TW201309621A - 新穎脂質 - Google Patents

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Makoto Koizumi
Takashi Nakada
Makiko Nakayama
Yoshiyuki Onishi
Miho Sato
Koji Morita
Takako Niwa
Satoshi Sibuya
Masakazu Tamura
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Daiichi Sankyo Co Ltd
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Abstract

本發明之課題在於提供可形成脂質粒子之新穎陽離子性脂質。本發明之解決手段為提供式I所示之化合物：□提供包含該化合物之脂質粒子，包含該脂質粒子之核酸脂質粒子，以該核酸脂質粒子做為有效成分之醫藥。

Description

新穎脂質
本發明係關於新穎陽離子性脂質、可形成脂質粒子之新穎陽離子性脂質、包含該陽離子性脂質之脂質粒子、於該脂質粒子中進一步包含核酸之核酸脂質粒子、以該核酸脂質粒子做為有效成分之醫藥組成物、使用該醫藥組成物之治療方法。
就抑制細胞、組織、或個體內之標的基因之表現之方法而言，有將雙股RNA導入該細胞、組織、或個體內之手法。藉由雙股RNA之導入，具有與該序列同源性之mRNA被分解而抑制標的基因之表現。該效果被稱為「RNA干擾」或「RNAi」。關於RNA干擾，最初在線蟲中被報告(例如，參照非專利文獻1)，之後在植物中亦被報告(例如，參照非專利文獻2)。
據報告於3’末端具有2核苷酸之突出(overhang)且正義鏈及反義鏈各包含21個核苷酸之雙股RNA(小型干擾RNA：siRNA)，在脊椎動物之培養細胞中具有RNA干擾作用(例如，參照非專利文獻3)。siRNA雖然在基因功能之鑑定、適於有用物質生產之細胞株之篩選、參與疾病之基因之控制等方面有用，但具有所謂容易被RNA分解酵素分解之性質(例如，參照非專利文獻4)。
就對於RNA分解酵素安定且具有RNA干擾作用之雙股多核苷酸而言，據報告具有由DNA與2’-OMeRNA交互組合而成之核苷酸單元之雙股多核苷酸可代替構成 siRNA之RNA(參照專利文獻1)。
siRNA或如修飾siRNA之雙股多核苷酸為具有約13,000之分子量，具有水溶性且具有電荷之分子，為了使其透過細胞膜，一般使用如轉染試藥之送達技術(例如，參照非專利文獻5)。尤其是脂質體，封入質體DNA等核酸分子，形成核酸脂質粒子後，被廣泛使用於核酸分子之送達(例如，參照非專利文獻6)。又，據報告包含陽離子性脂質之脂質體，藉由與siRNA混合形成核酸脂質粒子，可送達至細胞內(例如，參照專利文獻2、3、4、5)。然而，由於陽離子性脂質為非身體成分，因此要求可於低濃度使用之陽離子性脂質。就陽離子性脂質而言，已知二亞麻氧基環狀胺衍生物(專利文獻4)、二亞麻氧基丙基環狀胺衍生物(專利文獻5)、二油基甘油衍生物(專利文獻6)、3-亞麻氧基-2-亞麻氧基甲基丙基胺衍生物(專利文獻7)、二亞麻氧基丁基胺衍生物(專利文獻8)等。
本發明者為了取得包含：可封入如siRNA之雙股多核苷酸、DNA、反義寡核苷酸等核酸，並可於低濃度使用之陽離子性脂質之脂質粒子，進行深入研究，結果發現新穎的陽離子性脂質，並且發現包含：可封入核酸分子、可於低濃度使用、可達成高細胞內送達之該新穎陽離子性脂質之核酸脂質粒子，而完成本發明。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2010/001909號小冊子
[專利文獻2]國際公開第2005/120152號小冊子
[專利文獻3]國際公開第2007/086881號小冊子
[專利文獻4]國際公開第2010/054384號小冊子
[專利文獻5]國際公開第2009/129395號小冊子
[專利文獻6]美國專利US5,705,188號
[專利文獻7]國際公開第2009/129385號小冊子
[專利文獻8]國際公開第2009/129387號小冊子
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Nature、1998年、第391卷、p.806-811
[非專利文獻2]Science、1999年、第286卷、p.950-952
[非專利文獻3]Nature、2001年、第411卷、p.494-498
[非專利文獻4]Clinical Chemistry、2002年、第48卷、p.1647-1653
[非專利文獻5]Jonural of MedicinalChemistry 2010年、第57卷、p.7887-7901
[非專利文獻6]Gene Therapy 1999年、第6卷、p.271-281
本發明之一課題為提供可形成脂質粒子之新穎陽離子性脂質。
本發明之另一課題為提供藉由與兩親媒性脂質、膽固醇、PEG-脂質組合而形成脂質粒子之新穎陽離子性脂質。
本發明之另一課題為提供包含該陽離子性脂質之脂質粒子。
本發明之另一課題為提供於該脂質粒子中進一步包含核酸之核酸脂質粒子。
本發明之另一課題為提供以該核酸脂質粒子做為有效成分之醫藥組成物。
本發明之另一課題為提供使用該醫藥組成物之治療方法。
亦即，本發明包含：(1)一種通式(I)所示之陽離子性脂質 [式中，R1及R2獨立表示C1-C3烷基或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷，且R3表示下列基： 或者，R1表示C1-C3烷基且R2及R3與此等所鍵結之氮原子一起形成經R7及R8取代之環狀胺；R7表示基-CH2-O-L1-R4、基-O-R4、或氫原子；R8表示基-CH2-O-L2-R5、基-O-R5、或基-CH(OR4)CH2-O-R5(但是，在R7為基-O-R4之情況，R8不為基-O-R5 ；在R7為氫原子之情況，R8為基-CH(OR4)-CH2-O-R5)；L1及L2獨立表示單鍵、基-CH2CH2O、基-CH(CH3)CH2O、或基-CH2CH(CH3)O；R4及R5獨立表示C9-C24脂肪族飽和或不飽和烴基；R6表示氫原子、羥基或C1-C3烷氧基；R9表示氫原子或甲基；Z1表示單鍵或、基-C(O)O-；Z2表示基-C(O)O-；Z1為基-C(O)O-之情況，m表示2、3、4或5，Z1為單鍵之情況，m表示0或1；n表示2、3、4或5；(但是，排除R1及R2皆為C1-C3烷基，且L1、L2及Z1同時為單鍵者)]；(2)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷，且R3表示基 (3)如(2)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；(4)如(2)或(3)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示2、3、4或5；(5)如(2)或(3)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-，m表示2、3或4；(6)如(2)或(3)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示單 鍵；m表示0；(7)如(2)至(6)中任一項記載之陽離子性脂質，其中L1表示基-CH2CH2O；L2表示基-CH2CH2O；(8)如(2)至6項中任一項之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示基-CH2CH2O、基-CH(CH3)CH2O、或基-CH2CH(CH3)O；(9)如(2)至(8)中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基；(10)如(2)至(8)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基；(11)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基 (12)如(11)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；(13)如(11)或(12)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示3、4或5；(14)如(11)或(12)之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示3或4；(15)如(11)或(12)之陽離子性脂質，其中Z1表示單鍵；m表示0；(16)如(11)至(15)中任一項之陽離子性脂質，其中L1表示基-CH2CH2O；L2表示基-CH2CH2O； (17)如(11)至(16)中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基；(18)如(11)至(16)中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基；(19)如(1)之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基 (20)如(19)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；(21)如(19)或(20)記載之陽離子性脂質，其中R9表示氫原子或甲基；Z1表示基-C(O)O-；m表示3、4或5；(22)如(19)或(20)記載之陽離子性脂質，其中R9表示氫原子或甲基；Z1表示基-C(O)O-；m表示3或4；(23)如(19)或(20)記載之陽離子性脂質，其中R9表示氫原子；Z1表示單鍵；m表示0；(24)如(19)或(20)記載之陽離子性脂質，其中L1表示基-CH2CH2O；L2表示基-CH2CH2O；(25)如(19)至(24)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基。(26)如(19)至(24)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基；(27)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環 丁烷；且R3表示基 (28)如(27)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；(29)如(27)或(28)記載之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵；(30)如(27)至(29)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基；(31)如(27)至(29)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基；(32)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基 (33)如(32)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；(34)如(32)或(33)記載之陽離子性脂質，其中n表示3、4或5；(35)如(32)或(33)記載之陽離子性脂質，其中n表示3或4；(36)如(32)至(35)中任一項記載之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵；(37)如(32)至(36)中任一項記載之陽離子性脂質，其 中R6為羥基；(38)如(32)至(37)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基；(39)如(32)至(37)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基；(40)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示 (41)如(40)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；(42)如(40)或(41)記載之陽離子性脂質，其中n表示3、4或5；(43)如(40)或(41)記載之陽離子性脂質，其中n表示3或4；(44)如(40)至(43)中任一項記載之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵；(45)如範圍第40至44項中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基；(46)如(40)至(44)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基；(47)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1表示C1-C3烷基；且R2及R3與此等所鍵結之氮原子一起形成經R7及 R8取代之環狀胺；(48)如(47)記載之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵；(49)如(47)或(48)記載之陽離子性脂質，其中環狀胺表示吡咯啶或氮雜環丁烷；(50)如(47)或(48)記載之陽離子性脂質，其中環狀胺表示吡咯啶；(51)如(47)至(50)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R7表示基-CH2-O-L1-R4；R8表示基-CH2-O-L2-R5；(52)如(47)至(50)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R7表示基-CH2-O-L1-R4；R8表示基-O-R5；(53)如(51)或(52)記載之陽離子性脂質，其中R7及R8係取代在同一碳上；(54)如(47)至(50)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R7表示氫原子；R8表示基-CH(OR4)CH2-O-R5；(55)如(47)至(54)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基；(56)如(47)至(54)中任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基；(57)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(58)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(59)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(60)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(61)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(62)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(63)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(64)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示； (65)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(66)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(67)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(68)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(69)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(70)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(71)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(72)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(73)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(74)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(75)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(76)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(77)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(78)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(79)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(80)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(81)一種脂質粒子，其含有如(1)至(80)中任一項記載之陽離子性脂質；(82)如(81)記載之脂質粒子，其含有減低脂質粒子形成時之凝集之脂質；(83)如(82)記載之脂質粒子，其中減低脂質粒子形成時之凝集之脂質為PEG-脂質；(84)如(83)記載之脂質粒子，其中PEG-脂質為式 所示之1,2-二月桂醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、式 所示之1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、式 所示之1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、或式 所示之1,2-二硬脂醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇；(85)如(83)記載之脂質粒子，其中PEG-脂質為式 所示之1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇；(86)如(83)至(85)中任一項記載之脂質粒子，其中PEG之分子量為1,000至5,000；(87)如(83)至(85)中任一項記載之脂質粒子，其中PEG之分子量為1,800至2,200；(88)如(81)至(87)中任一項記載之脂質粒子，其含有固醇；(89)如(88)記載之脂質粒子，其中固醇為膽固醇；(90)如(81)至(89)中任一項記載之脂質粒子，其含有兩親媒性脂質；(91)如(90)記載之脂質粒子，其中兩親媒性脂質為選 自二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二肉荳蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、及神經鞘磷脂(SM)中之至少一種；(92)如(90)記載之脂質粒子，其中兩親媒性脂質為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)或二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)；(93)一種核酸脂質粒子，其含有如(81)至(92)中任一項記載之脂質粒子及核酸；(94)如(93)記載之核酸脂質粒子，其中核酸為選自由單股DNA、單股RNA、DNA與RNA所混合成之單股多核苷酸、雙股DNA、雙股RNA、DNA-RNA之雜合多核苷酸、及DNA與RNA所混合成之2種多核苷酸所構成之族群中之任一種；(95)如(93)記載之核酸脂質粒子，其中核酸為具有RNA干擾作用之單股或雙股多核苷酸；(96)如(93)至(95)中任一項記載之核酸脂質粒子，其中平均粒徑為約30nm-約300nm；(97)如(93)至(95)中任一項記載之核酸脂質粒子，其中平均粒徑為約30nm-約100nm；(98)一種醫藥，其含有如(93)至(97)中任一項記載之核酸脂質粒子，做為有效成分；(99)如(98)記載之醫藥，其係用於治療或預防由標的基因表現所引起之疾病；(100)如(99)記載之醫藥，其中由標的基因表現所引 起之疾病為癌；(101)一種標的基因之表現抑制方法，其係藉由將如(93)至(97)中任一項記載之核酸脂質粒子投與至哺乳動物；(102)一種用於治療或預防由標的基因表現所引起之疾病之方法，其係藉由將如(93)至(97)中任一項之核酸脂質粒子投與至哺乳動物；(103)如(102)記載之方法，其中由基因表現所引起之疾病為癌。
藉由本發明可提供形成脂質粒子之新穎陽離子性脂質。
又，藉由本發明，可提供藉由與兩親媒性脂質、膽固醇、PEG-脂質組合而形成脂質粒子之新穎陽離子性脂質。
又，藉由本發明，可提供包含該陽離子性脂質之脂質粒子。
又，藉由本發明可提供於該脂質粒子中進一步包含核酸之核酸脂質粒子。
又，藉由本發明，可提供以該核酸脂質粒子做為有效成分之醫藥組成物。
又，藉由本發明，可提供使用該醫藥組成物之疾病之治療方法。
[實施發明之形態]
以下，詳細說明本發明之實施形式。
1.陽離子性脂質
在本說明書中，所揭示之陽離子性脂質，可以其本身單獨使用，亦可與其他物質組合使用，例如，可使用做為構成脂質粒子之成分，亦可使用做為構成核酸脂質粒子之成分。
1-1.基之定義
在本發明中，所謂「陽離子性脂質」意指在生理pH等所選定之pH下，視該脂質所具有之pKa，一部分之分子帶有實質正電荷之脂質。本發明之陽離子性脂質為可離子化之脂質(ionizable lipid)，與在任何pH下全部分子均帶有實質正電荷之脂質，即具有四級銨之陽離子性脂質(例如，N,N-二油基-N,N-二甲基銨氯化物(DODAC))不同。
在本發明中，「C1-C3烷基」意指甲基、乙基、丙基或異丙基，以甲基為較佳。
在本發明中，「環狀胺」意指氮雜環丁烷、吡咯啶或哌啶，以氮雜環丁烷或吡咯啶為較佳，以吡咯啶為更佳。
本發明之「經R7及R8取代之環狀胺」中，經R7及R8取代之碳原子可為環狀胺上之相同碳原子，亦可為不同碳原子，以相同碳原子或隣接碳原子為較佳；更佳者，在環狀胺為氮雜環丁烷之情況，皆為3位之碳原子，在環狀胺為吡咯啶或哌啶之情況、一者為3位之碳原子，另一者為4位之碳原子，或二者皆為3位之碳原子。
在本發明中，「C9-C24脂肪族飽和或不飽和烴基」意指碳數9至24個之直鏈或分枝鏈烷基，亦可含有1個以上之不飽和部位，可列舉如：十二烯基、十四烯基、十六烯基、十八烯基、油基、二十烯基、十二碳二烯基、十四碳二烯基、十六碳二烯基、十八碳二烯基、亞麻基、二十碳二烯基、十二碳三烯基、十四碳三烯基、十六碳三烯基、十八碳三烯基、次亞麻基、或二十碳三烯基；以含有2個以上不飽和部位之碳數10至20個之烷基為較佳；以油基、亞麻基、或次亞麻基為更佳；以亞麻基為特佳。
在本發明中，「C1-C3烷氧基」意指甲氧基、乙氧基、丙基氧基或異丙基氧基；以甲氧基或乙氧基為較佳。
本發明之陽離子性脂質，可依照常法，形成「藥理上容許之鹽」，就此種鹽而言，較佳者可列舉：如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽之鹼土類金屬鹽；如鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等之金屬鹽；如銨鹽之無機鹽；如三級辛基胺鹽、二苯甲基胺鹽、啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷酯鹽、伸乙基二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙基胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽之有機鹽等胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽之氫鹵酸鹽、如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽 之低級烷磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等之有機酸鹽；以及，如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之胺基酸鹽。
本發明之陽離子性脂質亦可形成水合物或溶媒合物，本發明亦包含此等水合物或溶媒合物。
本發明之陽離子性脂質中，有時存在立體異構物、幾何異構物、阻轉異構物(atropisomer)，除非特別明示，否則本發明亦包含此等異構物及任何異構物之任何比例之混合物。
1-2.陽離子性脂質之具體例
就本發明之陽離子性脂質之具體例而言，可列舉例如以下各項。
(1)一種通式(I)所示之陽離子性脂質 [式中，R1及R2獨立表示C1-C3烷基或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷，且R3表示下列基： 或者，R1表示C1-C3烷基且R2及R3與此等所鍵結之氮原子一起形成經R7及R8取代之環狀胺；R7表示基-CH2-O-L1-R4、基-O-R4；R8表示基-CH2-O-L2-R5、基-O-R5(但是，在R7為基-O-R4之情況，R8不為基-O-R5)；L1及L2獨立表示單鍵、基-CH2CH2O、基-CH(CH3)CH2O、或基-CH2CH(CH3)O(但是，在R1及R2皆表示C1-C3烷基之情況，L1及L2不同時為單鍵)；R4及R5獨立表示C9-C24脂肪族飽和或不飽和烴基；R6表示氫原子、羥基或C1-C3烷氧基；R9表示氫原子或甲基；Z1表示單鍵或、基-C(O)O-或基-S(O)2O-；Z2表示基-C(O)O-；Z1為基-C(O)O-之情況，m表示2、3、4或5，Z1為單鍵之情況，m表示0或1；n表示2、3、4或5]；(2)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基 (3)如(2)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示2、3、4或5；(4)如(2)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示2、3或4；(5)如(2)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示單鍵；m表示0；(6)如選自(2)至(5)之任一項記載之陽離子性脂質，其中L1表示基-CH2CH2O；L2表示基-CH2CH2O；(7)如選自(2)至(5)之任一項記載之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示基-CH2CH2O、基-CH(CH3)CH2O、或基-CH2CH(CH3)O；(8)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基 (9)如(8)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示3、4或5；(10)如(8)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示3或4；(11)如(8)記載之陽離子性脂質，其中Z1表示單鍵；m表示0；(12)如選自(8)至(11)之任一項記載之陽離子性脂質 ，其中L1表示基-CH2CH2O；L2表示基-CH2CH2O；(13)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基 (14)如(13)記載之陽離子性脂質，其中R9表示氫原子或甲基；Z1表示基-C(O)O-；m表示3、4或5；(15)如(13)記載之陽離子性脂質，其中R9表示氫原子或甲基；Z1表示基-C(O)O-；m表示3或4；(16)如(13)記載之陽離子性脂質，其中R9表示氫原子；Z1表示單鍵；m表示0；(17)如選自(13)至(16)之任一項記載之陽離子性脂質，其中L1表示基-CH2CH2O；L2表示基-CH2CH2O；(18)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基 (19)如(18)記載之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵；(20)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基 (21)如(20)記載之陽離子性脂質，其中n表示3、4或5；(22)如(20)記載之陽離子性脂質，其中n表示3或4；(23)如選自(20)至(22)之任一項記載之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵；(24)如選自(20)至(23)之任一項記載之陽離子性脂質，其中R6表示羥基；(25)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基 (26)如(25)記載之陽離子性脂質，其中n表示3、4或5；(27)如(25)記載之陽離子性脂質，其中n表示3或4；(28)如選自(25)至(27)之任一項記載之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵；(29)如(1)記載之陽離子性脂質，其中R1表示C1-C3烷基；且R2及R3與此等所鍵結之氮原子一起形成經R7及R8取代之環狀胺；(30)如(29)記載之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵；(31)如(29)或(30)記載之陽離子性脂質，其中環狀胺 表示吡咯啶或氮雜環丁烷；(32)如(29)或(30)記載之陽離子性脂質，其中環狀胺表示吡咯啶；(33)如選自(29)至(32)之任一項記載之陽離子性脂質，其中R7表示基-CH2-O-L1-R4；R8表示基-CH2-O-L2-R5；(34)如選自(29)至(32)之任一項記載之陽離子性脂質，其中R7表示基-CH2-O-L1-R4；R8表示基-O-R5；(35)如(33)或(34)記載之陽離子性脂質，其中R7及R8係取代在同一碳上；(36)如選自(29)至(32)之任一項記載之陽離子性脂質，其中R7表示氫原子；R8表示基-CH(OR4)CH2-O-R5；(37)如選自(1)至(36)之任一項記載之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基或次亞麻基；(38)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(39)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(40)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示； (41)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(42)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(43)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(44)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(45)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(46)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(47)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(48)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(49)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(50)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(51)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(52)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(53)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(54)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(55)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(56)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(57)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示。
(58)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(59)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(60)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(61)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(62)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(63)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(64)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(65)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(66)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示；(67)如(1)記載之陽離子性脂質，其係以式 表示。
再者，就本發明之陽離子性脂質之具體例而言，可列舉以下表1所記載之化合物1-1至1-69、表2所記載之化合物2-1至2-10、表3所記載之化合物3-1至3-48、表4所記載之化合物4-1至4-14、表5所記載之化合物5-1至5-57、表6-1所記載之化合物6-1至6-57、表6-2所記載之化合物6-58至6-95、表7所記載之化合物7-1至7-32、表8所記載之化合物8-1至8-10、表9所記載之化合物9-1至9-10。表1至表3中之「Lin」表示亞麻基，「Ole」表示油基、「Len」表示次亞麻基，「-」表示單鍵，「Me」表示甲基，「Et」表示乙基，「Pr」表示丙基，「E」表示基-CH2CH2O-，「P1」表示基-CH(CH3)CH2O，「P2」表示基-CH2CH(CH3)O。
1-3.陽離子性脂質之製造方法
本發明之陽離子性脂質可依照業者所熟知之有機合成方法合成，不過亦可依照例如以下之方法或實施例中 記載之方法合成。
以下說明將概要展現在第1圖~第6圖及第25圖中之陽離子性脂質(Ia)~(In)之合成方法。
在下述方法及第1圖~第6圖及第25圖中，R1、R2、R4、R5、L1、L2、n以及m表示與「1-2.陽離子性脂質之具體例」之項相同者；R10表示C1-C3烷基；X1表示碘、溴或氯原子。m1及m2表示0或1。PG1表示烯丙基、三級丁基二苯基矽烷基、雙(三甲基矽烷基氧基)(環己氧基)矽烷基、9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl group)、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基或4,4’-二甲氧基三苯甲基。PG2基表示三級丁氧羰基(Boc)或苯甲氧羰基(Cbz)。
1-3-1.A法
A法之概要如第1圖中所示。
1-3-1-1.A-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之第1圖所示之化合物R4-OH在脫酸劑存在下與甲磺醯氯反應，得到第1圖之式(1)所示之化合物之步驟。
圖中，雖表示使用R4-OH之情況，不過在R5-OH之情況，亦可藉由同様之方法合成。在以下之各步驟亦同。
就所使用之溶劑而言，只要為不阻害反應並可使起始物質以某種程度溶解者即可，無特別限定；不過可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿之鹵化烴類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類；如二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸之亞碸類；如丙酮 、甲基乙基酮之酮類；如吡啶之雜環胺類或如乙腈之腈類，較佳者為二氯甲烷或雜環胺類(尤其是吡啶)。
就所使用之脫酸劑而言，只要為不阻害反應，且不會使生成物及起始物質分解者即可，無特別限定，較佳者可列舉如：三乙基胺、三丁基胺、吡啶、二異丙基乙基胺、N-甲基啉吡啶、4-(N,N-二甲基胺基)吡啶、N,N-二甲基苯胺、N,N-二乙基苯胺、1,5-二氮雜雙環[4,3,0]壬-5-烯、1,4-二氮雜雙環[2,2,2]辛烷(DABCO)、1,8-二氮雜雙環[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)之有機鹼類，較佳者為有機鹼類，尤其是三乙基胺、吡啶、N-甲基啉、DBU。
關於反應溫度及反應時間，雖視所使用之保護化試藥或脫酸劑種類而異；不過在使用甲磺醯氯做為保護化試藥，並使用吡啶兼做溶劑及脫酸劑之情況，為於室溫反應2小時。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜地中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，用水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-1-2.A-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使第1圖之式(1)所示之化合物(以下稱為「化合物(1)」；在以下之各步驟中亦同) 與乙二醇(HO-L1-H)反應，形成化合物(2)之步驟。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類，較佳者為鹵化烴類(尤其是二氯甲烷)、醚類(尤其是二烷)。
關於反應溫度及反應時間，雖視所使用之溶劑種類等而異，不過在使用二烷之情況，可列舉如：回流6小時。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-1-3.A-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(2)於 脫酸劑存在下與甲磺醯氯反應，得到化合物(3)之步驟。本步驟可依照與A-1步驟同様之方法進行。
1-3-2.B法
B法之概要如第1圖所示。
1-3-2-1.B-1步驟
本步驟為使胺(R1(R2)NH)與第1圖之式(4)所示之縮水甘油反應，得到化合物(5)之步驟。
就所使用之胺(R1(R2)NH)而言，可為N,N-二甲基胺、N,N-二乙基胺、N,N-二丙基胺、N-乙基甲胺、N-乙基丙胺、N-甲基丙胺、氮雜環丁烷等。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類；如氫氧化鈉水溶液之稀釋鹼；水；以如氫氧化鈉水溶液之稀釋鹼；水；與醚類(尤其二烷)之混合溶劑為較佳。
關於反應溫度及反應時間，雖視所使用之溶劑種類等而異，不過在使用如氫氧化鈉水溶液之稀釋鹼；水； 與醚類(尤其二烷)之混合溶劑之情況，為120℃，3~6小時。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-2-2.B-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(5)，於氫化鈉存在下，與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物式(Ia)之步驟。
於L1為單鍵之情況，係使用於A-1步驟中所得到之化合物(1)代替化合物(3)進行反應。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類 ，較佳者為如甲苯之芳香族烴類。
關於反應溫度及反應時間，雖隨所使用之溶劑種類等而異，不過在使用甲苯之情況，可列舉例如回流1~30小時。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-3.C法
C法之概要如第2圖所示。
1-3-3-1.C-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(6)於氫化鈉存在下與於A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(7)之步驟。
式(6)所示之化合物為美國專利US7,404,969號之實施例14之(5)所記載之1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-二甲基胺基-2-丙醇。在L2為單鍵之情況，係用A-1步驟中所得到之化合物(1)代替化合物(3)進行反應。本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-3-2.C-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(7)之羥基保護基除去，得到化合物(8)之步驟。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類；如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、三級丁醇、異戊醇、二乙二醇、甘油、辛醇、環己醇、乙二醇單甲醚之醇類，較佳者為醇類(尤其是甲醇、乙醇)或二氯甲烷，以及在使用乙酸做為脫保護化試藥之情況，為乙酸與水之混液。
就所使用之脫保護化試藥而言，只要為通常被使用者即可，無特別限制，不過可列舉如：乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸、鹽酸、對甲苯磺酸及如溴化鋅之路易士酸類；以乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸為較佳。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為-10至100℃，而以0至50℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至50小時，而以1分鐘至24小時為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不 溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-3-3.C-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(8)於氫化鈉存在下，與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(Ib)之步驟。本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-4.D法
D法之概要如第2圖所示。
1-3-4-1.D-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(9)於脫酸劑存在下與甲磺醯氯反應，得到化合物(10)之步驟。
化合物(9)為2-(四氫-2H-吡喃-2-基氧基)乙醇。本步驟可依照與A-1步驟同様之方法進行。
1-3-4-2.D-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(6)於氫化鈉存在下與在D-1步驟中所得到之化合物(10)反應，得到化合物(11)之步驟。
化合物(6)為美國專利US7,404,969號之實施例14之(5)所記載之1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-二甲基胺基-2-丙醇。本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行 。
1-3-4-3.D-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(11)之羥基保護基除去，得到化合物(12)之步驟。本步驟可依照與C-2步驟同様之方法進行。
1-3-4-4.D-4步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(12)於氫化鈉存在下與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(Ic)之步驟。
L1為單鍵之情況，係使在A-1步驟中所得到之化合物(1)代替化合物(3)進行反應。本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-5.E法
E法之概要如第3圖所示。
1-3-5-1.E-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(13)之羥基藉由PG1基保護，得到化合物(14)之步驟。
化合物(13)為2-(2,2-二甲基-1,3-二氧雜環戊-4-基)乙-1-醇、3-(2,2-二甲基-1,3-二氧雜環戊-4-基)丙-1-醇、或4-(2,2-二甲基-1,3-二氧雜環戊-4-基)丁-1-醇等。
就PG1基而言，使用三級丁基二苯基矽烷基、雙(三甲基矽烷氧基)(環己氧基)矽烷基之情況，所使用之保護化試藥為氯化三級丁基二苯基矽烷基、氯化雙(三甲基矽烷氧基)(環己氧基)矽烷基。
就PG1基而言，在使用烯丙基之情況，所使用之保護 化試藥為烯丙基鹵化物，例如，烯丙基碘化物、烯丙基溴化物、烯丙基氯化物，在氫化鈉存在下，與烯丙基鹵化物反應。
就PG1基而言，在使用9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl group)、三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基之情況，所使用之保護化試藥為9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl)氯化物、三苯甲基氯化物、4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物及4-甲氧基三苯甲基氯化物。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應，並可將起始物質以某種程度溶解者即可，無特別限定，不過可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿之鹵化烴類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類；如二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸之亞碸類；如丙酮、甲基乙基酮之酮類；如吡啶之雜環胺類或如乙腈之腈類，較佳者可列舉：如醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類。
就所使用之鹼而言，較佳者為有機鹼類(尤其三乙基胺、吡啶、N-甲基啉、DBU及咪唑等)。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為-10至100℃，而以0至50℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至50小時，而以1分鐘至24小時為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不 溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-5-2.E-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(14)之二醇之保護基選擇性地除去，得到化合物(15)之步驟。本步驟可依照與C-2步驟同様之方法進行。
1-3-5-3.E-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(15)，於氫化鈉存在下與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(16)之步驟。
本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-5-4.E-4步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(16)之PG1基脫保護，得到化合物(17)之步驟。
就PG1基而言，使用三級丁基二苯基矽烷基、雙(三甲基矽烷氧基)(環己氧基)矽烷基之情況，就所使用之脫保護試藥而言，通常為如氟化四丁基銨之可生成氟化物離子之化合物。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，不過以如四氫呋喃、二烷之醚類為較佳。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而 異，不過通常為-10℃至100℃，而以0℃至50℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至50小時，而以1分鐘至24小時為較佳。
就PG1基而言，在使用烯丙基之情況，所使用之脫保護試藥為鈀及三苯基膦、或雙(甲基二苯基膦)(1,5-環辛二烯)銥(I)．六氟磷酸鹽等。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，不過可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類，如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、三級丁醇、異戊醇、二乙二醇、甘油、辛醇、環己醇、甲基溶纖劑之醇類，較佳者為如甲醇、乙醇之醇類。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為-10℃至100℃，而以0℃至80℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至24小時，而以1分鐘至6小時為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物 中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
就PG1基而言，在使用9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl group)、三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基之情況，可依照與C-2步驟同様之方法進行。
1-3-5-5.E-5步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(17)在脫酸劑存在下與甲磺醯氯反應，得到化合物(18)之步驟。
本步驟可依照與A-1步驟同様之方法進行。
1-3-5-6.E-6步驟
本步驟為使胺(R1(R2)NH)與具有甲磺醯基之化合物(18)反應，得到化合物(Id)之步驟。
就所使用之胺(R1(R2)NH)而言，為N,N-二甲基胺、N,N-二乙基胺、N,N-二丙基胺、N-乙基甲胺、N-乙基丙胺、N-甲基丙胺、氮雜環丁烷等。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，不過可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基 乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類，較佳者為如四氫呋喃之醚類。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為-10℃至100℃，而以0℃至50℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至14日，而以24小時至10日為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-6.F法
F法之概要如第3圖所示。
1-3-6-1.F-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(19-1)之羥基藉由PG1基保護，得到化合物(19-2)之步驟。
PG1基為烯丙基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基等。
化合物(19-1)為2-(羥基甲基)-丙-1,3-二醇、三羥甲 基乙烷、三羥甲基丙烷、三羥甲基丁烷(J.Med.Pharm.Chem,1961,3,53-64)、2-羥基甲基-2-丙基丙-1,3-二醇(J.Am.Chem.Soc.,1949,71,180)等。
本步驟可依照與E-1步驟同様之方法進行。
1-3-6-2.F-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(19-2)於氫化鈉存在下與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(20)之步驟。
化合物(19-2)，在PG1為烯丙基，m1為1且m2為0之情況，為3-(烯丙基氧基)丙-1,2-二醇。又，在PG1為烯丙基，m1為0，m2為1之情況，為2-(烯丙基氧基)丙-1,3-二醇(J.Chem.Soc.1949,247)。在PG1為4,4’-二甲氧基三苯甲基，m1為1且m2為1之情況，為2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)丙-1,3-二醇(WO2009/129385之Example 26A)。本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-6-3.F-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(20)之PG1脫保護，得到化合物(21)之步驟。
在PG1為烯丙基之情況，就所使用之脫保護試藥而言，為鈀及三苯基膦、或雙(甲基二苯基膦)(1,5-環辛二烯)銥(I)．六氟磷酸鹽等。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，不過可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙 酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類，如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、三級丁醇、異戊醇、二乙二醇、甘油、辛醇、環己醇、甲基溶纖劑之醇類，較佳者為如甲醇、乙醇之醇類。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為-10℃至100℃，而以0℃至80℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至24小時，而以1分鐘至6小時為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
又，PG1為9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl group)、三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基之情況，可依照與D-3步驟同様之方法進行。
1-3-6-4.F-4步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(21)之羥基與化 合物(22-1)之羧酸反應，得到具有酯鍵結之化合物(Ie)之步驟。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類，較佳者為鹵化烴類(尤其二氯甲烷)、醯胺類(尤其是二甲基甲醯胺)。
就所使用之化合物(22-1)而言，可列舉3-(二甲基胺基)丙酸、3-(二乙基胺基)丙酸、3-(二丙基胺基)丙酸、3-(乙基甲基胺基)丙酸、3-(乙基丙基胺基)丙酸、3-(甲基丙基胺基)丙酸、3-氮雜環丁其丙酸、4-(二甲基胺基)丁酸、4-(二乙基胺基)丁酸、4-(二丙基胺基)丁酸、4-(乙基甲基胺基)丁酸、4-(乙基丙基胺基)丁酸、4-(甲基丙基胺基)丁酸、4-氮雜環丁基丁酸、5-(二甲基胺基)纈草酸、5-(二乙基胺基)纈草酸、5-(二丙基胺基)纈草酸、5-(乙基甲基胺基)纈草酸、5-(乙基丙基胺基)纈草酸、5-(甲基丙基胺基)纈草酸、5-氮雜環丁基纈草酸、或此等之鹽類(鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽等)等。
就所使用之酯形成試藥而言，可列舉如：N-羥基琥 珀醯亞胺、1-羥基苯并三唑、N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺之N-羥基化合物類；如1,1’-草醯基二咪唑、N,N’-羰基二咪唑之二咪唑化合物類；如2,2’-二吡啶基二硫化物之二硫化物化合物類；如N,N’-二琥珀醯亞胺基之碳酸酯之琥珀酸化合物類；如N,N’-雙(2-側氧基-3-唑啶基)次磷醯氯之次磷醯氯化合物類；如草酸N,N’-二琥珀醯亞胺基酯(DSO)、草酸N,N-二酞醯亞胺基酯(DPO)、草酸N,N’-雙(降冰片烯基琥珀醯亞胺基)酯(BNO)、草酸1,1’-雙(苯并三唑基)酯(BBTO)、草酸1,1’-雙(6-氯苯并三唑基)酯(BCTO)、草酸1,1’-雙(6-三氟甲基苯并三唑基)酯(BTBO)之草酸酯化合物類；二環己基碳化二亞胺(DCC)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(EDC)等碳化二亞胺類，較佳者為二咪唑化合物類、碳化二亞胺類(尤其是EDC)。
就反應補助試藥而言，亦可添加1-羥基苯并三唑(HOBT)。
反應溫度及反應時間隨所使用之酯形成試藥及溶劑之種類而異，為0℃至100℃下進行5分鐘至50小時，尤其在二氯甲烷中使用EDC之情況，以於室溫進行1小時至50小時為特佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反.應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到 。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-6-5.F-5步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(21)之羥基與化合物(22-2)之羧酸反應，得到具有酯鍵結之化合物(22-3)之步驟。
就所使用之化合物(22-2)而言，可列舉3-碘丙酸、3-溴丙酸、3-氯丙酸、4-碘丁酸、4-溴丁酸、4-氯丁酸、5-碘纈草酸、5-溴纈草酸、5-氯纈草酸或此等之鹽類(鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽等)等。
本步驟可依照與F-4步驟同様之方法進行。
1-3-6-6.F-6步驟
本步驟為使胺(R1(R2)NH)與具有鹵素之化合物(22-3)反應，得到化合物(Ie)之步驟。
本步驟可依照與E-6步驟同様之方法進行。
1-3-7.G法
G法之概要如第4圖所示。
1-3-7-1.G-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(23)，於氫化鈉存在下與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(24)之步驟。
化合物(23)為1-去氧-5-單甲氧基三苯甲基-D-核糖(特開2000-302675之實施例18之(18a)所記載之化合物)等。本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-7-2.G-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(24)之羥基保護基除去，得到化合物(25)之步驟。本步驟可依照與C-2步驟同様之方法進行。
1-3-7-3.G-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(25)於脫酸劑存在下與甲磺醯氯反應，得到化合物(26)之步驟。
本步驟可依照與A-1步驟同様之方法進行。
1-3-7-4.G-4步驟
本步驟為使胺(R1(R2)NH)與具有甲磺醯基之化合物(26)反應，得到化合物(If)之步驟。本步驟可依照與E-6步驟同様之方法進行。
1-3-8.H法
H法之概要如第4圖所示。
1-3-8-1.H-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(27)於氫化鈉存在下與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(28)之步驟。
化合物(27)為(4R,5S)-2,2-二甲基-1,3-二氧雜環戊-4,5-二基]二甲醇、(-)-2,3-O-亞異丙基-D-蘇糖醇、(+)-2,3-O-亞異丙基-L-蘇糖醇、或此等之混合物等。本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-8-2.H-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(28)之二醇保護基選擇性地除去，得到化合物(29)之步驟。本步驟可依 照與C-2步驟同様之方法進行。
1-3-8-3.H-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(29)於氫化鈉存在下與C1-C3烷基鹵化物反應，得到化合物(30)之步驟。
就C1-C3烷基鹵化物而言，有碘甲烷、碘乙烷、碘丙烷、溴甲烷、溴乙烷、溴丙烷、氯甲烷、氯乙烷、氯丙烷等。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類；較佳者為如甲苯之芳香族烴類；如四氫呋喃之醚類。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為-10℃至100℃，以0℃至80℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至24小時，以1分鐘至6小時為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不 溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-8-4.H-4步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(30)之羥基與化合物(31)之羧酸反應，得到具有酯鍵之化合物(Ig)之步驟。
本步驟可依照與F-4步驟同様之方法進行。
1-3-8-5.H-5步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(29)之羥基與化合物(31)之羧酸反應，得到具有酯鍵之化合物(Ih)之步驟。
本步驟可依照與F-4步驟同様之方法進行。
1-3-9.I法
I法之概要如第5圖所示。
1-3-9-1.I-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將1,2,4-丁三醇之2個一級羥基用三級丁基二甲基矽烷基保護，得到化合物(32)之步驟。本步驟係使用氯化三級丁基二甲基矽烷基，可以與E-1步驟同様之方法進行。
1-3-9-2.I-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(32)於氫化鈉存在下與烯丙基鹵化物反應，得到化合物(33-1) 及(33-2)之混合物之步驟。
就烯丙基鹵化物而言，為烯丙基碘化物、烯丙基溴化物、烯丙基氯化物。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類，較佳者為如甲苯之芳香族烴類；如四氫呋喃之醚類。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為-10℃至100℃，而以0℃至80℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至24小時，而以1分鐘至6小時為較佳。
反反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-9-3.I-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(33-1)與(33-2)之混合物之三級丁基二甲基矽烷基脫保護，分別得到化合物(34-1)及化合物(34-2)之步驟。本步驟可依照與E-4步驟同様之方法進行。
1-3-9-4.I-4步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(34-1)於氫化鈉存在下與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(35-1)之步驟。本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-9-5.I-5步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(35-1)之烯丙基脫保護，得到化合物(36-1)之步驟。本步驟可依照與F-3步驟同様之方法進行。
1-3-9-6.I-6步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(36-1)之羥基與化合物(31)之羧酸反應，得到具有酯鍵之化合物(Ii-1)之步驟。本步驟可依照與F-3步驟同様之方法進行。
1-3-9-7.I-7步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(36-1)之羥基於脫酸劑存在下與甲磺醯氯反應，得到化合物(36-1a)之步驟。本步驟可依照與A-1步驟同様之方法進行。
1-3-9-8.I-8步驟
本步驟為使胺(R1(R2)NH)與具有甲磺醯基之化合物(36-1a)反應，得到化合物(Ii-1a)之步驟。本步驟可依照 與E-6步驟同様之方法進行。
1-3-9-9.I-9步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(34-2)於氫化鈉存在下與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(35-2)之步驟。本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-9-10.I-10步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(35-2)之烯丙基脫保護，得到化合物(36-2)之步驟。本步驟可依照與F-3步驟同様之方法進行。
1-3-9-11.I-11步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(36-2)之羥基與化合物(31)之羧酸反應，得到具有酯鍵之化合物(Ii-2)之步驟。本步驟可依照與F-4步驟同様之方法進行。
1-3-9-12.I-12步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(36-2)之羥基於脫酸劑存在下與甲磺醯氯反應，得到化合物(36-2a)之步驟。本步驟可依照與A-1步驟同様之方法進行。
1-3-9-13.I-13步驟
本步驟為使胺(R1(R2)NH)與具有甲磺醯基之化合物(36-2a)反應，得到化合物(Ii-2a)之步驟。本步驟可依照與E-6步驟同様之方法進行。
1-3-10.J法
J法之概要如第6圖所示。
1-3-10-1.J-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有環狀胺構造(其中氮原子經苯甲基(Bn)保護)且環狀胺上具有2個羧酸酯之化合物(37)與還原劑反應，得到具有2個羥基之化合物(38)之步驟。
就化合物(37)而言，可列舉1-(苯基甲基)-3,3-氮雜環丁烷二羧酸二乙酯(Journal of Medicinal Chemistry,2008,51,948-956)、N-苯甲基吡咯啶-3,3-二羧酸二乙酯(Chemical & Pharmaceutical Bulletin,1987,35,3845-3849)、1-苯甲基吡咯啶-3,4-二羧酸二甲酯(Chemical & Pharmaceutical Bulletin,1985,33,2762-2766)、1-苯甲基-哌啶-3,3-二羧酸二乙酯、1-苯甲基哌啶-4,4-二羧酸二乙酯(WO2008/152149)等。
所使用之還原劑，可列舉：如氫化鋁鋰、氫化三乙氧基鋁鋰(lithium triethoxyaluminium hydride)之氫化鋁化合物等氫化試藥，以氫化鋁鋰為較佳。
所使用之溶劑，只要不會阻害反應，並能將起始物質溶解者即可，無特別限定，以如甲醇、乙醇之醇類、如醚、四氫呋喃之醚類或上述之混合溶劑為較佳。
反應溫度為0℃至使用溶劑之沸点，以50℃至使用溶劑之沸点為較佳。反應時間為10分鐘至24小時，以1小時至5小時為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機 層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-10-2.J-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(38)之苯甲基(Bn)基脫保護，得到化合物(39)之步驟。
所使用之觸媒，通常只要可使用於接觸還原反應者即可，無特別限定，可列舉如鈀碳、鈀黒、氫氧化鈀碳、蘭尼鎳、氧化鉑、鉑黒、銠-氧化鋁、三苯基膦-氯化銠、鈀-硫酸鋇等，以鈀碳或氫氧化鈀碳為較佳。
將觸媒做為還原劑之情況，所使用之溶劑，只要不阻害反應並能將起始物質溶解者即可，無特別限定，較佳者可列舉：如甲醇、乙醇之醇類、如四氫呋喃、二烷之醚類、如乙酸之脂肪酸、如乙酸乙酯之酯類，更佳者為甲醇。
反應溫度為0℃至使用溶劑之沸点，以50℃至使用溶劑之沸点為較佳。反應時間為10分鐘至24小時，以1小時至5小時為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-10-3.J-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(39)之胺基藉由PG2基保護，得到化合物(40)之步驟。
所使用之保護化試藥為2-(三級丁氧羰基氧基亞胺基)-2-苯基乙腈、三級丁氧羰基-1,2,4-三唑、二碳酸二-三級丁酯、2-(三級丁氧羰基硫基)-4,6-二甲基嘧啶、N-苯甲氧羰氧基琥珀醯亞胺、碳酸苯甲酯4-硝基苯酯、二碳酸二苯甲酯、氯甲酸苯甲酯等。
使就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類；較佳者為如二氯甲烷之鹵化烴類；如四氫呋喃之醚類。
視需要亦可使用脫酸劑。就所使用之脫酸劑而言，只要不會阻害反應，且不會使生成物及起始物質分解者即可，無特別限定，較佳者可列舉：如三乙基胺、三丁基胺、吡啶、二異丙基乙胺、N-甲基啉吡啶、4-(N,N-二甲基胺基)吡啶、N,N-二甲基苯胺、N,N-二乙基苯胺、 1,5-二氮雜雙環[4,3,0]壬-5-烯、1,4-二氮雜雙環[2,2,2]辛烷(DABCO)、1,8-二氮雜雙環[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)之有機鹼類，其中以有機鹼類，尤其是三乙基胺、吡啶、N-甲基啉、DBU為特佳。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為-10℃至100℃，而以0℃至80℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至24小時，而以1分鐘至6小時為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-10-4.J-4步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(40)於氫化鈉存在下與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(41)之步驟。
本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-10-5.J-5步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(41)與氫化鋁鋰反應，得到化合物(Ij)之步驟。
本步驟可依照與J-1步驟同様之方法進行。
1-3-11.K法
K法之概要如第6圖所示。
1-3-11-1.K-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有環狀胺構造(其中氮原子經PG2基保護)且於環狀胺之1個碳原子上具有乙烯基(-CH2-CH=CH2)之化合物(42)與氧化劑反應，得到具有二醇基之化合物(43)之步驟。
就環狀胺而言，可列舉氮雜環丁烷、吡咯啶、或哌等。
就化合物(42)而言，可列舉3-亞甲基氮雜環丁烷-1-羧酸三級丁酯(US2004/176348)、3-乙烯基-吡咯啶-1-羧酸三級丁酯(Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2009,19,p.4359-4363)、3-乙烯基哌啶-1-羧酸三級丁酯(Journal of Heterocyclic Chemistry,1992,29,p.1663-1665)、4-乙烯基哌啶-1-羧酸三級丁酯(US5861414)等。
就所使用之氧化劑而言，為如過錳酸鉀之氧化錳類；如四氧化鋨、鋨酸鉀．二水合物(K2OSO4．2H2O)之鋨化合物等。又，亦可使用將四氧化鋨固定在如聚(4-乙烯基吡啶)之聚合物上者。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類 ；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類；乙腈；水等，較佳者為乙腈、丙酮、水之混合溶劑。
反應溫度雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為-10至100℃，而以0℃至80℃為較佳。反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至24小時，而以1分鐘至6小時為較佳。
反應終了後，目的化合物可依照常法從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適宜中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
1-3-11-2.K-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(43)於氫化鈉存在下與在A-3步驟中所得到之化合物(3)反應，得到化合物(44)之步驟。
本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-11-3.K-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(44)與氫化鋁鋰反應，得到化合物(Ik)之步驟。本步驟可依照與J-1步驟同様之方法進行。
1-3-12.L法
L法之概要如第6圖所示。
1-3-12-1.L-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有環狀胺構造(其中氮原子經PG2基保護)，且在環狀胺之1個碳原子上具有環外亞甲基(-CH2=CH2)基之化合物(45)與氧化劑反應，得到具有二醇基之化合物(46)之步驟。
就環狀胺而言，可列舉氮雜環丁烷、吡咯啶、或哌等。
就化合物(45)而言，可列舉3-亞甲基氮雜環丁烷-1-羧酸三級丁基(WO2007/44515)、3-亞甲基吡咯啶-1-羧酸三級丁基(US2007/208001)、3-亞甲基哌啶-1-羧酸三級丁基(WO2006/85212)、4-亞甲基哌啶-1-羧酸三級丁基(US2010/222324)等。
本步驟可依照與K-1步驟同様之方法進行。
1-3-12-2.L-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(46)，於氫化鈉存在下，與A-3步驟中得到之化合物(3)反應，得到化合物(47)之步驟。
本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-12-3.L-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(47)與氫化鋁鋰反應，得到化合物(Il)之步驟。本步驟可依照與J-1步驟同様之方法進行。
1-3-13.T法
T法之概要如第25圖所示。
1-3-13-1.T-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(48)之一級羥基藉由PG1基保護，得到化合物(49)之步驟。
PG1基為9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl group)、三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基等。
化合物(48)為1,2-丙二醇、(R)-(-)-1,2-丙二醇、(S)-(+)-1,2-丙二醇。
本步驟可以與E-1步驟同様之方法進行。
1-3-13-2.T-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(49)，於氫化鈉存在下，與A-1步驟中得到之化合物(1)反應，得到化合物(50)之步驟。
本步驟可依照與A-2步驟同様之方法進行。
1-3-13-3.T-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(50)之PG1基脫保護，得到化合物(51)之步驟。
本步驟可依照與D-3步驟同様之方法進行。
1-3-13-4.T-4步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(51)，於脫酸劑存在下，與甲磺醯氯反應，得到化合物(52)之步驟。
本步驟可依照與A-1步驟同様之方法進行。
1-3-13-5.T-5步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(53)，於氫化鈉存在下，與化合物(52)反應，得到化合物(Im) 之步驟。
化合物(53)為國際公開第2011/000106號小冊子之137及138頁記載之化合物3。
本步驟可依照與B-2步驟同様之方法進行。
1-3-14.U法
U法之概要如第25圖所示。
1-3-14-1.U-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將T-1步驟中得到之化合物(49)之二級羥基藉由烯丙基保護，得到化合物(54)之步驟。
本步驟可依照與E-1步驟同様之方法進行。
1-3-14-2.U-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(54)之PG1基脫保護，得到化合物(55)之步驟。
本步驟可依照與D-3步驟同様之方法進行。
1-3-14-3.U-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(55)，於氫化鈉存在下，與A-1步驟中得到之化合物(1)反應，得到化合物(56)之步驟。
本步驟可依照與A-2步驟同様之方法進行。
1-3-14-4.U-4步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將化合物(56)之烯丙基脫保護，得到化合物(57)之步驟。
本步驟可依照與E-4步驟同様之方法進行。
1-3-14-5.U-5步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(57)，於脫酸劑存在下，與甲磺醯氯反應，得到化合物(58)之步驟。
本步驟可依照與A-1步驟同様之方法進行。
1-3-14-6.U-6步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使具有羥基之化合物(53)，於氫化鈉存在下，與化合物(58)反應，得到化合物(In)之步驟。
本步驟可依照與T-5步驟同様之方法進行。
2.脂質粒子
本說明書中之脂質粒子包含具有選自脂質體、脂質凝集而成之脂質凝集體、及膠團(micelle)之任一種構造之組成物，不過只要為含有脂質之組成物，脂質粒子之構造並不限於此等。脂質體為具有二層脂質構造，且將水相保持於內部。脂質體有脂質之二分子膜重疊成多層狀而成之多層脂質體、及膜為1片之單層脂質體，本發明之脂質體包含此兩種脂質體。
本發明之「脂質粒子」中，包含選自以下(a)至(c)之任一種組成物。
(a)包含陽離子性脂質、及減低脂質粒子形成時凝集之脂質之組成物、(b)包含陽離子性脂質、減低脂質粒子形成時凝集之脂質、及固醇類之組成物、(c)包含陽離子性脂質、減低脂質粒子形成時凝集之脂質、固醇類、及兩親媒性脂質之組成物。
其中，陽離子性脂質為於上述「1.陽離子性脂質」項中所記載之各種陽離子性脂質之1或2種以上。就具體例而言，可列舉在表1至表9中所記載之1或2種以上之化合物。
就兩親媒性脂質而言，可列舉在下述之「2-1.兩親媒性脂質」項中所記載之1或2種以上。
就固醇類而言，可列舉在下述之「2-2.固醇類」項中所記載之1或2種以上。
就減低脂質粒子形成時之凝集之脂質而言，可列舉在下述之「2-3.減低脂質粒子形成時之凝集之脂質」項中所記載之1或2種以上。
2-1.兩親媒性脂質
本說明書中，「兩親媒性脂質」意指對於極性、非極性溶劑均具有親和性之脂質。
就兩親媒性脂質之例而言，可列舉在「Liposomes ：from physics to applications」之Chapter 1.Chemistry of lipids and liposomes(出版社：Elsevier，出版年：1993年，著者：D.D.Lasic)等中所記載之脂質。例如，包含磷脂質、糖脂質、胺基脂質、鞘脂質、二醇類、飽和或不飽和之脂肪酸，不過不以此等為限。將具體例記載於2-1-1至2-1-3。
2-1-1.磷脂質
磷脂質可大致分為甘油磷脂質及鞘磷脂質。就甘油磷脂質之代表例而言，可列舉磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯甘油(PG)、磷脂醯 乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)。另一方面，就鞘磷脂質之代表例而言，可列舉神經鞘磷脂(SM)。例如，可列舉在以下(a)至(g)中所記載之脂質。
(a)磷脂醯膽鹼類
就磷脂醯膽鹼類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉荳蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二癸醯基磷脂醯膽鹼(DDPC)、二辛醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二己醯基磷脂醯膽鹼(DHPC)、二丁醯基磷脂醯膽鹼(DBPC)、二反油醯基磷脂醯膽鹼、二亞麻醯基磷脂醯膽鹼、二花生四烯醯基磷脂醯膽鹼、二(二十烯醯基)磷脂醯膽鹼(DEPC)、二庚醯基磷脂醯膽鹼、二己醯基磷脂醯膽鹼、二(十七醯基)磷脂醯膽鹼、二山萮醯基磷脂醯膽鹼、桐油醯基磷脂醯膽鹼、氫化卵磷脂醯膽鹼(HEPC)、氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)、1-棕櫚醯基-2-花生四烯醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、1-棕櫚醯基-2-亞麻醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-肉荳蔻醯基磷脂醯膽鹼、1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼、1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、1,2-二肉荳蔻醯基醯胺-1,2-去氧磷脂醯膽鹼、1-肉荳蔻醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、1-肉荳蔻醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二-O-十六基磷脂醯膽鹼、反式二反油醯基磷脂醯膽鹼、二反式棕櫚油醯基-磷脂醯膽鹼、正十八基-2-甲基磷脂醯膽鹼、正十八基磷脂醯膽鹼、1-月桂基丙二醇-3-磷醯膽鹼、赤型-N-二十 四醯基鞘磷脂醯膽鹼及棕櫚醯基-(9-順式-十八烯醯基)-3-sn-磷脂醯膽鹼等，較佳者可列舉DSPC、DPPC及DMPC。
(b)磷脂醯絲胺酸類
就磷脂醯絲胺酸類之具體例而言，可列舉二硬脂醯基磷脂醯絲胺酸(DSPS)、二肉荳蔻醯基磷脂醯絲胺酸(DMPS)、二月桂醯基磷脂醯絲胺酸(DLPS)、二棕櫚醯基磷脂醯絲胺酸(DPPS)、二油醯基磷脂醯絲胺酸(DOPS)、溶血磷脂醯絲胺酸、桐油醯基磷脂醯絲胺酸、1,2-二-(9-順式-十八烯醯基)-3-sn-磷脂醯絲胺酸等。
(c)磷脂醯肌醇類
就磷脂醯肌醇類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯肌醇(DPPI)、二硬脂醯基磷脂醯肌醇(DSPI)、二月桂醯基磷脂醯肌醇(DLPI)等。
(d)磷脂醯甘油類
就磷脂醯甘油類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二月桂醯基磷脂醯甘油(DLPG)、二肉荳蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)、溶血磷脂醯甘油、氫化大豆磷脂醯甘油(HSPG)、氫化卵磷脂醯甘油(HEPG)、心磷脂(二磷脂醯甘油)等。
(e)磷脂醯乙醇胺類
就磷脂醯乙醇胺類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二月桂醯基磷 脂醯乙醇胺(DLPE)、二肉荳蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二癸醯基磷脂醯乙醇胺(DDPE)、N-戊二醯基磷脂醯乙醇胺(NGPE)、溶血磷脂醯乙醇胺、N-(7-硝基-2,1,3-苯并二唑-4-基)-1,2-二油醯基-sn-磷脂醯乙醇胺、桐油醯基磷脂醯乙醇胺、N-琥珀醯基二油醯基磷脂醯乙醇胺、1-十六基-2-棕櫚醯基甘油磷脂醯乙醇胺等；較佳者，可列舉DOPE。
(f)磷脂酸類
就磷脂酸類之具體例而言，可列舉二棕櫚醯基磷脂酸(DPPA)、二硬脂醯基磷脂酸(DSPA)、二肉荳蔻醯基磷脂酸(DMPA)、二油基磷脂酸(DOPA)等。
(g)鞘磷脂質
就鞘磷脂質之具體例而言，可列舉神經鞘磷脂(SM)、二棕櫚醯基神經鞘磷脂、二硬脂醯基神經鞘磷脂、神經醯胺胺乙基膦酸酯(ceramide ciliatin)、神經醯胺磷醯基乙醇胺、神經醯胺磷醯基甘油等；較佳者，可列舉SM。
2-1-2.糖脂質
糖脂質可大致分為甘油糖脂質及鞘糖脂質。例如，可列舉在以下(a)或(b)中所記載之脂質。
(a)甘油糖脂質
就甘油糖脂質之具體例而言，可列舉二糖基二甘油酯、糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、亞碸基核糖基二甘油酯、(1,3)-D-甘露糖基(1,3)二甘油酯、二半乳糖基甘油酯、二半乳糖基二月桂醯基 甘油酯、二半乳糖基二肉荳蔻醯基甘油酯、二半乳糖基二棕櫚醯基甘油酯、二半乳糖基二硬脂醯基甘油酯、半乳糖基甘油酯、半乳糖基二月桂醯基甘油酯、半乳糖基二肉荳蔻醯基甘油酯、半乳糖基二棕櫚醯基甘油酯、半乳糖基二硬脂醯基甘油酯、二半乳糖基二醯基甘油等。
(b)鞘糖脂質
就鞘糖脂質之具體例而言，可列舉神經醯胺(腦苷脂)、半乳糖基神經醯胺、乳糖基神經醯胺、二半乳糖基神經醯胺、神經節苷脂GM1、神經節苷脂GM2、神經節苷脂GM3、硫脂、神經醯胺寡己糖苷及紅血球糖苷等。
2-1-3.飽和或不飽和脂肪酸
就飽和脂肪酸及不飽和脂肪酸之具體例而言，可使用辛酸、壬酸、癸酸、十一烯酸、月桂酸、十三烯酸、肉荳蔻酸、十五烯酸、棕櫚酸、十七酸、硬脂酸、十九烯酸、花生酸、十二烯酸、十四烯酸、油酸(oleic acid)、亞麻油酸(linoleic acid)、次亞麻油酸(linolenic acid)、二十烯酸、芥酸及二十二碳五烯酸等碳數5~30之飽和或不飽和脂肪酸。
2-2.固醇類
就固醇類之具體例而言，可列舉膽固醇、膽固醇琥珀酸、二氫膽固醇、羊毛固醇、二氫羊毛固醇、鏈固醇、豆固醇、榖固醇、菜油固醇、菜籽固醇、酵母固醇(zymosterol)、麥角固醇、菜油固醇、岩藻固醇、22-酮基固醇、20-羥基固醇、7-羥基膽固醇、19-羥基膽固醇、22-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、7-脫氫膽固醇、5α-膽 固-7-烯-3β-醇、表膽固醇、脫氫麥角固醇、硫酸膽固醇、半琥珀酸膽固醇、酞酸膽固醇、磷酸膽固醇、纈草酸膽固醇、膽固醇之半琥珀酸酯、3βN-(N’,N’-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基膽固醇、乙酸膽固醇酯、油酸膽固醇酯、亞麻油酸膽固醇酯、肉荳蔻酸膽固醇酯、棕櫚酸膽固醇酯、花生酸膽固醇酯、糞固醇、膽固醇酯、膽固醇基磷醯基膽鹼、及3,6,9-三氧雜辛烷-1-醇-膽固醇基-3e-醇；較佳者，可列舉膽固醇及半琥珀酸膽固醇酯；更佳者，可列舉膽固醇。
2-3.減低脂質粒子形成時之凝集之脂質
就減低脂質粒子形成時之凝集之脂質而言，可使用與非離子性水溶性高分子鍵結之脂質。
非離子性水溶性高分子意指在水或緩衝液等水性媒體中除末端外不具有解離基之高分子、或該高分子之末端為烷氧基之高分子。就此種非離子性水溶性高分子之實例而言，可列舉：(1)以乙烯基醇、甲基乙烯基醚、乙烯基吡咯啶酮、乙烯基唑啶酮、乙烯基甲基唑啶酮、2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶、N-乙烯基琥珀醯亞胺、N-乙烯基甲醯胺、N-乙烯基-N-甲基甲醯胺、N-乙烯基乙醯胺、N-乙烯基-N-甲基乙醯胺、甲基丙烯酸2-羥基乙酯、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、N,N-二甲基丙烯醯胺、N-異丙基丙烯醯胺、二丙酮丙烯醯胺、羥甲基丙烯醯胺、丙烯醯基啉、丙烯醯基吡咯啶、丙烯醯基哌啶、苯乙烯、氯甲基苯乙烯、溴甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、氰基丙烯酸甲酯、氰基丙 烯酸乙酯、氰基丙烯酸正丙酯、氰基丙烯酸異丙酯、氰基丙烯酸正丁酯、氰基丙烯酸異丁酯、氰基丙烯酸三級丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、乙基乙烯基醚、正丙基乙烯基醚、異丙基乙烯基醚、正丁基乙烯基醚、異丁基乙烯基醚、三級丁基乙烯基醚等單體單元做為構成成分之非離子性乙烯系高分子或該高分子之末端經烷氧基化之高分子；(2)以選自如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸之胺基酸之任一單體單元做為構成成分之非離子性聚胺基酸或該高分子之末端經烷氧基化之高分子；(3)以選自如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸之胺基酸之2種以上單體單元做為構成成分之非離子性合成多肽或該高分子之末端經烷氧基化之高分子；(4)以選自乙醇酸及乳酸之單體單元做為構成成分之非離子性聚酯或該高分子之末端經烷氧基化之高分子；(5)以選自如甲二醇、乙二醇、正丙二醇、異丙二醇、羥基丙二醇之二醇類之單體單元做為構成成分之非離子性聚醚或該高分子之末端經烷氧基化之高分子；(6)如葡聚糖、果膠、出芽短梗孢糖(pullulan)之糖類等非離子性天然高分子或該高分子之末端經烷氧基化之高分子； (7)如甲基纖維素、羥基丙基纖維素之纖維素類等非離子性改質天然高分子或該高分子之末端經烷氧基化之高分子；(8)以上述(1)至(7)之2種以上不同高分子做為構成單元之嵌段聚合物或接枝共聚物或該共聚物之末端經烷氧基化之共聚物。
此等非離子性水溶性高分子中，較佳者為非離子性聚醚、非離子性聚酯、非離子性聚胺基酸或非離子性合成多肽或此等高分子之末端經烷氧基化之高分子，更佳者為非離子性聚醚或非離子性聚酯或此等高分子之末端經烷氧基化之高分子，進一步更佳者為非離子性聚醚或非離子性單烷氧基聚醚，特佳者為聚乙二醇或單甲氧基聚乙二醇，最佳者為單甲氧基聚乙二醇。
又，此等非離子性水溶性高分子之平均分子量，無特別限定，不過以1000至12000為佳，以1000至5000為較佳，以1800至2200為更佳。
脂質部分可使用在「2-1」記載之「兩親媒性脂質」、「2-2」記載之「固醇類」中所列舉之脂質等。
就非離子性水溶性高分子所鍵結之脂質之具體例而言，可列舉如：二醯基甘油鍵結單甲氧基聚乙二醇、磷脂醯乙醇胺鍵結單甲氧基聚乙二醇、神經醯胺鍵結單甲氧基聚乙二醇(美國專利5,885,613號)等，不過不以此等為限。
更具體而言，可列舉下述任一個具有分子量約2000之PEG者： 以下式 表示之1,2-二月桂醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、以下式 表示之1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、以下式 表示之1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、以下式 表示之1,2-二硬脂醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、以下式 表示之N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉荳蔻氧基丙-3-胺(PEG-C-DMA：J.Controlled Release (2006)112,p.280-290)、以下式 表示之N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二棕櫚氧基丙-3-胺(PEG-C-DPA：J.Controlled Release(2006)112,p.280-290)、以下式 表示之N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二硬脂氧基丙-3-胺(PEG-C-DSA：J.Controlled Release(2006)112,p.280-290)、以下式 表示之mPEG2000-1,2-二-O-肉荳蔻基-sn3-胺甲醯基甘油酯(PEG-DMG：記載於WO2009/132131之實施例21中)、以下式 表示之mPEG2000-1,2-二-O-棕櫚基-sn3-胺甲醯基甘油酯(PEG-DPG：記載於WO2009/132131之實施例21中)、以及，以下式 表示之mPEG2000-1,2-二-O-硬脂基-sn3-胺甲醯基甘油酯(PEG-DSG：WO2009/132131實施例21中所記載)； 較佳者，可列舉1,2-二月桂醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、及1,2-二硬脂醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇；更佳者，可列舉1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇。
上述構造式中之CH3O(CH2CH2O)n’CH2CH2O-表示非離子性水溶性高分子，其之平均分子量無特別限定，不過以1000至12000為較佳，以1000至5000為更佳，以1800至2200為進一步更佳。n’為從非離子性水溶性高分子之平均分子量考量之數值，此數值無特別限定，不過以20至280為較佳，以20至120為更佳，以35至50為進一步更佳。
又，在可防止脂質粒子凝集之範圍內，亦可使用通常之PEG代替上述之PEG-脂質，或與上述之PEG-脂質同時使用。若脂質粒子於製造後安定，亦可在投與前藉由透析除去PEG。
2-4.其他脂質粒子之構成成分
本發明之脂質粒子中，在維持脂質粒子構造之範圍內，可含有其他物質，就此種脂質粒子之一例而言，可列舉含有選自聚醯胺.寡聚物(參照美國專利US6320017號。)、肽、蛋白質、界面活性劑之1或2種以上之脂質粒子。
亦可使對標的分子具有指向性之配位子鍵結於本發明脂質粒子之構成成分。
配位子可列舉，例如：(1)與被期望送達之細胞顯性 地表現之特定細胞受體鍵結之激素、成長因子、其之適當寡肽片段或低分子化合物，或(2)與標的細胞上顯性呈現之抗原性表位(epitope)特異地鍵結之多株或單株抗體、或其之適當片段(例如Fab、F(ab’)2)。
2-5.脂質粒子之組成比率
本發明之脂質粒子中之陽離子性脂質，以莫耳量計，占脂質粒子中所存在之全部脂質之約10%~約60%，以約20%~約60%為較佳，以約30%~約60%為更佳，以約40%~約60%為進一步更佳。兩親媒性脂質，以莫耳量計，占脂質粒子中所存在之全部脂質之約5%~約90%，以約5%~約60%為較佳，以約5%~約30%為更佳。減低脂質粒子形成時凝集之脂質，以莫耳量計，占脂質粒子中所存在之全部脂質之約0.2%~約20%，以約0.2%~約10%為較佳，以約0.5%~約5%為更佳，以約1%~約5%為進一步更佳。
在本發明之脂質粒子含有固醇類之情況，固醇類占該粒子中所存在之全部脂質之約10%~約60%，以約12%~約58%為較佳，以約20%~約55%為更佳。
就本發明之脂質粒子之較佳例而言，可列舉兩親媒性脂質：固醇：陽離子性脂質：PEG-脂質之莫耳比係選自(i)20：48：30：2、(ii)10：40：40：10及(iii)7.1：34.3：57.2：1.4之任一種比例者。
3.核酸脂質粒子
本發明提供在上述「2.脂質粒子」項記載之脂質粒子中進一步含有核酸之核酸脂質粒子。所謂「核酸脂質 粒子」之術語意指脂質粒子與核酸之複合體。脂質粒子與核酸形成複合體而得之核酸脂質粒子之一例為：具有核酸埋入脂質二層膜之構造之核酸脂質粒子。就本發明之核酸脂質粒子之一例而言，可列舉含有核酸、陽離子性脂質、兩親媒性脂質、固醇及PEG-脂質之組成物。
本發明之核酸脂質粒子內之核酸與脂質之重量比係以約0.01~0.3為較佳，以約0.02~0.15為更佳。
本發明之核酸脂質粒子所具有之平均粒徑係以約30nm~約300nm為較佳，以約30nm~約200nm為更佳，以約30nm~約100nm為進一步更佳。平均粒徑意指藉由Zeta電位/粒度測量計NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)測定之體積平均粒徑。
在通常之條件下會被核酸酶分解之核酸，若存在於本發明之核酸脂質粒子內，則對於在水溶液中核酸酶所引起之分解將具有抗性。核酸脂質粒子及其調製方法被揭示於美國專利第5,753,613號、第5,785,992號、第5,705,385號、第5,976,567號、第5,981,501號、第6,110,745號、第6,320,017號、國際公開公報第96/40964號及國際公開公報第07/012191號中。
在本說明書中，所謂「核酸」、「寡核苷酸」或「多核苷酸」之術語意指含有至少二個去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之聚合物，其可呈單股、雙股或參股之任一種形式。
除非特別指定，否則具體核酸序列亦包含：所暗示之其經保存性修飾之變異物(例如簡并密碼子 (degenerate codon)置換物)、對立基因、同源基因(ortholog)、SNP及互補序列，以及所明確指定之序列。
DNA亦可為反義、質體DNA、質體DNA之一部分、預先濃縮之DNA、聚合酶連鎖反應(PCR)之產物、載體(vector)(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色體)、表現框(cassette)、嵌合物(chimera)序列、染色體DNA或此等群之衍生物之形式。
在本說明書中，所謂「核酸」之術語係針對基因、質體、cDNA、mRNA、及干擾RNA分子(例如，合成siRNA或從質體表現之siRNA)而使用。
3-1.形成核酸脂質粒子之核酸
形成本發明之核酸脂質粒子之核酸，亦可包含業者所知之任何形式。就此種核酸形式之具體例而言，可列舉單股DNA、單股RNA、DNA與RNA混合而成之單股多核苷酸。就其他形式之核酸具體例而言，可列舉雙股DNA、雙股RNA、DNA-RNA之雜合多核苷酸、DNA與RNA混合而成之由2種多核苷酸所構成之雙股多核苷酸。
3-2.核苷或核苷酸
構成本發明之核酸脂質粒子中所含之核酸之核苷或核苷酸，除天然型者之外，亦包含經化學修飾之修飾核苷或修飾核苷酸。
在本說明書中，「天然型之核苷」意指2’-去氧腺苷、2’-去氧鳥苷、2’-去氧胞苷、2’-去氧-5-甲基胞苷、胸苷等2’-去氧核苷；腺苷、鳥苷、胞苷、5-甲基胞苷、尿苷等核糖核苷。又，「寡核苷酸」意指由核苷之糖部分 與磷酸形成酯之化合物所構成之寡核苷酸。本說明書中，寡核苷酸及多核苷酸，係以相同之意義來使用。
在本說明書中，亦有將2’-去氧腺苷以At表示，將2’-去氧鳥苷以Gt表示，將2’-去氧胞苷以Ct表示，將2’-去氧-5-甲基胞苷以5meCt表示，將胸苷以Tt表示，將2’-去氧尿苷以Ut表示，將腺苷以Art表示，將鳥苷以Grt表示，將胞苷以Crt表示，將5-甲基胞苷以5meCrt表示，將尿苷以Urt表示。又，在本說明書中，亦有將2’-去氧腺苷酸以Ap表示，將2’-去氧鳥苷酸以Gp表示，將2’-去氧胞苷酸以Cp表示，將2’-去氧-5-甲基胞苷酸以5meCp表示，將胸苷酸以Tp表示，將2’-去氧尿苷酸以Up表示，將腺苷酸以Arp表示，將鳥苷酸以Grp表示，將胞苷酸以Crp表示，將5-甲基胞苷酸以5meCrp表示，將尿苷酸以Urp表示。
在本說明書中，關於以硫代磷酸酯代替核苷酸之磷酸酯而成之硫代磷酸酯，對應於Ap者以As表示，對應於Gp者以Gs表示，對應於Cp者以Cs表示，對應於5meCp者以5meCs表示，對應於Tp者以Ts表示，對應於Up者以Us表示，對應於Arp者以Ars表示，對應於Grp者以Grs表示，對應於Crp者以Crs表示，對應於5meCrp者以5meCrs表示，對應於Urp者以Urs表示。
在本說明書中，所謂「糖修飾核苷」係指核苷之糖部分經過修飾之核苷。
其中，就2’-O-甲基修飾之例子而言，有2’-O-甲基核苷及2’-O-甲基核苷酸，對應於Art者以Am1t表示，對應於Grt者以Gm1t表示，對應於Crt者以Cm1t表示，對應於5meCrt 者以5meCm1t表示，對應於Urt者以Um1t表示，對應於Arp者以Am1p表示，對應於Grp者以Gm1p表示，對應於Crp者以Cm1p表示，對應於5meCrp者以5meCm1p表示，對應於Urp者以Um1p表示，對應於Ars者以Am1s表示，對應於Grs者以Gm1s表示，對應於Crs者以Cm1s表示，對應於5meCs者以5meCm1s表示，對應於Urs者以Um1s表示。
隨附於本說明書之序列表中，在各序列之<223>項目中，“cm”表示2’-O-甲基胞苷(2’-O-Methylcytidine)，“um”表示2’-O-甲基尿苷(2’-O-Methyluridine)，“gm”表示2’-O-甲基鳥苷(2’-O-Methylguanosine)。
在本說明書中，所謂2’-O,4’-C-伸乙基核苷酸單元及「ENA單元」係指上述各核苷、各核苷酸中具有ENA者，有時亦以下述方式來表示具有ENA單元之核苷及核苷酸：將對應於At者稱為A2t，對應於Ap者稱為Ae2p，對應於As者稱為Ae2s，對應於Gt者稱為G2t，對應於Gp者稱為Ge2p，對應於Gs者稱為Ge2s，對應於5meCt者稱為C2t，對應於5meCp者稱為Ce2p，對應於5meCs者稱為Ce2s，對應於Tt者稱為T2t，對應於Tp者稱為Te2p，對應於Ts者稱為Te2s。
本說明書中，所謂2’-O,4’-C-亞甲基核苷酸單元及「2’,4’-BNA/LNA單元」係指上述各核苷、各核苷酸中具有2’,4’-BNA/LNA者，有時亦以下述方式來表示具有2’,4’-BNA/LNA單元之核苷及核苷酸：將對應於At者稱為A1t，對應於Ap者稱為Ae1p，對應於As 稱為Ae1s，對應於Gt者稱為G1t，對應於Gp者稱為Ge1p，對應於Gs者稱為Ge1s，對應於5meCt者稱為C1t，對應於5meCp者稱為Ce1p ，對應於5meCs者稱為Ce1s，對應於Tt者稱為T1t，對應於Tp者稱為Te1p，對應於Ts者稱為Te1s。
以下，展現各核苷酸之構造式。
3-3.標的基因
在本說明書中，所謂的「標的基因」，在導入其之細胞、組織或個體(以下，將其稱為「被導入體」)中若為RNA，將無特別限制，其可為能轉譯成蛋白質之mRNA，也可為無法轉譯成蛋白質之非編碼RNA。就非編碼RNA 而言，可列舉功能性RNA，例如，mRNA之非轉譯領域、tRNA、rRNA、mRNA型ncRNA(類似mRNA之非編碼RNA)、長鏈ncRNA(長鏈非編碼RNA)、snRNA(小型核RNA)、snoRNA(小型核仁RNA)、miRNA(顯微RNA)等。具體而言，該RNA在待導入之被導入體中可為內在性者，亦可為藉由基因導入等手法導入之外來性者。又，可為存在於染色體上之基因，亦可為在染色體外者。就外來性之基因而言，雖可列舉如：來自可感染被導入體之病毒、細菌、真菌或原生動物者，但非限制於該等。關於基因之功能，可為已知者，也可為未知者。
就此等標的基因之例子而言，可列舉在具有特定疾病之患者中特異性地表現上昇及/或特異性地變異之基因，此等疾病例如為：中樞疾病(例如，阿茲海默症、痴呆、攝食障礙等)、炎症性疾病(例如過敏、風濕症、變形性關節症、紅斑性狼瘡等)、循環器官疾病(例如、高血壓症、心臟肥大、狹心症、動脈硬化症、高膽固醇血症等)、癌(例如非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胰臓癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌等)、呼吸器官疾病(例如肺炎、支氣管炎、氣喘、慢性阻塞性肺疾病等)、糖尿病、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎病、貧血(例如伴隨慢性疾病之貧血、鐵不耐受性鐵缺乏性貧血等)、年齢相關性黃斑變性症、免疫系疾病(例如、克隆氏病(Crohn’s disease)、異位性皮膚炎、自體免疫疾病、免疫缺陷、白血病等)、肝臓．膽囊疾病(例如非酒精性脂肪性肝炎、肝硬變、肝炎、 肝功能衰竭、膽汁鬱滞症、結石等)、消化道疾病(例如、潰瘍、腸炎、吸收不良等)、感染症、肥胖、纖維症(肺纖維症、肝纖維症、腎纖維症、骨髓纖維症等)；關於此等疾病之原因基因，雖可列舉如：紡錘體驅動蛋白(kinesin spindle protein(KSP))、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor、(VEGF))、運甲狀腺素蛋白(transthyretin(TTR))、前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisn/kexin type 9(PCSK9))、polo樣激酶(polo-like kinase 1(PLK-1))、ApoB-100、核醣核苷酸還原酶M2亞單元(ribonucleotide reductase M2 subunit(RRM2))、成簇蛋白(clusterin)、熱激蛋白(heat shock protein 27(Hsp27))、生存素(survivin)、真核起始因子-4E(eukaryotic initiation factor-4E(eIF-4E))、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1))、間白素4受體之α亞單位(alpha subunit of the interleukin 4 receptor(IL-4R-alpha))、因子XI、因子VII、N-ras、H-ras、K-ras、bcl-2、bcl-xL、Her-1、Her-2、Her-3、Her-4、MDR-1、人類β-連環素(β-catenin)基因、DDX3(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)箱型多肽3、X-鍵連)、髓樣細胞白血病序列1(myeloid cell leukemia sequence 1(MCL1))基因、PKR(Eif2ak2)、Hsp47(Serpinhl)、人鐵調素(Hepcidin)、活性化蛋白質C(APC)、生存素(survivin)、轉錄之信息傳遞及活化子(STAT3)，但不限於此等基因。
3-4.雙股多核苷酸
在本發明之核酸脂質粒子所含之核酸為對標的基因具有RNA干擾作用之核酸之情況，只要核酸具有RNA干擾作用，對於其構造及化學修飾將無限制，不過可列舉如：siRNA(例如參照WO2002/044321、Current Opinion in Chemical Biology,570-579)、由RNA與2’-OMeRNA交互鍵結而成之多核苷酸所構成之AtuRNAi(例如參照WO2004/015107)、在以下3-4-1項中所說明之在DNA與2’-OMeRNA交互鍵結而成之多核苷酸中，正義鏈與反義鏈為不同種類之核酸以沃森-克里克(Watson-Crick)鹼基對形成雙股而得之雙股多核苷酸(例如參照WO2010/001909)、在以下3-4-2項中所說明之多核苷酸之末端經修飾之核酸、以及在以下3-4-3項中所說明之反義鏈多核苷酸之5’末端與正義鏈多核苷酸之3’末端各經由連接子鍵結而成之單股，再者，可列舉在分子內形成沃森-克里克鹼基對而具有雙股構造之單股多核苷酸等。
此等多核苷酸之構造如第7圖所示。
本說明書中，「由與標的基因相同之核苷酸序列所構成」係指由與標的基因之至少一部分核苷酸序列相同之序列所構成，不過除了完全相同之序列外，只要對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含實質上相同之序列。「由與標的基因互補之核苷酸序列所構成」係指由與標的基因之至少一部分核苷酸序列互補之序列構成，不過除了完全互補之序列外，只要對標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，亦包含實質上相同之序列。又，已知對於標的基因有 單核苷酸多形性(SNPs)之情況，具有此種變異之序列亦包含於相同之核苷酸序列中。在本說明書中，包含與標的基因互補之核苷酸序列且對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用之多核苷酸被稱為對抗標的基因之多核苷酸。
本發明之核酸粒子所含之核酸之核苷酸序列，只要對於標的基因具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，將無特別限制，不過例如可藉由使用電腦軟體(例如，GENETYX(註冊商標)：GENETYX CORPORATION製等。)，依據被預測對於標的基因具有RNA干擾作用之序列來設定正義鏈及反義鏈之序列而決定，再者，亦可藉由確認依據選出序列所製作之多核苷酸之RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用而決定。
具有RNA干擾作用之雙股多核苷酸之正義鏈及反義鏈之鏈長，只要具有RNA干擾作用及/或基因表現抑制作用，可為從10個核苷酸至標的基因之開放閱讀框(open reading frame)(ORF)全長之任何長度，以從18個核苷酸至標的基因之開放閱讀框(ORF)全長之任何長度為較佳，以從10個至100個核苷酸為更佳，以從15~30個核苷酸為進一步更佳。
就具有RNA干擾作用之雙股多核苷酸而言，在使用DNA與2’-OMeRNA交互鍵結而成之多核苷酸中正義鏈與反義鏈為不同種類之核酸且形成沃森-克里克鍵結之雙股多核苷酸(WO2010/001909)之情況，就正義鏈而言，以18~21之鏈長者為較佳，以18~19之鏈長者為更佳。就反 義鏈而言，以19~21之鏈長者為較佳，以21鏈長者為更佳。又，並非其全部必須為雙股構造，亦包含5’及/或3’末端一部分突出者，該突出末端為1~5個核苷酸，而以1~3個核苷酸為較佳、以2個核苷酸為更佳。又，就最佳例而言，可列舉反義鏈之多核苷酸之3’末端具有2個核苷酸突出之構造(突出構造)，且形成18個鹼基對之多核苷酸。
3-4-1.DNA與2’-OMeRNA交互鍵結而成之多核苷酸
就本發明之核酸脂質粒子所含之核酸之一例而言，可列舉：DNA與2’-OMeRNA交互鍵結而成之多核苷酸中，正義鏈與反義鏈為不同種類之核酸且形成沃森-克里克鍵結之雙股多核苷酸，再者，就其之具體例而言，可列舉如：具有WO2010/001909記載之構造之雙股多核苷酸。就其之一例而言，可列舉由與WO2010/001909之實施例51所記載之CT-169相同之DNA與2’-OMeRNA組合而成之正義鏈，及與實施例45所記載之CT-157相同之DNA與2’-OMeRNA組合而成之反義鏈所構成，且鹼基序列包含對於標的基因之標的序列而言為正義及反義之序列之雙股構造多核苷酸。更具體而言，可列舉例如以下選自(A)至(C)之任一項之雙股多核苷酸或其鹽。
(A)具有以下(a)至(e)所構成之特徴，且由式(I)所示之正義鏈與式(II)所示之反義鏈構成之多核苷酸或其鹽：5’-(α-β)9-αp-λm-3’(I)
5’-δs-(α-β)9-υn-3’(II)
(a)α及β不同，表示DNA或2’-OMeRNA；δ及λ相同或不同，表示DNA或2’-OMeRNA；υ相同或不同，表示選自 DNA、RNA及2’-OMeRNA之任何核苷酸；(b)p表示0或1之整數，m在p為0時表示0，p為1時表示0~5之任一個整數，s表示0或1之整數，n表示0~5之任一個整數；(c)式(II)所示之多核苷酸中，δs-(α-β)9係由與標的基因互補之核苷酸序列所構成；(d)式(I)中之(α-β)9及式(II)中之(α-β)9，係由彼此互補之核苷酸序列所構成；(e)於式(II)之5’末端附加磷酸基。
α、β、λ及υ表示核苷單元，各核苷間連結之線表示磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。「核苷單元」表示如上述之「天然型核苷」或「糖修飾核苷」之核酸鹼基之N-葡萄糖基體，其係多核苷酸之構成單元。
(B)具有以下(a)至(e)所構成之特徴，且係由式(III)所示之正義鏈及式(IV)所示之反義鏈構成之多核苷酸或其鹽：5’-β-(α-β)8-αp-λm-3’(III)
5’-δs-(α-β)8-(α-β)-υn-3’(IV)
(a)α及β不同，表示DNA或2’-OMeRNA；δ及λ相同或不同，表示DNA或2’-OMeRNA，υ相同或不同，表示選自DNA、RNA及2’-OMeRNA之任何核苷酸；(b)p表示0或1之整數，m在p為0時表示0，p為1時表示0~5之任一個整數，s表示0或1之整數，n表示0~5之任一個整數；(c)式(IV)所示之多核苷酸中，δs-(α-β)8-(α-β)係由與 標的基因互補之核苷酸序列所構成；(d)式(VI)中之(α-β)8及式(VII)中之(α-β)8，係由彼此互補之核苷酸序列所構成；(e)於式(IV)之5’末端附加磷酸基。
α、β、λ及υ表示核苷單元，各核苷間連結之線表示磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。「核苷單元」表示如上述之「天然型核苷」或「糖修飾核苷」之核酸鹼基之N-葡萄糖基體，其係多核苷酸之構成單元。
(C)具有以下(a)至(d)所構成之特徴，且係由式(V)所示之正義鏈及式(VI)所示之反義鏈構成之多核苷酸或其鹽：5’-(α-β)9-3’(V)
5’-δ-(α-β)9-υ2-3’(VI),(a)α表示DNA；β表示2’-OMeRNA；δ表示DNA或2’-OMeRNA；υ相同或不同，表示DNA或2’-OMeRNA；(b)式(VI)所示之多核苷酸中，δ-(α-β)9係由與標的基因互補之核苷酸序列所構成；(c)式(V)中之(α-β)9及式(VI)中之(α-β)9係由彼此互補之核苷酸序列所構成；(d)於式(VI)之5’末端附加磷酸基。
α、β、δ及υ表示核苷單元，各核苷間連結之線表示磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。「核苷單元」表示如上述之「天然型核苷」或「糖修飾核苷」之核酸鹼基之N-葡萄糖基體，其係多核苷酸之構成單元。
3-4-2.修飾雙股多核苷酸
就核酸脂質粒子中所含之核酸而言，使用具有RNA干擾作用之核酸之情況，只要具有RNA干擾作用，亦可列舉多核苷酸之末端經修飾之核酸做為其之一例。例如，可列舉siRNA、AtuRNAi、DNA與2’-OMeRNA交互鍵結之多核苷酸中，正義鏈與反義鏈為不同種類之核酸且形成沃森-克里克鍵結之雙股多核苷酸(例如，參照WO2010/001909)等具有RNA干擾作用之雙股多核苷酸中，反義鏈之5’末端之磷酸基經5’芳基磷酸修飾之雙股多核苷酸。
就此種雙股多核苷酸之具體例而言，可列舉以下者。
具有與標的基因互補之鹼基序列所構成之反義鏈多核苷酸，以及具有與該反義鏈多核苷酸互補之鹼基序列所構成之正義鏈多核苷酸的雙股多核苷酸中，下述式X所示之取代基鍵結於該反義鏈多核苷酸之5’末端之磷酸基上，形成磷酸二酯構造而成之雙股多核苷酸或其鹽，其中X為：(a)式(I)所示之基 [式中，A表示氮原子或C-R3，R1及R2各自獨立表示：氫原子、可具有取代基之碳數1至8之烷基、 可具有取代基之碳數1至8之烷氧基、可具有取代基之碳數3至6之環狀烷基、鹵素原子、包含可具有取代基之碳數1至8之烷基之烷基羰基、可具有取代基之苯基、可具有取代基之苯氧基、可具有取代基之含有選自氮原子、氧原子及硫原子所構成群中之雜原子之1至3個雜原子，且可為飽和或不飽和之5員環或6員環之雜環基、於苯基部分可具有取代基之芳烷基、於苯基部分可具有取代基之芳烷氧基、碳數1至6之烷磺醯基、羥基、具有碳數1至9之烷基之烷羰胺基、具有碳數1至9之烷基，該烷基之末端碳原子上經羥基取代之羥基烷羰胺基、具有碳數1至8之烷基之N-烷基胺甲醯基、具有碳數1至9之烷基，該烷基之末端碳原子上經羥基取代之N-(羥基烷基)胺甲醯基、具有碳數1至8之烷基，且以含有1至4個碳原子之伸烷基與芳香環鍵結之N-烷基胺甲醯基伸烷基、具有碳數1至9之烷基，該烷基之末端碳原子上經羥基取代，且以含有1至4個碳原子之伸烷基與芳香環鍵結之N-(羥基烷基)胺甲醯基伸烷基、羧基、或 式：-(CH2)k-CONR4R5所示之基(式中，R4及R5各自獨立表示氫原子、可具有取代基之碳數1至6之烷基、或於苯基部分可具有取代基之芳烷基，k表示0至3之整數)，或者R1與R2一體化，R1及R2可與其所鍵結之芳香環形成可具有取代基之二環性或三環性之環狀構造(該環狀構造可為飽和，亦可為不飽和，且該環狀構造可進一步包含1個或1個以上之雜原子做為環之構成原子，亦可具有側氧基),R3表示鹵素原子、碳數1至6之烷基、碳數1至6之烷氧基、鹵甲基、羥基、或氫原子]；或者(b)酪胺酸殘基其於胺基上可具有取代基，且以苯基上之羥基為鍵結部位。
就雙股多核苷酸中，反義鏈之5’末端之磷酸基經修飾之化合物之具體例而言，可列舉在以下之表10-1至表10-6中所記載之化合物。
此種經5’苯基磷酸修飾之反義鏈多核苷酸之製造方法，只要可合成經5’苯基磷酸修飾之反義鏈，將無特別限制，例如，可依照以下所示之M法(第8圖)或N法(第9圖)而合成。
3-4-2-1.M法
M法之概要如第8圖所示。
3-4-2-1-1.M-1步驟
本步驟為使用鍵結有期望之核苷之市售聚合物支撐體(polymer support)(1)(M法中，以Tr-O-Y-CPG表示，式中，CPG表示可與多核苷酸鍵結之具有連接子之聚合物支撐體，Y表示除去5’-及3’-羥基且核酸鹼基部分之胺基經保護之核苷單元，Tr表示羥基之保護基)，製造由期望之核苷酸序列所構成之寡核苷酸類似物，即式(2)所示之化合物(以下記載為「化合物(2)」，在下文中亦同)之步驟(M法中，以HO-W1-Y-CPG表示，式中，W1-Y表示除去5’-末端及3’-末端之羥基之經保護多核苷酸)。
Tr只要為不會使核酸保護基脫離，而可將羥基保護基脫保護者，將無特別限定，可列舉如：4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl)、三苯甲基、乙醯丙醯基(levulinyl)、雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基，其中以4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基為較佳。
就核酸鹼基部分之胺基保護基而言，只要為通常所使用者即可，無特別限制，可列舉如：苯甲醯基、異丁醯基、乙醯基、苯氧基乙醯基、4-(三級丁基)苯氧基乙醯基、烯丙氧羰基、對硝基苯基乙基羰基。
就CPG而言，可列舉可控孔玻璃(controlled-pore glass)、長鏈烷基胺基可控孔玻璃(Oligonucleotide synthesis Edited by M.J.Gait,IRL Press,1984,pp84-115) 、聚苯乙烯珠粒(Tetrahedron Lett.34,3373(1994))等。此時，可列舉聚合物支撐體上具有如胺基丙基、胺基己基之胺基烷基者。
就可與多核苷酸鍵結之連結基而言，可列舉-OC(=O)-CH2CH2C(=O)-，亦即琥珀酸經由氧原子酯鍵結於Y之3’位，琥珀酸之另一端之羧酸與聚合物支撐體上之胺基形成醯胺鍵者。除了琥珀酸之外，可列舉肌胺酸(-OC(=O)-CH2-NCH3-)，草酸連結基(-OC(=O)C(=O)-)等。
就Tr-O-Y-CPG[其中Tr為4,4’-二甲氧基三苯甲基，CPG係藉由琥珀酸連結基(-OC(=O)-CH2CH2C(=O)-)連結於Y，亦即該琥珀酸連結基經由氧原子以酯鍵連結於Y之3’位，該琥珀酸連結基之另一端之羧酸則與聚合物支撐體上之胺基形成醯胺鍵]之市售品之例而言，可列舉Glen Research公司之2’-OMe-A-RNA-CPG(20-3600-10)、2’-OMe-C-RNA-CPG(20-3610-10)、2’-OMe-G-RNA-CPG(20-3621-10)、2’-OMe-U-RNA-CPG(20-3630-10)、Bz-A-RNA-CPG(20-3303-10)、Ac-C-RNA-CPG(20-3315-10)、iPr-Pac-G-RNA-CPG(20-3324-10)、U-RNA-CPG(20-3330-10)、dA-CPG(20-2000-10)、dC-CPG(20-2010-10)dG-CPG(20-2020-10)、dT-CPG(20-2030-10)等。
使用製造化合物(2)時所必需之亞磷醯胺試藥等，並藉由使用DNA自動合成機之通常亞磷醯胺法來製造化合物(2)。具有所期望之核苷酸序列之寡核苷酸類似物，可藉由使用DNA合成機，例如柏金愛爾默(PerkinElmer)公 司之藉由亞磷醯胺法之392型等，並依照文獻(Nucleic Acids Research,12,4539(1984))記載之方法來合成。
又，如期望，將寡核苷酸類似物硫代酯(thioate)化之情況，可使用硫或四乙基秋蘭姆二硫化物(TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥、苯基乙醯基二硫化物/吡啶-乙腈(1：1 v/v)溶液(Ravikumar，V.T.et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.(2006)16，p.2513-2517)等試藥，依照文獻(Tetarhedron Letters,32,3005(1991),J.Am.Chem.Soc.,112,1253(1990))記載之方法，得到硫代酯(thioate)衍生物。
3-4-2-1-2M-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使在上述M-1步驟中所製造之化合物(2)與亞磷酸參-(1,2,4-三唑基)酯、或2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧雜磷雜環己-4-酮(2-chloro-4H-1,3,2-phosphorin-4-one)反應後，加水，進行H-膦酸酯化，製造化合物(3)之步驟。
就所使用之溶劑而言，只要對反應不造成影響者即可，無特別限定，不過較佳者可列舉：如四氫呋喃、二乙基醚、二烷之醚類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類。
在使用2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧雜磷雜環己-4-酮之情況中，可使用脫酸劑，此情況下，就所使用之脫酸劑而言，可列舉如：吡啶、二甲基胺基吡啶之雜環胺類，如三甲基胺、三乙基胺、二異丙基胺之脂肪族胺類，不過較佳者為脂肪族胺類(尤其是三乙基胺)。
反應溫度無特別限定，通常為-20至100℃，以10至40℃為較佳。
反應時間雖隨所使用之原料、試藥、溫度等而異，不過通常為5分鐘至30小時；在於室溫反應之情況，以30分鐘為較佳。
反應終了後，藉由過濾可將反應液與CPG分離。使用吡啶、乙腈等有機溶劑洗淨後，添加三乙基胺碳酸鹽/水溶液，再度用乙腈洗淨，藉由乾燥，可得到化合物(3)。
3-4-2-1-3.M-3步驟
本步驟為使在上述M-2步驟中所製造之化合物(3)與具有羥基之化合物(在M法中以X-H表示)，在如三甲基乙醯氯之縮合劑及脫酸劑存在下縮合，形成H-膦酸二酯鍵，而製造化合物(4)之步驟。
就在本步驟中所使用之溶劑而言，只要不會阻害反應，將無特別限定，以使用無水乙腈、無水吡啶、或此等之混合液為較佳。
就做為縮合劑使用之試藥而言，可列舉羧酸或磷酸之醯氯化物，使用三甲基乙醯氯或金剛烷醯氯為較佳。
就所使用之脫酸劑而言，可列舉：如吡啶、二甲基胺基吡啶之雜環胺類；如三甲基胺、三乙基胺、二異丙基乙基胺之脂肪族胺類；以脂肪族胺類(尤其是三乙基胺)為較佳。
反應溫度無特別限定，不過通常為-50至50℃，較佳者為室溫。
反應時間，雖隨所使用之原料、試藥、溫度等而異，不過通常為5分鐘至30小時；在於室溫反應之情況，以30分鐘為較佳。
反應終了後，可藉由過濾將反應液與CPG分離。用吡啶、乙腈等有機溶劑洗淨後，藉由乾燥，得到化合物(4)。
3-4-2-1-4.M-4步驟
本步驟為使用氧化劑，將在上述M-3步驟中所製造之化合物(4)之H-膦酸鍵變換為磷酸二酯鍵，而製造化合物(5)之步驟。
就將H-膦酸鍵氧化之氧化劑而言，只要通常可使用於氧化反應者即可，無特別限定，可列舉；如過錳酸鉀、二氧化錳之氧化錳類；如四氧化釕之氧化釕類；如二氧化硒之硒化合物；如氯化鐵之鐵化合物；如四氧化鋨之鋨化合物；如氧化銀之銀化合物；如乙酸汞之汞化合物；如氧化鉛、四氧化鉛之氧化鉛化合物；如鉻酸鉀、鉻酸-硫酸錯合物、鉻酸-吡啶錯合物之鉻氧化物；如硝酸鈰銨(CAN)之鈰化合物等無機金屬氧化劑；如氯分子、溴分子、碘分子之鹵素分子；如過碘酸鈉之過碘酸類；臭氧；過氧化氫水溶液；如亞硝酸之亞硝酸化合物；如亞氯酸鉀、亞氯酸鈉之亞氯酸化合物；如過硫酸鉀、過硫酸鈉之過硫酸化合物等無機氧化劑；使用於DMSO氧化之試藥類(二甲基亞碸與二環己基碳化二亞胺、草醯基氯、乙酸酐或五氧化磷之錯合物，或吡啶-乙酸酐之錯合物)；如氫過氧化三級丁基之過氧化物類；如三苯基甲 基陽離子之安定陽離子類；如N-溴琥珀醯亞胺之琥珀醯亞胺類；如次氯酸三級丁酯之次氯酸化合物；如偶氮二羧酸甲酯之偶氮二羧酸化合物；如二甲基二硫化物、二苯基二硫化物、二吡啶基二硫化物之二硫化物類及三苯基膦；如亞硝酸甲酯之亞硝酸酯類；如四溴甲烷之四鹵素化碳；如2,3-二氯-5,6-二氰基-p-苯醌(DDQ)之醌化合物等有機氧化劑；以碘分子為較佳。
就所使用之脫酸劑而言，可列舉：如吡啶、二甲基胺基吡啶之雜環胺類；如三甲基胺、三乙基胺、二異丙基乙基胺之脂肪族胺類；以吡啶為較佳。
反應溫度無特別限定，不過通常為-50至50℃，以室溫為較佳。
反應時間，雖隨所使用之原料、試藥、溫度等而異，不過通常為5分鐘至30小時；在於室溫反應之情況，以30分鐘為較佳。
反應終了後，可藉由過濾將反應液與CPG分離。用吡啶、乙腈等有機溶劑洗淨後，藉由乾燥，可得到化合物(5)。
3-4-2-1-5.M-5步驟
本步驟為將在上述M-4步驟中所製造之化合物(5)從CPG切出，以及進行保護基之除去，製造最終化合物(6)之步驟(在M、N法中，-W1’-Y’-表示將5’-末端及3’-末端之羥基除去保護之多核苷酸之構造)。
就所使用之鹼而言，可列舉濃氨水、甲醇性氨、乙醇性氨、濃氨水-乙醇(3：1(V/V))混合液、濃氨水-40% 甲基胺水溶液(1：1V/V)混合液、甲基胺、0.5M LiOH水溶液、3.5M三乙基胺/甲醇溶液之(1：10V/V)混合液，以濃氨水、濃氨水-乙醇混合液(3：1(V/V))為較佳。
反應溫度無特別限定，不過通常為-50至80℃，以室溫至60℃為較佳。
反應時間，雖隨所使用之原料、試藥、溫度等而異，不過通常為5分鐘至30小時；在於60℃反應之情況，以5小時為較佳。以此種方式所得到之含有化合物(6)之反應混合物，藉由逆相及離子交換層析法(包含高速液體層析法。)等各種層析法等通常用於核酸精製之精製操作來精製，可得到化合物(6)。
3-4-2-2.N步驟
N步驟之概要如第9圖所示。
3-4-2-2-1.N-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，將形成羥基之化合物(在N法中，以X-H表示)，與通常使用於amidite化之單取代-氯(烷氧基)膦類(第9圖中，以R12-P(-O-R11)-Cl表示)或二取代-烷氧基膦類(第9圖中，以(R12-)2P(-O-R11)表示)反應，製造化合物(7)之步驟。
就所使用之溶劑而言，只要對反應不造成影響者即可，無特別限定，不過較佳者可列舉：如四氫呋喃、二乙基醚、二烷之醚類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類。
就本步驟中之R11而言，可列舉：2-氰基乙基、甲基、甲磺醯基乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基；以氰基乙基 、甲基為較佳。
本步驟中之R12，可列舉啉基、二異丙基胺基、二乙基胺基、二甲基胺基，較佳者為二異丙基胺基。
就所使用之單取代-氯(烷氧基)膦類而言，可列舉：如氯(啉基)甲氧基膦、氯(啉基)氰基乙氧基膦、氯(二甲基胺基)甲氧基膦、氯(二甲基胺基)氰基乙氧基膦、氯(二異丙基胺基)甲氧基膦、氯(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦之膦類；以氯(啉基)甲氧基膦、氯(啉基)氰基乙氧基膦、氯(二異丙基胺基)甲氧基膦、氯(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦為較佳。
在使用單取代-氯(烷氧基)膦類之情況，可使用脫酸劑，此種情況下，就所使用之脫酸劑而言，可列舉：如吡啶、二甲基胺基吡啶之雜環胺類；如三甲基胺、三乙基胺、二異丙基乙基胺之脂肪族胺類；以脂肪族胺類(尤其二異丙基乙基胺)為較佳。
就所使用之二取代-烷氧基膦類而言，可列舉：如雙(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦、雙(二乙基胺基)甲磺醯基乙氧基膦、雙(二異丙基胺基)(2,2,2-三氯乙氧基)膦、雙(二異丙基胺基)(4-氯苯基甲氧基)膦之膦類，以雙(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦為較佳。
在使用二取代-烷氧基膦類之情況，可使用酸，此種情況下，就所使用之酸而言，以四唑、乙酸或對甲苯磺酸為較佳。
反應溫度無特別限定，不過通常為0至80℃，以室溫為較佳。
反應時間，雖隨所使用之原料、試藥、溫度等而異，不過通常為5分鐘至30小時；在於室溫反應之情況，以30分鐘至10小時為較佳。
反應終了後，本反應之目的化合物(7)，例如，將反應混合物適當地中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。
所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
3-4-2-2-2.N-2步驟
本步驟為藉由使用DNA自動合成機之通常亞磷醯胺法，使在M-1中所製造之化合物(2)與在N-1中所製造之化合物(7)之亞磷醯胺體(phosphoroamidite)反應，製造化合物(8)之步驟(圖中，W1-Y表示將5’末端、及3’末端之羥基除去保護之反義鏈多核苷酸)。
所期望之化合物(8)，可藉由使用DNA合成機，例如PerkinElmer公司之藉由亞磷醯胺法之模型392等，依據文獻(Nucleic Acids Research,12,4539(1984))所記載之方法而合成。
又，依照期望，在硫代酯(thioate)化之情況，除硫之外，可使用四乙基秋蘭姆二硫化物(TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥、苯基乙醯基二硫化物/吡啶-乙腈(1：1 v/v)溶液(Ravikumar,V.T.et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.(2006)16,p.2513-2517)等試藥，依據 文獻(Tetrahedron Letters,32,3005(1991)、J.Am.Chem.Soc.,112,1253(1990))所記載之方法，得到硫代酯衍生物。
3-4-2-2-3.N-3步驟
本步驟為將在上述N-2步驟中所製造之化合物(8)從CPG切出，並進行保護基之除去，而製造最終化合物(6)之步驟(圖中，W1’-Y’表示除去5’末端、及3’末端之羥基之反義鏈多核苷酸)。
本步驟可依照與M-5步驟同様之方法進行。
再者，將具有互補性之正義鏈、反義鏈之各單股多核苷酸個別合成，再藉由適當之方法使其會合，可形成雙股。就會合之方法而言，具體地可列舉如：將合成之單股多核苷酸，較佳以至少約3：7之莫耳比，更佳以約4：6之莫耳比，最佳以等莫耳量(5：5之莫耳比)混合，並加熱至雙股解離之溫度，然後慢慢冷卻之方法等。會合之雙股多核苷酸，可視需要藉由本身周知之常用方法來精製。就精製方法而言，可使用，例如，使用瓊脂糖凝膠等確認會合，然後藉由適當酵素分解殘存之單股多核苷酸而除去之方法。依照本方法，可取得5’-芳基磷酸修飾-雙股多核苷酸及5’末端之磷酸基未經修飾之雙股多核苷酸。
3-4-3.經修飾之單股多核苷酸
就在核酸脂質粒子中所含之核酸而言，只要具有RNA干擾作用，亦可含有以下之多核苷酸。
為具有對應於標的基因之正義鏈多核苷酸，及具有 與該正義鏈多核苷酸互補之鹼基序列之反義鏈多核苷酸之多核苷酸，且該反義鏈多核苷酸之5’末端與該正義鏈多核苷酸之3’末端，藉由在上述各端可形成磷酸二酯構造之具有下式所示構造之連接子鍵結而成之多核苷酸或其鹽：
式中，鍵結於苯基之氧原子與反義鏈之5’末端鍵結，形成磷酸二酯構造，R1、R2及R3之任一個表示下式所示之構造：-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→，式中，m表示0至4之整數，n1表示0至4之整數，n2表示0或2至10之整數，L1表示單鍵或-O-，L2表示單鍵或-CH(-NH-L4-R)-，L3以與L2之鍵結做為基點，表示單鍵、-(C=O)-NH-、或-NH-(C=O)-，L3為單鍵以外之基時，n2表示2至10之整數，L1及L2為單鍵，m為1，且n1及n2為0時，L3-O→表示：-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Ser、 -CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Thr、-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Ser、或-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Thr，不過此等絲胺酸及蘇胺酸之羥基部分，與正義鏈多核苷酸之3’末端之磷酸基鍵結，形成磷酸二酯構造，再者，絲胺酸及蘇胺酸之胺基亦可經醯基取代，j表示0至2之整數，L4表示單鍵、-(C=O)-(CH2)k-NH-、或-(C=O)-(CH2)k-，k表示1至6之整數，R表示氫原子、碳數1至6之烷基、可為飽和或不飽和之碳數2至30之烴羰基、可為飽和或不飽和之碳數2至30之烴氧基羰基。
R1、R2及R3中之其餘2個各自獨立表示選自下列所構成之群之基：氫原子、可具有取代基之碳數1至8之烷基、可具有取代基之碳數1至8之烷氧基、鹵素原子、具有碳數1至9之烷基之烷基羰基胺基、及含有可具有取代基之碳數1至8之烷基之烷基羰基。
連接子所含之苯基上有R1、R2及R3存在，不過其中1個成為具有連接子功能，與正義鏈之3’末端鍵結之部位，其構造上以形成磷酸二酯構造為特徵。剩餘2個無連接子功能，僅是苯基上之取代基。
現說明擔任連接子功能之構造中苯基部分以外之部分，即-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→。
L1為單鍵，或2價氧原子-O-。
L2為單鍵，或為於亞甲基碳原子上具有胺基之構造，該胺基可具有取代基。該胺基係經由連接子構造L4而與取代基R連結。
L4為單鍵、或為亞甲基或碳數2至4之聚亞甲基、或為-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-O-構造。-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-O-構造之羰基，在構造式之左端與胺基鍵結，形成-NH-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-O-之構造。
R為碳數1至6之烷基時，該烷基可為直鏈狀及分枝鏈狀之任一種。例如，可列舉甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、戊基、己基等。
R為碳數1至6之烷基時，其可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一種。例如，可列舉甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、戊基、己基等。
R為可飽和或不飽和之碳數2至30之烴羰基(烴基-(C=O)-)時，或為可飽和或不飽和之碳數2至30之烴氧基羰基(烴基-O-(C=O)-)時，此等之烴基部分可為直鏈狀或分枝鏈狀。又，烴基可為飽和，不過成為不飽和亦可。就此種烴基而言，可列舉從脂肪族烴衍生出之基。就烴基而言，可列舉碳數至30為止之烷基。此外，此烷基內之碳碳鍵結亦可為雙鍵，而形成不飽和之烷類。再者，該烴基部分亦可包含不飽和鍵，並成為稠合環狀構造。就此種環狀烴基而言，可列舉膽固醇基。
L3為單鍵，或成為-(C=O)-NH-或-NH-(C=O)-之構造。L3，左端與L2鍵結，視情況亦可直接與化8所示之苯基鍵結。再者，L3非為單鍵時，亦即L3為-(C=O)-NH-或-NH-(C=O)-時，鍵結於此等基之下述構造中必須存在亞甲基或聚亞甲基。亦即，在此種情況中，n2不為0。
在L3之右端為與-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→鍵結之構造。二亞甲基氧基構造可為1個(n1=1)，或者將其當做1個單元，由重複之2至4個單元(n1=2~4)鍵結而成。再者，視情況有時亦可不存在二亞甲基氧構造。二亞甲基氧構造，以重複2或3個者為較佳。亦即，n1係以2或3為較佳。更佳地，二亞甲基氧構造為2個，即n1以為2為更佳。
在該二亞甲基氧構造之右端，雖然可與亞甲基或達9個亞甲基所構成之聚亞甲基鍵結，但有時可不存在該亞甲基或聚亞甲基。就亞甲基或聚亞甲基而言，以聚亞甲基為較佳。於存在聚亞甲基之情況，鏈長以碳數計，以成為2至10者為較佳。聚亞甲基鏈，以鏈長越長者為越佳，以碳數5以上之聚亞甲基鏈為較佳。以碳數7以上之聚亞甲基鏈為更佳。
二亞甲基氧構造與亞甲基或聚亞甲基可混合存在，在此情況，就鏈長而言，只要原子數為約2至10者即可。
L1及L2為單鍵，m為1且n1及n2為0時，-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→部分成為L3-O→，該L3-O→表示：-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Ser、-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Thr、-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Ser、或-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Thr之各個構造。
該各構造雖然為多肽，不過只要該多肽之一端為酪胺酸，另一端為含羥基之胺基酸即可。再者，酪胺酸之苯基，為與5’末端之磷酸二酯構造鍵結之部位，另一端之胺基酸之羥基部分，則為與3’末端之磷酸二酯構造鍵結之部位。與3’末端鍵結之胺基酸只要為含有羥基之胺基酸，將可為任一種，即可為絲胺酸或羥丁胺酸。再者，該絲胺酸及羥丁胺酸之胺基可經醯基取代。該醯基可為苯基羰基或烷基羰基。苯基羰基之苯基可經碳數1至6之烷基、碳數1至6之烷氧基、鹵素原子等取代。烷基羰基之烷基只要為碳數1至6之烷基即可，其可為直鏈狀或分枝鏈狀，且可經碳數1至6之烷氧基、鹵素原子等進一步取代。此等醯基之中，以烷基羰基為較佳，以乙醯基為特佳。
例如，←O-Ph-CH(COOH)NH-(胺基酸殘基)j-Ser之構造為絲胺酸，或以絲胺酸為末端之多肽鍵結於酪胺酸之胺基而成之構造。該肽構造，如←O-Ph-CH(NH2)CO-(胺基酸殘基)j-Ser般，可在酪胺酸之羧基末端形成多肽。
形成多肽之胺基酸可為L-型、D-型、DL-型之任一種。
就多肽而言，只要為二肽至四肽即可。就酪胺酸與絲胺酸或蘇胺酸之中間所鍵結之胺基酸而言，無特別限制，可為甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸等之胺基酸即可。就胺基酸而言，較佳者為甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸。就酪胺酸與絲胺酸或蘇胺酸中間鍵結之二胺基酸而言，無特別限制，只要由上述胺基酸構成之二胺基酸即可。就胺基酸而言，較佳者為甘胺酸-甘胺酸、甘胺酸-丙胺酸、甘胺酸-β-丙胺酸、丙胺酸-甘胺酸、丙胺酸-丙胺酸、丙胺酸-β-丙胺酸、β-丙胺酸-甘胺酸、β-丙胺酸-丙胺酸、β-丙胺酸-β-丙胺酸。
存在於構成連結基之苯基上之R1、R2及R3中之任一者為-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→所示之構造且具有連結基功能。R1、R2及R3內之2個為苯基上之取代基。就此等取代基而言，只要為選自包含下列之群之基即可：氫原子、可具有取代基之碳數1至8之烷基、可具有取代基之碳數1至8之烷氧基、鹵素原子、具有碳數1至9之烷基之烷羰胺基，及可具有取代基之包含碳數1至8之烷基之烷基羰基。
R1、R2及R3中之2個為可具有取代基之碳數1至8之烷基時，烷基可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一者。可列舉如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。烷基具有取代基時，該 取代基為選自包含羥基、胺基、鹵素原子、碳數1至6之烷硫基、碳數1至6之烷氧基、羧基、含有碳數1至6之烷氧基之烷氧基羰基之群中之1個或1個以上之基。在取代基為1個以上之情況，可為相同或相異。羥基或胺基為烷基之取代基時，該等以取代在烷基之末端之碳原子上為更佳。就含有羥基之烷基而言，以羥基甲基，2-羥基乙基，2-羥基丙基，3-羥基丙基為較佳。在以鹵素原子做為烷基之取代基之情況，烷基雖然可為碳數1至6之直鏈狀或分枝狀之任一者，但以甲基或乙基上具有鹵素原子者為更佳，以甲基為特佳。鹵素原子為烷基之取代基時，鹵素原子以氟原子為較佳。氟原子之數目可為單取代至全氟取代之任一者。可例示單氟甲基、二氟甲基、三氟甲基及2,2,2-三氟乙基。以單氟甲基、二氟甲基及三氟甲基為較佳。就碳數1至6之烷硫基及碳數1至6之烷氧基而言，可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一者，可列舉如：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基等。羧基或含有碳數1至6之烷氧基之烷氧基羰基為烷基之取代基時，以該等取代在烷基之末端碳原子上為更佳。含有碳數1至6之烷氧基之烷氧基羰基之烷基可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一者，可列舉如：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基等。
R1、R2及R3中之2個為可具有取代基之碳數1至8之烷氧基時，該烷氧基只要為包含在上文中所示之烷基及氧原子之烷氧基即可。
R1、R2及R3中之2個為鹵素原子之情況，只要為氟原 子、氯原子、溴原子、或碘原子即可。此等之中，以氯原子或氟原子為較佳，以氟原子為更佳。
R1、R2及R3中之2個為可具有取代基之包含碳數1至9之烷基之烷基羰基(脂肪族醯基)時，該烷基部分只要為包含在上文中所示之碳數1至8之烷基之碳數可達9之烷基即可，烷基羰基只要為包含此等烷基及羰基者即可。烷基羰基係以乙醯基為較佳。
就R1、R2及R3而言，以R1及R3為氫原子，且R2為-L1-(CH2)m-L2-L3-(CH2CH2O)n1-(CH2)n2-O→所示之連結基構造為較佳。
再者，R1及R3為氫原子時，以下述組合為較佳： L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，且m與n2之和為3以上之整數。
L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，且m與n2之和為8以上之整數。
L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，且n2為6以上之整數。
L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，且n2為6或8。
L1及L2為單鍵，L3為-(C=O)-NH-，m為0或2，n2為8之情況。
在本說明書中，亦將上述之以具有對應於標的基因之正義鏈多核苷酸，及含與該正義鏈多核苷酸互補之鹼基序列之反義鏈多核苷酸之雙股多核苷酸為來源，以「具有該反義鏈之5’末端及正義鏈之3’末端藉由在上述各 端形成磷酸二酯構造之具下述構造式所示構造之連結基而鍵結成之單股構造」為特徴，而形成多核苷酸-3’-P(=O)(OH)-[連結基]-P(=O)(OH)-5’-多核苷酸之構造之多核苷酸稱為「3L5-多核苷酸」。
就此種化合物之具體例而言，可列舉在以下之表11-1及表11-2中所記載之化合物。表中，X末端之亞甲基與正義鏈多核苷酸之3’末端鍵結，形成磷酸二酯鍵結，鍵結於苯基之氧原子與反義鏈多核苷酸之5’末端鍵結，形成磷酸二酯鍵結。
此種單股多核苷酸之製造方法，只要可合成該單股多核苷酸，將無特別限制，不過可藉由例如上述M法中之M-1步驟(第8圖)及下述方法合成。
3-4-3-1.O法
O法之概要如第10圖所示。
3-4-3-1-1.O-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(9)，在脫酸劑存在下，與在酸性條件下可除去之保護化試藥(以二甲氧基三苯甲基氯化物為較佳)反應，得到將化合物(9)之羥基保護而成之化合物(10)之步驟。
就所使用之溶劑而言，只要不會阻害反應且可將起始物質以某種程度溶解即可，無特別限定，可列舉如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿之鹵化烴類；如乙醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷之醚類；如二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三 胺之醯胺類；如二甲基亞碸之亞碸類；如丙酮、甲基乙基酮之酮類；如吡啶之雜環胺類或如乙腈之腈類，較佳者可列舉雜環胺類(尤其是吡啶)。
就所使用之保護化試藥而言，可列舉氯化三苯甲基、氯化單甲氧基三苯甲基、氯化二甲氧基三苯甲基、氯化三甲氧基三苯甲基等鹵化三苯甲基類，不過以氯化單甲氧基三苯甲基、氯化二甲氧基三苯甲基為較佳。
就所使用之脫酸劑而言，只要不阻害反應，不將生成物及起始物質分解者即可，無特別限定，不過以如吡啶、二甲基胺基吡啶之芳香族胺類為較佳。
關於反應溫度及反應時間，雖隨所使用之保護化試藥或脫酸劑之種類而異，不過在使用氯化二甲氧基三苯甲基做為保護化試藥，使用吡啶兼做溶劑及脫酸劑之情況下，為於室溫2小時。
反應終了後，目的化合物可依照常法，從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適當地中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
3-4-3-1-2.O-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(10)之羧基與具有胺基之酚反應，形成具有醯胺鍵之化合物(11)之步驟。
就所使用之溶劑而言，只要為不會阻害反應者即可，無特別限定，可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類，以鹵化烴類(尤其是二氯甲烷)、醯胺類(尤其是二甲基甲醯胺)為較佳。
就所使用之酚而言，可列舉4-胺基酚、3-胺基酚，不過以4-胺基酚為較佳。
就所使用之醯胺形成試藥而言，可列舉如：N-羥基琥珀醯亞胺、1-羥基苯并三唑、N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺之N-羥基化合物類；如1,1’-草醯基二咪唑、N,N’-羰基二咪唑之二咪唑化合物類；如2,2’-二吡啶基二硫化物之二硫化物化合物類；如碳酸N,N’-二琥珀醯亞胺基酯之琥珀酸化合物類；如N,N’-雙(2-側氧基-3-唑啶基)次磷醯氯之次磷醯氯化合物類；如草酸N,N’-二琥珀醯亞胺基酯(DSO)、草酸N,N-二酞醯亞胺基酯(DPO)、草酸N,N’-雙(降冰片烯基琥珀醯亞胺基)酯(BNO)、草酸1,1’-雙(苯并三唑基)酯(BBTO)、草酸1,1’-雙(6-氯苯并三唑基)酯(BCTO)、草酸1,1’-雙(6-三氟甲基苯并三唑基)酯(BTBO)之草酸酯化合物類、二環己基碳化二亞胺(DCC) 、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(EDC)等碳化二亞胺類；以二咪唑化合物類、碳化二亞胺類(尤其是EDC)為較佳。
就反應補助試藥而言，亦可添加1-羥基苯并三唑(HOBT)。
反應溫度及反應時間隨所使用之醯胺形成試藥及溶劑之種類而異；例如在0℃至100℃下反應5至50小時，尤其是在二氯甲烷中使用4-胺基酚及EDC之情況，為於室溫反應18小時。
反應終了後，目的化合物可依照常法，從反應混合物中取得。例如，將反應混合物適當地中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，藉由餾去溶劑而得到。所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
3-4-3-2.P法
P法之概要如第10圖所示。圖中，n1、n2、m、及L1表示與上述相同者，具體而言，m表示0至4之整數，L1表示單鍵或-O-。
2-3-3-1 P-1a步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(12a)之胺基，與具有羧基之酚反應，形成具有醯胺鍵之化合物(13a)之步驟。
就所使用之酚而言，可列舉3-羥基苯基乙酸、4-羥 基苯基乙酸、3-(3-羥基苯基)丙酸、3-(4-羥基苯基)丙酸、4-(3-羥基苯基)纈草酸、4-(4-羥基苯基)纈草酸、3-羥基苯氧基乙酸、4-羥基苯氧基乙酸等；以3-(4-羥基苯基)丙酸為較佳。
本步驟可依照與O-2步驟同様之方法進行。
2-3-3-2 P-2a步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(13a)，在脫酸劑存在下，與在酸性條件下可除去之保護化試藥(較佳者為氯化二甲氧基三苯甲基)反應，得到將化合物(13a)之羥基保護而成之化合物(14a)之步驟。
本步驟可依照與O-1步驟同様之方法進行。
2-3-3-3 P-1b步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(12b)之胺基，與具有羧基之酚反應，形成具有醯胺鍵之化合物(13b)之步驟。
就所使用之酚而言，可列舉3-羥基苯基乙酸、4-羥基苯基乙酸、3-(3-羥基苯基)丙酸、3-(4-羥基苯基)丙酸、4-(3-羥基苯基)纈草酸、4-(4-羥基苯基)纈草酸、3-羥基苯氧基乙酸、4-羥基苯氧基乙酸等；不過以3-(4-羥基苯基)丙酸為較佳。
本步驟可依照與O-2步驟同様之方法進行。
2-3-3-4 P-2b步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(13b)，於脫酸劑存在下，與在酸性條件下可除去之保護化試藥(較佳者為氯化二甲氧基三苯甲基氯)反應，得到將化合物(13b)之羥 基保護而成之化合物(14b)之步驟。
本步驟可依照與O-1步驟同様之方法進行。
2-3-3-5 P-1c步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(12a)之胺基，與具有羧基之酚反應，形成具有醯胺鍵之化合物(13c)之步驟。
就所使用之酚而言，可列舉N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-酪胺酸。
本步驟可依照與O-2步驟同様之方法進行。
2-3-3-6 P-2c步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(13c)，於脫酸劑存在下，與在酸性條件下可除去之保護化試藥(較佳者為氯化二甲氧基三苯甲基)反應，得到將化合物(13c)之羥基保護而成之化合物(14c)之步驟。
本步驟可依照與O-1步驟同様之方法進行。
3-4-3-3.Q法
Q法之概要如第11圖所示。
3-4-3-3-1.Q-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(15)，於脫酸劑存在下，與在酸性條件下可除去之保護化試藥(較佳者為氯化單甲氧基三苯甲基)反應，得到將化合物(15)之羥基保護而成之化合物(16)之步驟。
本步驟可依照與O-1步驟同様之方法進行。
3-4-3-3-2.Q-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(16)之羧基，與 酪胺酸酯反應，形成具有醯胺鍵之化合物(17)之步驟。
就所使用之酪胺酸酯而言，可列舉酪胺酸甲酯、酪胺酸乙酯等，不過以酪胺酸乙酯為較佳。
本步驟可依照與O-2步驟同様之方法進行。
3-4-3-4.R法
R法之概要如第11圖所示。
3-4-3-4-1.R-1步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(18)之胺基，與胺基經t-Boc基保護之胺基酸(19)反應，形成具有醯胺鍵之化合物(20)之步驟。
就經t-Boc基保護之胺基酸種類而言，可列舉甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸、白胺酸、異白胺酸等，不過以甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸為較佳。
本步驟可依照與O-2步驟同様之方法進行。
3-4-3-4-2.R-2步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(20)與脫保護化試藥反應，得到將胺基之保護基選擇性地除去，製造化合物(21)之步驟。
就所使用之溶劑而言，較佳者可列舉：如苯、甲苯、二甲苯之芳香族烴類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類；如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、碳酸二乙酯之酯類；如乙醚、二異丙基醚、四氫呋喃、二烷、二甲氧基乙烷、二乙二醇二甲基醚之醚類；如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、三級丁醇、異戊醇、二乙 二醇、甘油、辛醇、環己醇、乙二醇甲醚之醇類；如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、異佛爾酮、環己酮之酮類；如硝基乙烷、硝基苯之硝基化合物類；如乙腈、異丁腈之腈類；如甲醯胺、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、六甲基磷醯三胺之醯胺類；如二甲基亞碸、環丁碸之亞碸類；更佳者為醇類(尤其甲醇、乙醇)或二氯甲烷，以及在使用乙酸做為脫保護化試藥之情況，為乙酸與水之混合液。
就所使用之脫保護化試藥而言，只要為通常所使用者即可，無特別限制，不過在保護基為t-Boc基之情況，可列舉，例如：乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸、鹽酸及如溴化鋅之路易士酸類；以乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸為較佳。
反應溫度雖隨所使用之試藥、原料、溶劑等而異，不過通常為-10℃至100℃，以0℃至50℃為較佳。
反應時間雖隨所使用之原料、溶劑、反應溫度等而異，不過通常為1分鐘至50小時，以1分鐘至24小時為較佳。
反應終了後，目的化合物依照常法，從反應混合物中取得。
3-4-3-4-3.R-3步驟
本步驟為在惰性溶劑中，使化合物(21)之胺基，與化合物(16)反應，形成具有醯胺鍵之化合物(22)之步驟。
本步驟可依照與O-2步驟同様之方法進行。
3-4-3-5.S法
S法之概要如第12圖所示。
3-4-3-5-1.S-1步驟
本步驟為將在O-2步驟中所製造之化合物(11)、在P-2a步驟中所製造之化合物(14a)、在P-2b步驟中所製造之化合物(14b)、在P-2c步驟中所製造之化合物(14c)、在Q-2步驟中所製造之化合物(17)、以及在R-3步驟中所製造之化合物(22)之酚(第12圖中以Tr1-O-X1-H表示；Tr表示羥基之保護基)之羥基與使用於amidite化之單取代-氯(烷氧基)膦類(在第12圖中，以R12-P(-O-R11)-Cl表示)或二取代-烷氧基膦類(在第12圖中，以(R12-)2P(-O-R11)表示)反應，製造化合物(23)之步驟。
Tr1只要為不會將核酸之保護基脫離，且可脫保護之羥基保護基即可，無特別限定，可列舉如：4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl group)、三苯甲基、乙醯丙醯基(levulinyl group)、雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基；以4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基為較佳。
就所使用之溶劑而言，只要不會對反應造成影響者即可，無特別限定；較佳者，可列舉：如四氫呋喃、二乙基醚、二烷之醚類；如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯、二氯苯之鹵化烴類。
就本步驟中之R11而言，可列舉2-氰基乙基、甲基、甲磺醯基乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基；以氰基乙基、甲基為較佳。
就本步驟中之R12而言，可列舉啉基、二異丙基胺 基、二乙基胺基、二甲基胺基；以二異丙基胺基為較佳。
就所使用之單取代-氯(烷氧基)膦類而言，可列舉：如氯(啉基)甲氧基膦、氯(啉基)氰基乙氧基膦、氯(二甲基胺基)甲氧基膦、氯(二甲基胺基)氰基乙氧基膦、氯(二異丙基胺基)甲氧基膦、氯(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦之膦類；以氯(啉基)甲氧基膦、氯(啉基)氰基乙氧基膦、氯(二異丙基胺基)甲氧基膦、氯(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦為較佳。
在使用單取代-氯(烷氧基)膦類之情況，可使用脫酸劑，在此種情況下，就所使用之脫酸劑而言，可列舉：如吡啶、二甲基胺基吡啶之雜環胺類；如三甲基胺、三乙基胺、二異丙基乙基胺之脂肪族胺類；以脂肪族胺類(尤其是二異丙基乙基胺)為較佳。
就所使用之二取代-烷氧基膦類而言，可列舉如雙(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦、雙(二乙基胺基)甲磺醯基乙氧基膦、雙(二異丙基胺基)(2,2,2-三氯乙氧基)膦、雙(二異丙基胺基)(4-氯苯基甲氧基)膦之膦類；以雙(二異丙基胺基)氰基乙氧基膦為較佳。
在使用二取代-烷氧基膦類之情況中，可使用酸，此種情況下，就所使用之酸而言，以四唑、乙酸或對甲苯磺酸為較佳。
反應溫度無特別限定，不過通常為0℃至80℃，以室溫為較佳。
反應時間雖隨所使用之原料、試藥、溫度等而異， 不過通常為5分鐘至30小時，在於室溫反應之情況，以30分鐘至10小時為較佳。
反應終了後，本反應之目的化合物(23)可藉由例如將反應混合物適當地中和，又，於存在不溶物之情況，藉由過濾除去後，添加如乙酸乙酯之與水不混合之有機溶劑，水洗後，將含有目的化合物之有機層分離，用無水硫酸鎂等乾燥後，餾去溶劑而得到。
所得到之目的化合物，若需要，可藉由常法如再結晶、再沉澱或層析法等進一步精製。
3-4-3-5-2.S-2步驟
本步驟為藉由使用DNA自動合成機之通常亞磷醯胺法，使在M-1中所製造之化合物(2)與在S-1中所製造之化合物(23)反應，製造化合物(24)之步驟(圖中，W2表示將5’-末端、及3’-末端之羥基去除保護而得之正義鏈多核苷酸，W1-Y表示將5’-末端、及3’-末端之羥基去除保護而得之反義鏈多核苷酸，Tr2表示羥基之保護基)。
Tr2只要為不會將核酸之保護基脫離，且可脫保護之羥基保護基即可，無特別限定，可列舉，例如，4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基、三苯甲基、乙醯丙醯基、雙(三甲基矽烷基氧基)(環己基氧基)矽烷基，較佳者為4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基。
藉由使用DNA自動合成機之通常亞磷醯胺法，製造化合物(24)。具有期望核苷酸序列之寡核苷酸類似物，可使用DNA合成機，例如PerkinElmer公司之藉由亞磷醯 胺法之模型392等，依據文獻(Nucleic Acids Research,12,4539(1984))所記載之方法而合成
又，依照期望，將寡核苷酸類似物進行硫代酯化之情況，除硫之外，可使用四乙基秋蘭姆二硫化物(TETD，Applied Biosystems公司)、Beaucage試藥、苯基乙醯基二硫化物/吡啶-乙腈(1：1(v/v))溶液(Ravikumar,V.T.et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.(2006)16,p.2513-2517)等試藥，依據文獻(Tetrahedron Letters,32,3005(1991)、J.Am.Chem.Soc.，112,1253(1990))所記載之方法，得到硫代酯衍生物。
3-4-3-5-3.S-3步驟
本步驟為將於S-2中所製造之化合物(24)從CPG切出，進行保護基之除去，製造最終化合物(25)之步驟(圖中，式中之W2’表示將5’-末端、及3’-末端之羥基除去而得之正義鏈多核苷酸，W1’-Y’表示將5’-末端、及3’-末端之羥基除去而得之反義鏈多核苷酸)。
就所使用之鹼而言，可列舉濃氨水、甲醇性氨、乙醇性氨、濃氨水-乙醇(3：1(V/V))混合液、濃氨水-40%甲基胺水溶液(1：1V/V)混合液、甲基胺、0.5M LiOH水溶液、3.5M三乙基胺/甲醇溶液之(1：10V/V)混合液；以濃氨水、濃氨水-乙醇混合液(3：1(V/V))為較佳。
反應溫度無特別限定，不過通常為-50℃至80℃，以室溫至60℃為較佳。
反應時間雖隨所使用之原料、試藥、溫度等而異，不過通常為5分鐘至30小時，在於60℃反應之情況，以5 小時為較佳。
反應終了後，藉由餾去溶劑而得到之化合物，在Tr2鍵結之情況，可藉由逆相層析法、離子交換層析法(包含高速液體層析法)等各種層析法等之精製操作進行精製。
Tr2為例如4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)氧雜蒽基(pixyl group)、三苯甲基等，在鹼性條件下不進行脫保護之情況，可以與C-2步驟同様之方法，於酸性條件下將Tr2脫保護。以80%乙酸水溶液為較佳。
可將含有以此種方式得到之化合物(25)之反應混合物，藉由逆相層析法、離子交換層析法(包含高速液體層析法)等各種層析法等通常用於核酸精製之精製操作進行精製，得到化合物(25)。
3-5.核酸脂質粒子之製造方法
本發明之核酸脂質粒子之製造方法，只要可製造核酸脂質粒子即可，無特別限制，不過可藉由例如薄膜法、逆相蒸發法、乙醇注入法、醚注入法、脫水-再水合法、界面活性劑透析法、水合法、冷凍熔解法等方法製造。更具體而言，可藉由下述之乙醇注入法製造。
使陽離子性脂質、兩親媒性脂質、PEG-脂質等疏水性物質溶於50~90%乙醇中。另一方面，將上述核酸等親水性物質溶於pH3~6之緩衝液中。
藉由將上述脂質乙醇溶液與核酸水溶液以1：20~1：1之體積比混合，形成脂質粒子，以及藉由帶負電荷之核酸與帶正電荷之陽離子性脂質之静電相互作用形成核 酸脂質粒子，而得到核酸脂質粒子之粗分散液。
又，在其他態様中，脂質乙醇溶液藉由與不含核酸之緩衝液混合，形成脂質粒子。然後，藉由混合核酸水溶液，亦可使核酸脂質粒子形成。
繼而，藉由限外過濾或透析等方法，使所得到之核酸脂質粒子之粗分散液中所含之乙醇及遊離核酸除去，可得到安定之核酸脂質粒子。
就此種核酸脂質之實例而言，可列舉：含有以選自下列(a)至(h)所構成群中之任一莫耳比所構成之構成成分的核酸脂質。
(a)兩親媒性脂質：固醇：陽離子性脂質：PEG-脂質=20：48：30：2、(b)兩親媒性脂質：固醇：陽離子性脂質：PEG-脂質=7.1：34.3：57.2：1.4、(c)兩親媒性脂質：固醇：陽離子性脂質：PEG-脂質=10：40：40：10、(d)兩親媒性脂質：固醇：陽離子性脂質：PEG-脂質=7.5：31.5：57.5：3.5、(e)兩親媒性脂質：固醇：陽離子性脂質：PEG-脂質=10：38.5：50：1.5、(f)兩親媒性脂質：固醇：陽離子性脂質：PEG-脂質=10：35：50：5、(g)兩親媒性脂質：固醇：陽離子性脂質：PEG-脂質=7.5：31：60：1.5、(h)兩親媒性脂質：固醇：陽離子性脂質：PEG-脂質 =7：33.5：57：2.5。
核酸脂質粒子中之核酸與脂質之重量比係以約0.01~0.3為較佳，以約0.02~0.15為更佳。
4.含有核酸脂質粒子之醫藥
本發明之核酸脂質粒子，只要對標的基因具有RNA干擾作用及/或基因抑制作用，即可做為醫藥品。
就醫藥品而言，只要為治療或預防標的基因表現所引起之疾病之醫藥品即可，無特別限定，不過較佳者可列舉抗腫瘤藥、抗生物質、免疫調節劑、抗炎症劑及作用於中樞神經系統之藥劑。
本發明之核酸脂質粒子，可單獨投與，或以與依照投與途徑及標準醫藥慣例所選出之生理學上容許之載劑(生理學食鹽水或磷酸緩衝液)之混合物投與。
一般而言，標準之生理食鹽水可做為藥學上容許之載劑使用。
其他較佳的載劑包含，例如，水、緩衝化水液、0.4%食鹽水、0.3%甘胺酸等，而且為了提高安定性，包含白蛋白、脂蛋白、球蛋白等糖蛋白質。
藥學上之載劑，一般而言可在粒子形成後添加。因此，粒子形成後，粒子可用如標準生理學食鹽水之藥學上容許之載劑稀釋。
醫藥調合物中粒子之濃度極廣，亦即以重量計，從小於約0.05%，至通常約2~5%，或至少2~5%，乃至約10~30%皆可；該濃度依照所選擇之具體投與方式，主要視液體之體積、粘度等來選擇。例如，將濃度提高，可 減小伴隨治療之液體負荷。此對於與粥樣性動脈硬化症相關之鬱血性心臟衰竭或重症高血壓之患者為特佳。或者，將由刺激性脂質所構成之粒子稀釋成低濃度，可減輕投與部位之炎症。
典型而言，核酸脂質粒子內之核酸濃度係以約1~20%為較佳，以約3~10%為更佳。
本發明之藥學組成物，亦可藉由通常周知之滅菌技術滅菌。水溶液依使用目的進行包裝，或者亦可於無菌條件下過濾並冷凍乾燥，冷凍乾燥製劑可在投與前與無菌水溶液合併。組成物可含有，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及氯化鈣等pH調節及緩衝劑，以及滲透壓調節劑等接近生理學狀態所必需之藥學上容許之補助物質。
此外，粒子懸浮液由於貯藏中之自由基及脂質之過氧化損傷，亦可含有保護脂質之脂質保護劑。以如α-生育酚等脂肪親和性自由基清除劑(quencher)、及如鐵草胺(ferrioxamine)之水溶性離子特異性螯合化劑為較佳。
在此等使用之其他例子中，核酸脂質粒子雖包含凝膠、油劑、乳劑等，不過不以此等為限，可組合入廣範圍之局部投與形式中。例如，含有核酸脂質粒子之懸浮液，可調配成局部用乳膏、糊劑、軟膏、凝膠、洗滌劑等而投與。
本發明之核酸脂質粒子在將核酸導入細胞內上為有用。因此，本發明亦提供將核酸(例如質體或siRNA)導入細胞內之方法。此方法首先如上述形成粒子，繼而藉由 將粒子與細胞接觸足以使核酸送達細胞內之充分時間，而在活體外或活體內實施。
本發明之核酸脂質粒子，可被與其混合或接觸之幾乎任何類型之細胞吸附。一旦吸附，粒子可藉由細胞部分內吞(endocytosis)，或將脂質與細胞膜交換，或與細胞融合之任一種來送達細胞內。
粒子之核酸部分之移送或取回，可依照此等途徑之任一種進行。尤其，在產生融合之情況，粒子膜被組入細胞膜內，粒子之內容物與細胞內液合併。
本發明之核酸脂質粒子在治療或預防參與或回應細胞或組織中標的基因表現程度之所有特徴、疾病或症狀上有用。就治療或預防之對象疾病而言，只要為標的基因表現引起之疾病即可，無特別限定，不過以癌症為較佳。本發明之核酸脂質粒子可投與至需要其之哺乳動物(以人類為較佳)。
本發明提供阻害或下調(down regulation)細胞或組織中標的基因之表現之方法。又，本發明提供：在標的基因為不轉譯成蛋白質之非編碼RNA之情況，阻害或下調非編碼RNA之表現之方法，再者，上調(up regulation)，或者視情況下調與該非編碼RNA相關之基因表現之方法。
[實施例]
以下，藉由實施例、參考例及試驗例更具體說明本發明，然而本發明不受此等限定。再者，在下述實施例中，基因操作所相關之各種操作，除非特別明示，否則 係依照「分子選殖(Molecular Cloning)」[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發行]所記載之方法進行，或者，在使用市售之試藥或套組之情況，係依照市售品之指示書而使用。
(參考例1) 2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙醇
將甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(0.983g，2.85mmol，WO2009/132131所記載之實施例1之化合物)、乙二醇(3.16mL，57mmol)於二烷(5mL)中回流6小時。讓反應液回到室溫，於減壓下餾去溶劑。用5%碳酸氫鈉水溶液及二氯甲烷進行萃取。將有機層用無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。藉由將殘餘物在矽膠管柱中用二氯甲烷精製，得到無色油狀之目的化合物(388mg、44%)。
1H-NMR(400MHz、CDCl3)δppm：5.42-5.30(4H,m),3.75-3.70(2H,m),3.54-3.52(2H,m),3.47(2H,t,J=7.0 Hz),2.79-2.72(2H,m),2.08-2.03(4H,m),1.95(1H,t,J=6.2 Hz),1.62-1.55(2H,m),1.39-1.26(16H,m),0.89(3H,t,J=6.9 Hz).EI-MS：310 M+。
(實施例1) 1,2-雙{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙氧基}-3-二甲基胺基丙烷(例示化合物1-1)
將參考例1中得到之化合物(379mg，1.22mmol)、三乙基胺(255μL，1.83mmol)溶解於二氯甲烷(5mL)，於冰 冷下滴入甲磺醯氯(141.6μL，1.83mmol)，攪拌2小時。添加5%碳酸氫鈉水溶液及二氯甲烷，進行萃取。將有機層用硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑，將甲磺醯化之化合物(甲磺酸2-亞麻氧基乙酯)使用於以下之反應。
將3-(二甲基胺基)-1,2-丙二醇(30mg，0.257mmol)及55%氫化鈉(NaH，51mg，1.285mmol)於甲苯(3mL)中回流1小時後，添加上述得到之甲磺醯化化合物(244mg，0.628mmol)，並將反應液回流3小時。讓反應液回到室溫，使用5%碳酸氫鈉水溶液及二氯甲烷，進行萃取。將有機層用無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物在矽膠管柱中藉由含有1~5%甲醇之二氯甲烷精製，得到無色油狀之目的化合物(47.1mg，26%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm：5.41-5.30(8H,m),3.81-3.51(11H,m),3.44(4H,t,J=6.9 Hz),2.79-2.72(4H,m),2.45(2H,m),2,31(6H,brs),2.16-2.02(8H,m),1.61-1.57(4H,m),1.39-1.26(32H,m),0.89(6H,t,J=6.9 Hz)
FAB-MAS(mNBA)：704(M+H)+。
(參考例2) 3-(氮雜環丁-1-基)丙-1,2-二醇
將200μL之縮水甘油(3.0mmol)及350mg之氮雜環丁烷(6mmol)溶解於7mL之水：二烷(2：5)中。添加5N氫氧化鈉水溶液3mL，於120℃加熱，攪拌3小時30分鐘後，冷卻至室溫，添加10mL之水，並以20mL之乙酸乙酯萃取3次。將約60mL之萃取液用無水硫酸鈉乾燥，過濾後， 使用蒸發器進行濃縮，得到無色油狀之目的化合物31.7mg(收率8%)。
1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δppm：1.82(s,3 H)2.03-2.15(m,1 H)2.28(dt,J=15.57,7.79 Hz,2 H)3.23-3.34(m,1 H)3.98(t,J=7.79 Hz,2 H)4.21(t,J=7.56 Hz,2 H)
MS(ESI+)m/z 132.1[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 132.10182[M+H]+(-0.64 mmu)。
(實施例2) 1-{2,3-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙基}氮雜環丁烷(例示化合物1-49)
從31.7mg之於參考例2中所得到之化合物及185mg之甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯，藉由與實施例1同様之方法，得到無色油狀之目的化合物71.1mg(收率47%)。
1H-NMR(400 MHz,CHLOROFORM-d)δppm：0.79-0.96(m,6 H)1.18-1.45(m,32 H)1.47-1.62(m,4 H)1.96-2.10(m,8 H)2.16(quin,J=7.33 Hz,2 H)2.55-2.65(m,1 H)2.65-2.73(m,1 H)2.77(t,J=6.41 Hz,4 H)3.26-3.69(m,11 H)5.10-5.59(m,8 H)
MS(ESI+)m/z 628.6[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 628.60318[M+H]+(-0.08 mmu)。
(參考例3) 1,4-脫水-5-O-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-2,3-二-O-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基-D-核糖醇
從100mg之1-去氧-5-單甲氧基三苯甲基-D-核糖(日本特開2000-302675之實施例18之(18a)所記載之化合物)及170mg之甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯，藉由與實施例1同様之方法，得到無色油狀之目的化合物42.9mg(收率19%)。
1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δppm：0.75-0.98(m,6 H)1.17-1.45(m,32 H)1.46-1.69(m,4 H)2.05(q,J=6.87 Hz,8 H)2.77(t,J=6.41 Hz,4 H)3.10(dd,J=10.08,4.12 Hz,1 H)3.29(dd,J=9.85,3.89 Hz,1 H)3.34-3.43(m,1 H)3.43-3.57(m,3 H)3.78(s,3 H)3.80-3.92(m,2 H)3.96(q,J=5.04 Hz,1 H)4.00-4.10(m,2 H)5.23-5.48(m,8 H)6.72-6.91(m,2 H)7.09-7.40(m,8 H)7.40-7.51(m,4 H)
MS(ESI+)m/z 925.7[M+Na]+
HRMS(ESI+)m/z 925.66808[M+Na]+(-0.52 mmu)。
(參考例4) 1,4-脫水-2,3-二-O-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基-D-核糖醇
將35mg之於參考例3中所得到之化合物溶解於3mL之5%乙酸/二氯甲烷溶液中，在室溫下攪拌5小時。添加10mL之水，並用10mL之乙酸乙酯萃取3次。
將所得到之約30mL之有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾後使用蒸發器進行濃縮。所得到之反應混合物藉由開放式層析分取，其中以5mL之矽膠做為固定層，用己烷：乙酸乙酯(5：1)展開，然後使用蒸發器進行濃縮。得 到無色油狀之目的化合物19.6mg(收率80%)。
1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δppm：0.84-0.94(m,6 H)1.20-1.44(m,30 H)1.53-1.66(m,4 H)1.74(br.s.,2 H)2.05(q,J=6.87 Hz,8 H)2.77(t,J=6.64 Hz,4 H)3.38-3.54(m,3 H)3.54-3.66(m,2 H)3.75-4.07(m,6 H)5.25-5.52(m,8 H)
MS(ESI+)m/z 653.6[M+Na]+
HRMS(ESI+)m/z 653.54821[M+Na]+(-0.27 mmu)。
(參考例5) 1,4-脫水-5-O-(甲基磺醯基)-2,3-二-O-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基-D-核糖醇
將17mg之於參考例4中所得到之化合物溶解於二氯甲烷中。添加10mg之甲磺酸酐及13.7μL之三乙基胺並攪拌。3日後進一步添加5mg之甲磺酸酐及7μL之三乙基胺，攪拌1小時30分鐘後，添加5mL之飽和氯化銨水溶液，並以5mL之乙酸乙酯萃取3次。將約15mL之有機層用無水硫酸鈉乾燥’過濾後使用蒸發器進行濃縮’得到無色油狀之目的化合物20.4mg(收率99%)。
1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δppm：0.89(t,J=6.64 Hz,6 H)1.24-1.44(m,30 H)1.55-1.65(m,4 H)1.72(br.s.,2 H)2.05(q,J=6.87 Hz,8 H)2.77(t,J=6.41 Hz,4 H)3.05(s,3 H)3.38-3.54(m,3 H)3.55-3.64(m,1 H)3.76(dd,J=7.79,4.58 Hz,1 H)3.89-4.02(m,3 H)4.08(dt,J=6.98,3.61 Hz,1 H)4.25-4.34(m,1 H)4.43(dd,J=11.45,2.29 Hz,1 H)5.20-5.53(m,8 H)。
(實施例3) 1,4-脫水-5-去氧-5-(二甲基胺基)-2,3-二-O-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基-D-核糖醇(例示化合物2-1)
將17.8mg之於參考例5中所得到之化合物溶解於10mL之2M二乙基胺之四氫呋喃溶液中，攪拌10日。將反應液使用蒸發器進行濃縮，並藉由開放式層析分取，其中使用1mL之矽膠，並以二氯甲烷：甲醇(20：1)展開，然後使用蒸發器進行濃縮。回收無色油狀原料，即於參考例5中所得到之化合物12mg；又，得到淡黃色油狀之反應生成物，即目的化合物1.6mg。
1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δppm：0.89(t,6 H)1.17-1.45(m,30 H)1.49-1.69(m,6 H)1.98-2.13(m,8 H)2.32(s,6 H)2.44-2.58(m,2 H)2.77(t,J=6.41 Hz,4 H)3.37-3.54(m,4 H)3.53-3.64(m,1 H)3.81-3.86(m,1 H)3.86-3.93(m,1 H)3.94-4.05(m,2 H)5.23-5.44(m,8 H)
MS(ESI+)m/z 658.6[M+Na]+
HRMS(ESI+)m/z 658.61430[M+Na]+(0.48 mmu)。
(參考例7) 3,3-雙{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}-氮雜環丁烷-1-羧酸三級丁酯
將3,3-雙(羥基甲基)氮雜環丁烷-1-羧酸三級丁酯(J.Med.Chem.(2008)51,p.948-956，80mg，0.368mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(70mg，1.84mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(320mg，0.929mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管 柱層析(二氯甲烷)精製，得到呈油狀物質之目的化合物(165mg，63%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm：5.42-5.29(8H,m),3.66(4H,s),3.49(4H,s),3.42(4H,t,J=7.0 Hz),2.77(4H,t,J=6.7 Hz),2.05(8H,dt,J=7.0,7.0 Hz),1.57-1.25(36H,m),1.43(9H,s),0.89(6H,t,J=6.7 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：714(M+H)+。
(實施例4) 1-甲基-3,3-雙{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}-氮雜環丁烷(例示化合物4-1)
將於參考例7中所得到之化合物(160mg，0.244mmol)溶解於無水THF(8mL)中，使用氫化鋁鋰(25mg，0.659mmol)，以與參考例8同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=50：3)精製，得到呈油狀物質之目的化合物(109mg，78%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm：5.43-5.29(8H,m),3.50(4H,s),3.43(4H,t,J=6.3 Hz),3.11(4H，s),2.77(4H,t,J=6.7 Hz),2.33(3H,s),2.05(8H,dt,J=7.0,7.0 Hz),1.57-1.25(36H,m),0.89(6H,t,J=6.7 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：628(M+H)+。
(參考例8) (3R,4S)-3,4-雙(羥基甲基)-吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將氫化鋁鋰(50mg，1.32mmol)溶解於無水THF(3mL)中，冷卻至0℃。氮氣流下，添加順式-1-苯甲基-3,4-吡咯啶二羧酸二甲酯(Chem.Pharm.Bull(1985)33,2762- 2766，370mg，1.33mmol)之THF(2mL)溶液，升溫至室溫，攪拌一夜。再者，由於反應尚未終了，添加氫化鋁鋰(100mg，2.64mmol)，再於室溫攪拌一夜。反應終了後，冷卻至0℃，依序添加水(1mL)、5N氫氧化鈉水溶液(1mL)、水(3mL)，攪拌3小時後將不溶物用矽藻土過濾。將殘餘物濃縮，並藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=4：1)精製，得到油狀物質(345mg)。將所得到之油狀物質溶解於甲醇(3mL)中，在氮氣流下添加10%碳鈀觸媒(340mg)，並在氫氣流下於室溫中攪拌一夜。反應終了後，將觸媒用矽藻土過濾，並將殘餘物濃縮，得到油狀物質(215mg)。此物不進行以上之精製，直接使用於以下之反應。將上述得到之化合物(1.32mmol)及二碳酸二-三級丁酯(700mg，3.21mmol)溶解於甲醇(3mL)中，添加三乙基胺(550μl，3.95mmol)，並於室溫攪拌二日。將反應液濃縮，並用矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=9：1)精製，得到呈油狀物質之目的化合物(167mg，48%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm：3.82-3.68(4H,m),3.51-3.41(2H,m),3.24-3.11(2H,m),2.61-2.48(2H,m),1.45(9H,s).
FAB-MAS(mNBA)：232(M+H)+。
(參考例9) (3R,4S)-3,4-雙{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}-吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將於參考例8中所得到之化合物(100mg，0.432mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(80mg，2.10mmol) 、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(372mg，1.08mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到呈油狀物質之目的化合物(181mg，57%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm：5.43-5.28(8H,m),3.51-3.21(12H,m),2.77(4H,t,J=6.7 Hz),2.56-2.45(2H,m),2.05(8H,dt,J=7.0,7.0 Hz),1.57-1.25(36H,m),1.46(9H,s),0.89(6H,t,J=6.7 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：726(M-H)+。
(實施例5) (3R,4S)-1-甲基-3,4-雙{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}吡咯啶(例示化合物4-3)
將於參考例9中所得到之化合物(170mg，0.233mmol)溶解於無水THF(8mL)中，使用氫化鋁鋰(27mg，0.711mmol)，以與實施例5同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=50：3)精製，得到呈油狀物質之目的化合物(110mg，73%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm：5.43-5.28(8H,m),3.53-3.48(2H,m),3.40-3.32(2H,m),3.37(4H,t,J=6.7 Hz),2.93-2.87(2H,m),2.77(4H,t,J=6.7 Hz),2.61-2.52(2H,m),2.34(3H,s),2.28-2.22(1H,m),2.05(8H,dt,J=7.0,7.0 Hz),1.57-1.25(36H,m),0.89(6H,t,J=6.7 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：642(M+H)+。
(參考例10) (4R,5S)-2,2-二甲基-4,5-雙{[(9Z,12Z)-十八碳-9.12-二烯-1-基氧基]甲基}-1,3-二氧雜環戊烷
將(4R,5S)-2,2-二甲基-1,3-二氧雜環戊-4,5-二基]二甲醇(1.0g，6.17mmol)溶解於無水甲苯(43mL)中，使用氫化鈉(1.64g，43.16mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(4.89g，14.18mmol)，以與實施例1同様之方式得到呈無色油狀物質之目的物(2.27g，73%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm：0.88(6H,t,J=6.3 Hz),1.23-1.62(36H,m),1.56(6H,s),2.05(8H,t,J=6.8 Hz),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),3.37-3.57(8H,m),4.31(2H,br),5.29-5.42(8H,m)。
(參考例11) (2R,3S)-1,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-2,3-二醇
在於參考例10中所得到之化合物(3.3g，5.01mmol)之乙醇(80mL)溶液中，添加1N鹽酸(6mL)，並於80℃反應4.8小時。於減壓下餾去溶劑，藉由施行矽膠管柱層析得到呈白色固體之目的物(2.27g，73%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm：0.88(6H,t,J=6.3 Hz),1.23-1.60(36H,m),2.05(8H,t,J=6.8 Hz),2.74-2.76(2H,m),2.78(4H,t,J=6.8 Hz),3.48(4H,t,J=6.8Hz),3.57-3.61(4H,m),3.77(2H,br),5.29-5.42(8H,m)。
(實施例6) 4-(二甲基胺基)-丁酸(1S,2R)-2-羥基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12,-二烯-1-基氧基]-1-{[(9Z,12Z)-十八碳-9.12-二 烯-1-基氧基]甲基}丙酯及其鏡像體(例示化合物3-3)
在於參考例11中所得到之化合物(0.10g，0.16mmol)、4-(二甲基胺基)丁酸鹽酸鹽(0.07g，0.40mmol)及三乙基胺(0.04g，0.42mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.08g，0.42mmol)，於室溫攪拌5分鐘後，添加4-二甲基胺基吡啶(3.9mg，0.03mmol)，並於室溫反應19小時。於減壓下餾去溶劑，並藉由施行矽膠管柱層析得到呈淡黃色油狀物質之目的物。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm：0.89(6H,t,J=6.3 Hz),1.24-1.59(36H,m),1.75-1.85(2H,m),2.05(4H,dt,J=6.8,7.3 Hz),2.21(6H,s),2.29(2H,t,J=6.8 Hz),2.38(2H,t,J=7.3 Hz),2.76(4H,t,J=6.8 Hz),3.38-3.48(6H,m),3.65(1H,dd,J=3.9,10.7 Hz),3.74(1H,dd,J=4.9,10.7 Hz),4.00(1H,ddd,J=3.9,5.9,6.3 Hz),5.02(1H,ddd,J=3.9,4.9,5.9 Hz),5.29-5.41(8H,m).
MS(ESI+)m/z 732[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 732.65115(0.55mmu)。
(參考例12) 3-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]-N,N-二甲基-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺
將1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-二甲基胺基-2-丙醇(美國專利US7,404,969號之實施例14之(5)所記載之化合物：1.00g，2.37mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(23mg，6.04mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八 碳-9,12-二烯-1-基酯(1.00g，2.90mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀之目的物(1.24g，78%)。
1H-NMR(CDCl3)δppm：7.46(2H,d,J=7.3 Hz),7.35(4H,d,J=7.8 Hz),7.27(2H,t,J=7.3 Hz),7.19(1H,t,J=7.3 Hz),6.81(4H,d,J=9.3 Hz),5.42-5.30(4H,m),3.78(6H,s),3.59-3.41(3H,m),3.13(2H,d,J=4.9 Hz),2.77(2H,t,J=6.3 Hz),2.44-2.38(2H,m),2.22(6H,s),2.09-1.99(4H,m),1.56(2H,tt,J=7.8,6.8 Hz)，1.40-1.22(11H,m),0.89(3H,t,J=7.0 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：670(M+H)+。
(參考例13) 3-(二甲基胺基)-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-醇
將在參考例12中所得到之化合物(1.24g，1.85mmol)溶解於80%乙酸溶液(7mL)中，在60℃攪拌10分鐘後，添加飽和碳酸氫鈉，並以二氯甲烷萃取。藉由減壓濃縮餾去溶劑後，以矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=30：1)精製，得到油狀之目的物(510mg，75%)。
1H-NMR(CDCl3)δppm：5.43-5.28(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.72-3.41(4H,m),2.77(2H,t,J=6.7 Hz),2.61-2.50(2H,m),2.29(6H,s),2.04(4H,q,J=7.4 Hz),1.54(2H,tt,J=7.4,6.7 Hz),1.40-1.22(16H,m),0.89(3H,t,J=7.0Hz).FAB-MAS(mNBA)：368(M+H)+。
(實施例7) N,N-二甲基-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙氧基}丙-1-胺(例示化合物1-3)
將於參考例13中所得到之化合物(80.0mg，0.216mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(20.0mg，0.525mmol)、於實施例1中所記載之甲磺酸2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙酯(100mg，0.257mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀之目的物(32.3mg，23%)。
1H-NMR(CDCl3)δppm：5.43-5.28(8H,m),3.66-3.41(11H,m),2.77(4H,t,J=7.0 Hz),2.50-2.35(2H,m),2.28(6H,s),2.05(8H,dt,J=6.7,6.7 Hz),1.62-1.51(4H,m),1.40-1.22(32H,m),0.89(6H,t,J=7.0 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：660(M+H)+。
(參考例14) (4R,5R)-2,2-二甲基-4,5-雙{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}-1,3-二氧雜環戊烷
將(-)-2,3-O-亞異丙基-D-蘇糖醇(0.5g，3.08mmol)溶解於無水甲苯(21mL)中，使用甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(2.44g，7.09mmol)、氫化鈉(0.82g，21.58mmol)，以與實施例1同様之方式合成，得到含有目的物之無色油狀物質(1.96g)。
(參考例15) (2R,3R)-1,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-2,3-二醇
在含有參考例14中所得到之化合物之混合物(1.96g)的乙醇(40mL)溶液中，添加1N鹽酸(3mL)，於80℃反應4.75小時後，減壓餾去揮發成分，並藉由施行矽膠管柱層析，得到為無色液體之目的物(1.63g，89%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm：0.90(6H,t,J=6.8 Hz),1.23-1.61(36H,m),2.02-2.09(8H,m),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),2.85(2H,d,J=4.4 Hz),3.48(4H,dt,J=9.8,3.4 Hz),3.56(2H,dd,J=5.4,9.8 Hz),3.59(2H,dd,J=4.4,9.8 Hz),3.80-3.85(2H,m),5.29-5.42(8H,m)。
(實施例8) 4-(二甲基胺基)丁酸(1R,2R)-2-羥基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙酯(例示化合物3-3)
在參考例15中所得到之化合物(100mg，0.16mmol)、4-(二甲基胺基)丁酸鹽酸鹽(32mg，0.19mmol)及三乙基胺(21mg，0.21mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(40mg，0.21mmol)及3mmol/g之由聚苯乙烯支撐之N,N-二甲基胺基吡啶(5mg)，於室溫反應67小時後，於減壓餾去揮發成分，藉由施行矽膠管柱層析得到為淡黃色液體之目的物(44mg，37%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm：0.89(6H,t,J=6.8 Hz),1.24-1.59(36H,m),1.88(2H,quint,J=7.3 Hz),2.05(8H,q,J=6.8 Hz),2.31(6H,s),2.40-2.47(4H,m),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),3.36-3.50(6H,m),3.61(1H,q,J=5.4 Hz),3.66(1H,dd,J=4.4,10.7 Hz),3.97-4.01(1H,m),5.10(1H,q,J=4.4 Hz),5.29-5.41(8H,m).
MS(FAB+)m/z 732[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 732.64991(-0.69mmu)。
(參考例16) (4S,5S)-2,2-二甲基-4,5-雙{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}-1,3-二氧雜環戊烷
將(+)-2,3-O-亞異丙基-L-蘇糖醇(0.5g，3.08mmol)溶解於無水甲苯(21mL)中，使用甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(2.44g，7.09mmol)、氫化鈉(0.82g，21.58mmol)，以與實施例1同様之方式合成，得到含有目的物之無色油狀物質(1.96g)。
(參考例17) (2S,3S)-1,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-2,3-二醇
在含有於參考例16中所得到之化合物之混合物(1.96g)之乙醇(60mL)溶液中，添加1N鹽酸(2mL)，於80℃反應2.5小時後，追加1N鹽酸(2.5mL)，再於80℃反應2.5小時。減壓餾去揮發成分，藉由施行矽膠管柱層析，得到呈無色液體之目的物(1.47g，80%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm：0.90(6H,t,J=6.8 Hz),1.23-1.61(36H,m),2.02-2.09(8H,m),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),2.85(2H,d,J=4.4 Hz),3.48(4H,dt,J=9.8,3.4 Hz),3.56(2H,dd,J=5.4,9.8 Hz),3.59(2H,dd,J=4.4,9.8 Hz),3.80-3.85(2H,m),5.29-5.42(8H,m)。
(實施例9) 4-(二甲基胺基)丁酸(1S,2S)-2-羥基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙酯(例示化合物3-3)
在參考例17中所得到之化合物(100mg，0.16mmol)、4-(二甲基胺基)丁酸鹽酸鹽(32mg，0.19mmol)及三乙基胺(21mg，0.21mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(40mg，0.21mmol)及3mmol/g之由聚苯乙烯支撐之N,N-二甲基胺基吡啶(5mg)，於室溫反應67小時後，於減壓餾去揮發成分，藉由施行矽膠管柱層析，得到呈淡黃色液體之目的物(55mg，46%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δppm：0.89(6H,t,J=6.8 Hz),1.24-1.59(36H,m),1.88(2H,quint,J=7.3 Hz),2.05(8H,q,J=6.8 Hz),2.31(6H,s),2.40-2.47(4H,m),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),3.36-3.50(6H,m),3.61(1H,q,J=5.4 Hz),3.66(1H,dd,J=4.4,10.7 Hz),3.97-4.01(1H,m),5.10(1H,q,J=4.4 Hz),5.29-5.41(8H,m).
MS(FAB+)m/z 732[M+H]+
HRMS(ESI+)m/z 732.65045(-0.15mmu)。
(參考例18) 甲磺酸2-(四氫-2H-吡喃-2-基氧基)乙酯
將2-(四氫-2H-吡喃-2-基氧基)乙醇(2.0g，13.7mmol)溶解於二氯甲烷(20mL)中，並冰冷。添加甲磺醯氯(1.60mL，20.7mmol)、三乙基胺(2.9mL，20.8mmol)，升 溫至室溫，攪拌1小時。反應終了後，添加飽和氫氧化鈉水溶液，並以二氯甲烷萃取。藉由減壓濃縮餾去溶劑後，藉由矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=1：1)精製，得到油狀之目的物(3.28g)。
1H-NMR(CDCl3)δppm：4.66(1H,t,J=3.5 Hz),4.42(2H,t,J=4.7 Hz),4.02-3.95(1H,m),3.90-3.82(1H,m),3.76-3.69(1H,m),3.57-3.50(1H,m),3.08(3H,s),1.87-1.69(2H,m),1.67-1.49(4H,m).
FAB-MAS(mNBA)：225(M+H)+。
(參考例19) 3-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]-N,N-二甲基-2-[2-(四氫-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基]丙-1-胺
將1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-二甲基胺基-2-丙醇(特表2008-530215記載之化合物(5)：360mg，0.854mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(80.0mg，2.10mmol)、參考例18中所得到之化合物(400mg，1.78mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀之目的物(196mg，42%)。
1H-NMR(CDCl3)δppm：7.46(2H,d,J=7.4 Hz),7.35(4H,d,J=7.8 Hz),7.28(2H,t,J=7.8 Hz),7.20(1H,t,J=7.8 Hz),6.82(4H,d,J=9.0 Hz),3.89-3.43(5H,m),3.79(6H,s),3.22-3.09(2H,m),2.53-2.33(2H,m),2.23(6H,s),1.85-1.42(6H,m).
FAB-MAS(mNBA)：550(M+H)+。
(參考例20) 3-(二甲基胺基)-2-(2-羥基乙氧基)丙-1-醇
在參考例19中所得到之化合物(190mg，0.346mmol)中添加1N鹽酸乙醇溶液(3mL)。5分鐘後將反應液減壓濃縮，將殘餘物用乙醚、己烷洗淨後，溶解於甲醇(2mL)中。添加MP-碳酸鹽(2.98mmol/g，1.16g，3.46mmol)，攪拌10分鐘後過濾，將殘餘物減壓濃縮，得到油狀之目的化合物(34.1mg，60%)。
1H-NMR(CD3OD)δppm：3.87-3.71(5H,m),3.63-3.54(2H,m),3.42-3.22(2H,m),2.96(3H,s),2.92(3H,s).FAB-MAS(mNBA)：164(M+H)+。
(實施例12) N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-2-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙氧基}丙-1-胺(例示化合物1-2)
將參考例20中得到之化合物(32.0mg，0.196mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(38.8mg，1.02mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(190mg，0.489mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=15：1)精製，得到油狀之目的物(32.3mg，23%)。
1H-NMR(CDCl3)δppm：5.43-5.28(8H,m),3.82-3.38(11H,m),2.77(4H,t,J=6.7 Hz),2.43(2H,d,J=5.1 Hz),2.29(6H,s),2.05(8H,dt,J=7.0,6.7 Hz),1.61-1.50(4H,m),1.40-1.22(32H,m),0.89(6H,t,J=7.0 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：660(M+H)+。
(參考例21) 3,3-雙(羥基甲基)吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將WO2005/26165記載之化合物(吡咯啶-3,3-二基二甲醇，44.2mg，0.332mmol)及二碳酸二-三級丁酯(145mg，0.664mmol)溶解於甲醇(3mL)中，添加三乙基胺(115μL，0.825mmol)，於室溫攪拌一整夜。將反應液濃縮，並以矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=9：1)精製，得到油狀物質(45.4mg，59%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：3.71(4H,br s),3.49-3.35(2H,m),3.27(2H,s),1.83-1.70(2H,m),1.46(9H,s).
FAB-MAS(mNBA)：232(M+H)+。
(參考例22) 3,3-雙{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將參考例21中得到之化合物(45.4mg，0.196mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(45.0mg，1.18mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(202mg，0.586mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀物質(35.6mg，25%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.45-5.28(8H,m),3.46-3.14(12H,m),2.77(4H,t,J=6.3 Hz),2.05(8H,dt,J=7.0,7.0 Hz),1.76(2H,dd,J=8.2,16.0 Hz),1.59-1.49(4H,m),1.45(9H,s),1.40-1.22(32H,m),0.89(6H,t,J=7.0 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：728(M+H)+。
(實施例13) 1-甲基-3,3-雙{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}吡咯啶(例示化合物4-2)
將於參考例22中所得到之化合物(52.0mg，0.0714mmol)溶解於無水THF(3mL)中，使用氫化鋁鋰(13mg，0.343mmol)，以與實施例5同樣之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=50：3)精製，得到油狀物質(21.7mg，47%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.28(8H,m),3.50-3.33(8H，m),3.16-2.85(2H,br m),2.77(4H,t,J=6.3 Hz),2.66(3H,br s),2.05(8H,dt,J=6.3,7.0 Hz),1.98-1.86(2H,m),1.53(4H,tt,J=7.0,7.0 Hz),1.41-1.22(32H,m),0.89(6H,t,J=7.4 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：642(M+H)+。
(參考例23) 1-苯甲基-3-(羥基甲基)吡咯啶-3-醇
將在Bioorg.Med.Chem.Lett.(1997)7,515-520中所記載之化合物6(4.0g，21.1mmol)懸浮於水(200mL)中，添加濃硫酸(3.5ml)，並於室溫攪拌2日。添加碳酸鉀使反應終了，以乙酸乙酯萃取，並以無水硫酸鎂乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物以矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=5：1)精製，得到油狀物質(1.54g，36%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.41-7.23(5H,m),3.68-3.45(4H,m),2.90-2.79(1H,m),2.65(1H,d,J=9.4 Hz),2.53-2.40(4H,m),1.98-1.88(1H,m),1.87-1.75(1H,m).
FAB-MAS(mNBA)：208(M+H)+。
(參考例24) 3-(羥基甲基)吡咯啶-3-醇
將於參考例23中所得到之化合物(1.53g，7.38mmol)溶解於甲醇(3mL)中，在氮氣流下添加10%碳鈀觸媒(1.53g)，在氫氣流下於室溫攪拌2日。反應終了後，將觸媒以矽藻土過濾。於減壓下餾去溶劑，得到油狀物質(865mg，quant.)。其未進行以上之精製，直接使用於以下之反應。
(參考例25) 3-羥基-3-(羥基甲基)吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將於參考例24中所得到之化合物(865mg，7.38mmol)及二碳酸二-三級丁酯(3.22g，14.8mmol)溶解於甲醇(10mL)中，添加三乙基胺(2.60mL，18.7mmol)，於室溫攪拌一整夜。將反應液濃縮，並藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=9：1)精製，得到油狀物質(1.40g，88%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：3.65(2H,dd,J=2.3,5.5 Hz),3.59-3.30(2H,m),3.36(2H,br s),2.89-2.34(2H,m),1.97-1.81(2H,m),1.46(9H,s).
FAB-MAS(mNBA)：218(M+H)+。
(參考例26) 3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將於參考例25中所得到之化合物(100mg，0.460 mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(90.0mg，2.36mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(400mg，1.16mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀物質(102mg，31%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.47-5.24(9H,m),3.55-3.26(10H,m),2.77(4H,t,J=7.0 Hz),2.05(8H,q,J=6.6 Hz),2.00-1.83(2H,m),1.58-1.48(4H,m),1.45(9H,s),1.40-1.24(32H,m),0.89(6H,t,J=6.6 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：715(M+H)+。
(實施例14) 1-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}吡咯啶(例示化合物4-8)
將於參考例26中所得到之化合物(95.0mg，0.133mmol)溶解於無水THF(3mL)中，使用氫化鋁鋰(15mg，0.395mmol)，以與實施例5同樣之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=50：3)精製，得到油狀物質(52.7mg，63%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.45-5.28(8H,m),3.51-3.35(6H,m),2.78(4H,t,J=6.6 Hz),2.76-2.53(4H,m),2.36(3H,br s),2.05(8H,q,J=7.4 Hz),1.98-1.75(2H,m),1.55(4H,tt,J=7.0,11.7 Hz),1.41-1.21(32H,m),0.89(6H,t,J=6.6 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：628(M+H)+。
(參考例27) (4R)-1-苯甲基-4-[(1S)-1,2-雙(苯甲基氧基)乙基]吡咯啶-2-酮
在(R)-4-((S)-1-羥基-2-三異丙基矽烷氧基乙基)吡咯啶-2-酮(即於WO2005/026154之實施例7步驟5記載之化合物，1.05g，3.48mmol)之四氫呋喃(20mL)溶液中，在氮氣環境下，於0℃添加氟化四丁基銨之四氫呋喃溶液(1M，4.18mL，4.18mmol)，於室溫攪拌3小時。在反應混合物中添加苄基溴(2.48mL，20.9mmol)及碘化四丁基銨(322mg，0.87mmol)，冷卻至0℃後，添加60%氫化鈉(975mg，24.4mmol)，加熱回流3小時。將反應混合物減壓濃縮後，於殘餘物中添加乙酸乙酯，並依飽和氯化銨水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水之順序洗淨。將有機層以無水硫酸鈉乾燥，過濾後，將濾液減壓濃縮，將得到之殘餘物付諸於中壓矽膠管柱層析。將從己烷：乙酸乙酯=3：2溶出部分得到之餾分減壓濃縮，得到目的化合物(1.22g，2.94mmol，84%)。
1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ：2.43-2.50(2H,m),2.57-2.67(1H,m),2.97-3.03(1H,m),3.13-3.20(1H,m),3.40-3.53(3H,m),4.38(2H,s),4.43(1H,d,J=12.2 Hz),4.46(2H,s),4.68(1H,d,J=12.2 Hz),7.13-7.33(15H,m)。
(參考例28) (3R)-1-苯甲基-3-[(1S)-1,2-雙(苯甲基氧基)乙基]吡咯啶
在參考例27中得到之化合物(1.22g，2.94mmol)之四 氫呋喃(30mL)溶液中，在氮氣環境下，於0℃添加氫化鋰鋁之四氫呋喃溶液(1M，6.24mL，6.24mmol)，並加熱回流2小時。將反應混合物冷卻至0℃後，於殘餘物中添加水(0.35mL)、1N氫氧化鈉水溶液(0.95mL)、繼而乙醚(30mL)，在室溫攪拌1小時。用矽藻土除去析出物後，將濾液減壓濃縮，將得到之殘餘物付諸於鹼性矽膠管柱層析。將從己烷：乙酸乙酯=9：1溶出部分得到之餾分減壓濃縮，得到目的化合物(1.07g，2.66mmol，91%)。
1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ：1.71-1.80(1H,m),1.91-2.00(1H,m),2.14-2.22(1H,m),2.37-2.52(2H,m),2.63-2.73(2H,m),3.46-3.61(5H,s),4.51(1H,d,J=12.2 Hz),4.54(1H,d,J=12.2 Hz),4.56(1H,d,J=11.7 Hz),4.77(1H,d,J=11.7 Hz),7.20-7.36(15H,m)。
(參考例29) (1S)-1-[(3R)-吡咯啶-3-基]乙-1,2-二醇
在參考例28中得到之化合物(1.07g，2.66mmol)之甲醇(30mL)溶液中，添加20%氫氧化鈀-碳觸媒(400mg)，在氫氣環境下，於50℃攪拌4小時。將反應混合物冷卻至室溫後，以矽藻土除去觸媒，並將濾液減壓濃縮。將得到之殘餘物溶解於乙醇(30mL)中，添加20%氫氧化鈀-碳觸媒(400mg)，並在氫氣環境下，於60℃攪拌5小時。將反應混合物冷卻至室溫，用矽藻土除去觸媒後，將濾液減壓濃縮，得到目的化合物(350mg，2.66mmol，100%)。
1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ：1.64-1.74(1H,m),1.84-1.94(1H,m),2.14-2.24(1H,m),2.57-2.64(1H,m), 2.78-2.99(3H,m),3.39-3.54(3H,m)。
(參考例30) (3R)-3-[(1S)-1,2-二羥基乙基]吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將於參考例29中得到之化合物(100mg，0.762mmol)及二碳酸二-三級丁酯(317mg，1.45mmol)溶解於甲醇(3mL)中，添加三乙基胺(270μL，1.94mmol)，並於室溫攪拌一整夜。將反應液濃縮，並藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=9：1)精製，得到油狀物質(160mg，91%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：3.74-3.35(5H,m),3.32-3.17(1H,m),3.01(1H,t,J=10.2 Hz),2.47-2.31(1H,m),2.31-2.15(1H,m),2.15-1.90(2H,m),1.88-1.71(1H,m),1.45(9H,s).
FAB-MAS(mNBA)：232(M+H)+。
(參考例31) (3R)-3-{(1S)-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙基}吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將在參考例30中得到之化合物(92.7mg，0.400mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(76.0mg，2.00mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(345mg，1.00mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀物質(127mg，43%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.44-5.26(8H,m),3.67(1H,dt,J=6.3,8.6 Hz),3.54-3.33(7H,m),3.29-3.15(2H,m),3.02 (1H,q,J=10.6 Hz),2.77(4H,t,J=7.0 Hz),2.42-2.27(1H,m),2.10-1.96(9H,m),1.82-1.64(1H,m),1.61-1.48(4H,m),1.46(9H,s),1.40-1.23(32H,m),0.89(6H,t,J=6.7 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：726(M+H)+。
(實施例15) 1-甲基-(3R)-3-{(1S)-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙基}吡咯啶(例示化合物4-12)
將於參考例31中所得到之化合物(115mg，0.158mmol)溶解於無水THF(3mL)中，使用氫化鋁鋰(18mg，0.395mmol)，以與實施例5同樣之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=50：3)精製，得到油狀物質(39.5mg，39%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.27(8H,m),3.73-3.64(1H,m),3.47-3.34(5H,m),3.28-3.21(1H,m),2.77(4H,t,J=6.7 Hz),2.75-2.65(2H,m),2.48-2.36(2H,m),2.35(3H,br s),2.21(1H,t,J=8.6 Hz),2.05(8H,q,J=6.7 Hz),2.02-1.89(1H,m),1.80-1.70(1H,m),1.54(4H,tt,J=6.3,13.7 Hz),1.40-1.24(32H,m),0.89(6H,t,J=7.0 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：642(M+H)+。
(參考例33) (3R)-3-[(1R)-1,2-二羥基乙基]吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將1-吡咯啶-3R-基-乙-1R,2-二醇(WO2005/026154之 實施例7之化合物，100mg，0.762mmol)及二碳酸二-三級丁酯(317mg，1.45mmol)溶解於甲醇(3mL)中，添加三乙基胺(270μL，1.94mmol)，並於室溫攪拌一整夜。將反應液濃縮，並以矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=9：1)精製，得到油狀物質(142mg，81%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：3.80-3.66(1H,m),3.68-3.55(2H,m),3.57-3.41(2H,m),3.35-2.92(3H,m),2.68-2.41(1H,m),2.36-2.20(1H,m),1.95-1.81(1H,m),1.75-1.51(1H,m),1.46(9H,s).
FAB-MAS(mNBA)：232(M+H)+。
(參考例34) (3R)-3-{(1R)-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙基}吡咯啶-1-羧酸三級丁酯
將於參考例33中所得到之化合物(80.0mg，0.346mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(66.0mg，1.73mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(300mg，0.871mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀物質(132mg，52%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.28(8H,m),3.73-3.06(11H,m),2.77(4H,t,J=7.0 Hz),2.43-2.31(1H,m),2.05(8H,dt,J=7.0,6.6 Hz),1.91-1.81(1H,m),1.71-1.61(1H,m),1.60-1.48(4H,m),1.46(9H,s),1.41-1.23(32H,m),0.89(6H,t,J=6.6 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：726(M-H)+。
(實施例16) 1-甲基-(3R)-3-{(1R)-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙基}吡咯啶(例示化合物4-12)
將於參考例34中所得到之化合物(125mg，0.172mmol)溶解於無水THF(3mL)中，使用氫化鋁鋰(20.0mg，0.527mmol)，以與實施例5同樣之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=50：3)精製，得到油狀物質(42.5mg，39%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.28(8H,m),3.73-3.66(1H,m),3.53-3.34(6H,m),3.29-3.22(1H,m),2.77(4H,t,J=6.3 Hz),2.74-2.68(1H,m),2.65-2.56(1H,m),2.49-2.37(1H,m),2.35(3H,br s),2.05(8H,dt,J=6.3,7.0 Hz),1.96-1.84(1H,m),1.59-1.48(5H,m),1.40-1.22(32H,m),0.89(6H,t,J=6.6 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：642(M+H)+。
(參考例35) 3-(1,2-二羥基乙基)氮雜環丁烷-1-羧酸三級丁酯
將3-乙烯基氮雜環丁烷-1-羧酸三級丁酯(FOCUS製，商品編號FS007944，250mg，1.36mmol)溶解於丙酮(500μL)、乙腈(500μL)、水(500μL)之混合溶劑中，添加N-甲基啉-N-氧化物(240mg，2.05mmol)、微膠囊化氧化鋨(136mg，4mol%)，並於室溫攪拌一整夜。將觸媒過濾後，於減壓下餾去溶劑，殘餘物藉由矽膠管柱層析( 二氯甲烷：甲醇=50：1)精製，得到油狀物質(293mg，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：4.02-3.89(3H,m),3.89-3.82(1H,m),3.75-3.69(2H,m),3.64(1H,dd,J=2.4,10.3 Hz),3.47-3.39(1H,m),2.61(1H,dt,J=8.3,13.2 Hz),2.47-2.37(2H,br m),2.29(1H,s),1.44(9H,s).
FAB-MAS(mNBA)：218(M+H)+。
(參考例36) 3-{1,2-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙基}氮雜環丁烷-1-羧酸三級丁酯
將於參考例35中所得到之化合物(100mg，0.460mmol)溶解於無水甲苯(3mL)中，使用氫化鈉(88.0mg，2.31mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(400mg，1.16mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀物質(143mg，43%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.29(8H,m),3.93(2H,q,J=8.2 Hz),3.87-3.80(1H,m),3.74-3.64(2H,m),3.52-3.31(6H,m),2.77(4H,t,J=6.3 Hz),2.74-2.63(1H,m),2.05(8H,dt,J=6.3,6.6 Hz),1.60-1.48(4H,m),1.44(9H,s),1.39-1.23(32H,m),0.89(6H,t,J=7.0 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：736(M+Na)+。
(實施例17) 1-甲基-3-{1,2-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙基}氮雜環丁烷(例示化合物4-11)
將於參考例36中得到之化合物(138mg，0.193mmol)溶解於無水THF(3mL)中，使用氫化鋁鋰(22.0mg，0.580mmol)，以與實施例5同樣之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=25：1)精製，得到油狀物質(92.1mg，76%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.44-5.29(8H,m),3.68-3.61(1H,m),3.53-3.30(8H,m),3.02(1H,t,J=6.8 Hz),2.91(1H,t,J=6.8 Hz),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),2.61(1H,dt,J=7.8,14.6 Hz),2.29(3H,s),2.05(8H,q,J=6.8 Hz),1.54(4H,tt,J=5.9,12.2 Hz),1.40-1.24(30H,m),0.89(6H,t,J=6.8 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：628(M+H)+。
(參考例37) 4-(烯丙氧基)丁-1,3-二醇 2-(烯丙氧基)丁-1,4-二醇
在冷卻至0℃之1,2,4-丁三醇(2.00g，18.85mmol)及咪唑(3.21g，47.12mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(29.2mL)溶液中，經1小時滴入三級丁基二甲基氯矽烷(5.86g，37.69mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(17.5mL)溶液。於室溫攪拌21.5小時後，用冰水處理，藉由己烷-乙酸乙酯進行萃取，將有機層用無水硫酸鎂乾燥後，於減壓下餾去溶劑。得到之殘餘物藉由矽膠層析精製，得到無色油狀物質(5.39g，86%)。
在氫化鈉(63%)礦油分散物(0.67g，17.72mmol)之四氫呋喃(30mL)溶液中，添加所得到之油狀物質(5.39g)後 ，添加烯丙基溴(2.14g，17.72mmol)。於65℃攪拌2.5小時後，用水處理，並於減壓下除去揮發成分。將得到之殘餘物藉由己烷進行萃取，將有機層以無水硫酸鎂乾燥後，於減壓下餾去溶劑。得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到淡黃色液體(4.49g，74%)。
在所得液體之四氫呋喃(50mL)溶液中，添加1M氟化四丁基銨-四氫呋喃溶液(28.76mL，28.76mmol)。於室溫攪拌3小時後，減壓下除去揮發成分，將所得殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，分別得到呈無色油狀物質之4-(烯丙氧基)丁-1,3-二醇(0.48g，27%)、呈無色油狀物質之2-(烯丙氧基)丁-1,4-二醇(0.38g，22%)。
4-(烯丙氧基)丁-1,3-二醇
1H-NMR(5OOMHz,CDCl3)δ：1.72(2H,t,J=5.9 Hz),2.44(1H,t,J=5,4 Hz),2.73(1H,d,J=2.4 Hz),3.37(1H,dd,J=7.8,9.3 Hz),3.49(1H,dd,J=3.4,9.3 Hz),3.86(2H,dt,J=5.4,5.9 Hz),4.04(1H,dddt,J=2.4,3.4,7.8,9.8 Hz),4.04(2H,d,J=5.9 Hz),5.21(1H,d,J=10.7 Hz),5.29(1H,J=17.1 Hz),5.92(1H,ddt,J=10.7,17.1,5.9 Hz).
MS(CI+)m/z 147[M+H]+.
2-(烯丙氧基)丁-1,4-二醇
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：1.77-1.92(2H,m),2.12(1H,br),2.27(1H,br),3.56-3.69(3H,m),3.72-3.83(3H,m),4.09(1H,d,J=5.9 Hz),4.12(1H,d,J=5.9 Hz),5.21(1H,d,J=10.7 Hz),5.30(1H,d,J=17.1 Hz),5.94(1H, ddt,J=10.7,17.1,5.9 Hz).
MS(CI+)m/z 147[M+H]+。
(參考例38) (6Z,9Z,6’Z,9’Z)-18,18’-{[2-(烯丙氧基)丁-1,4-二基]雙(氧基)}雙(十八碳-6,9-二烯)
將於參考例37中所得到之2-(烯丙氧基)丁-1,4-二醇(0.38g，2.60mmol)溶解於無水甲苯(18mL)中，使用氫化鈉(0.69g，18.20mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(2.06g，5.98mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀物質(1.10g，66%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.3 Hz),1.20-1.60(36H,m),1.68-1.83(2H,m),2.05(8H,dt,J=7.3,6.8 Hz),2.78(4H,t,J=6.8 Hz),3.34-3.67(9H,m),4.04(1H,dd,J=5.4,12.7 Hz),4.16(1H,dd,J=5.4,12.7 Hz),5.14(1H,d,J=10.3 Hz),5.26(1H,d,J=17.1 Hz),5.29-5.42(8H,m),5.93(1H,ddt,J=10.3,17.1,5.4 Hz)。
(參考例39) 1,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-2-醇
在參考例38之(6Z,9Z,6’Z,9’Z)-18,18’-{[2-(烯丙氧基)丁-1,4-二基]雙(氧基)}雙(十八碳-6,9-二烯)(1.210g，1.71mmol)及肆三苯基膦鈀(0)(0.28g，0.24mmol)之乙醇(15.64mL)溶液中，添加三氟乙酸(1.76g，15.39mmol)。於80℃攪拌8小時後，添加肆三苯基膦鈀(0)(0.28g， 0.24mmol)，並於80℃攪拌3小時，繼而添加三氟乙酸(1.68g，14.74mmol)，並於80℃攪拌3小時。於減壓下除去揮發成分，並將得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到呈無色油狀物質之目的物(0.69g，67%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.3 Hz),1.20-1.60(36H,m),1.71-1.77(2H,m),2.05(8H,dt,J=7.3,6.8 Hz),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),3.02(1H,d,J=2.4 Hz),3.32-3.50(6H,m),3.55-3.66(2H,m),3.95(1H,br),5.29-5.42(8H,m)。
(實施例18) 5-(二甲基胺基)戊酸3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙酯(例示化合物3-8)
在參考例39之1,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-2-醇(0.06g，0.10mmol)、5-(二甲基胺基)戊酸鹽酸鹽(0.07g，0.40mmol)及三乙基胺(0.04g，0.42mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.08g，0.40mmol)、4-二甲基胺基吡啶(10mol%)。於室溫攪拌4小時後，於減壓下除去揮發成分，將得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到呈淡黃色油狀物質之目的物(0.07g，93%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.3 Hz),1.20-1.60(36H,m),1.49-1.60(2H,m),1.65(2H,quint,J=7.3 Hz),1.87(2H,quint,J=6.8 Hz),2.06(8H,q,J=6.8 Hz),2.26(6H,s),2.34(2H,q,J=7.3 Hz),2.77(4H, t,J=6.8 Hz),3.37(2H,t,J=6.8 Hz),3.38-3.47(4H,m),3.49(2H,d,J=5.4 Hz),5.14(1H,tt,J=5.4,6.8 Hz),5.29-5.42(8H,m).
MS(FAB+)m/z 730[M+H]+.
MS(ESI+)m/z 730[M+H]+.
HRMS(ESI+)m/z 730.67153[M+H]+(0.20mmu)。
(參考例40) (6Z,9Z,6’Z,9’Z)-18,18’-{[4-(烯丙氧基)丁-1,3-二基]雙(氧基)}雙(十八碳-6,9-二烯)
將於參考例37中所得到之4-(烯丙氧基)丁-1,3-二醇(0.48g，3.28mmol)溶解於無水甲苯(23mL)中，使用氫化鈉(0.88g，22.99mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(2.60g，7.55mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀物質(1.20g，57%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.90(6H,t,J=6.3 Hz),1.20-1.60(36H,m),1.67-1.89(2H,m),2.05(8H,dt,J=7.3,6.8 Hz),2.77(4H,t,J=6.3 Hz),3.34-3.65(9H,m),4.00(2H,d,J=5.9 Hz),5.17(1H,dd,J=2.0,10.3 Hz),5.28(1H,dd,J=2.0,17.6 Hz),5.29-5.42(8H,m),5.91(1H,ddt,J=10.3,17.6,5.9 Hz)。
(參考例41) 2,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-1-醇
在參考例40之(6Z,9Z,6’Z,9’Z)-18,18’-{[4-(烯丙氧基)丁-1,3-二基]雙(氧基)}雙(十八碳-6,9-二烯)(1.20g， 1,87mmol)及肆三苯基膦鈀(0)(0.30g，0.26mmol)之乙醇(17.06mL)溶液中，添加三氟乙酸(1.91g，16.79mmol)。於80℃攪拌8小時後，添加肆三苯基膦鈀(0)(0.28g，0.24mmol)，並於80℃攪拌3小時，繼而添加三氟乙酸(1.68g，14.74mmol)，並於80℃攪拌3小時。於減壓下除去揮發成分，將所得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到呈無色油狀物質之目的物(0.64g，57%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.8 Hz),1.20-1.60(36H,m),1.73-1.89(2H,m),2.01-2.09(8H,m),2.77(4H,t,J=6.3 Hz),3.41(2H,q,J=6.3 Hz),3.44-3.72(7H,m),5.30-5.43(8H,m)。
(實施例19) 4-(二甲基胺基)丁酸2,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁酯(例示化合物5-5)
在參考例41之2,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-1-醇(0.10g，0.17mmol)、4-(二甲基胺基)丁酸鹽酸鹽(0.06g，0.33mmol)及三乙基胺(0.04g，0.35mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.06g，0.33mmol)、4-二甲基胺基吡啶(5mol%)。於室溫攪拌4小時後，減壓下除去揮發成分，將得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到為淡黃色油狀物質之目的物(0.10g，81%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.3 Hz),1.20-1.60(36H,m),1.71-1.81(2H,m),1.79(2H,quint,J=7.3 Hz),2.05(8H,dt,J=7.3,6.8 Hz),2.21(6H,s), 2.28(2H,t,J=7.3 Hz),2.37(2H,t,J=7.3 Hz),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),3.34-3.66(7H,m),4.05(1H,dd,J=5.9,11.7 Hz),4.18(1H,dd,J=3.9,11.7 Hz),5.29-5.42(8H,m).
MS(FAB+)m/z 716[M+H]+.
MS(ESI+)m/z 716[M+H]+.
HRMS(ESI+)m/z 716.65565[M+H]+(-0.03mmu)。
(實施例20) 5-(二甲基胺基)戊酸2,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁酯(例示化合物5-6)
在參考例41之2,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-1-醇(0.06g，0.10mmol)、5-(二甲基胺基)戊酸鹽酸鹽(0.04g，0.20mmol)及三乙基胺(0.02g，0.21mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.04g，0.20mmol)、4-二甲基胺基吡啶(5mol%)。於室溫攪拌4小時後，於減壓下除去揮發成分，將得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到呈淡黃色油狀物質之目的物(0.05g，71%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.3 Hz),1.20-1.60(36H,m),1.50-1.59(2H,m),1.66(2H,quint,J=7.3 Hz),1.72-1.79(2H,m),2.05(8H,dt,J=7.3,6.8 Hz),2.27(6H,s),2.31-2.39(4H,m),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),3.34-3.66(7H,m),4.04(1H,dd,J=5.9,11.7 Hz),4.18(1H,dd,J=3.9,11.7 Hz),5.29-5.42(8H,m).
MS(FAB+)m/z 730[M+H]+.
MS(ESI+)m/z 730[M+H]+.
HRMS(ESI+)m/z 730.67116[M+H]+(-0.17mmu)。
(參考例42) 甲磺酸3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙酯
在參考例39之1,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-2-醇(0.10g，0.17mmol)及三乙基胺(0.02g，0.20mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加甲磺醯氯(0.02g，0.20mmol)。於室溫攪拌21小時後，添加甲磺醯氯(0.02g，0.20mmol)及三乙基胺(0.02g，0.20mmol)，於室溫攪拌6小時。於減壓下除去揮發成分，將得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到含有目的物之無色油狀物質。對於生成物，不施行進一步精製，直接使用於以下之反應。
(實施例21) N,N-二甲基-1,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-2-胺(例示化合物8-1)
在參考例42之甲磺酸3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙酯(0.09g，0.13mmol)中，添加2M二甲基胺-四氫呋喃溶液(5.00mL，10.00mmol)，在微波照射下，於150℃攪拌1.5小時。於減壓下除去揮發成分，將得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到呈黃色油狀物質之目的物(0.02g，28%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.3 Hz), 1.20-1.60(36H,m),1.59-1.67(2H,m),1.76(1H,sext,J=6.3 Hz),2.05(8H,q,J=6.8 Hz),2.31(6H,s),2.70(1H,quint,J=6.3 Hz),2.78(4H,t,J=6.8 Hz),3.33-3.42(5H,m),3.46(2H,t,J=6.8 Hz),3.51(1H,dd,J=6.3,9.8 Hz),5.29-5.42(8H,m).
MS(ESI+)m/z 630[M+H]+.
HRMS(ESI+)m/z 630.61832[M+H]+(-0.59mmu)。
(參考例43) 甲磺酸2,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁酯
在參考例41之2,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁-1-醇(0.10g，0.17mmol)及三乙基胺(0.02g，0.20mmol)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加甲磺醯氯(0.02g，0.20mmol)。於室溫攪拌21小時後，添加甲磺醯氯(0.02g，0.20mmol)及三乙基胺(0.02g，0.20mmol)，並於室溫攪拌4小時。於減壓下除去揮發成分，將所得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到呈無色油狀物質之目的物(0.07g，58%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.3 Hz),1.20-1.60(36H,m),1.74-1.82(2H,m),2.05(8H,q,J=6.8 Hz),2.77(4H,t,J=6.3 Hz),3.05(3H,s),3.34-3.74(7H,m),4.16(1H,dd,J=5.9,10.7 Hz),4.34(1H,dd,J=2.9,10.7 Hz),5.29-5.42(8H,m)。
(實施例22) N,N-二甲基-2,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧 基]丁-1-胺(例示化合物9-1)
在參考例43之甲磺酸2,4-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丁酯(0.07g，0.10mmol)之乙腈(5mL)溶液中，添加2M二甲基胺-四氫呋喃溶液(6.00mL，12.00mmol)，在微波照射下，於90℃攪拌45分鐘。追加2M二甲基胺-四氫呋喃溶液(5.00mL，10.00mmol)，在微波照射下，於130℃攪拌1小時及於150℃攪拌45分鐘。於減壓下除去揮發成分，將所得到之殘餘物藉由矽膠管柱層析精製，得到呈黃色油狀物質之目的物(0.03g，50%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ：0.89(6H,t,J=6.3 Hz),1.20-1.60(36H,m),1.65-1.87(2H,m),2.05(8H,dt,J=7.3,6.8 Hz),2.24(6H,s),2.28(1H,dd,J=4.9,12.7 Hz),2.40(1H,dd,J=6.3,12.7 Hz),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),3.34-3.57(7H,m),5.29-5.42(8H,m).
MS(ESI+)m/z 630[M+H]+.
HRMS(ESI+)m/z 630.61879[M+H]+(-0.11mmu)。
(實施例23)封入雙股多核苷酸之核酸脂質粒子之調製
將具有二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine：以下稱為DSPC，NOF CORPORATION)、膽固醇(Cholesterol：以下稱為Chol，Sigma-Aldrich,Inc.)、實施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所記載之化合物(稱為LP)、及含有分子量約2000之聚乙二醇(polyethylene glycol：以下稱為PEG)的1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(1,2-dimyristoyl-sn-glycerol methoxypolyethylene glycol )(以下稱為GM-020，NOF CORPORATION)，以DSPC：Chol：LP：GM-020=20：48：30：2之莫耳比，在90%乙醇中，以使總脂質濃度成為25mM之方式，調製成脂質溶液。
使用DNA合成機合成國際公開第2010/001909號小冊子中之實施例45及實施例51所記載之多核苷酸CT-157：HO-P(=O)(OH)-O-Um1p-Tp-Gm1p-Tp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Cm1p-Ap-Um1p-Tp-Cm1p-Tp-Um1p-Gp-Um1p-Gp-Cm1p-Tp-Um1t-H(序列表之序列編號1)(含有與人類β-連環蛋白基因(GenBank accession No.NM_001904.3)之核苷酸第3139-3157號互補之序列之多核苷酸)
以及多核苷酸CT-169：HO-Gp-Cm1p-Ap-Cm1p-Ap-Am1p-Gp-Am1p-Ap-Um1p-Gp-Gm1p-Ap-Um1p-Cp-Am1p-Cp-Am1t-H(序列表之序列編號2)(含有人類β-連環蛋白基因(GenBank accession No.NM_001904.3)之核苷酸第3139-3156號之序列)，在每1支試管中加入300pmol，於減壓下乾燥，添加30μL之siRNA懸浮緩衝液(QIAGEN)，於65℃加溫1分鐘後，在室溫放置5分鐘，使其進行緩冷配對反應(annealing)，得到10μM之雙股多核苷酸溶液，然後，用檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，pH4.0)，調製成1mg/mL，得到雙股多核苷酸溶液。將上述之脂質溶液及雙股多核苷酸溶液加溫至37℃，將各100μL混合，繼而，藉由添加檸檬酸緩衝液(20mM Citrate Buffer，300mM NaCl，pH6.0) 200μL，並於37℃培養30分鐘，得到含有核酸脂質粒子之分散液。藉由將含有核酸脂質粒子之分散液以約100mL之磷酸緩衝液(pH7.4)透析12-18小時(Float-A-Lyzer G2，MWCO：100kD，Spectra/Por)，並藉由乙醇除去及中和來除去未封入之雙股多核苷酸，得到包含核酸脂質粒子之精製分散液，該核酸脂質粒子含有封入siRNA之實施例1、2、3、4、5、6、7、8、或9所記載之化合物。使用國際公開第2005/120152號小冊子所記載之1,2-二亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(Dlin-DMA)做為對照檢體。
(實施例24)封入雙股多核苷酸之核酸脂質粒子之特性評價
進行含有在實施例23中所調製之核酸脂質粒子之分散液之特性評價。對於各種特性評價之方法，分別加以說明。
(1)平均粒徑
脂質體之粒徑係以Zeta電位/粒度測定器NICOMPTM 380ZLS(PARTICLE SIZING SYSTEMS)來測定。表中之平均粒徑係表示體積平均粒徑，±以下表示偏差。
(2)雙股多核苷酸之封入率
雙股多核苷酸之封入率，係使用Quant-iT RiboGreen RNA分析套組(Invitrogen)，依據隨附之說明書測定。
亦即，在0.1% Triton X-100界面活性劑存在下及不存在下，將含有核酸脂質粒子之分散液中之雙股多核苷酸定量，並藉由下式計算封入率。
{[界面活性劑存在下之雙股多核苷酸量]-[界面活性劑不 存在下之雙股多核苷酸量]}/[界面活性劑存在下之雙股多核苷酸量]}×100(%)
(3)雙股多核苷酸與脂質之比率
將含有核酸脂質粒子之分散液與乙腈、氯仿以1：1：1之比例混合，以15,000rpm離心2分鐘後，回收上層之水層，萃取雙股多核苷酸。藉由離子交換層析測定試料中之雙股多核苷酸量(系統：Agilent 1100series，Column：TSKgel DEAE-2SW(2.6×150mm)(東曹股份有限公司)；緩衝液A：20%乙腈；緩衝液B：20%乙腈，1.6M甲酸銨；梯度(B%)：30-55%(0-20分鐘)；流速：1毫升/分鐘；溫度：40℃；檢測：260nm)。
含有核酸脂質粒子之分散液中之磷脂質量係使用磷脂質C-Test Wako(和光純藥工業股份有限公司)，依據隨附之說明書來測定。亦即，在10% Triton X-100界面活性劑存在下，將試料中之磷脂質定量。從本測定值及構成脂質體之脂質成分之組成比，計算總脂質量。
從上述之多核苷酸量及總脂質量，藉由下式計算多核苷酸與脂質之比率。
[雙股多核苷酸濃度]/[總脂質濃度] (wt/wt)
將結果示於表12、表13及表14中。
從以上之結果，明顯地雙股多核苷酸封入脂質粒子內時，此等核酸脂質粒子成為具有約70nm至約300nm之粒徑。
(實施例25)封入雙股多核苷酸之核酸脂質粒子之調製
以與實施例23同様之方法調製含有封入siRNA之實施例13、14、15、16、17、18、19、20、21或22所記載之化合物之核酸脂質粒子。
(實施例26)封入雙股多核苷酸之核酸脂質粒子之特性評價
含有在實施例25中所調製之核酸脂質粒子之分散液之特性評價係以與實施例24同様之方式來進行。將結果示於表15。
從以上之結果，將雙股多核苷酸封入脂質粒子內時，此等核酸脂質粒子顯然具有約100nm至約300nm之粒徑。
(試驗例1)
如以下方式比較使用新穎脂質所調製之核酸脂質粒子所產生之人類β-連環蛋白基因表現抑制活性之強度。
(1)轉染
將人類大腸癌SW480細胞株(來自人類大腸腺癌)在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum)之RPMI1640培養基(Invitrogen公司製)中，調製成100000個細胞/毫升之濃 度。然後，在12孔平底培養盤(Corning公司製)中各接種1毫升，於37℃，5.0%二氧化碳下培養1日。將在實施例23中所調製之含有實施例1至6所記載之化合物之核酸脂質粒子之分散液，以使培養基中最終雙股多核苷酸濃度成為3、0.3、及0.03nM之方式，在OPTI-MEM培養基中製作稀釋系列後添加，然後繼續培養3日。
(2)即時(real time)PCR
轉染後，從孔除去培養上清液，用RNeasy 96套組(QIAGEN公司製)萃取mRNA。將所得mRNA用iScriptTM cDNA合成套組(BIORAD公司製)，依照說明書之記載，從0.5μgRNA調製cDNA。繼而，為了進行即時PCR，使用針對人類β-連環蛋白基因之PCR引子(引子對ID：HA135664，Takara Bio公司製)、做為內部標準之針對人類-GAPDH基因之PCR引子(引子對ID：HA067812，Takara Bio公司製)、及含有PCR所需藥劑之QuantiTect SYBR Green PCR套組(QIAGEN公司製)，如以下之方式，進行mRNA之定量。
β連環蛋白基因 ID：HA135664
正向引子 5’-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA-3’(序列編號3)
反向引子 5’-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3’(序列編號4)
GAPDH基因 ID：HA067812
正向引子 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(序列編號5)
反向引子 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(序列編號6)
在96孔PCR培養盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔中，添加即時PCR套組中所含之2×QuantiTect SYBR GREEN PCR主混合物25μL、不含RNase之水18μL、各PCR引子5μL(最終濃度0.3μM)、調製成之cDNA溶液2μL，將總量調成50μL，安裝於Mx3000P(STRATAGENE公司製)中，依照以下之條件實施PCR。
PCR初期活化 95℃，15分鐘
PCR 94℃，15秒
56℃，30秒
72℃，30秒
重複進行此PCR循環40次。校正線，係使用從未經處理細胞(=NC)萃取而得之mRNA所調製之cDNA之5倍系列稀釋液。依據該校正線定量各被轉染物(transfectant)之人類β-連環素及人類GAPDH，以人類β-連環素基因量除以人類GAPDH量所得之相對量作圖。實施即時PCR 2次(N=2)，在圖中顯示其平均值。
(3)即時PCR解析 (a)基因抑制活性解析1
調查在實施例23中所調製之含有實施例1至6記載之化合物的核酸脂質粒子之分散液的β-連環蛋白基因表現抑制活性。
如第13圖及第14圖所示，含有實施例1、2、3及5之化合物之核酸脂質粒子，與做為對照之含有DLin-DMA 之核酸脂質粒子相較，較強地抑制β-連環蛋白基因之表現。又，含有實施例4及6之化合物之核酸脂質粒子，呈現與含有DLin-DMA之核酸脂質粒子相同程度之抑制活性。因此，實施例1、2、3、4、5及6之化合物顯然為可供調製具有與DLin-DMA相同程度或更強活性之核酸脂質粒子用之有益新穎脂質。
(試驗例2)
以與試驗例1同様之方式，比較使用新穎脂質所調製之核酸脂質粒子所產生之人類β-連環蛋白基因表現抑制活性之強度。但是，對於人類大腸癌SW480細胞株，係將在實施例23中所調製之包含核酸脂質粒子之分散液(該核酸脂質粒子含有實施例7、8及9之化合物)添加於培養基後，繼續培養2日。
其結果，如第15圖所示，含有實施例7、8及9之化合物之核酸脂質粒子顯示與做為對照之含有DLin-DMA之核酸脂質粒子相同程度之β-連環蛋白基因表現抑制活性。因此，實施例7、8及9之化合物顯然為可供調製具有與DLin-DMA相同程度之活性之核酸脂質粒子用之有益新穎脂質。
(試驗例3)
以與試驗例1同様之方式，比較使用新穎脂質所調製之核酸脂質粒子所產生之人類β-連環蛋白基因表現抑制活性之強度。但是，(1)轉染之操作係以下述方式進行。將人類大腸癌SW480細胞株(來自人類大腸腺癌)，在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum)之RPMI1640培養基 (Invitrogen公司製)中，調製成100000個細胞/毫升之濃度後，在12孔平底培養盤(Corning公司製)中各接種1mL。繼而將在實施例25中所調製之含有實施例13至22記載之化合物之核酸脂質粒子之分散液，以使培養基中之最終雙股多核苷酸濃度成為3、0.3、及0.03nM之方式，於OPTI-MEM培養基中製作成系列稀釋液後添加，在37℃、5.0%二氧化碳下培養3日。
如第16圖及第17圖所示，含有實施例15及16之化合物之核酸脂質粒子，與做為對照之含有DLin-DMA之核酸脂質粒子相較，更強地抑制β-連環蛋白基因之表現。又，含有實施例13、14、17、18、19、20、21及22之化合物之核酸脂質粒子顯示與含有DLin-DMA之核酸脂質粒子相同程度之抑制活性。因此，實施例13、14、15、16、17、18、19、20、21及22之化合物顯然為可供調製具有與DLin-DMA相同程度或更強活性之核酸脂質粒子用之有益新穎脂質。
(參考例44) 1,3-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-醇
將WO2009/129385記載之實施例6C之化合物(1,3-雙((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)丙-2-酮(1.47g，2.50mmol)之THF(15ml)溶液冷卻至0℃，添加氫化硼鈉(160mg，4.02mmol)及水(1.6ml)，於室溫攪拌45分鐘。反應終了後，再度冷卻至0℃，並添加1N鹽酸，及以乙酸乙酯萃取。用無水硫酸鎂乾燥後，於減壓下餾去溶劑，將殘餘物藉由矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=9：1)精製， 得到油狀之目的物(1.30g，88%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.29(8H,m),3.99-3.90(1H,m),3.51-3.41(8H,m),2.78(4H,t,J=5.9 Hz),2.46(1H,d,J=3.9 Hz),2.05(8H,q,J=7.0 Hz),1.61-1.52(4H,m),1.41-1.22(32H,m),0.89(6H,t,J=6.6 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：588(M+H)+
(實施例27) 5-(二甲基胺基)戊酸2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}乙酯(例示化合物7-4)
在參考例44中所得到之化合物(80.0mg，0.136mmol)及5-二甲基胺基戊酸鹽酸鹽(49.4mg，0.272mmol)之二氯甲烷(10ml)溶液中，添加三乙基胺(40μl，0.289mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(55.0mg，0.287mmol)、二甲基胺基吡啶(2.0mg，0.0164mmol)，並於室溫攪拌3小時。反應終了後，將反應液減壓濃縮，藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=12：1)精製，得到油狀之目的物(83.9mg，86%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.28(8H,m),5.13(1H,tt,J=10.6,5.1 Hz),3.59-3.35(8H,m),2.77(4H,t,J=7.0 Hz),2.44-2.26(10H,m),2.05(8H,q,J=7.0 Hz),1.72-1.48(8H,m),1.40-1.22(32H,m),0.89(6H,t,J=6.7 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：716(M+H)+
(參考例45) 3-二甲基胺基丙酸2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧 基]-1-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}乙酯
在參考例44中所得到之化合物(80.0mg，0.136mmol)及3-二甲基胺基丙酸鹽酸鹽(41.8mg，0.272mmol)之二氯甲烷(10ml)溶液中，添加三乙基胺(40μl，0.289mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(55.0mg，0.287mmol)、二甲基胺基。吡啶(2.0mg，0.0164mmol)，於室溫攪拌3小時。反應終了後，將反應液減壓濃縮，藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=12：1)精製，得到油狀之目的物(86.8mg，93%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.29(8H,m),5.14(1H,tt,J=5.1,10.2 Hz),3.61-3.52(4H,m),3.49-3.37(4H,m),2.77(4H,t,J=6.3 Hz),2.63(2H,t,J=7.4 Hz),2.52(2H,t,J=7.4 Hz),2.24(6H,s),2.05(8H,q,J=6.7 Hz),1.54(4H,tt,J=6.7,13.3 Hz),1.41-1.23(16H,m),0.89(6H,t,J=6.3 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：688(M+H)+
(參考例46) 4-二甲基胺基丁酸2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}乙酯
在參考例44中所得到之化合物(80.0mg，0.136mmol)及4-二甲基胺基丁酸鹽酸鹽(45.6mg，0.272mmol)之二氯甲烷(10ml)溶液中，添加三乙基胺(40μl，0.289mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(55.0mg ，0.287mmol)、二甲基胺基吡啶(2.0mg，0.0164mmol)，於室溫攪拌3小時。反應終了後，將反應液減壓濃縮，藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=12：1)精製，得到油狀之目的物(87.5mg，92%)。
本化合物為美國專利5,705,188之第7欄從上方算起第4行所記載之2-O-(4-二甲基胺基丁醯基)-1,3-二亞麻基甘油。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.28(8H,m),5.13(1H,tt,J=5.1,10.2 Hz),3.55(4H,dd,J=1.2,5.5 Hz),3.50-3.36(4H,m),2.77(4H,t,J=7.0 Hz),2.40-2.31(2H,m),2.38(2H,t,J=7.4 Hz),2.26(6H,br s),2.05(8H,q,J=6.7 Hz),1.82(2H,tt,J=7.4,14.9 Hz),1.54(4H,tt,J=6.7,13.3 Hz),1.41-1.22(32H,m),0.89(6H,t,J=7.0 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：701(M+H)+
(參考例47) 1,1’-[({(2R)-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙基}氧基)(苯基)亞甲基]雙(4-甲氧基苯)
將(2R)-1-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]丙-2-醇(J.Med.Chem.2009,52,5837-5863記載之化合物97，5.0g，13.2mmol)溶解於無水甲苯(50ml)中，使用氫化鈉(1.0g，26.3mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(6.82g，19.8mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(己烷：二氯甲烷=1：1)精製，得到油狀之目的物(5.48g，66%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.49-7.16(9H,m),6.81(4H,d,J= 9.0 Hz),5.43-5.28(4H,m),3.79(6H,s),3.62-3.43(4H,m),3.16(1H,dd,J=6.7,8.6 Hz),2.94(1H,dd,J=4.3,9.0 Hz),2.77(2H,t,J=6.3 Hz),2.09-1.99(4H,m),1.61-1.50(2H,m),1.43-1.22(16H,m),1.14(3H,d,J=6.7 Hz),0.88(3H,t,J=6.7 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：626(M+H)+
(參考例48) (2R)-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-醇
在參考例48中得到之化合物(5.48g，8.74mmol)中添加80%乙酸溶液(50ml)，於60℃加熱30分鐘。添加二氯甲烷，用碳酸氫鈉水溶液洗淨，藉由減壓濃縮餾去溶劑。將殘餘物以矽膠管柱層析(己烷：二氯甲烷=1：5)精製，得到油狀之目的物(1.19g，42%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.29(4H,m),3.61-3.32(5H,m),2.77(2H,t,J=6.3 Hz),2.05(4H,q,J=5.9 Hz),1.62-1.52(2H,m),1.41-1.23(16H,m),1.11(3H,d,J=6.3 Hz),0.89(3H,t,J=6.7 Hz).
CI-MAS：325(M+H)+
(參考例49) 甲磺酸(2R)-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙酯
將在參考例48中所得到之化合物(1.18g，3.64mmol)溶解於二氯甲烷(10ml)中，冷卻至0℃。添加甲磺醯氯(423μl，5.47mmol)、三乙基胺(760μl，5.45mmol)，並升溫至室溫，攪拌2小時。反應終了後，藉由減壓濃縮餾去 溶劑後，藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀之目的物(1.44g，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.28(4H,m),4.22-4.10(2H,m),3.74-3.64(1H,m),3.55-3.40(2H,m),3.05(3H,s),2.77(2H,t,J=6.7 Hz),2,05(4H,q,J=7.0 Hz),1.60-1.50(2H,m),1.46-1.22(16H,m),1.20(3H,d,J=5.9 Hz),0.89(3H,t,J=6.7 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：402(M-H)+
(實施例28) N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-2-({(2R)-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙基}氧基)丙-1-胺(例示化合物1-59)
將WO2011/000106，138頁記載之化合物3(2-羥基-3-亞麻氧基-N,N-二甲基丙基胺，100mg，0.271mmol)溶解於無水甲苯(3ml)中，使用氫化鈉(25mg，0.656mmol)、在參考例49中得到之化合物(131mg，0.325mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=50：1)精製，得到油狀之目的物(44.8mg，24%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.27(8H,m),3.78-3.37(10H,m),2.77(4H,t,J=6.7 Hz),2.67-2.51(2H,br m),2.43(6H,br s),2.05(8H,q,J=7.0 Hz),1.54(4H,tt,J=6.3,13.7 Hz),1.41-1.21(32H,m),1.14(3H,t,J=7.0 Hz),0.89(6H,t,J=7.0 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：674(M+H)+
(參考例50) 1,1’-[{[(2R)-2-(烯丙氧基)丙基]氧基}(苯基)亞甲基]雙(4-甲氧基苯)
在(2R)-1-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]丙-2-醇(J.Med.Chem.2009,52,5837-5863記載之化合物97，5.15g，13.6mmol)之THF(30ml)溶液中添加氫化鈉(570mg，15.0mmol)，於60℃攪拌20分鐘後，添加烯丙基溴(1.30mL，15.4mmol)，進一步於60℃攪拌2小時。反應終了後，冷卻至室溫，加水，並以二氯甲烷萃取。藉由減壓濃縮餾去溶劑，將殘餘物藉由矽膠管柱層析(己烷：乙酸乙酯=20：1)精製，得到油狀之目的物(5.59g，98%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.50-7.17(9H,m),6.82(4H,d,J=8.6 Hz),5.99-5.88(1H,m),5.32-5.25(1H,m),5.16(1H,dd,J=1.2,10.2 Hz),4.08(2H,t,J=6.3 Hz),3.79(6H,s),3.68-3.58(1H,m),3.18(1H,dd,J=6.3,9.4 Hz),2.98(1H,dd,J=5.1,10.2 Hz),1.16(3H,d,J=6.6 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：418(M+H)+
(參考例51) (2R)-2-(烯丙氧基)丙-1-醇
在參考例50所得到之化合物(5.59g，13.4mmol)中添加80%乙酸溶液(100ml)，於60℃加熱2小時。反應終了後，將反應液減壓濃縮，將殘餘物藉由矽膠管柱層析(己烷：二氯甲烷=1：5)精製，得到油狀之目的物。無法與二甲氧基三苯甲基醇分離，將混合物以原樣使用於以下之反應。
(參考例52) (6Z,9Z)-18-{[(2R)-2-(烯丙氧基)丙基]氧基}十八碳-6,9-二烯
將於參考例51中所得到之化合物(13.4mmol)溶解於無水甲苯(10ml)中，使用氫化鈉(1.0g，26.2mmol)、甲磺酸(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基酯(4.80g，13.9mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(己烷：二氯甲烷=1：1)精製，得到油狀之目的物(1.21g，25%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.98-5.87(1H,m),5.43-5.12(6H,m),4.07(2H,d,J=5.9 Hz),3.70-3.60(1H,m),3.46(1H,dd,J=5.9,9.8 Hz),3.44(2H,t,J=6.3 Hz),3.35(1H,dd,J=4.3,10.2 Hz),2.77(2H,t,J=6.6 Hz),2.05(4H,q,J=7.0 Hz),1.62-1.52(2H,m),1.41-1.22(16H,m),1.16(3H,d,J=6.6 Hz),0.89(3H,t,J=6.3 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：365(M+H)+
(參考例53) (2R)-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-醇
將於參考例52中得到之化合物(1.20g，3.29mmol)溶解於乙醇(15ml)中，添加三氟乙酸(3.0mL，40.4mmol)、肆三苯基膦鈀(1.14g，0.987mmol)，並於80℃攪拌3小時。反應終了後，過濾觸媒，並將濾液減壓濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀之目的化合物(822mg，77%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.28(4H,m),4.00-3.91(1H, m),3.52-3.38(2H,m),3.21(1H,d,J=8.2 Hz),3.19(1H,d,J=8.2 Hz),2.77(2H,t,J=6.7 Hz),2.05(4H,q,J=7.0 Hz),1.58(2H,tt,J=7.0,14.1 Hz),1.41-1.21(16H,m),1.14(3H,d,J=6.3 Hz),0.89(3H,t,J=6.7 Hz).
CI-MAS：325(M+H)+
(參考例54) 甲磺酸(1R)-1-甲基-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙酯
將於參考例53中所得到之化合物(820mg，2.53mmol)溶解於二氯甲烷(10ml)中，並於0℃冷卻。添加甲磺醯氯(300μl，3.88mmol)、三乙基胺(530μl，3.80mmol)，升溫至室溫，攪拌2小時。反應終了後，藉由減壓濃縮餾去溶劑後，藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到油狀之目的物(967mg，95%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.44-5.28(4H,m),4.91-4.81(1H,m),3.56-3.40(4H,m),3.05(3H,s),2.78(2H,t,J=7.0 Hz),2.05(4H,q,J=6.6 Hz),1.61-1.51(2H,m),1.40-1.23(16H,m),1.39(3H,d,J=6.6 Hz),0.89(3H,t,J=7.0 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：401(M-H)+
(實施例29) N,N-二甲基-2-{(1R)-1-甲基-2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙氧基}-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(例示化合物1-58)
將於WO2011/000106，138頁中所記載之化合物3(2- 羥基-3-亞麻氧基-N,N-二甲基丙胺，200mg，0.544mmol)溶解於無水甲苯(3ml)中，使用氫化鈉(50mg，1.31mmol)、參考例54中得到之化合物24(263mg，0.653mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=50：1)精製，得到油狀之目的物(55.2mg，15%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.43-5.28(8H,m),3.84-3.23(10H,m),2.77(4H,t,J=6.6 Hz),2.45-2.34(2H,br m),2.26(6H,br s),2.05(8H,q,J=6.6 Hz),1.55(4H,tt,J=6.6,13.7 Hz),1.41-1.23(32H,m),1.19-1.12(3H,m),0.89(6H,t,J=6.6 Hz).
FAB-MAS(mNBA)：674(M+H)+
(參考例55) 2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]丙-1,3-二醇
將2-(羥基甲基)-丙-1,3-二醇(2.653g)溶解於吡啶125mL)中，滴入溶解於吡啶(50mL)之1-[氯-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基-]-4-甲氧基苯(6.68g)，於室溫攪拌3.5小時後，添加甲醇(5mL)並餾去溶劑。在殘餘物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，並以二氯甲烷萃取，用無水碳酸氫鈉乾燥及餾去溶劑後，藉由矽膠層析精製，得到目的物(4.49g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 2.03(1H,m),2.21(2H,br),3.26(2H,d,J=1.5 Hz),3.79(6H,s),3.80(4H,m),6.83(4H,m),7.18-7.34(7H,m),7.41(2H,m).
(參考例56) 1-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)-[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙氧基]-苯基-甲基]苯
將氫化鈉(2.93g、63%)用己烷洗淨後，添加甲苯(70mL)，並依序滴入溶解於甲苯(15mL)之參考例55之2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]丙-1,3-二醇、溶解於甲苯(10mL)之甲磺酸[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基]酯(8.72g)後，回流5小時。將反應液注入冰冷水中，用乙酸乙酯萃取後，以水、飽和食鹽水洗淨，用無水碳酸氫鈉乾燥後，餾去溶劑。得到之殘餘物藉由矽膠層析精製，得到目的物(10.712g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,m),1.20-1.60(36H,m),2.05(8H,m),2.77(4H,m),3.14(2H,d,J=1.4 Hz),3.35(4H,t,J=1.8 Hz),3.49(4H,t,J=1.5 Hz),5.28-5.44(8H,m),6.81(4H,m),7.16-7.34(7H,m),7.42(2H,m).
(參考例57) 3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1-醇
將參考例56之1-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)-[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙氧基]-苯基-甲基]苯(4.67g)溶解於四氫呋喃(20mL)、乙酸(5mL)、2N鹽酸(5mL)中，攪拌80分鐘後添加2N氫氧化鈉水溶液(5mL)，以飽和碳酸氫鈉水溶液中和後用乙酸乙酯萃取，將有機層以飽和食鹽水洗淨後，及用無水碳酸鈉乾燥後，藉由矽膠管柱層析精製，得到目的物(3.868g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.7 Hz),1.22-1.60(36H,m),2.05(8H,m),2.78(4H,t,J=1.6 Hz),2.91(1H,t,J=1.3 Hz),3.41(4H,t,J=1.6 Hz),3.48-3.58(4H,m),3.77(2H,t,J=1.3 Hz),5.28-5.44(8H,m).
(實施例30) 4-(二甲基胺基)丙酸3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(例示化合物6-4)
將3-二甲基胺基丙酸(24mg)溶解於二氯甲烷(3mL)中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(WSC；77mg)、N,N-二異丙基乙胺(87μL)後，添加溶解於二氯甲烷(2mL)之參考例57之3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1-醇(61mg)、N,N-二甲基胺基吡啶(DMAP，2mg)，並攪拌一夜。添加3-二甲基胺基丙酸(24mg)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(WSC；77mg)、N,N-二異丙基乙胺(87μL)，進一步攪拌一夜。餾去溶劑，藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀之目的物(71mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.6 Hz),1.20-1.59(39H,m),2.05(6H,m),2.24(6H,s),2.48(2H,t,J=1.8 Hz),2.61(2H,t,J=1.8 Hz),2.77(4H,t,J=1.6 Hz),3.38(4H,t,J=1.6 Hz),3.44(4H,m),4.15(2H,d,J=1.6 Hz),5.28-5.44(8H,m).
MS(Q-TOF)m/z 702
(實施例31) 4-(二甲基胺基)丁酸[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(例示化合物6-5)
將4-二甲基胺基丁酸鹽酸鹽(34mg)溶解於二氯乙烷(3mL)中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(WSC；77mg)、N,N-二異丙基乙胺(87μL)後，添加溶解於二氯乙烷(2mL)之參考例57之3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1-醇(61mg)、N,N-二甲基胺基吡啶(DMAP，2mg)，並攪拌一夜。餾去溶劑，藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀之目的物(71mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.7 Hz),1.24-1.42(29H,m),1.48-1.64(8H,m),1.78(2H,m),2.05(8H,m),2.22(6H,m),2.28(2H,t,J=2.0 Hz),2.34(2H,t,J=2.0 Hz),2.78(4H,t,J=1.6 Hz),3.38(4H,t,J=1.6 Hz),3.43(4H,m),4.14(2H,d,J=1.6 Hz),5.28-5.44(8H,m).
MS(Q-TOF)m/z 716
(實施例32) 4-(二甲基胺基)戊酸[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(例示化合物6-6)
將5-二甲基胺基纈草酸(36mg)溶解於二氯甲烷 (3mL)中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(WSC；77mg)、N,N-二異丙基乙胺(87μL)後，添加溶解於二氯甲烷(2mL)之參考例57之3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1-醇(61mg)、N,N-二甲基胺基吡啶(DMAP，2mg)，並攪拌2日。餾去溶劑，藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀之目的物(71mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.7 Hz),1.20-1.70(41H,m),2.01-2.09(6H,m),2.21(6H,s),2.26(2H,t,J=1.9 Hz),2.33(2H,t,J=1.9 Hz),2.77(4H,t,J=1.6 Hz),3.38(4H,t,J=1.6 Hz),3.43(4H,m),4.13(2H,d,J=1.6 Hz),5.28-5.44(8H,m).
MS(Q-TOF)m/z 730
(參考例58) 5-溴戊酸[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯
將5-溴纈草酸(73mg)溶解於二氯甲烷(2mL)中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(WSC；115mg)、N,N-二異丙基乙胺(174μL)後，添加參考例57之3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1-醇(121mg)，2小時後添加5-溴纈草酸(73mg)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(WSC；115mg)、N,N-二異丙基乙胺(174μL)，並攪拌一夜。餾去溶劑，藉由矽膠管柱層析精製，得到目的物(130mg)。
(實施例33) 5-(氮雜環丁-1-基)戊酸[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(例示化合物6-21)
將氮雜環丁烷(100μL)溶解於二氯甲烷(5mL)中並冰冷後，添加溶解於二氯甲烷(2mL)之參考例58之5-溴戊酸[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(119mg)後，升溫至室溫。添加N,N-二異丙基乙胺(26μL)並攪拌一夜，添加氮雜環丁烷(100μL)，進一步攪拌一夜，餾去溶劑後，藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀之目的物(50mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.7 Hz),1.20-1.66(41H,m),2.04(10H,m),2.30(2H,t,J=1.9 Hz),2.37(2H,t,J=1.9 Hz),2.77(4H,t,J=1.6 Hz),3.15(4H,t,J=1.8 Hz),3.38(4H,t,J=1.6 Hz),3.42(4H,m),4.12(2H,d,J=1.5 Hz),5.28-5.44(8H,m).
MS(Q-TOF)m/z 742
(參考例59) 4-溴丁酸[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯
將4-溴丁酸(334mg)溶解於二氯甲烷(4mL)中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(WSC；575mg)、N,N-二異丙基乙胺(871μL)後，添加溶解於二氯甲烷(2mL)之參考例57之3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1-醇 (302mg)、N,N-二甲基胺基吡啶(DMAP，2mg)，並攪拌一夜。添加飽和碳酸氫鈉水溶液，用乙酸乙酯萃取，將有機層以無水碳酸鈉乾燥後，餾去溶劑，藉由矽膠管柱層析精製，得到目的物(110mg)。
(實施例34) 4-(氮雜環丁-1-基)丁酸[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(例示化合物6-20)
將參考例59之4-溴丁酸[3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(110mg)溶解於乙腈(3mL)、四氫呋喃(3mL)中，添加氮雜環丁烷(100μL)、碳酸鉀(41mg)並攪拌一夜。添加N,N-二異丙基乙胺(127μL)，並攪拌1日後，添加氮雜環丁烷(100μL)，並於50℃攪拌9.5小時，過濾不溶物並餾去溶劑。藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀之目的物(24mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.8 Hz),1.20-1.74(39H,m),2.00-2.12(10H,m),2.32(2H,t,J=1.8 Hz),2.42(2H,t,J=1.8 Hz),2.77(4H,t,J=1.6 Hz),3.20(4H,t,J=1.7 Hz),3.38(4H,t,J=1.6 Hz),3.42(4H,m),4.13(2H,d,J=1.6 Hz),5.28-5.44(8H,m).
MS(Q-TOF)m/z 728
(參考例60) 3-(1,2-二羥基乙基)哌啶-1-羧酸三級丁酯
在3-乙烯基哌啶-1-羧酸三級丁酯(Lowen,Gregory T.氏，J.Heterocycl.Chem.1992,29,1663-1665：0.5g ，2.37mmol)及4-甲基啉N-氧化物(0.43g，3.55mmol)之丙酮、乙腈、水(1：1：1，4mL)溶液中，添加封入氧化鋨(VIII)(0.24g，0.09mmol)之微膠囊，並於室溫反應24小時。用二氯甲烷及水處理後，將有機層用無水硫酸鎂乾燥。將得到之溶液之揮發成分減壓餾去，藉由施行矽膠層析法，得到為無色液體之目的物(0.10g，17%)。
(參考例61) 3-{1,2-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙基}哌啶-1-羧酸三級丁酯
將在參考例60中得到之化合物(0.1g，0.41mmol)溶解於無水甲苯(10mL)中，使用氫化鈉(0.11g，2.85mmol)、在實施例1中所記載之甲磺酸2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙酯(0.34g，0.98mmol)，以與實施例1同様之方式合成。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷)精製，得到為白色固體之目的物(0.06g，20%)。
(實施例35) 3-{1,2-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9.12-二烯-1-基氧基]乙基}-1-甲基哌啶(例示化合物4-13)
在氫化鋰鋁(0.01g，0.24mmol)之四氫呋喃(10mL)懸浮液中，添加參考例61之3-{1,2-雙[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙基}哌啶-1-羧酸三級丁酯(0.06g，0.08mmol)之四氫呋喃(8mL)溶液，於60℃反應3.5小時。水處理後，添加硫酸鈉及乙酸乙酯，並以矽藻土過濾。將得到之溶液之揮發成分減壓餾去，藉由施行矽膠管柱層析，得到為淡黃色液體之目的物。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：0.87-0.92(6H,m),1.22-1.62(36H,m),2.02-2.09(8H,m),2.16-2.27(4H,m),3.15-3.66(7H,m),5.29-5.43(8H,m).
MS(TOFMS ES+)m/z 656.63[M+H]+
HRMS(TOFMS ES+)m/z 656.6346(0.0mmu)
(參考例62) 2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-甲基-丙-1,3-二醇
將三羥甲基乙烷(3.0g)溶解於吡啶(125mL)中，滴入溶解於吡啶(50mL)之1-[氯-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲基-]-4-甲氧基苯(6.68g)，於室溫攪拌3.5小時後，添加甲醇(5mL)，並餾去溶劑。在殘餘物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，並以二氯甲烷萃取，用無水硫酸鈉乾燥及將溶劑餾去後，藉由矽膠層析精製，得到目的物(5.65g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.84(3H,s),2.34(2H,br),3.14(2H,s),3.58(2H,d,J=2.8 Hz),3.70(2H,d,J=2.8 Hz),3.79(6H,s),6.84(4H,m),7.18-7.34(7H,m),7.42(2H,m).
(參考例63) 1-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)-[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙氧基]-苯基-甲基]苯
將氫化鈉(1.43g、63%)用己烷洗淨後，添加甲苯(50mL)，依序滴入溶解於甲苯(10mL)之2-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-甲基-丙-1,3-二醇(2.26g)、溶解於甲苯(10mL)之甲磺酸[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基 ]酯(4.24g)後，回流3.5小時。將反應液注入冰冷水中，以矽藻土過濾，用乙酸乙酯萃取後，以水、飽和食鹽水洗淨，再用無水硫酸鈉乾燥後，餾去溶劑。將得到之殘餘物藉由矽膠層析精製，得到目的物(2.83g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.7 Hz),0.92(3H,s),1.20-1.55(34H,m),2.05(10H,m),2.77(4H,t,J=1.6 Hz),2.95(2H,s),3.25-3.40(8H,m),3.79(6H,s),5.28-5.44(8H,m),6.80(4H,m),7.14-7.34(7H,m),7.44(2H,m).
(參考例64) 2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1-醇
將參考例63之1-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)-[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙氧基]-苯基-甲基]苯(2.35g)溶解於四氫呋喃(10mL)、乙酸(5mL)中，並於50℃攪拌。3小時後，添加乙酸(5mL)，進一步攪拌12小時。餾去溶劑，添加四氫呋喃(20mL)、2N鹽酸(5mL)，攪拌40分鐘後，注入飽和碳酸氫鈉水溶液中，並以乙酸乙酯萃取，用飽和食鹽水洗淨及以無水硫酸鈉乾燥後，藉由矽膠管柱層析精製，得到目的物(1.2g)。
(參考例65) 4-溴丁酸[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯
將參考例64之2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1- 醇(208mg)溶解於二氯甲烷(10mL)中，添加N,N-二異丙基乙胺(294μL)、4-溴丁醯基氯(137μL)。攪拌110分鐘後，添加甲醇(2mL)並餾去溶劑，藉由矽膠管柱層析精製，得到目的物(260mg)。
(實施例36) 4-(氮雜環丁-1-基)丁酸[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(例示化合物6-73)
將參考例65之4-溴丁酸[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(260mg)溶解於四氫呋喃(3mL)、乙腈(3mL)中，添加氮雜環丁烷(114μL)、N,N-二異丙基乙胺(0.5mL)，並於50℃加熱15小時。餾去溶劑，藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀之目的物(74mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.8 Hz),0.93(3H,s),1.22-1.72(38H,m),2.00-2.12(10H,m),2.33(2H,t,J=1.8 Hz),2.41(2H,t,J=1.8 Hz),2.77(4H,t,J=1.6 Hz),3.18(4H,t,J=1.7 Hz),3.24(4H,s),3.35(4H,t,J=1.7 Hz),3.99(2H,s),5.28-5.44(8H,m).
MS(Q-TOF)m/z 742
(參考例66) 5-溴戊酸[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯
將參考例64之2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1- 醇(151mg)溶解於二氯甲烷(10mL)中，添加N,N-二異丙基乙胺(213μL)、5-溴戊醯基氯(113μL)。攪拌一夜後，添加5-溴戊醯基氯(113μL)，進一步攪拌4小時。添加甲醇(2mL)，將溶劑餾去，並藉由矽膠管柱層析精製，得到目的物(149mg)。
(實施例37) 5-(氮雜環丁-1-基)戊酸[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(例示化合物6-74)
將參考例66之5-溴戊酸[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(260mg)溶解於四氫呋喃(2mL)、乙腈(2mL)中，添加氮雜環丁烷(100μL)、N,N-二異丙基乙胺(0.5mL)，並攪拌一夜。餾去溶劑，藉由矽膠管柱層析精製，得到目的物(88mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.7 Hz),0.93(3H,s),1.24-1.70(40H,m),2.00-2.10(8H,m),2.26(2H,m),2.33(2H,t,J=1.8 Hz),2.65(2H,t,J=1.9 Hz),2.77(4H,t,J=1.6 Hz),3.24(4H,s),3.36(4H,t,J=1.6 Hz),3.52(4H,br),3.99(2H,s),5.28-5.43(8H,m).
MS(Q-TOF)m/z 756
(實施例38) 5-(二甲基胺基)戊酸[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(例示化合物6-61)
將參考例66之5-溴戊酸[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(194mg)溶解於四氫呋喃(2mL)中，添加二甲基胺(2N THF溶液，0.5mL)、N,N-二異丙基乙胺(0.5mL)，於50℃攪拌6小時。添加二甲基胺(2N THF溶液，0.5mL)後於50℃攪拌9小時，添加乙腈(2mL)、二甲基胺(2N THF溶液，0.5mL)，進一步於50℃攪拌10小時。餾去溶劑，藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀之目的物(51mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.7 Hz),0.93(3H,s),1.20-1.68(40H,m),2.00-2.10(6H,m),2.25(6H,s),2.29-2.36(4H,m),2.77(4H,t,J=1.6 Hz),3.25(4H,s),3.36(4H,t,J=1.6 Hz),3.99(2H,s),5.28-5.44(8H,m).
MS(Q-TOF)m/z 744
(實施例39) 4-(二甲基胺基)丁酸[2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙基]酯(例示化合物6-60)
將參考例65之2-甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]-2-[[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯氧基]甲基]丙-1-醇(168mg)溶解於四氫呋喃(3mL)中，添加二甲基胺(2NTHF溶液，0.5mL)、N,N-二異丙基乙胺(0.5mL)，於50℃攪拌6小時。添加二甲基胺(2N THF溶液，0.5mL)，進一步於50℃攪拌9小時，添加乙腈(2mL)、二甲基胺(2N THF溶液，0.5mL)，進一步於50℃攪拌10小時。餾去溶劑， 藉由矽膠管柱層析精製，得到油狀之目的物(110mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 0.89(6H,t,J=1.7 Hz),0.94(3H,s),1.22-1.42(32H,m),1.52(4H,m),1.80(2H,m),2.00-2.10(8H,m),2.23(6H,s),2.30(2H,t,J=1.9 Hz),2.35(2H,t,J=1.9 Hz),2.77(4H,t,J=1.7 Hz),3.36(4H,t,J=1.6 Hz),3.99(2H,s),5.28-5.43(8H,m).
MS(Q-TOF)m/z 730
(參考例67) (6Z,9Z,37Z,40Z)-23-[(烯丙氧基)-19,22,25,28-四氧雜四十六碳-6,9,37,40-四烯
在2,2’-{[3-(烯丙氧基)丙-1,2-二基]雙(氧基)}二乙醇(Babb,David A.氏，J.Heterocycle.Chem.1986,23,609-613：0.46g，2.09mmol)、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-醇(1.58g，4.59mmol)及硫酸氫四丁基銨(0.28g，0.84mmol)之甲苯(6.7mL)溶液中，添加50%氫氧化鈉水溶液(3.3mL)，於室溫反應20小時。用水稀釋後，以乙醚進行萃取，並將有機層用無水硫酸鎂乾燥。將得到之溶液之揮發成分減壓餾去，藉由施行矽膠層析，得到呈黃色液體之目的物(0.84g，56%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：0.90(6H,t,J=6.8 Hz),1.23-1.40(32H,m),1.52-1.61(4H,m),2.05(8H,q,J=6.8 Hz),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),3.45(4H,t,J=6.8 Hz),3.49-3.65(10H,m),3.69(1H,quint,J=5.4 Hz),3.76(2H,t,J=5.4 Hz),4.01(2H,d,J=5.4 Hz),5,16(1H,dd,J=1.5,10.7 Hz),5.26(1H,dd,J=1.5,17.1 Hz), 5.30-5.42(8H,m),5.90(1H,ddt,J=10.7,17.1,5.4 Hz).
(參考例68) 2,3-雙{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙氧基}丙-1-醇
在參考例67之(6Z,9Z,37Z,40Z)-23-[(烯丙氧基)-19,22,25,28-四氧雜四十六碳-6,9,37,40-四烯(0.84g，1.17mmol)及三氟乙酸(1.60g，14.06mmol)之乙醇(10.7mL)溶液中，添加肆(三苯基膦)鈀(0)(0.41g，0.35mmol)，於80℃反應6小時。於減壓下除去揮發成分後，用水處理，並以己烷-乙酸乙酯(4：1)進行萃取，將有機層藉由無水硫酸鎂乾燥。將得到之溶液之揮發成分減壓餾去，藉由施行矽膠層析法，得到為黃色液體之目的物(0.66g，83%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：0.90(6H,t,J=6.8 Hz),1.23-1.40(32H,m),1.54-1.62(4H,m),2.05(8H,q,J=6.8 Hz),2.77(4H,t,J=6.8 Hz),3.46(4H,dt,J=7.3,6.8 Hz),3.50-3.74(10H,m),3.88(dq,J=3.4,5.4 Hz),5.29-5.42(8H,m).
(實施例40) 4-(二甲基胺基)2,3-雙{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙氧基}丙酯(例示化合物1-8)
在參考例68之2,3-雙{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]乙氧基}丙-1-醇(0.10g，0.15mmol)、4-(二甲基胺基)丁酸鹽酸鹽及三乙基胺(0.08g，0.74mmol)之二氯甲烷(1.9mL)溶液中，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基) 碳化二亞胺鹽酸鹽(0.08g，0.74mmol)及4-二甲基胺基吡啶(2mg，0.0l5mmol)，並於室溫反應7小時。用水處理後，藉由二氯甲烷進行萃取，將有機層用無水硫酸鎂乾燥。將得到之溶液之揮發成分減壓餾去，藉由施行矽膠層析，得到呈淡黃色液體之目的物(0.03g，26%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：0.90(6H,t,J=6.8 Hz),1.22-1.40(32H,m),1.54-1.62(4H,m),1.79(2H,quint,J=7.3 Hz),2.05(8H,q,J=6.8 Hz),2.21(6H,s),2.27(2H,d,J=7.3 Hz),2.36(2H,d,J=7.3 Hz),2.78(4H,t,J=6.8 Hz),3.52-3.64(8H,m),3.70-3.76(3H,m),4.12(1H,dd,J=5.9,11.7 Hz),4.25(1H,dd,J=4.4,11.7 Hz),5.29-5.41(8H,m).
MS(TOFMS ES+)m/z 790.70[M+H]+
HRMS(TOFMS ES+)m/z 790.6950(2.5mmu)
(實施例41)封入雙股多核苷酸之核酸脂質粒子之調製
將封入siRNA之含有參考例45、46及實施例12、27至40記載之化合物之核酸脂質粒子，以與實施例23同様之方法調製。但是，PEG脂質係使用N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二肉荳蔻氧基丙基-3-胺(PEG-C-DMA)。
(實施例42)封入雙股多核苷酸之核酸脂質粒子之特性評價
實施例41中所調製之含有核酸脂質粒子之分散液之特性評價係以與實施例24同様之方式進行。將結果示於表16、17、18、及19中。
從以上之結果顯然可知當將雙股多核苷酸封入脂質粒子內時，此種核酸脂質粒子變得具有約100nm至約200nm之粒徑。
(試驗例4)
如以下之方式，比較使用新穎脂質調製之核酸脂質粒子所產生人類β-連環蛋白基因表現抑制活性之強度。
(1)轉染
將人類大腸癌SW480細胞株(來自人類大腸腺癌)在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum)之RPMI1640培養基(Invitrogen公司製)(培養用培養基)中調製成100,000個細胞/毫升之濃度。然後，在12孔平底培養盤(Corning 公司製)中各接種1mL，於37℃，5.0%二氧化碳下培養1日。將在實施例41中所調製之包含核酸脂質粒子之分散液(該核酸脂質粒子含有參考例45、46及實施例27至35記載之化合物)，以使培養基中最終雙股多核苷酸濃度成為3.0、0.3、及0.03nM之方式，用培養用培養基製成系列稀釋液後添加，再繼續培養3日。對於各濃度進行2次培養(N=2)。
(2)即時PCR
轉染後，從孔除去培養上清液，並用RNeasy 96套組(QIAGEN公司製)萃取mRNA。將得到之mRNA藉由iScriptTMcDNA合成套組(BIORAD公司製)，依照說明書之記載，從0.3μgRNA調製cDNA。繼而，使用即時PCR所用之針對人類β-連環蛋白基因之PCR引子(引子對ID：HA135664，Takara Bio公司製)、做為內部標準之針對人類-GAPDH基因之PCR引子(引子對ID：HA067812，Takara Bio公司製)及含有PCR所需要之藥劑之QuantiTect SYBR Green PCR套組(QIAGEN公司製)，依照以下之方式，進 行mRNA之定量。
β連環蛋白基因 ID：HA135664
正向引子 5’-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA-3’(序列編號3)
反向引子 5’-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3’(序列編號4)
GAPDH基因 ID：HA067812
正向引子 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(序列編號5)
反向引子 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(序列編號6)
在384孔PCR培養盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔，添加即時PCR套組所含之2×QuantiTect SYBR GREEN PCR主混合物10μL、不含RNase水7μL、各PCR引子2μL(最終濃度0.3μM)、調製之cDNA溶液1μL，將總量調成20μL，安裝於ABI PRISM® 7900HT序列檢測系統中(Applied Biosystems公司製)’依照以下之條件實施PCR。即時PCR，係針對從mRNA調製之cDNA，實施2次。
PCR初期活化 95℃，15分鐘
PCR 94℃，15秒
56℃，30秒
72℃，30秒
重複進行此PCR循環40次。
(3)即時PCR解析
校正線係使用從未經處理細胞(=NC)萃取之mRNA 所調製之cDNA5倍系列稀釋液。校正線係將原本各轉染物之人類β-連環蛋白及人類GAPDH定量，將人類β-連環蛋白基因量除以人類GAPDH量，求取相對量，以NC之相對量所補正之值做為相對值來作圖。圖中所示為N=2之平均值。
(a)基因抑制活性解析
調查在實施例41中所調製之含有參考例45、46及實施例27至35記載之化合物的核酸脂質粒子之分散液的β-連環蛋白基因表現抑制活性。
如第18圖所示，含有實施例27之化合物之核酸脂質粒子，與做為對照之含有參考例45、或參考例46之化合物之核酸脂質粒子相較，呈現更強之β-連環蛋白基因之表現抑制活性。因此，實施例27之化合物顯然為供調製呈現比參考例45、或參考例46之化合物更強活性之核酸脂質粒子用之有益新穎脂質。
又，如第19及20圖所示，含有實施例28、29、30、31、32、33、34、及35之化合物之核酸脂質粒子，與做為對照之含有DLin-DMA之核酸脂質粒子相較，呈現相同程度或更強之β-連環蛋白基因表現抑制活性。因此，實施例28、29、30、31、32、33、34、及35之化合物顯然為可供調製呈現與DLin-DMA相同程度或更強活性之核酸脂質粒子用之有益新穎脂質。
(試驗例5)
如以下之方式，比較使用新穎脂質所調製之核酸脂質粒子所產生之人類β-連環蛋白基因表現抑制活性之強 度。
(1)轉染
將人類大腸癌SW480細胞株(來自人類大腸腺癌)在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum)之RPMI1640培養基(Invitrogen公司製)(培養用培養基)中，調製成50,000個細胞/毫升之濃度。然後，在96孔平底培養盤(Falcon公司製)中各接種100μL，於37℃，5.0%二氧化碳下，培養1日。將在實施例41中所調製之包含核酸脂質粒子(該核酸脂質粒子含有實施例12以及實施例36至40記載之化合物)之分散液，以培養基中最終雙股多核苷酸濃度成為30、3.0、0.3、及0.03nM之方式，在培養用培養基中製作成系列稀釋液後，添加於除去培養上清液之細胞中，再繼續培養3日。於各濃度進行3次(N=3)培養。
(2)即時PCR
來自經轉染細胞之即時PCR測定用溶裂物(lysate)及cDNA係使用TaqMan® Fast-Cells-to-Ct kit(Ambion公司)依照說明書之記載來調製。調製溶裂物時，係使用添加有DNase I之溶裂溶液(lysis solution)。關於即時PCR用探針，供人類β-連環蛋白基因用者，係使用TaqMan® Gene Expression Assays(CTNNB1，FAM探針)(Hs00355045_m1，Applied Biosystems公司製)，做為內部標準者，係使用人類-GAPDH基因探針，即人類GAPD(GAPDH)內源性對照(VIC/MGB探針，Primer Limited(4326317E，Applied Biosystems公司製)。在384孔PCR培養盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔中，添加TaqMan®快速進階主 混合物(TaqMan® Fast Advanced Master Mix)5μL、不含RNase之水2μL、各基因探針0.5μL、調製之cDNA溶液2μL，將總量調成10μL，並安裝於ViiATM7即時PCR系統(Applied Biosystem公司製)中，依照以下之條件實施PCR。對於從溶裂物所調製之cDNA，實施4次(N=4)即時PCR。
PCR初期活化 95℃，20秒
PCR 95℃，1秒
62℃，20秒
重複進行此PCR 40次。
(3)即時PCR解析
定量解析係依照△△Ct法進行。求取從各轉染物之人類β-連環蛋白與人類GAPDH之Ct值之差(△Ct)減去未處理細胞(=NC)之△Ct所得之值(△△Ct)，相對於NC之相對值(RQ)係依照以下之公式計算。圖中表示N=3之平均值。
RQ=2-△△Ct
其結果，如第21、22圖及第26圖所示，含有實施例12、36、37、38、39及40之化合物之核酸脂質粒子與做為對照之含有DLin-DMA之核酸脂質粒子相同程度或更強地抑制β-連環蛋白基因之表現。因此，實施例12、36、37、38、39及40之化合物顯然為可供調製呈現與DLin-DMA相同程度或更強活性之核酸脂質粒子用之有益新穎脂質。
(試驗例6)
如以下之方式，比較使用新穎脂質所調製之核酸脂 質粒子所產生之人類β-連環蛋白基因表現抑制活性之強度。
(1)轉染
將人類肝臓癌HepG2細胞株(來自人類肝臓癌)在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum)之DMEM培養基(Invitrogen公司製)(培養用培養基)中，調製成50000個細胞/毫升之濃度。然後，在96孔平底培養盤(Falcon公司製)中各接種100μL，並於37℃，5.0%二氧化碳下培養1日。將實施例41中所調製之包含核酸脂質粒子之分散液(該核酸脂質粒子含有實施例37至39記載之化合物)，以在培養基中最終雙股多核苷酸濃度成為30、3、0.3、及0.03nM之方式，在培養用培養基中製作系列稀釋液後，添加於除去培養上清液之細胞中，再繼續培養3日。對於各濃度進行3次(N=3)培養。
(2)即時PCR
來自經轉染細胞之即時PCR測定用之溶裂物及cDNA係使用TaqMan® Fast-Cells-to-Ct kit(Ambion公司)依照說明書之記載調製。調製溶裂物時，係使用添加DNase I之溶裂溶液(lysis solution)。關於即時PCR用之探針，對於人類β-連環蛋白基因，係使用TaqMan® Gene Expression Assays(CTNNB1、FAM探針)(Hs00355045_m1，Applied Biosystems公司製)，做為內部標準者，係使用人類-GAPDH基因探針，即人類GAPD(GAPDH)內源性對照(VIC/MGB探針，Primer Limited(4326317E、Applied Biosystems公司製)。在384孔PCR培養盤(Applied Biosystems公司製)之每1孔中，添加TaqMan® Fast Advanced Master Mix 5μL、不含RNase之水2μL、各探針0.5μL、調製之cDNA溶液2μL，並將總量調成10μL，安裝於ViiATM7即時PCR系統(Applied Biosystem公司製)中，依照以下之條件實施PCR。對於從溶裂物調製之cDNA，實施4次(N=4)即時PCR。
PCR初期活化 95℃，20秒
PCR 95℃，1秒
62℃，20秒
重複進行此PCR循環40次。
(3)即時PCR解析
定量解析係依照△△Ct法進行。求取從各轉染物之人類β-連環蛋白與人類GAPDH之Ct值之差(△Ct)減去未處理細胞(=NC)之△Ct所得之值(△△Ct)，相對於NC之相對值(RQ)係依照以下之公式計算。圖中表示N=3之平均值。
RQ=2-△△Ct
其結果如第23及24圖所示，含有實施例37、38及39之化合物之核酸脂質粒子呈現與做為對照之含有DLin-DMA之核酸脂質粒子相同程度之β-連環蛋白基因表現抑制活性。因此，實施例37、38及39之化合物顯然為可供調製呈現與DLin-DMA相同程度之活性之核酸脂質粒子用之有益新穎脂質。
(實施例43)封入雙股多核苷酸之核酸脂質粒子之調製
為了調製具有抗腫瘤活性之核酸脂質粒子，將包含封入siRNA之實施例記載之化合物(LP)的核酸脂質粒子 ，以與實施例23同様之方法調製。但是，PEG脂質係使用N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二棕櫚氧基丙基-3-胺(PEG-C-DPA)、N-[甲氧基聚(乙二醇)2000]胺甲醯基]-1,2-二硬脂氧基丙基-3-胺(PEG-C-DSA)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇、或1,2-二硬脂醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇之任一種，並使用DPPC代替DSPC。以DPPC：Chol：LP：PEG脂質=7：33.5：57：2.5之莫耳比調製脂質溶液。
就siRNA而言，使用在文獻J.Clin.Invest.2009,119,661-673中所記載之雙股多核苷酸PLK1424-2/A。雙股多核苷酸PLK1424-2/A係由多核苷酸PLK1424-2：HO-Arp-Grp-Arp-Um1p-Crp-Arp-Crp-Crp-Crp-Um1p-Crp-Crp-Urp-Um1p-Arp-Arp-Arp-Um1p-Arp-Urp-Urt-H(序列表之序列編號7)以及多核苷酸PLK1424-A：HO-Urp-Arp-Urp-Urp-Urp-Arp-Arp-Gm1p-Grp-Arp-Grp-Grp-Grp-Urp-Grp-Arp-Um1p-Crp-Urp-Urp-Urt-H(序列表之序列編號8)所構成。
(實施例44)封入雙股多核苷酸之核酸脂質粒子之特性評價
在實施例43中所調製之含有核酸脂質粒子之分散液之特性評價係以與實施例24同様之方式進行。
(試驗例7)Hep3B細胞(人類肝臓癌細胞)中實施例化合物之細胞増殖抑制活性之測定
就培養基而言，使用MEM(Invitrogen公司製)(含有10%牛胎仔血清(Hyclone公司製)、1mM丙酮酸鈉(Invitrogen公司製)及1×非必需胺基酸(Invitrogen公司製 ))，以一定之密度，將人類肝臓癌細胞株Hep3B細胞配置於96孔培養盤(150μL/孔)中，繼而於37℃，5% CO2培養24小時。以最終濃度成為0.01、0.03、0.1、0.3、1及3μM之方式，將在實施例43中所調製之包含核酸脂質粒子之分散液追加於各孔，繼而培養72小時(3日)。培養72小時(3日)後，使用MTT檢驗法，測定實施例化合物之細胞増殖抑制活性。總之，將20μL之MTT溶液(藉由PBS調成5mg/ml)追加於各孔，於37℃，5%CO2下培養4小時。去除培養上清液後，將DMSO(150μL)追加於各孔，振動5分鐘。藉由培養盤讀取器(plate reader)(SpectraMaxPlus384，Molecular Devices Corporation製)，測定培養盤之吸光度(540nm)。決定化合物投與群之生存細胞數與未處理細胞群之生存細胞數之相對比率，然後計算抑制50%細胞増殖之濃度(IC50)。
(試驗例8)實施例化合物之活體內抗腫瘤試驗
經1週之馴化飼育後，將1×107個培養之人類Hep3B細胞移植至裸小鼠之側腹部皮下。在移植腫瘤約2週後，將腫瘤體積依指標分群，將在實施例43中所調製之包含核酸脂質粒子之分散液(投與量：1或3mg/kg等)投與至小鼠尾静脈內，一週投與2次至3次。對照群係投與PBS。進行腫瘤直徑之測定，觀察腫瘤體積之推移。
在驗證活體內基因失活(in vivo knockdown)之情況，係在投與之翌日，從罹癌小鼠採取腫瘤塊，使用QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN公司製)及氯仿將核酸萃取後，依照附加於RNeasy迷你套組(QIAGEN公司製)之規程 (protocol)精製全部RNA。使用該全部RNA並藉由TaqmanPCR來定量標的分子之mRNA。
[產業上之可利用性]
根據本發明，可提供藉由與兩親媒性脂質、膽固醇、PEG-脂質組合而形成脂質粒子之新穎陽離子性脂質。
又，根據本發明，可提供含有該陽離子性脂質之脂質粒子。
再者，根據本發明，可提供在該脂質粒子中進一步含有核酸之核酸脂質粒子。可將本發明之該核酸脂質粒子做成醫藥組成物。
第1圖係顯示合成式(Ia)所示之陽離子性脂質所使用之A法及B法之概要之圖。
第2圖係顯示式(Ib)所示之陽離子性脂質之合成方法(C法)以及式(Ic)所示之陽離子性脂質之合成方法(D法)之概要之圖。
第3圖係顯示式(Id)所示之陽離子性脂質之合成方法(E法)以及式(Ie)所示之陽離子性脂質之合成方法(F法)之概要之圖。
第4圖係顯示式(If)所示之陽離子性脂質之合成方法(G法)以及式(Ig)或式(Ih)所示之陽離子性脂質之合成方法(H法)之概要之圖。
第5圖係顯示式(Ii-1)、(Ii-1a)、(Ii-2)及(Ii-2a)所示之陽離子性脂質之合成方法(I法)之概要之圖。
第6圖係顯示式(Ij)所示之陽離子性脂質之合成方法 (J法)、式(Ik)所示之陽離子性脂質之合成方法(K法)、及式(Il)所示之陽離子性脂質之合成方法(L法)之概要之圖。
第7圖係顯示構成核酸脂質粒子之核酸之中，具有雙股構造之核酸之構造之圖。圖中，上為正義鏈，下為反義鏈。符號之中，白方形(□)表示RNA，黒圓形(●)表示DNA、白圓形(○)表示2’-O-甲基RNA。各符號間之線表示核苷間之磷酸二酯鍵。圖中之p表示-P(=O)(OH)-，在p鍵結之情況，多核苷酸之末端羥基之氫原子被除去。在多核苷酸之末端沒有任何鍵結之情況，RNA、DNA或2’-O-甲基RNA之3’末端或5’末端為OH基。X為說明書中「3-4-2.修飾雙股多核苷酸」項所記載之修飾反義鏈之5’末端之化合物。連接子(linker)為說明書中「3-4-3.修飾單股多核苷酸」項所記載之多核苷酸之連接子。
第8圖係顯示M法之概要之圖。
第9圖係顯示N法之概要之圖。
第10圖係顯示O法及P法之概要之圖。
第11圖係顯示Q法及R法之概要之圖。
第12圖係顯示S法之概要之圖。
第13圖係顯示包含1,2-二亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLin-DMA)、於實施例1、實施例2及實施例3中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白(β-catenin)基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第14圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例1、實施例4、實施例5及實施例6中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第15圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例7、實施例8及實施例9中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第16圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例13至實施例17中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第17圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例18至實施例22中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第18圖係顯示包含參考例45、參考例46及實施例27中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第19圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例28及實施例29中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組 之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第20圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例30至實施例35中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第21圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例36及實施例37中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第22圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例38至實施例40中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第23圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例37中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第24圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例38及實施例39中所記載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
第25圖係顯示式(Im)所示之陽離子性脂質之合成方法(T法)以及式(In)所示之陽離子性脂質之合成方法(U法)之概要之圖。
第26圖係顯示包含DLin-DMA及於實施例12中所記 載之化合物之核酸脂質粒子分散液之β-連環蛋白基因表現抑制活性之圖。縱軸顯示相對於對照組之相對活性。「NC」表示不含核酸脂質粒子之對照組。
[序列表，自由文本格式(freetext)]
序列編號1：CT-157
序列編號2：CT-169
序列編號3：β連環蛋白基因正向引子
序列編號4：β連環蛋白基因反向引子
序列編號5：GAPDH基因正向引子
序列編號6：GAPDH基因反向引子
序列編號7：PLK1424-2
序列編號8：PLK1424-A
<110> DAIICHI SANKYO COMPANY,LTD.
<120> 新穎脂質
<130> DSPCT-FP1203
<150> JP 2011-024732
<151> 2011-02-08
<150> JP 2011-133642
<151> 2011-06-15
<160> 8
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 正義股
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> cm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (4)..(4)
<223> cm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 2’-O-甲基腺苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 2’-O-甲基腺苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (10)..(10)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> gm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (14)..(14)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (16)..(16)
<223> 2’-O-甲基腺苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (18)..(18)
<223> 2’-O-甲基腺苷
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 反義股
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (3)..(3)
<223> gm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (5)..(5)
<223> gm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (9)..(9)
<223> cm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (11)..(11)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (13)..(13)
<223> cm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (15)..(15)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (19)..(19)
<223> cm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (21)..(21)
<223> um
<400> 2
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> β-連環蛋白基因正向引子
<400> 3
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> β-連環蛋白基因反向引子
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> GAPDH正向引子
<400> 5
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> GAPDH反向引子
<400> 6
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人造
<220>
<223> PLK1424-2
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (4)..(4)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (10)..(10)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (14)..(14)
<223> um
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (18)..(18)
<223> um
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人造
<220>
<223> PLK1424-A
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> gm
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> um
<400> 8

Claims (103)

  1. 一種通式(I)所示之陽離子性脂質 [式中，R1及R2獨立表示C1-C3烷基或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷，且R3表示下列基： 或者，R1表示C1-C3烷基且R2及R3與此等所鍵結之氮原子一起形成經R7及R8取代之環狀胺；R7表示基-CH2-O-L1-R4、基-O-R4、或氫原子；R8表示基-CH2-O-L2-R5、基-O-R5、或基-CH(OR4)CH2-O-R5(但是，在R7為基-O-R4之情況，R8不為基-O-R5；在R7為氫原子之情況，R8為基-CH(OR4)-CH2-O-R5)；L1及L2獨立表示單鍵、基-CH2CH2O、基-CH(CH3)CH2O、或基-CH2CH(CH3)O；R4及R5獨立表示C9-C24脂肪族飽和或不飽和烴基；R6表示氫原子、羥基或C1-C3烷氧基；R9表示氫原子或甲基；Z1表示單鍵或、基-C(O)O-； Z2表示基-C(O)O-；Z1為基-C(O)O-之情況，m表示2、3、4或5，Z1為單鍵之情況，m表示0或1；n表示2、3、4或5；(但是，排除R1及R2皆為C1-C3烷基，且L1、L2及Z1同時為單鍵者)]。
  2. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷，且R3表示基
  3. 如申請專利範圍第2項之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷。
  4. 如申請專利範圍第2或3項之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示2、3、4或5。
  5. 如申請專利範圍第2或3項之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-，m表示2、3或4。
  6. 如申請專利範圍第2或3項之陽離子性脂質，其中Z1表示單鍵；m表示0。
  7. 如申請專利範圍第2至6項中任一項之陽離子性脂質，其中L1表示基-CH2CH2O；L2表示基-CH2CH2O。
  8. 如申請專利範圍第2至6項中任一項之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示基-CH2CH2O、基-CH(CH3)CH2O、或基-CH2CH(CH3)O。
  9. 如申請專利範圍第2至8項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基。
  10. 如申請專利範圍第2至8項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基。
  11. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基
  12. 如申請專利範圍第11項之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷。
  13. 如申請專利範圍第11或12項之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示3、4或5。
  14. 如申請專利範圍第11或12項之陽離子性脂質，其中Z1表示基-C(O)O-；m表示3或4。
  15. 如申請專利範圍第11或12項之陽離子性脂質，其中Z1表示單鍵；m表示0。
  16. 如申請專利範圍第11至15項中任一項之陽離子性脂質，其中L1表示基-CH2CH2O；L2表示基-CH2CH2O。
  17. 如申請專利範圍第11至16項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基。
  18. 如申請專利範圍第11至16項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基。
  19. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基
  20. 如申請專利範圍第19項之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷。
  21. 如申請專利範圍第19或20項之陽離子性脂質，其中R9表示氫原子或甲基；Z1表示基-C(O)O-；m表示3、4或5。
  22. 如申請專利範圍第19或20項之陽離子性脂質，其中R9表示氫原子或甲基；Z1表示基-C(O)O-；m表示3或4。
  23. 如申請專利範圍第19或20項之陽離子性脂質，其中R9表示氫原子；Z1表示單鍵；m表示0。
  24. 如申請專利範圍第19或23項之陽離子性脂質，其中L1表示基-CH2CH2O；L2表示基-CH2CH2O。
  25. 如申請專利範圍第19至24項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基。
  26. 如申請專利範圍第19至24項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基。
  27. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基
  28. 如申請專利範圍第27項之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷。
  29. 如申請專利範圍第27或28項之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵。
  30. 如申請專利範圍第27至29項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基。
  31. 如申請專利範圍第27至29項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基。
  32. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示基
  33. 如申請專利範圍第32項之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷。
  34. 如申請專利範圍第32或33項之陽離子性脂質，其中n表示3、4或5。
  35. 如申請專利範圍第32或33項之陽離子性脂質，其中n表示3或4。
  36. 如申請專利範圍第32至35項中任一項之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵。
  37. 如申請專利範圍第32至36項中任一項之陽離子性脂質，其中R6為羥基。
  38. 如申請專利範圍第32至37項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基。
  39. 如申請專利範圍第32至37項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基。
  40. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其中R1及R2獨立表示C1-C3烷基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷；且R3表示
  41. 如申請專利範圍第40項之陽離子性脂質，其中R1及R2表示甲基，或與此等所鍵結之氮原子一起形成氮雜環丁烷。
  42. 如申請專利範圍第40或41項之陽離子性脂質，其中n表示3、4或5。
  43. 如申請專利範圍第40或41項之陽離子性脂質，其中n表示3或4。
  44. 如申請專利範圍第40至43項中任一項之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵。
  45. 如申請專利範圍第40至44項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基。
  46. 如申請專利範圍第40至44項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基。
  47. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其中R1表示C1-C3烷基；且R2及R3與此等所鍵結之氮原子一起形成經R7及R8取代之環狀胺。
  48. 如申請專利範圍第47項之陽離子性脂質，其中L1表示單鍵；L2表示單鍵。
  49. 如申請專利範圍第47或48項之陽離子性脂質，其中環狀胺表示吡咯啶或氮雜環丁烷。
  50. 如申請專利範圍第47或48項之陽離子性脂質，其中環狀胺表示吡咯啶。
  51. 如申請專利範圍第47至50項中任一項之陽離子性脂質，其中R7表示基-CH2-O-L1-R4；R8表示基-CH2-O-L2-R5。
  52. 如申請專利範圍第47至50項中任一項之陽離子性脂質，其中R7表示基-CH2-O-L1-R4；R8表示基-O-R5。
  53. 如申請專利範圍第51或52項之陽離子性脂質，其中R7及R8係取代在同一碳上。
  54. 如申請專利範圍第47至50項中任一項之陽離子性脂質，其中R7表示氫原子；R8表示基-CH(OR4)CH2-O-R5。
  55. 如申請專利範圍第47至54項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5獨立表示亞麻基、次亞麻基或油基。
  56. 如申請專利範圍第47至54項中任一項之陽離子性脂質，其中R4及R5表示亞麻基。
  57. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  58. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  59. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  60. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  61. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  62. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  63. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  64. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  65. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  66. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  67. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  68. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  69. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  70. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  71. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  72. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  73. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  74. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  75. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  76. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  77. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  78. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  79. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  80. 如申請專利範圍第1項之陽離子性脂質，其係以式 表示。
  81. 一種脂質粒子，其含有如申請專利範圍第1至80項中任一項之陽離子性脂質。
  82. 如申請專利範圍第81項之脂質粒子，其含有減低脂質粒子形成時之凝集之脂質。
  83. 如申請專利範圍第82項之脂質粒子，其中減低脂質粒子形成時之凝集之脂質為PEG-脂質。
  84. 如申請專利範圍第83項之脂質粒子，其中PEG-脂質為式 所示之1,2-二月桂醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、式 所示之1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、式 所示之1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇、或式 所示之1,2-二硬脂醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇。
  85. 如申請專利範圍第83項之脂質粒子，其中PEG-脂質為式 所示之1,2-二肉荳蔻醯基-sn-甘油．甲氧基聚乙二醇。
  86. 如申請專利範圍第83至85項中任一項之脂質粒子，其中PEG之分子量為1,000至5,000。
  87. 如申請專利範圍第83至85項中任一項之脂質粒子，其中PEG之分子量為1,800至2,200。
  88. 如申請專利範圍第81至87項中任一項之脂質粒子，其含有固醇。
  89. 如申請專利範圍第88項之脂質粒子，其中固醇為膽固醇。
  90. 如申請專利範圍第81至89項中任一項之脂質粒子，其含有兩親媒性脂質。
  91. 如申請專利範圍第90項之脂質粒子，其中兩親媒性脂質為選自二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二肉荳蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、及神經鞘磷脂(SM)中之至少一種。
  92. 如申請專利範圍第90項之脂質粒子，其中兩親媒性脂質為二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)或二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)。
  93. 一種核酸脂質粒子，其含有如申請專利範圍第81至92項中任一項之脂質粒子及核酸。
  94. 如申請專利範圍第93項之核酸脂質粒子，其中核酸為選自由單股DNA、單股RNA、DNA與RNA所混合成之單股多核苷酸、雙股DNA、雙股RNA、DNA-RNA之雜合多核苷酸、及DNA與RNA所混合成之2種多核苷酸所構成之族群中之任一種。
  95. 如申請專利範圍第93項之核酸脂質粒子，其中核酸為具有RNA干擾作用之單股或雙股多核苷酸。
  96. 如申請專利範圍第93至95項中任一項之核酸脂質粒子 ，其中平均粒徑為約30nm-約300nm。
  97. 如申請專利範圍第93至95項中任一項之核酸脂質粒子，其中平均粒徑為約30nm-約100nm。
  98. 一種醫藥，其含有如申請專利範圍第93至97項中任一項之核酸脂質粒子，做為有效成分。
  99. 如申請專利範圍第98項之醫藥，其係用於治療或預防由標的基因表現所引起之疾病。
  100. 如申請專利範圍第99項之醫藥，其中由標的基因表現所引起之疾病為癌。
  101. 一種標的基因之表現抑制方法，其係藉由將如申請專利範圍第93至97項中任一項之核酸脂質粒子投與至哺乳動物。
  102. 一種用於治療或預防由標的基因表現所引起之疾病之方法，其係藉由將如申請專利範圍第93至97項中任一項之核酸脂質粒子投與至哺乳動物。
  103. 如申請專利範圍第102項之方法，其中由基因表現所引起之疾病為癌。
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