CN103194483A

CN103194483A - 一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法

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Publication number: CN103194483A
Application number: CN2013101500838A
Authority: CN
Inventors: 施维; 赵昊; 张桂荣; 李全顺; 于洋; 林雪贞
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2013-07-10

Abstract

一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法，属于生物工程技术领域。用SOE-PCR的方法扩增得到短肽的全长基因；将若干短肽的基因定向串联起来；将得到的串联基因构建到酵母菌的表达载体中，进而转化酵母菌；诱导表达串联多肽并切割成目的短肽。本发明的特点是可以通过该方法用酵母菌高效表达多种小分子短肽，这些短肽有重要应用价值；此外，利用串联短肽质粒的高效表达，产品开发成本极低。

Description

一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒来制备活性小肽的方法。

背景技术

许多短肽分子量很小，由十几或几十个氨基酸残基组成，却是功能性完整的分子，有重要的无法替代的活性。短肽氨基酸数目少，利用化学方法合成具有一定优势，但是在多肽化学合成中，尤其是在活化步骤中，存在着氨基酸消旋化的可能，而且有些分子中含有较多修饰氨基酸残基，给化学合成带来很多麻烦。随着分子生物学和基因工程技术的快速进展，人们尝试利用基因工程法制备许多有重要实用价值的生物制品；而且，基因工程方法具有周期短、操作简单、成本低廉和蛋白质产量高的优点，在许多短肽的生产中仍具有重要应用价值。由于这些短肽的相对分子质量较小，在表达时易被宿主蛋白酶降解，利用融合蛋白表达技术有利于蛋白质性质的改良和后期纯化，但由于在融合蛋白中短肽所占的比例不高，产量仍然较低。如果将短肽基因串联起来，适当增加拷贝数，可以提高表达量，这在一些短肽如抗菌肽、线性表位、心钠素、血管紧张素酶抑制剂等的生产方面具有很好的应用前景。

发明内容

本发明旨在提高上述短肽表达量，提出一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法：

(1)为使短肽能够相互连接形成短肽串联体，短肽序列需要进行一定的修饰。经过修饰的短肽5'端含有限制性同尾酶的酶切位点T1，短肽3'端含有限制性同尾酶的酶切位点T2，其中T1、T2为一对限制性同尾酶的酶切位点，如XhoI和SalI、XbaI和NheI、BamHI和BglII等酶切位点。同时，为使最后表达出的短肽串联体大分子蛋白能够被分割成单个短肽蛋白，短肽两端的酶切位点的内侧应各含有一个蛋白切割位点，分别称之为G1、G2，G1、G2为两个不同的蛋白切割位点，均可被各自对应的蛋白酶或化学试剂切割。常见的蛋白切割位点如甲硫氨酸(Met)可被溴化氰（CNBr）切割；天冬酰胺（Asn）-甘氨酸（Gly）可被羟胺（NH₂OH）切割；C端的Lys或Arg可被羧肽酶B切割等等。

为得到上述能够用于构建短肽串联体经过修饰的的单个短肽序列，我们采用SOE-PCR的方法，其具体操作步骤如下：首先，我们根据SOE-PCR方法设计上、下游引物的基本原则，将短肽序列D（氨基酸数目一般不大于100）的前半部分（短肽碱基数目的一半即可）命名为D1，结合前面所述在其5'端依次加入修饰基因T1、G1，我们就可以得到用于SOE-PCR的上游引物（5'-3'）：T1及其保护碱基—G1—D1；然后，将D1序列后端的5-10个碱基和短肽序列D的后半部分合起来命名为D2，其互补序列为D2'（这样D1序列后端的5-10个碱基与D2'序列前端的5-10个碱基互为互补序列，在进行SOE-PCR反应时就能使上下游引物结合在一起），结合前面所述在3’端依次加入修饰基因G2、T2的互补序列G2'、T2'，我们就可以得到用于SOE-PCR的下游引物（3'-5'）:D2'—G2'—T2'及其保护碱基互补序列。得到上述引物之后，用SOE-PCR的方法就能得到经过修饰的单个短肽序列，其序列构成如下：

T1及其保护碱基—G1—D—G2—T2及其保护碱基

其中，T1、T2为限制性内切酶的酶切位点，并且T1、T2互为同尾酶；T1、T2的保护碱基（在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应，由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。加入的保护碱基序列会在随后的酶切反应中被切除，因此在设计上下游引物时加入保护碱基并不会影响最后的短肽串联体序列的蛋白表达）；G1、G2为蛋白切割位点，D为短肽序列（由于对短肽的修饰都是在短肽的两端进行，并不会改变短肽自身序列，因此该方案能够适用于所有短肽）。

(2)在构建含有短肽串联体的酵母表达质粒时，由于酵母表达质粒（如酵母表达质粒pPICZa系列等）中通常不同时含有一对互为同尾酶的两个限制性内切酶的酶切位点（如酵母表达质粒pPICZa只有XhoI酶切位点而没有SalI酶切位点，只有XbaI酶切位点而没有NheI酶切位点），因此直接构建含有短肽串联体的酵母表达质粒操作性不强。我们的解决方法是：在酵母表达质粒上只有两个同尾酶之一T1的前提下，我们在酵母表达质粒上选择位置在T1之后的任何一个其他酶切位点，我们称之为R。然后我们在短肽串联体T2之后引入酶切位点R（这样整个短肽串联体序列就能被包含在酶切位点T1和R之间）,即酵母表达质粒上有酶切位点T1和R，而短肽串联体上也有酶切位点T1、R，这样我们就能将短肽串联体通过双酶切的方法转化进酵母表达质粒。因此在构建含有短肽串联体的酵母表达质粒之前，我们需要先为短肽串联体引入酶切位点R。

在短肽串联体中引入酶切位点R，具体步骤如下：

选择一种质粒X，其含有一对同尾酶T1、T2酶切位点且同时含有酵母表达质粒中也有的酶切位点R（如pBluescriptIISK+质粒中不仅同时含有一对同尾酶Xho I和SalI，而且还含有pPICZa酵母表达质粒中也有的XbaI、Sac II、NotI），将质粒X用T1、T2进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带（被两种酶切开的线性化质粒X的长片段）。将上述回收的经过双酶切的质粒X的长片段和步骤1得到的经过修饰的单个短肽序列及限制性内切酶T1、限制性内切酶T2及T4连接酶组成混合体系（质粒X的长片段、经过修饰的单个短肽序列、T1、T2和T4连接酶的物质的量之比依次为1：6：1：1：1，混合于10×反应缓冲液，其余体积由水补齐；10×反应缓冲液组成为（10×表示使用反应缓冲液时要将其浓度稀释10倍），Tris-HCl（pH7.6）660mmol/L，MgCl₂66mmol/L，DTT100mmol/L，ATP1mmol/L，NaCl1mol/L）。先在37℃温度条件下（双酶切反应适宜的温度）双酶切一定时间（1h～2h），接着将混合体系在16℃温度条件下（连接酶适宜的温度）连接一定时间（1h～2h）。循环该过程数次（10次～20次）后，65℃终止反应，醇沉，重悬得到含有不同倍数短肽串联体的重组质粒X（由于短肽与短肽之间、形成串联体的短肽与质粒之间是随机连接，因此不同的重组质粒含有的短肽串联体倍数不同）。得到的重组质粒上不仅有短肽串联体，而且串联体序列之后有酶切位点R，这样我们就为短肽串联体引入了酶切位点R。由于在短肽基因两端引入了一对同尾酶的酶切位点，所以在双酶切后进行连接时，如果两个短肽基因正向顺次串联，则在下一轮酶切时两短肽间的连接处将不被切开；而如果两短肽对向连接，则在下一轮酶切时两短肽间的连接处将被切开。这样，经过若干轮的切连反应后，将会只有正确构建的顺次串联短肽的重组质粒产生。步骤(2)的意义在于：构建重组质粒X的目的在于引入能够把串联体转化进酵母表达质粒所必须的其他酶切位点。

(3)将构建好的重组质粒X转化到质粒克隆菌株中（常用的克隆菌株有E.coliDH5a、BL21、JM109等），小量提取质粒，双酶切并测序鉴定，保存含有所需串联体个数的菌种，并提取含所需倍数的短肽串联体的质粒以进行表达质粒的构建。

(4)将步骤3得到的含所需串联体个数的重组质粒和酵母表达质粒分别用限制性内切酶T1、限制性内切酶R进行双酶切反应，琼脂糖电泳，分别回收重组质粒经过双酶切得到的串联体片段及空酵母表达质粒经过双酶切得到的长片段。

(5)将回收的串联体片段和酵母表达质粒长片段加入到含有T4连接酶的连接体系（串联体片段：酵母表达质粒：T4连接酶的物质的量之比依次为6：1：1，混合于10×反应缓冲液，其余体积由双蒸水补齐），在T4连接酶适宜的温度条件连接一定时间（12h～16h），经琼脂糖凝胶电泳、胶回收得到含有所需倍数（由于质粒载体的最大插入片段约为10kb，因此根据短肽的大小便可确定所能够建的短肽最大串联倍数，然后根据表达的需要选择合适的倍数，如一短肽大小为100bp，那么理论上在质粒载体上所能够建的最大串联倍数为100倍，然后根据表达的需要，一般可以为1～100倍，进一步优选为1～50倍，再进一步优选为1～16倍）短肽串联体的表达质粒。

(6)将得到的酵母表达质粒转化到质粒克隆菌株中，小量提取质粒，双酶切鉴定。

(7)将经过鉴定、构建好的酵母表达质粒转化进酵母菌GS115中，用浓度为100％的甲醇进行诱导表达。

(8)取诱导表达后的菌液，12000rpm离心2～3min，分别收集上清液和沉淀，根据所表达的短肽分泌方式初步确定串联短肽存在于上清液还是沉淀，之后将含有串联短肽的上清液或沉淀选择合适的方法进行纯化，最后用G1和G2蛋白切割位点所对应的蛋白酶或化学试剂切割将串联短肽切割为目的短肽。

本发明的特点是可以通过该方法用酵母菌高效表达多种小分子短肽，这些短肽有重要应用价值；此外，利用串联短肽质粒的高效表达，产品开发成本极低。

附图说明

图1：实施例所述的抗菌肽凝胶电泳图：其中M：核酸maker，1：SOE-PCR得到的抗菌肽。

图2：实施例1所述的表达质粒pPICZa-T经过双酶切的凝胶电泳图；其中M：核酸maker，1：单倍体抗菌肽（maker100对应位置）。

图3：实施例2、3、4所述的表达质粒pPICZa-4T、pPICZa-8T、pPICZa-16T经过双酶切的凝胶电泳图；其中M1：核酸maker，1：4倍抗菌肽串联体（maker400对应位置），2：8倍抗菌肽串联体（maker750对应位置），3：16倍抗菌肽串联体（maker2000与1000中间对应位置），M2：核酸maker。

图4：实施例1所述的表达质粒pPICZa-T的基因测序图谱。

图5：实施例2所述的表达质粒pPICZa-4T的基因测序图谱。

图6：实施例3所述的表达质粒pPICZa-8T的基因测序图谱，由于本测序图谱中序列较长，因此将该图谱分为图6a、图6b两个图谱。

具体实施方式

本发明结合以下抗菌肽为实例作进一步说明，该实例不应解释为对本发明的限制。

实施例1

(1)为使抗菌肽两端各含有一个同尾酶和一个蛋白切割位点，因此，在设计抗菌肽上、下游引物时分别引入了Xho I和Sal I两种同尾酶的酶切位点。同时，分别在酶切位点内侧于氨基端引入了溴化氰（CNBr）蛋白切割位点甲硫氨酸(Met)的密码子（ATG）；于羧基端引入了羟胺（NH2OH）的蛋白切割位点（天冬酰胺（Asn）-甘氨酸（Gly））的密码子AATGGA。

抗菌肽的基因编码序列为（其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示）：

aagtggaagtccttcctgaagaccttcaagtccgctgctaagactgttctgcatactgctctgaaggctatttcctcc；

上游引物（5'-3'）：

tcgactcgagatgaagtggaagtccttcctgaagaccttcaagtccgctgctaagactgttctg；

下游引物（3'-5'）：

ctgacttctagagtcgactccattaggaggaaatagccttcagagcagtatgcagaacagtcttag；

使用上述引物通过SOE-PCR的方法得到经过修饰的抗菌肽全长基因如下：

tcgactcgagatgaagtggaagtccttcctgaagaccttcaagtccgctgctaagactgttctgcatactgctctgaaggctatttcctccaatggagtcgactctagaagtcag；

其中5'端有下划线的ctcgag是限制性内切酶Xho I识别位点，粗体显示的atg是溴化氰（CNBr）蛋白切割位点；3'端有下划线的gtcgac是限制性内切酶SalI识别位点，粗体显示的aatgga是羟胺（NH2OH）的蛋白切割位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

(2)将pBluescriptIISK+空质粒用Xho I和Sal I在50μL体系、37℃条件下进行双酶切，琼脂糖电泳并回收用于构建短肽串联体重组质粒的目的条带（被两种酶切开的线性化pBluescriptIISK+质粒长片段）。根据各自的浓度将双酶切后的pBluescriptIISK+空质粒、步骤(1)得到的SOE-PCR产物、Xho I、Sal I和T4连接酶按适当的比例（pBluescriptIISK+空质粒、SOE-PCR产物、Xho I、Sal I和T4连接酶物质的量之比依次为1：6：1：1：1）混合在特制的10×反应缓冲液（Tris-HCl（pH7.6）660mmol/L，MgCl₂66mmol/L，DTT100mmol/L，ATP1mmol/L，NaCl1mol/L）中，其余体积由双蒸水补齐。混合体系先在37℃酶切1h，接着将混合体系在22℃接1h。循环该过程10次后，65℃止反应，醇沉，重悬分别含有不同倍数抗菌肽串联体的pBluescriptIISK+重组质粒，浓度为100mg/mL。

(3)将得到的pBluescriptIISK+重组质粒转化进大肠杆菌DH5α中，在氨苄青霉素浓度为100mg/L的平板上挑单菌落，小量提取质粒、双酶切并测序鉴定。保存所需菌种（其质粒中含有单倍体抗菌肽，即1倍体抗菌肽），并从中提取质粒以进行表达质粒的构建。

(4)将pBluescriptIISK+重组质粒和空酵母表达质粒pPICZa分别用Xho I和Xba I两种限制性内切酶进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，分别回收重组质粒经过双酶切得到的单倍体抗菌肽片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示）及空酵母表达质粒pPICZa经过双酶切得到的长片段。

(5)根据各自的浓度将回收的单倍体抗菌肽串联体片段和双酶切后的空表达质粒长片段加入含有T4连接酶的连接体系（串联体片段：质粒：T4连接酶的物质的量之比依次为6：1：1，混合于10×反应缓冲液，其余体积由双蒸水补齐），在连接酶适宜的温度条件下（37℃）连接一定时间（12h～16h），经琼脂糖凝胶电泳、胶回收得到含有单倍体抗菌肽的表达质粒pPICZa-T，浓度为110mg/mL。

(6)将得到的表达质粒pPICZa-T转化进E.coli DH5a中，在zeocin浓度为50mg/L的平板上挑单菌落，小量提取质粒、双酶切鉴定。

(7)将构建好的含有单倍体抗菌肽的表达质粒pPICZa-T电转化到酵母菌GS115中，用浓度为100％的甲醇进行诱导表达。

(8)取诱导表达后的菌液，12000rpm离心2～3min，分别收集上清液和沉淀，因抗菌肽为分泌表达，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液经镍柱纯化抗菌肽，再先后用CNBr和NH₂OH将抗菌肽切割为目的短肽，凝胶层析纯化后冻干保存。经质谱分析得到的抗菌肽分子量为2892，薄层扫描得其纯度为94%，产率为6mg/L发酵液。

实施例2

(1)如实施例1步骤(1)。

(2)如实施例1步骤(2)。

(3)将得到的pBluescriptIISK+重组质粒转化进大肠杆菌DH5α中，在氨苄青霉素浓度为100mg/L的平板上挑单菌落，小量提取质粒、双酶切并测序鉴定。保存所需菌种（其质粒中含有正确串联的4倍抗菌肽串联体），并从中提取含4倍抗菌肽串联体的质粒以进行表达质粒的构建。

(4)将pBluescriptIISK+重组质粒和空酵母表达质粒pPICZa分别用Xho I和Xba I两种限制性内切酶进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，分别回收重组质粒经过双酶切得到的4倍抗菌肽串联体片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示）及空酵母表达质粒pPICZa经过双酶切得到的长片段。

(5)根据各自的浓度将回收的4倍抗菌肽串联体片段和双酶切后的空表达质粒长片段加入含有T4连接酶的连接体系（串联体片段：质粒：T4连接酶的物质的量之比依次为6：1：1，混合于10×反应缓冲液，其余体积由双蒸水补齐），在连接酶适宜的温度条件下（37℃）连接一定时间（12h～16h），经琼脂糖凝胶电泳、胶回收得到含有4倍串联体抗菌肽串联体的表达质粒pPICZa-4T，浓度为135mg/mL。

(6)将得到的表达质粒pPICZa-4T转化进E.coli DH5a中，在zeocin浓度为50mg/L的平板上挑单菌落，小量提取质粒、双酶切鉴定。

(7)将构建好的含有4倍串联体抗菌肽串联体表达质粒pPICZa-4T电转化到酵母菌GS115中，用浓度为100％的甲醇进行诱导表达。

(8)取诱导表达后的菌液，12000rpm离心2～3min，分别收集上清液和沉淀，因抗菌肽为分泌表达，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液经镍柱纯化串联抗菌肽，再先后用CNBr和NH₂OH将串联抗菌肽切割为目的短肽，凝胶层析纯化后冻干保存。经质谱分析得到的抗菌肽分子量为2892，薄层扫描得其纯度为93%，产率为19mg/L发酵液。

实施例3

(1)如实施例1步骤(1)。

(2)如实施例1步骤(2)。

(3)将得到的pBluescriptIISK+重组质粒转化进大肠杆菌DH5α中，在氨苄青霉素浓度为100mg/L的平板上挑单菌落，小量提取质粒、双酶切并测序鉴定。保存所需菌种（其质粒中含有正确串联的8倍抗菌肽串联体），并从中提取含8倍抗菌肽串联体的质粒以进行表达质粒的构建。

(4)将pBluescriptIISK+重组质粒和空酵母表达质粒pPICZa分别用Xho I和Xba I两种限制性内切酶进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，分别回收重组质粒经过双酶切得到的8倍抗菌肽串联体片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示）及空酵母表达质粒pPICZa经过双酶切得到的长片段。

(5)根据各自的浓度将回收的8倍抗菌肽串联体片段和双酶切后的空表达质粒长片段加入含有T4连接酶的连接体系（串联体片段：质粒：T4连接酶的物质的量之比依次为6：1：1，混合于10×反应缓冲液，其余体积由双蒸水补齐），在连接酶适宜的温度条件下（37℃）连接一定时间（12h～16h），经琼脂糖凝胶电泳、胶回收得到含有8倍串联体抗菌肽串联体的表达质粒pPICZa-8T，浓度为115mg/mL。

(6)将得到的表达质粒pPICZa-8T转化进E.coli DH5a中，在zeocin浓度为50mg/L的平板上挑单菌落，小量提取质粒、双酶切鉴定。

(7)将构建好的含有8倍串联体抗菌肽串联体表达质粒pPICZa-8T电转化到酵母菌GS115中，用浓度为100％的甲醇进行诱导表达。

(8)取诱导表达后的菌液，12000rpm离心2～3min，分别收集上清液和沉淀，因抗菌肽为分泌表达，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液经镍柱纯化串联抗菌肽，再先后用CNBr和NH₂OH将串联抗菌肽切割为目的短肽，凝胶层析纯化后冻干保存。经质谱分析得到的抗菌肽分子量为2892，薄层扫描得其纯度为96%，产率为39mg/L发酵液。

实施例4

(1)如实施例1步骤(1)。

(2)如实施例1步骤(2)。

(3)将得到的pBluescriptIISK+重组质粒转化进大肠杆菌DH5α中，在氨苄青霉素浓度为100mg/L的平板上挑单菌落，小量提取质粒、双酶切并测序鉴定。保存所需菌种（其质粒中含有正确串联的16倍抗菌肽串联体），并从中提取含16倍抗菌肽串联体的质粒以进行表达质粒的构建。

(4)将pBluescriptIISK+重组质粒和空酵母表达质粒pPICZa分别用Xho I和Xba I两种限制性内切酶进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，分别回收重组质粒经过双酶切得到的16倍抗菌肽串联体片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示）及空酵母表达质粒pPICZa经过双酶切得到的长片段。

(5)根据各自的浓度将回收的16倍抗菌肽串联体片段和双酶切后的空表达质粒长片段加入含有T4连接酶的连接体系（串联体片段：质粒：T4连接酶的物质的量之比依次为6：1：1，混合于10×反应缓冲液，其余体积由双蒸水补齐），在连接酶适宜的温度条件下（37℃）连接一定时间（12h～16h），经琼脂糖凝胶电泳、胶回收得到含有16倍串联体抗菌肽串联体的表达质粒pPICZa-16T，浓度为120mg/mL。

(6)将得到的表达质粒pPICZa-16T转化进E.coli DH5a中，在zeocin浓度为50mg/L的平板上挑单菌落，小量提取质粒、双酶切鉴定。

(7)将构建好的含有16倍串联体抗菌肽串联体表达质粒电转化到酵母菌GS115中，用浓度为100％的甲醇进行诱导表达。

(8)取诱导表达后的菌液，12000rpm离心2～3min，分别收集上清液和沉淀，因抗菌肽为分泌表达，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液经镍柱纯化串联抗菌肽，再先后用CNBr和NH₂OH将串联抗菌肽切割为目的短肽，凝胶层析纯化后冻干保存。经质谱分析得到的抗菌肽分子量为2892，薄层扫描得其纯度为94%，产率为67mg/L发酵液。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术工作人员可最大限度的应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

Claims

1.一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法，其步骤如下：

(1)将短肽序列D的前半部分命名为D1，在其5'端依次加入修饰基因T1、G1，得到上游引物：T1及其保护碱基—G1—D1；然后，将D1序列后端的5～10个碱基和短肽序列D的后半部分合起来命名为D2，其互补序列为D2'，在3’端依次加入修饰基因G2、T2的互补序列G2'、T2'，得到下游引物：D2'—G2'—T2'及其保护碱基互补序列；

用SOE-PCR的方法得到经过修饰的单个短肽序列，其序列构成如下：

T1及其保护碱基—G1—D—G2—T2及其保护碱基

其中，T1、T2为限制性内切酶的酶切位点，并且T1、T2互为同尾酶；G1、G2为蛋白切割位点，D为短肽序列；

(2)选择质粒X，其含有一对同尾酶T1、T2酶切位点且同时含有酵母表达质粒中也有的酶切位点R，将质粒X用T1、T2进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带；将上述回收的经过双酶切的质粒X的长片段和步骤(1)得到的经过修饰的单个短肽序列及限制性内切酶T1、限制性内切酶T2、T4连接酶组成混合体系，先在37℃温度条件下双酶切1h～2h，接着将混合体系在16℃温度条件下连接1h～2h；循环该过程数次后，65℃终止反应，醇沉，重悬得到含有不同倍数短肽串联体的重组质粒X；得到的重组质粒上不仅有短肽串联体，而且串联体序列之后有酶切位点R，这样我们就为短肽串联体引入了酶切位点R；

(3)将构建好的重组质粒X转化到质粒克隆菌株中，小量提取质粒，双酶切并测序鉴定，保存含有所需串联体个数的菌种，并提取含所需倍数的短肽串联体的质粒以进行表达质粒的构建；

(4)将步骤(3)得到的含所需串联体个数的重组质粒和酵母表达质粒分别用限制性内切酶T1、限制性内切酶R进行双酶切反应，琼脂糖电泳，分别回收重组质粒经过双酶切得到的串联体片段及空酵母表达质粒经过双酶切得到的长片段；

(5)将回收的串联体片段和酵母表达质粒长片段加入到含有T4连接酶的连接体系，在T4连接酶适宜的温度条件连接12h～16h，经琼脂糖凝胶电泳、胶回收得到含有所需倍数短肽串联体的表达质粒；

(6)将得到的酵母表达质粒转化到质粒克隆菌株中，小量提取质粒，双酶切鉴定；

(7)将经过鉴定、构建好的酵母表达质粒转化进酵母菌GS115中，进行100％甲醇诱导表达；

(8)取诱导表达后的菌液，离心2～3min，分别收集上清液和沉淀，之后将含有串联短肽的上清液或沉淀选择合适的方法进行纯化，最后用G1和G2蛋白切割位点所对应的蛋白酶或化学试剂切割将串联短肽切割为目的短肽，从而制备得到活性小肽。

2.如权利要求1所述的一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法，其特征在于：步骤(2)中质粒X的长片段、经过修饰的单个短肽序列、T1、T2和T4连接酶的物质的量之比依次为1：6：1：1：1。

3.如权利要求1所述的一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法，其特征在于：步骤(3)中质粒克隆菌株为E.coli DH5a、BL21或JM109。

4.如权利要求1所述的一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法，其特征在于：步骤(3)中短肽串联体的倍数为1～16倍。

5.如权利要求1所述的一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法，其特征在于：步骤(5)中串联体片段、酵母表达质粒、T4连接酶的物质的量之比依次为6：1：1。