/1:10,000 희석에서 이들 평판에 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 평판은 이후, PBS-T로 8회 세척되고 TMB/H2O2를 기질로서 이용하여 전개되었다. 상기 기질은 20 분 동안 배양되고, 그리고 반응은 2 N 황산 (H2SO4, VWR, cat# BDH3500-1) 또는 1 N 인산 (JT Baker, Cat# 7664-38-2)으로 중지되었다. 평판은 450 nm에서 분광광도계 (Victor, Perkin Elmer)에서 판독되었다. 역가는 Graphpad PRISM 소프트웨어를 이용하여 전산되었다.
주사된 면역원에 대해 생쥐에서 유도된 면역 반응은 역가로서 계측되었는데, 이것은 항원 결합 흡광도가 배경에 비하여 2-배 높은 최대 혈청 희석의 역비례로서 규정된다. 면역화 코스의 종결점에서 KOH 및 VI3 생쥐 둘 모두 필적하는 높은 역가를 유도하였다.
Luminex에 의한 결합 단백질의 확인
선별검사를 위한 항원-연계된 비드를 제조하기 위해, pH 6.2에서 0.1M 인산나트륨 완충액 (J.T.Baker 카탈로그 번호 4011-01)에서 0.12 mL의 Luminex 비드 현탁액 (카르복실화된 마이크로스피어, Luminex Corp.)이 15 μl의 50 mg/mL EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, Sigma 카탈로그 번호 03449) 및 15 μl의 50 mg/mL 술포-NHS (N-히드록시숙신이미드, Pierce 카탈로그 번호 24510)의 첨가, 그 이후에 실온에서 10 분 동안 항온처리에 의해 활성화되었다. 차후에, pH 5에서 50 mM MES 완충액 (ACROS 카탈로그 번호 327765000)에서 0.5 mL의 20 μg/mL BSA-접합 항원 A (치환된 방향족 자연 산물 알칼로이드)가 활성화된 비드에 첨가되었고, 그리고 일차 아민 연계 반응이 2 시간 동안 진행하도록 허용되었고, 그리고 이들 비드 상에서 나머지 반응성 기가 pH 8에서 1/10 용적의 1M 트리스 용액 (Teknova 카탈로그 번호 T1080)의 첨가에 의해 퀀칭되었다. 비드는 0.05% Tween-20 (Calbiochem 카탈로그 번호 655205)을 내포하는 PBS (Life Technologies 카탈로그 번호 14190-144)로 세척되고, 그리고 2% w/v BSA를 내포하는 PBS 완충액 (Sigma 카탈로그 번호 A4503)에서 보관되었다. 동일한 방식으로, BSA 단백질이 연계된 음성 대조 비드의 배치 역시 제조되었다.
결합 단백질을 선별검사하기 위해, 3000 Anitgen A-BSA 비드를 내포하는 75 μl 분취량이 96-웰 필터 평판 (Millipore 카탈로그 번호 MSBVN1250)의 각 전수화된 웰에 분포되었다. 각 결합 단백질 표본 (25 μl)이 각 웰에 첨가되었고, 그리고 이들 평판은 4℃에서 평판 진탕기에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 이틀째의 아침에, 비드는 진공 다양체를 이용하여 0.05% Tween-20 (PBS-T)을 내포하는 PBS 완충액으로 세척되었고, 그리고 비드-결합된 결합 단백질은 실온에서 30 분 동안 PBS-T에서 0.1 mL의 1.25 μg/mL R-피코에리트린-접합된 염소 항인간 Igκ 항체 (Southern Biotech 카탈로그 번호 2063-09)와 함께 이들 비드의 항온처리에 의해 검출되었다. 비드는 이후, 0.15 mL의 PBS-T에서 세척되고 현탁되며, 그리고 중앙 형광 강도 (MFI)가 Luminex 유세포분석법-기초된 분석기로 계측되었다. 유사한 방식으로, BSA-접합 항원 B (스테로이드) 비드가 제조되었고, 그리고 결합 단백질-내포 표본이 선별검사되었다.
상대적 결합 동역학
50nM의 뉴트라비딘이 선별검사의 시작 전 최소한 24 시간 동안 200nM의 비오틴 표지된 항원과 함께 전배양되었다. 소형 분자에 뉴트라비딘의 태깅은 소형 분자 질량 무게를 증가시킴으로써 결합 단백질 미가공 상층액의 처리량 친화성 선별검사의 감수성을 증강시켰다. 항인간 Fc 또는 항생쥐 Fc 특이적 항체로 먼저 고정된 Biacore 센서 표면이 미가공 조건부 배지로부터 항체를 포획하는데 이용되었다. 소형 분자/뉴트라비딘 용액은 이후, 결합 단백질 포획된 표면 위에 2 분 동안 주입되고, 그 이후에 결합된 복합체가 10 분 동안 해리되었다. 실험은 HBST를 작업 완충액으로서 이용하여 25℃에서 수행되었다.
도면 4는 KOH 생쥐 및 VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐로부터 획득된 항원-양성 항체 (즉, VL 항원 결합 단백질)의 총수 (왼쪽) 및 백분율 (오른쪽)을 진술한다. 도면 5는 KOH 생쥐 및 VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐로부터 획득된 항원 B에 대한 항체의 예시적인 결합 동역학을 진술한다.
결과는 VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐 (VI3)가 항원 A 비드 상에서 MFI >1000을 갖는 528개 결합 단백질 표본 중에서 10개를 생산한다는 것을 보여주었다. 항원 B 비드의 경우에, VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐 (VI3)는 1000을 초과하는 MFI를 갖는 350개 결합 단백질 표본 중에서 단지 2개만을 보여주었다. 대조적으로, KOH 생쥐는 항원 A 비드 상에서 MFI >1000을 갖는 528개 표본 중에서 453개를 보여주었다. 항원 B 비드 상에서, KOH 생쥐는 MFI >1000을 갖는 339개 표본 중에서 74개를 보여주었다. 모든 항원 양성 표본은 음성 대조 BSA 비드 상에서 최소 또는 미미한 결합 (가령, MFI ~ 118)을 보여주었다.
인간 κ 유전자 분절 용법
본 발명에 따른 생쥐에서 생산된 항-항원 A 또는 항-항원 B VL 항원 결합 단백질을 더욱 특징짓기 위해, 인간 Vκ 도메인 (VL 항원 결합 단백질의 중쇄와 경쇄 둘 모두로부터)을 인코딩하는 핵산이 본원에서 전체적으로 참조로서 편입되는 US 2007/0280945A1에서 설명된 것들로부터 개작된 방법을 이용하여 클로닝되고 염기서열결정되었다. 이들 항체의 핵산 서열 및 예측된 아미노산 서열로부터, 항원 A 또는 B (앞서 설명됨)로 면역화된 생쥐로부터 획득된 선별되고 정제된 VL 항원 결합 단백질의 하이브리드 중쇄 가변 영역에 대한 유전자 용법이 확인되었다. 표 4는 선별된 항-항원 A VL 항원 결합 단백질로부터 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 용법을 진술한다. 표 5는 선별된 항-항원 B VL 항원 결합 단백질로부터 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 용법을 진술한다.
유전자 용법 데이터는 본 발명에 따른 생쥐가 작은 항원에 대항하여 독특한 하이브리드 중쇄 가변 영역을 산출할 수 있다는 것을 보여주는데, 이들 영역은 면역글로불린 중쇄 좌위에서 다양한 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절로부터 유래된다. 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절 용법은 이의 좌위 내에서뿐만 아니라 경쇄 Vκ 및 Jκ 유전자 분절과 비교하여 다양하고 변하는 재배열을 더욱 증명한다. 게다가, 다양성은 하이브리드 중쇄 및 경쇄 사이에 유전자 분절 용법에서 명확하다.
V L 단백질 하이브리드 중쇄 경쇄
Vκ Jκ Vκ Jκ
1 3-20 4 4-1 2
2 3-20 4 1-5 2
3 4-1 1 4-1 3
4 4-1 1 3-20 3
5 1-5 5 3-20 1
6 3-20 4 1-5 2
7 4-1 1 3-20 2
8 3-20 4 1-5 2
9 4-1 1 3-20 3
10 4-1 1 3-20 3
11 1-33 1 1-33 3
12 4-1 1 3-20 3
13 4-1 1 3-20 3
14 4-1 1 3-20 2
15 3-20 3 4-1 1
16 1-33 1 3-20 3
17 3-20 3 4-1 1
18 4-1 1 3-20 1
19 4-1 1 3-20 3
20 4-1 1 3-20 3
21 4-1 1 3-20 3
22 4-1 1 3-20 3
23 1-33 3 3-20 5
V L 단백질 하이브리드 중쇄 경쇄
Vκ Jκ Vκ Jκ
24 1-5 3 3-20 3
25 3-15 5 1-39 3
26 1-5 4 3-20 2
27 1-5 4 3-20 3
28 1-5 5 3-20 2
29 1-5 3 3-20 2
30 4-1 3 3-20 2
31 4-1 1 3-20 2
32 1-5 4 3-20 1
33 1-5 5 3-20 1
34 4-1 1 3-20 2
친화성 결정
선별된 항원 B-특이적 및 정제된 VL 항원 결합 단백질 상층액에 대한 평형 해리 상수 (KD)는 BIACORE™ 2000 기기 (GE Healthcare)를 이용한 SPR (표면 플라스몬 공명)에 의해 결정되었다. 모든 데이터는 25℃에서 DPBS+0.1% DMSO를 표본 및 작업 완충액으로서 이용하여 획득되었다.
간단히 말하면, 각 정제된 VL 항원 결합 단백질은 표준 아민 연계 화학을 이용하여, 고밀도의 단백질 A로 미리 유도체화된 CM5 센서 칩 표면에 놓였다. 포획 단계 동안, 정제된 항-항원 B VL 항원 결합 단백질이 총 3-4 분 동안, 5 μL/분의 유속에서 단백질 A 표면을 교차하여 주입되었다. 포획 단계 이후에, 100 μL/분의 유속에서 1.5 분 동안 270 μM -13.7 nM 원액의 3-배 희석 농도 범위에서 작업 완충액 또는 피분석물의 주사가 이어졌다. 포획된 정제된 VL 항원 결합 단백질로부터 항원의 해리는 최소 5 분 동안 모니터링되었다. 포획된 정제된 VL 항원 결합 단백질은 10 mM 글리신, pH 1.5의 짧은 주입에 의해 제거되었다. 모든 센서그램은 피분석물 센서그램으로부터 완충액 주입으로부터 센서그램을 감산하고, 따라서 포획 표면으로부터 정제된 VL 항원 결합 단백질의 해리에 의해 유발된 인공물을 제거함으로써 이중 참조되었다. 각 정제된 VL 항원 결합 단백질에 대한 결합 데이터는 Biacore T100 평가 소프트웨어 v2.1을 이용하여 질량 이동을 동반한 1:1 결합 모형에 적합되었다. 표 6은 항원 B에 특정한 상업적으로 가용한 항체, 11개의 정제된 항원 B-특이적 VL 항원 결합 단백질, 그리고 대조 VI3 동물로부터 획득된 3개의 대조 항체에 대한 결합 데이터를 제공한다.
V L 단백질 /mAb ka kd KD t1/2 (초)
상업적인 mAb 1.03E+06 5.85E-02 56.9nM 12
VL 단백질 1 4.82E+06 4.58E-02 9.49nM 15
VL 단백질 2 6.40E+05 7.43E-03 11.6nM 93
VL 단백질 3 IC IC IC IC
VL 단백질 4 1.35E+06 5.98E-03 4.4nM 116
VL 단백질 5 1.19E+06 7.11E-03 6.0nM 97
VL 단백질 6 8.50E+05 7.41E-03 8.7nM 94
VL 단백질 7 NB NB NB NB
VL 단백질 8 1.01E+06 4.46E-03 4.4nM 156
VL 단백질 9 1.04E+05 2.02E-01 1.93uM 3
VL 단백질 10 2.42E+06 8.10E-02 33.4nM 9
VL 단백질 11 ≥270uM
대조 mAb 1 NB NB NB NB
대조 mAb 2 ≥270uM
대조 mAb 3 항정 상태 6.3uM
IC = 약한 신호로 인한 결정적이지 않은 1:1 결합 적합 분석
NB = 결합되지 않음
11개의 정제된 항-항원 B VL 항원 결합 단백질의 결합 친화성은 변하였는데, 이들 모두 약 4.4 nM 내지 1.93 μM의 범위에서 KD를 전시하였다. 특히, 11개 VL 항원 결합 단백질 중에서 7개는 약 10 nM 또는 그 이하의 KD를 전시하였다. 대조적으로, 상업적으로 가용한 항체는 ~57 nM의 항원 A에 대한 결합 친화성을 가졌고, 그리고 대조 동물로부터 단리된 3개의 항체 중에서 어느 것도 나노몰 범위에서 KD를 전시하지 않았다. 낮은 나노몰 범위에서 KD를 전시하는 정제된 VL 항원 결합 단백질에 대한 T1/2 치수는 15 및 156 초 사이에서 변하였다. 임의의 특정 이론에 한정됨 없이, 표 6에서 도시된 정제된 VL 항원 결합 단백질의 결합 프로필에서 변동, 그리고 특히, 정제된 VL 항원 결합 단백질 중에서 일부에 의한 결합의 낮은 친화성 또는 결여는 담체에 연결될 때에만 존재하는 항원 A의 에피토프를 인식하는 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질의 결과일 수 있다. 상관없이, 정제된 항체를 이용한 친화성 데이터는 높은 친화성이고, 클론에 의해 선별되고, 체성으로 돌연변이되고, 높은 효율로 소형 분자에 결합할 수 있고, 그리고 따라서, 치료적으로 유관한, 중쇄와 경쇄 불변 영역에 연결된 재배열된 인간 경쇄 가변 도메인의 조합 연관 (표 4에서 설명됨)으로부터 발생하는 VL 항원 결합 단백질과 일치한다.
실시예 3: 프로파일링 결합 특징
면역화
KOH 생쥐의 코호트는 R&D systems로부터 구입된 인간 분비된 당단백질 (항원 C)로 별개로 면역화되었다. "Adam6/VI3" (통합된 Adam6 유전자를 갖는 VELOCIMMUNE® 인간화 생쥐, U.S. 특허 번호 8,642,835 및 U.S. 특허 번호 8,502,018 B2를 참조한다), "ULC" 생쥐 (US 2011-0195454A1, US 2012-0021409A1, US 2012-0192300A1, US 2013-0045492A1, US 2013-0185821A1 및 US 2013-0302836A1을 참조한다; 이들 출원은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다), 그리고 야생형 Balb/c 생쥐의 별개의 코호트 역시 필적하는 면역 반응 프로필을 제공하기 위해 면역화되었다.
합텐에 접합된 항원 C는 KOH, Adam6/VI3, ULC 및 Balb/c 생쥐를 면역화시키는 면역원으로서 이용되었다. 면역전 혈청은 면역화의 개시에 앞서 생쥐로부터 수집되었다. 면역원은 풋패드 (f.p.) 주사를 통해 25 μl의 용적에서 어쥬번트로서 10 μg의 CpG 올리고뉴클레오티드 (Invivogen)와 혼합된, 초기 기폭 면역화를 위한 2.35 μg의 접합체에서 투여되었다. 차후에, 생쥐는 동일한 루트를 통해, 총 6회 추가 접종 동안 3, 6, 11, 13, 17, 20 일자에 어쥬번트로서 10 μg의 CpG 및 25 μg의 Adju-Phos (Brenntag)와 함께 2.35 μg의 면역원이 추가 접종되었다. 생쥐는 각각, 4번째 및 6번째 추가 접종 후 15 및 22 일자에 채혈되었다. 항혈청은 항원 C의 합텐 접합체에 대한 항체 역가에 대해 검정되었다. KOH 생쥐의 경우에, 6회 추가 접종의 완결 후, 생쥐는 4 내지 5 주의 휴식기가 허용되었고, 그 이후에 이들 면역원으로 4회 추가 접종이 투여되었다. 생쥐는 채혈되고 항혈청 역가가 검정되었다.
비드 상에서 항원 C의 제조와 변형
선별검사를 위한 항원-연계된 비드를 제조하기 위해, pH 6.2에서 0.1M 인산나트륨 완충액 (J.T.Baker 카탈로그 번호 4011-01)에서 0.12 mL의 Luminex 비드 현탁액 (카르복실화된 마이크로스피어, Luminex Corp.)이 15 μl의 50 mg/mL EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, Sigma 카탈로그 번호 03449) 및 15 μl의 50 mg/mL 술포-NHS (N-히드록시숙신이미드, Pierce 카탈로그 번호 24510)의 첨가, 그 이후에 실온에서 10 분 동안 항온처리에 의해 활성화되었다. 차후에, pH 5에서 50 mM MES 완충액 (ACROS 카탈로그 번호 327765000)에서 0.5 mL의 20 μg/mL 항원 C가 활성화된 비드에 첨가되었고, 그리고 일차 아민 연계 반응이 2 시간 동안 진행하도록 허용되었고, 그리고 이들 비드 상에서 나머지 반응성 기가 pH 8에서 1/10 용적의 1M 트리스 용액 (Teknova 카탈로그 번호 T1080)의 첨가에 의해 퀀칭되었다. 비드는 0.05% Tween-20 (Calbiochem 카탈로그 번호 655205)을 내포하는 PBS (Life Technologies 카탈로그 번호 14190-144)로 세척되고, 그리고 2% w/v BSA를 내포하는 PBS 완충액 (Sigma 카탈로그 번호 A4503)에서 보관되었다. 동일한 방식으로, 음성 대조 비드의 배치 역시 제조되었다.
항원 C와 연계된 19개 비드 세트가 다음의 차별적 항원 붕괴 시약 중에서 한 가지로 개별적으로 처리되었다: 트립신, Glu-C, Asp-N, 키모트립신, Lys-C, Arg C, 펩신, 술포-NHS 아세트산염, EDC/에탄올아민, TCEP/요오드아세트아미드, PEG-5000, 파파인, 서몰리신, 서브틸리신, 프로테아제K, 브로멜라인, 피신, 그리고 H1193 또는 7-히드록시쿠마린-3-카르복실산, 숙신이미딜 에스테르. 화학적 처리는 실온에서 90 분 동안 인산염 완충된 용액 (PBS)에서 10 mM 새로 용해된 반응성 화학물질에서 비드 세트를 항온처리는 것을 포함하였다. 단백질분해 처리는 실온에서 90 분 동안 PBS 또는 다른 권장된 완충액에서 새로 용해된 10-100 mg의 효소에서 비드 세트를 항온처리하는 것을 포함하였다. 하나의 추가 비드 세트가 실온에서 90 분 동안 PBS에서 항온처리되었고, 그리고 이러한 비드 세트에 연계된 항원 C는 변형되지 않은 채로 남겨졌다. 상기 항온처리 후, 비드 세트는 0.05% Tween 20을 내포하는 PBS (PBS-T)에서 세척되고, 그리고 5% BSA 및 0.02% 아지드화나트륨을 포함하는 PBS에서 보관되었다.
결합 단백질을 선별검사하기 위해, 앞서 설명된 바와 같은 19개의 변형된 항원 비드 및 비변형된 대조 항원 비드가 모아졌다. 3000개 비드를 내포하는 75 μl 분취량이 96-웰 필터 평판 (Millipore 카탈로그 번호 MSBVN1250)의 각 전수화된 웰에 분포되었다. 각 항체 표본 (25 μl)이 각 웰에 첨가되었고, 그리고 이들 평판은 4℃에서 평판 진탕기에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 이틀째의 아침에, 비드는 진공 다양체를 이용하여 PBS-T로 세척되었고, 그리고 비드-결합된 항체는 실온에서 45 분 동안 PBS-T에서 0.2 mL의 1.25 μg/mL R-피코에리트린-접합된 염소 항-생쥐 또는 인간 IgG 항체와 함께 이들 비드의 항온처리에 의해 검출되었다. 비드는 이후, 0.2 mL의 PBS-T에서 세척되고 현탁되며, 그리고 중앙 형광 강도 (MFI)가 Luminex 형광분광광도계로 계측되었다. 결합 데이터는 앞서 설명된 바와 같은 생물정보학적 데이터 분석에 종속되었다.
도면 6은 차별적 항원 붕괴 에피토프 프로파일링 데이터에 근거된 736개 항원 C 결합 단백질 클러스터의 2D PCA 디스플레이를 제공한다. 시험된 전통적인 항체와 에피토프 결합 특질을 공유하지 않는 독특한 에피토프 클러스터는 직사각형에 의해 강조된다. 이러한 독특한 에피토프 저장통의 구성원은 하나 또는 그 이상의 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 중쇄 영역에 작동가능하게 융합된 하나 또는 그 이상의 경쇄 가변 영역 유전자 분절에 의해 인코딩된 가변 영역을 갖는 하이브리드 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 면역글로불린 좌위를 포함하는 생쥐에서 산출된 VL 항원 결합 단백질이다.
바이오센서 표면 상에서 변형된 항원 C의 제조
분비된 당단백질인 항원 C는 표준 NHS/EDC-매개된 아민 연계 절차에 의해 CM5 바이오센서 칩 표면에 연계된다. 각 흐름 셀 표면에 연계된 항원 C의 양은 3000 내지 10,000 RU 사이이다. 밀도 효과를 최소화하기 위해, 바람직한 연계 밀도는 약 5000 RU이다. 거의 동일한 양의 항원 C를 4개의 모든 흐름 셀에 연계하여 3개의 변형된 흐름 셀 신호 및 비변형된 대조 흐름 셀 표면에 결합 사이에 공정한 비교가 이루어질 수 있도록 주의가 요구된다.
6가지 염기서열결정-등급 단백질분해 효소가 각 연계된 항원 C 표면을 변형하는데 이용된다: 첫 번째 바이오센서로부터 흐름 셀 2, 3 및 4를 변형하기 위한 트립신, 엔도프로테이나아제 Glu-C 및 엔도프로테이나아제 Asp-N, 그리고 두 번째 바이오센서 칩으로부터 흐름 셀 2, 3 및 4를 변형하기 위한 키모트립신, 엔도프로테이나아제 Lys-C 및 엔도프로테이나아제 Arg-C. Biacore 2000은 2 μl/분의 유속에서 단일 흐름 셀 방식에 세팅되고, 그리고 0.1M Tris-HCl, pH 8.0에서 60 μl의 200 μg/ml 트립신이 흐름 셀 2 내로 주입된다. 하향 곡선화 센서그램이 전형적인 단백질분해 소화 프로필로서 관찰될 수 있는데, 이것은 트립신이 트립신-가소화성 덩어리를 특이적으로 제거한다는 것을 지시한다. 안정된 표면이 형성될 때까지 동일한 용량의 효소가 반복적으로 흐름 셀 내로 주입된다. 트립신 소화가 흐름 셀 2에서 완결될 때, 트립신과 동일한 완충액에서 60 μl의 50 μg/ml 엔도프로테이나아제 Glu-C가 흐름 셀 3 내로 주입된다. 다시 한 번, 안정된 표면이 형성될 때까지 동일한 용량의 효소가 반복적으로 동일한 흐름 셀 내로 주입된다. 유사한 방식으로, 안정된 endoAsp-N 변형된 표면을 창출하기 위해 동일한 완충액에서 60 μl의 50 μg/ml 엔도프로테이나아제 Asp-N이 흐름 셀 4 내로 주입된다. 효소 처리의 종결점에서, Biacore 2000은 전체 흐름 셀 방식에 세팅된다. 재생 완충액은 안정된 최종 작업 표면을 산출하기 위해 4가지 모든 항원 C 표면을 교차하여 이동된다.
실시예 2에서 설명된 바와 같이 변형된 면역글로불린 좌위를 갖는 비인간 동물 및 대조 동물에서 산출된 항원 C에 특정한 결합 단백질뿐만 아니라 항원 C에 특정한 미리 특징화된 상업적으로 가용한 항체는 새로운 96-웰 마이크로역가 평판 내로 이전되고 75 μl의 2X 희석 완충액 (20 mM Hepes, pH 7.4, 300 mM NaCl, 0.01% P-20, 40 mg/ml CMDX)과 혼합된다. 2X 희석 완충액과 혼합된 적절한 대조 배지는 음성 대조로서 이용된다.
각 결합 단백질 표본은 4가지 모든 흐름 셀 내로 주입되고, 그리고 각 흐름 셀로부터 결합 신호 (RU)가 주입의 종결점에서 기록되고 표면이 재생된다. 각 항체 표본에 대한 결합/재생 주기는 Biacore 제조업체에 의해 제공된 자동화 Wizard 프로그램에 의해 제어된다.
동일한 양의 항원 C를 내포하는 두 번째 칩으로부터 흐름 셀 2, 3 및 4는 첫 번째 칩의 제조에서 앞서 설명된 바와 유사한 방식으로, 각각 키모트립신, 엔도프로테이나아제 Lys-C, 그리고 엔도프로테이나아제 Arg-C로 소화된다. 결합 단백질 표본의 동일한 세트가 4가지 모든 흐름 셀 내로 주입되고, 그리고 그들의 결합 신호 (RU)가 첫 번째 칩과 동일한 방식으로 수집된다.
동일한 양의 항원 C는 표준 알데히드 연계 프로토콜 (BIA Applications Handbook, 4.5)에 의해 세 번째 CM5 칩의 4가지 모든 흐름 셀에 연계된다. 각 흐름 셀 표면에 연계된 항원 C의 양은 3000 내지 10,000 RU 사이이고, 임의의 밀도 효과를 최소화하기 위한 바람직한 연계 양은 약 5000 RU이다. 구조를 변성하지 않으면서 항원 C에서 리신의 임의의 ε 아민을 변형하기 위해, 인산염 완충된 식염수 (PBS)에 용해된 5 mM 술포-NHS-아세트산염이 20 분 동안 흐름 셀 2 내로 5 μl/분에서 주입된다. 구조를 변성하지 않으면서 항원 C에서 임의의 글루타민산 및 아스파르트산 잔기의 임의의 카르복실산 기를 변형하기 위해, H2O에서 용해된 200 mM EDC가 7 분 동안 동일한 유속에서 흐름 셀 3 내로 주입되고, 그 이후에 7 분 동안 H2O에 용해된 50 mM 히드라진이 주입된다. 항원 C의 변성 처리를 위해, 0.1M Tris-HCl, pH 8.0에 용해된 100 mM TCEP가 20 분 동안 동일한 유속에서 흐름 셀 4 내로 주입되고, 그 이후에 0.1M Tris-HCl, pH 8.0에 용해된 100 mM 요오드아세트아미드가 주입된다. 처리의 종결점에서, Biacore 2000은 전체 흐름 셀 방식에 세팅된다. 재생 완충액이 안정된 최종 작업 표면을 산출하기 위해 4가지 모든 항원 C 표면 내로 3회 주입된다.
9개의 변형된 항원 C 표면 및 3개의 변형되지 않은 항원 C 대조 표면을 내포하는 3개의 별개의 칩의 결합 데이터가 수집될 때, 9개의 변형된 항원 C 표면에 대한 각 결합 단백질의 9개 반응 RU 값 모두 변형되지 않은 대조의 것에 대한 반응 비율로 전환된다. 모든 시험된 결합 단백질 제조물의 반응 데이터는 앞서 설명된 바와 같은 생물정보학적 데이터 분석에 종속된다.
에피토프 클러스터 분포의 결과는 전형적인 패턴 인식 (비 감독된) 디스플레이 방법에 의해 제시된다. 이런 디스플레이 방법 중에서 한 가지는 계층적 나무 (계통수)인데, 이들은 결합 단백질의 클러스터 관계를 나무 같은 배열에서 개설한다. 계층적 나무에서, 에피토프를 아마도 공유하는 결합 단백질은 상대적으로 더욱 짧은 "팔"에 의해 함께 연결될 것이고, 반면 에피토프를 공유할 것 같지 않은 것들은 상대적으로 더욱 긴 "팔"에 의해 연결될 것이다.
에피토프 지도화에 의한 결합 단백질 클러스터의 실증
DAD에 의해 결정될 때 2개의 상이한 기능적 군 (또는 클러스터 또는 저장통)으로부터 결합 단백질은 다른 방법, 예를 들면, ELISA, 경쟁 검정 등에 의해 실증될 수 있다. 에피토프 지도화 검정은 전형적으로, Biacore 또는 Octet 기기에 의해 수행된다. 2개의 상이한 기능적 군으로부터 항체는 동일한 에피토프와 상호작용하지 않아야 한다. 이런 이유로, 고정된 항원에 대한 한 클러스터로부터 첫 번째 항체의 결합은 상이한 클러스터로부터 두 번째 항체의 결합을 임의의 유의미한 정도까지 배제하지 않아야 한다. 반대로, 동일한 클러스터로부터 항체는 그들의 항원에 결합할 때, 서로와 거의 완전한 경쟁을 전시해야 한다.
DAD를 이용하여 확인된 기능적 군은 또한, 항원 C 일차 서열-유래된 펩티드 어레이를 이용하여 실증된다. 전체 항원 C 서열을 커버하는 항원 C로부터 유래된 펩티드 또는 중복 펩티드는 PVDF 막 상에서 반점 어레이로서 제조되거나 또는 전형적인 단백질 마이크로어레이 슬라이드 상에 인쇄된다. 상이한 기능적 군을 나타내는 결합 단백질 또는 동일한 기능적 군으로부터 결합 단백질은 펩티드 어레이와 함께 배양되고, 그 이후에 표준 반점 블로팅 또는 단백질 어레이 결합 및 염색 절차가 수행된다. 동일한 에피토프를 인식하는, 동일한 기능적 군으로부터 결합 단백질은 펩티드 어레이 시트 또는 슬라이드 상에서 동일한 또는 거의 동일한 결합 패턴을 전시할 것이다. 반대로, 항원 C 상에서 상이한 에피토프를 인식하는, 상이한 기능적 군으로부터 결합 단백질은 펩티드 어레이에 상이한 결합 패턴을 전시할 것이다.
실시예 4. 소형 분자에 특정한 V L 결합 단백질의 평가
실시예 1-3에서 개시된 바와 같은 항원 A, 항원 B 및 항원 C에 대하여 산출된 VL 결합 단백질은 구조적 특징에 대해 평가되었다. 특히, 항원 A (알칼로이드 소형 분자; n =132), 항원 B (스테로이드성 소형 분자; n =87), 또는 항원 C (당단백질 거대분자, n=61)에 특정한 VL 결합 단백질의 하이브리드 및 경쇄의 CDR3 길이가 결정되었다. 표 7은 항원 A, 항원 B, 또는 항원 C에 특정한 VL 결합 단백질로부터 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12의 CDR3 아미노산 길이를 갖는 하이브리드 사슬의 숫자를 보여준다. 표 8는 이들 동일한 VL 결합 단백질로부터 7, 8, 9 또는 10의 CDR3 아미노산 길이를 갖는 경쇄의 숫자를 보여준다. 도면 7는 이러한 데이터를 막대 그래프 형식으로 제공한다.
CDR3 길이 항원 A 항원 B 항원 C 총합
6 3 38 41
7 2 6 8
8 1 1
9 31 17 48
10 94 45 139
11 1 30 10 41
12 2 2
CDR3 길이 항원 A 항원 B 항원 C 총합
7 2 1 3
8 9 1 1 11
9 98 86 48 232
10 23 11 34
VL 결합 단백질의 경쇄에서 CDR3의 길이는 항원 특이성에 상관없이 일관되게 약 9개 아미노산이었다. 대조적으로, 평가된 VL 결합 단백질의 하이브리드 사슬에서 CDR3의 길이는 특히, 소형 분자에 특정한 VL 결합 단백질의 경우에 더욱 가변적이었다. 당단백질인 항원 C에 특정한 VL 결합 단백질의 하이브리드 사슬은 길이에서 약 10 내지 11개 아미노산의 CDR3 길이를 가졌고, 단지 소수만 10개보다 적은 아미노산을 가졌다. 대조적으로, 소형 분자, 예를 들면, 항원 A 또는 항원 B에 특정한 VL 결합 단백질로부터 하이브리드 사슬의 CDR3은 길이에서 10개보다 적은 아미노산일 가능성이 높다. 항원 B에 특정한 VL 결합 단백질 중에서 단지 절반 이하 (약 40%)가 6개 아미노산의 CDR3 길이를 가졌다.
종합하면, 이들 실시예는 특히, 본원에서 설명된 바와 같은 VL 항원 결합 단백질을 생산하도록 유전적으로 변형된 비인간 동물, 예를 들면, 설치류 및 생쥐가 아마도, 전통적인 항체에 의한 결합에 충분히 적합하지 않은 소형 분자 상에서 신규한 파라토프 또는 결합 표면의 이용을 통해, 전형적인 항체에 의해 전시되지 않는 결합 특징, 예를 들면, 높은 친화성으로 소형 분자에 결합하는 능력을 전시하는 항원 특이적 VL 항원 결합 단백질의 효율적인 산출을 위한 견실한 생체내 시스템을 제공한다는 것을 증명한다.
등가물
본 발명의 최소한 하나의 구체예의 여러 양상이 설명되었기 때문에, 다양한 변경, 변형, 그리고 향상은 당업자에게 쉽게 발생할 것으로 당업자에 의해 인지된다. 이런 변경, 변형, 그리고 향상은 본 발명의 일부인 것으로 의도되고, 그리고 본 발명의 사상과 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 단지 실례에 불과하고, 그리고 본 발명은 다음의 청구항에 의해 상세하게 설명된다.
특정한 배제가 명세서에서 언급되는 지에 상관없이, 본 발명의 임의의 구체예 또는 양상은 청구항으로부터 명시적으로 배제될 수 있는 것으로 또한 이해되어야 한다.
당업자는 본원에서 설명된 검정 또는 다른 과정에서 획득된 값에 기인한 전형적인 표준 편차 또는 오차를 인지할 것이다.
본 발명의 배경을 설명하고 이의 실시에 관한 추가 상세를 제공하기 위해 본원에서 인용된 간행물, 웹사이트 및 다른 참고 자료는 본원에 참조로서 편입된다.

Claims (31)

  1. 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질로서, 첫 번째 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 회합되어 소형 분자에 특이적으로 결합하는 결합 포켓을 형성하는, 항원 결합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 첫 번째 및/또는 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인인 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 경쇄 가변 도메인의 결합 포켓은 50 nM 또는 그 이하의 친화성으로 소형 분자에 결합하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질.
  4. 청구항 1에 있어서, 첫 번째 및/또는 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 첫 번째 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질.
  5. 청구항 4에 있어서, 첫 번째 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 비인간 동물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질.
  6. 청구항 5에 있어서, 비인간 동물은 생쥐 및 쥐에서 선택되는 설치류인 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질.
  7. 청구항 1에 있어서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 (a) Vκ4-1 유전자 분절, Vκ1-5 유전자 분절, Vκ3-15 유전자 분절, Vκ3-20 유전자 분절 또는 Vκ1-33 유전자 분절 및 (b) Jκ1 유전자 분절, Jκ3 유전자 분절, Jκ 4 유전자 분절 또는 Jκ 5 유전자 분절로부터 유래된 첫 번째 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩된 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질.
  8. 청구항 7에 있어서, 첫 번째 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자는 Vκ4-1 유전자 분절 및 Jκ1 유전자 분절로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질.
  9. 청구항 7에 있어서, 첫 번째 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자는 1-5 Vκ 유전자 분절, 그리고 Jκ 3 유전자 분절, Jκ 4 유전자 분절 및 Jκ 5 유전자 분절로 구성된 군에서 선택되는 Jκ 유전자 분절로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질.
  10. 청구항 7에 있어서, 두 번째 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 인간 3-20 Vκ 유전자 분절로부터 유래되는 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩된 것을 특징으로 하는 항원 결합 단백질.
  11. 소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 항원 결합 단백질을 생산하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 유전적으로 변형된 비인간 동물을 소형 분자로 면역화하는 단계, 여기서 유전적으로 변형된 비인간 동물은
    (i) 비인간 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절, 그리고
    (ii) 비인간 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절을 포함하는 단계; 그리고
    (b) 면역화된 비인간 동물로부터 세포 또는 VL 항원 결합 단백질을 단리하는 단계, 여기서 세포 또는 VL 항원 결합 단백질은 소형 분자에 특이적으로 결합한다.
  12. 청구항 11에 있어서,
    (c) 벡터로 형질감염된 세포를 상기 벡터의 발현에 충분한 조건에서 배양하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 상기 벡터는 인간 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하고, 여기서 상기 핵산은 단계 (b)에서 단리된 VL 항원 결합 단백질의 가변 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 실제적으로 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 11에 있어서,
    (c) 하이브리도마 배양액의 상층액으로부터 VL 항원 결합 단백질을 수집하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 하이브리도마는 단계 (b)에서 단리된 세포로부터 생산된 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    (d) 벡터로 형질감염된 세포를 상기 벡터의 발현에 충분한 조건에서 배양하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 상기 벡터는 인간 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하고, 여기서 상기 핵산은 단계 (c)에서 수집된 VL 항원 결합 단백질의 가변 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 실제적으로 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 소형 분자는 분자량이 6 kDa보다 적은 담체 또는 유기 화합물에 연결된 합텐인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 비인간 동물은 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 비인간 동물은 생쥐 또는 쥐에서 선택되는 설치류인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 11의 방법에 따라 단리된 세포로부터 생산된 하이브리도마.
  19. 청구항 11의 방법에 따라 단리된 VL 항원 결합 단백질의 가변 도메인을 인코딩하는 핵산.
  20. 청구항 11의 방법에 따라 단리된 세포.
  21. 다음을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물:
    (a) 유전체 내에
    (i) 비인간 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절, 그리고
    (ii) 비인간 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 및 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절; 그리고
    (b) 소형 분자에 특이적으로 결합하는 VL 항원 결합 단백질.
  22. 청구항 21에 있어서, 비인간 동물은 참조 비인간 동물과 비교하여, 소형 분자 특이적 결합 단백질 역가에서 2-배 또는 그 이상의 증가를 전시하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  23. 전통적인 항체와 비교하여 항원에 대한 독특한 결합 특징을 전시하는 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질을 확인하는 방법으로서,
    (a) 항원에 결합하는 복수의 면역글로불린 단백질 각각의 하나 또는 그 이상의 결합 특징을 프로파일링하는 단계, 여기서 복수의 면역글로불린 단백질은 VL 항원 결합 단백질 및 전통적인 항체를 포함하고,
    여기서 각 VL 항원 결합 단백질은 (i) 하나 또는 그 이상의 경쇄 가변 영역 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인 및 (ii) 하나 또는 그 이상의 중쇄 불변 영역 유전자 분절로부터 유래된 불변 도메인을 포함하는 하이브리드 면역글로불린 사슬을 포함하고, 그리고
    여기서 각 전통적인 항체는 하나 또는 그 이상의 중쇄 가변 영역으로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 하나 또는 그 이상의 경쇄 가변 영역 유전자 분절로부터 유래된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하고;
    (b) 복수의 면역글로불린 단백질을 각 면역글로불린 단백질의 최소한 하나의 결합 특징에 근거하여 하나 또는 그 이상의 군으로 비닝하는 단계, 여기서 유사한 결합 특징을 전시하는 VL 항원 결합 단백질 및 전통적인 항체는 동일한 군으로 비닝되고; 그리고
    (c) 모든 또는 실제적으로 모든 VL 항원 결합 단백질을 포함하는 군을 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 복수의 면역글로불린 단백질 각각의 하나 또는 그 이상의 결합 특징은 차별적 항원 붕괴에 의해 프로파일링된 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 23에 있어서, 복수의 면역글로불린 단백질 각각에 의해 결합된 항원의 하나 또는 그 이상의 에피토프를 지도화하는 단계를 더욱 포함하고; 여기서 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 면역글로불린 단백질은 동일한 기능적 군으로 비닝된 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 23에 있어서, 각 면역글로불린 단백질을 비닝하는 단계를 주성분 분석 (PCA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 23에 있어서, 각 면역글로불린 단백질을 비닝하는 단계를 계층적 군집화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 23에 있어서, 군은 연합 상수, 해리 상수, 에피토프 특이성, 에피토프 친화성, 또는 이들의 조합을 포함하는 결합 프로필에 근거된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 23에 있어서, 마지막 단계로서
    (d) 모든 또는 실제적으로 모든 VL 항원 결합 단백질을 포함하는 것으로 확인된 기능적 군에서 비닝된 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질을 단리하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 마지막 단계로서
    (e) 단리된 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질이 전통적인 항체에 의해 인식되지 않는 항원의 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합한다는 것을 확증하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 단리된 하나 또는 그 이상의 VL 항원 결합 단백질의 하이브리드 면역글로불린 사슬을 염기서열결정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ606824A (en) 2010-08-02 2015-05-29 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
KR102601491B1 (ko) 2014-03-21 2023-11-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
AU2015231025A1 (en) 2014-03-21 2016-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
CN107438622A (zh) 2015-03-19 2017-12-05 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
CA3026088A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase
US12025615B2 (en) 2017-09-15 2024-07-02 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods of classifying response to immunotherapy for cancer
IL305557A (en) * 2018-06-14 2023-10-01 Regeneron Pharma Non-human animals with transgenic DH–DH rearrangement capacity, and their uses
EP4038222A4 (en) 2019-10-02 2023-10-18 Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University METHODS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFYING NEOANTIGENS FOR USE IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER
WO2021142007A1 (en) * 2020-01-09 2021-07-15 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Antibodies and method of producing antibodies
CN114196626A (zh) * 2022-02-16 2022-03-18 北京国卫生物科技有限公司 脐带间充质干细胞及其分离培养扩增方法

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4977081A (en) 1987-05-04 1990-12-11 Adi Diagnostics, Inc. Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1991000906A1 (en) 1989-07-12 1991-01-24 Genetics Institute, Inc. Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
AU8212291A (en) 1990-07-10 1992-02-04 Nkk Corporation Hybridoma which produces avian specific immunoglobulin g
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) * 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
EP0583980A1 (en) 1992-08-20 1994-02-23 Eli Lilly And Company Method for generating monoclonal antibodies from rabbits
WO1994004678A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Casterman Cecile Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
EP0671951A4 (en) 1992-12-01 1997-05-21 Protein Design Labs Inc HUMANIZED ANTIBODIES REACTING WITH L-SELECTIN.
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
AU7326796A (en) 1995-10-30 1997-05-22 Spectral Diagnostics Inc. Stable chicken b-cell line and method of use thereof
AU3507297A (en) 1996-06-26 1998-01-14 Baylor College Of Medicine Chromosomal rearrangement by insertion of two recombination substrates
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
CN1203922A (zh) 1997-03-21 1999-01-06 三共株式会社 人源化抗人fas抗体
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
AU5043200A (en) 1999-05-27 2000-12-18 Human Genome Sciences, Inc. Adam polynucleotides and polypeptides
GB0001448D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
AU2001284703B2 (en) 2000-08-03 2007-03-22 Therapeutic Human Polyclonals Inc. Production of humanized antibodies in transgenic animals
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
TWI255272B (en) 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US7034134B2 (en) 2001-04-26 2006-04-25 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel metalloprotease highly expressed in the testis, MMP-29
DE60227067D1 (de) 2001-05-11 2008-07-24 Kirin Pharma Kk Künstliches menschliches chromosom mit dem gen für die lambda-leichte kette menschlicher antikörper
GB0115256D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
FR2827302B1 (fr) 2001-07-13 2003-10-10 Genoway Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
WO2003031656A1 (en) 2001-10-05 2003-04-17 United States Environmental Protection Agency Genetic testing for male factor infertility
EP3269235B1 (en) 2001-11-30 2022-01-26 Amgen Fremont Inc. Transgenic mice bearing human ig lambda light chain genes
US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US20050246782A1 (en) 2002-03-22 2005-11-03 Origen Therapeutics Transgenic aves producing human polyclonal antibodies
DK1517921T3 (da) 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
CA2965865C (en) 2002-07-18 2021-10-19 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
GB0230201D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
CA2511910A1 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
GB2398784B (en) 2003-02-26 2005-07-27 Babraham Inst Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal
EP2395016A3 (en) 2003-05-30 2012-12-19 Merus B.V. Design and use of paired variable regions of specific binding molecules
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
US7205148B2 (en) 2003-06-11 2007-04-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genome mutation by intron insertion into an embryonic stem cell genome
MXPA06000562A (es) 2003-07-15 2006-03-30 Therapeutic Human Polyclonals Loci de inmunoglobulina humanizada.
WO2005019463A1 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Improved transgenesis with humanized immunoglobulin loci
RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
WO2005038001A2 (en) 2003-10-14 2005-04-28 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Improved transgenesis by sperm-mediated gene transfer
FR2861255B1 (fr) 2003-10-24 2006-02-17 Centre Nat Rech Scient Mammifere non-humain transgenique pour la region constante de la chaine lourde des immunoglobulines humaines de classe a et ses applications.
JP2008512987A (ja) 2004-07-22 2008-05-01 エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム 結合分子
ES2463476T3 (es) 2004-10-19 2014-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética
CN101084317A (zh) 2004-10-22 2007-12-05 人类多克隆治疗公司 对内源免疫球蛋白表达的抑制
GB0618345D0 (en) 2006-09-18 2006-10-25 Univ Erasmus Binding molecules
KR101481843B1 (ko) 2006-01-25 2015-01-12 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담 형질전환 동물 내에서의 중쇄만의 항체의 생성
EP2505058A1 (en) 2006-03-31 2012-10-03 Medarex, Inc. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
PL2041177T3 (pl) 2006-06-02 2012-09-28 Regeneron Pharma Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu receptorowi IL 6
JP5087625B2 (ja) 2006-09-01 2012-12-05 セラピューティック・ヒューマン・ポリクローナルズ・インコーポレーテッド 非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトまたはヒト化免疫グロブリンの発現強化
DK2769992T3 (da) 2006-10-02 2021-03-22 Regeneron Pharma Humane antistoffer med høj affinitet for human IL-4-receptor
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
AU2008259939B2 (en) 2007-06-01 2014-03-13 Open Monoclonal Technology, Inc. Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies
WO2009013620A2 (en) 2007-06-11 2009-01-29 Erasmus University Medical Center Rotterdam Homologous recombination
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
EP3255144A1 (en) 2007-08-10 2017-12-13 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Recombineering construct for preparing transgenic mice capable of producing human immunoglobulin
AU2008294074B2 (en) 2007-08-30 2015-01-22 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Dendritic cell marker and uses thereof
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US8012714B2 (en) 2008-04-14 2011-09-06 Innovative Targeting Solutions, Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
KR20110020860A (ko) 2008-05-23 2011-03-03 알리바 바이오파마수티컬스, 아이엔씨. 유전자 삽입동물에서 단일 ｖｌ 도메인 항체를 생산하는 방법
US20100122358A1 (en) 2008-06-06 2010-05-13 Crescendo Biologics Limited H-Chain-only antibodies
ES2906344T3 (es) 2008-06-27 2022-04-18 Merus Nv Animal murino transgénico productor de anticuerpos
LT2346994T (lt) 2008-09-30 2022-03-10 Ablexis, Llc Knock-in pelė, skirta chimerinių antikūnų gamybai
RU2011129459A (ru) 2008-12-18 2013-01-27 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение
WO2010091182A2 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Molecular Innovations Methods for screening candidate agents for modulating prorenin and renin, assays for detecting prorenin, and antibodies used therein
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
WO2010115553A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-2/anti-c-met antibodies
EP3916011A1 (en) 2009-06-26 2021-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN102638971B (zh) 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
KR101553244B1 (ko) 2009-12-10 2015-09-15 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 중쇄 항체를 만드는 마우스
US20130185821A1 (en) 2010-02-08 2013-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
RU2724663C2 (ru) 2010-02-08 2020-06-25 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Мышь с общей легкой цепью
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
CN103228130B (zh) 2010-06-17 2016-03-16 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
JP6009441B2 (ja) * 2010-06-22 2016-10-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ハイブリッド軽鎖マウス
NZ606824A (en) 2010-08-02 2015-05-29 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
MX338953B (es) * 2010-08-16 2016-05-06 Novimmune Sa Metodos para la generacion de anticuerpos multiespecificos y multivalentes.
WO2012063048A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Kymab Limited Cells & vertebrates for enhanced somatic hypermutation and class switch recombination
PL2578688T5 (pl) 2011-02-25 2023-05-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Myszy adam6
KR101638224B1 (ko) * 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
CN103403025B (zh) * 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
MY172718A (en) 2011-08-05 2019-12-11 Regeneron Pharma Humanized universal light chain mice
WO2013041845A2 (en) 2011-09-19 2013-03-28 Kymab Limited Animals, repertoires & methods
JP2014533930A (ja) 2011-09-19 2014-12-18 カイマブ・リミテッド 免疫グロブリン遺伝子多様性の操作およびマルチ抗体治療薬
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
SG10202010120XA (en) 2011-10-17 2020-11-27 Regeneron Pharma Restricted immunoglobulin heavy chain mice
GB2496375A (en) 2011-10-28 2013-05-15 Kymab Ltd A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CA2859408C (en) 2011-12-20 2020-06-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized light chain mice
PL2809150T3 (pl) 2012-02-01 2020-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizowane myszy wykazujące ekspresję łańcuchów ciężkich zawierających domeny VL
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
JP6045049B2 (ja) 2012-04-05 2016-12-14 ノヴァレッド ゲーエムベーハー 有機電界効果トランジスタ及びその製造方法
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
RS62263B1 (sr) 2013-04-16 2021-09-30 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
KR102601491B1 (ko) 2014-03-21 2023-11-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
AU2015231025A1 (en) 2014-03-21 2016-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
CN107438622A (zh) 2015-03-19 2017-12-05 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物

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