WO2023095845A1 - 溶菌方法、及び細菌検出方法 - Google Patents

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克佳 高橋
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Definitions

  • the present invention relates to a bacteriolysis method for lysing multiple types of bacterial groups in a specimen, and a bacterium detection method using the bacteriolysis method.
  • the present invention further relates to a bacteriolytic agent, a lysis kit, and a bacterium detection kit for use in the bacteriolysis method.
  • Patent Documents 1 and 2 JP 2017-32579 and WO 2015/093544 disclose techniques for detecting Staphylococcus aureus by antigen-antibody reaction based on its ribosomal protein L7/L12. It is described that lysostaphin is sometimes used as a bacteriolytic agent to lyse bacteria in the sample.
  • Patent Document 3 International Publication No. 2015/093545 discloses a technique for detecting E. coli by an antigen-antibody reaction based on its ribosomal protein L7/L12. It is described to lyse the bacteria in the specimen.
  • Patent Documents 1 to 3 were unable to lyse multiple types of bacteria at the same time. For this reason, when detecting multiple types of bacteria at the same time, it is necessary to lyse each bacterial genus with a separate bacteriolytic agent, resulting in complicated and delayed bacteriolytic treatment.
  • the gist of the present invention relates to, for example, the following.
  • a method for lysing multiple types of bacterial groups containing at least one type of Gram-positive bacteria and/or Gram-negative bacteria in a specimen comprising a step of treating the specimen with a solution containing a surfactant and a lytic enzyme. wherein said surfactant is selected from amine oxides and quaternary ammoniums.
  • the plurality of species of bacteria includes at least one or more Gram-positive bacteria and at least one or more Gram-negative bacteria.
  • the surfactant is one or more amine oxides.
  • amine oxide is N,N-dimethyldodecylamine N-oxide (DDAO).
  • DDAO N,N-dimethyldodecylamine N-oxide
  • concentration of the amine oxide in the solution during treatment with the specimen is 0.01 to 0.2% by mass.
  • surfactant is one or more quaternary ammonium salts.
  • a method according to item 6, wherein the quaternary ammonium salt is benzalkonium chloride.
  • concentration of the quaternary ammonium salt in the solution during treatment with the specimen is 0.005 to 0.08% by mass.
  • a method for detecting multiple types of bacterial groups in a specimen comprising: A step of lysing multiple types of bacteria in a sample by the method according to any one of items 1 to 13; A detection method comprising detecting with the resulting antibody.
  • the method according to item 14 wherein the plurality of species of bacteria in the sample to be detected includes at least one or more Gram-positive bacteria and at least one or more Gram-negative bacteria.
  • a method according to item 14 or 15, wherein the step of detecting is performed by immunochromatography.
  • the method according to any one of items 14 to 16, wherein the bacterial antigen released by the lysing step is the L7 antigen.
  • a lysis kit used in the method according to any one of items 1 to 13, for lysing multiple types of bacterial groups containing at least one type of Gram-positive bacteria and/or Gram-negative bacteria in a specimen comprising a surfactant and a lysis enzyme.
  • a method for detecting the presence and/or abundance of bacteria in a specimen comprising: (I) a step of lysing bacteria in the specimen by the method according to any one of items 1 to 13; (II) Through an antigen-antibody reaction between the sample, the capturing antibody immobilized on the solid-phase carrier, and the labeling antibody having a label for detection, the antigen derived from the bacteria in the sample is captured and the antigen derived from the bacteria in the sample is captured.
  • One of the capturing antibody and the labeling antibody is one or more general-purpose antibodies that cause an antigen-antibody reaction with antigens derived from bacteria of five or more genera including bacteria, and the capturing antibody and the labeling antibody A method, wherein the other of the antibodies is one or more specific antibodies that cause an antigen-antibody reaction with one or more genera of bacteria.
  • a method according to item 20 wherein two or more types of bacteria in a specimen are detected at a single capturing antibody immobilization site.
  • bacteria of multiple genera can be lysed at the same time, and the efficiency and speed of bacteriolysis can be improved. It becomes possible. As a result, detection of multiple genera of bacteria using intracellular antigens of bacteria and the like can be made more efficient and faster.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing a schematic configuration of a strip-shaped detection mechanism, which is an example of a detection mechanism of a lateral flow type immunochromatography detection device.
  • Figure 2 shows the final concentration of N,N-dimethyldodecylamine N-oxide (DDAO) used as a surfactant when a specimen containing E. coli (EC) or Staphylococcus aureus (SA) is detected by immunochromatography. It shows the results of measuring the test line strength by changing.
  • Fig. 3 shows the test line intensity measured by changing the final concentration of benzalkonium chloride used as a surfactant when a sample containing E. coli (EC) or Staphylococcus aureus (SA) is detected by immunochromatography.
  • DDAO N,N-dimethyldodecylamine N-oxide
  • FIG. 4 shows the test line intensity measured by immunochromatographic detection of a sample containing Staphylococcus aureus (SA), using DDAO as a surfactant and varying the final concentration of lysostaphin used as a lytic enzyme. Show the results.
  • FIG. 4(a) shows all the data
  • FIG. 4(b) shows the horizontal axis (lysostaphin final concentration) enlarged in the range of 0 to 1.0 ⁇ g/ml.
  • FIG. 5 shows the test line intensity when detecting a sample containing Staphylococcus aureus (SA) by immunochromatography, using benzalkonium chloride as a surfactant and changing the final concentration of lysostaphin used as a lytic enzyme. (Fig. 5a).
  • FIG. 5b shows a graph in which the horizontal axis of FIG. 5a is expanded to the range of 0-1.0 ⁇ g/ml.
  • One aspect of the present invention relates to a method for lysing multiple types of bacterial groups. Another aspect of the present invention relates to a method for detecting multiple types of bacterial groups in a specimen, comprising the step of lysing multiple types of bacterial groups. Still another aspect relates to a bacteriolysis agent or lysis kit used in the bacteriolysis method, and a bacterium detection kit for detecting multiple types of bacterial groups in a sample.
  • the bacteriolysis method of the present invention includes a step of treating a specimen in a solution containing a surfactant and a lytic enzyme to lyse the above-mentioned plurality of bacterial groups present in the specimen.
  • the bacteria lysed by the lysis method of the present invention are then subjected to immunological techniques.
  • the immunological technique may be any detection technique using an antigen-antibody reaction such as immunochromatography, Western blotting, ELISA, immunoprecipitation, and immunoturbidimetry. Immunochromatography is preferred.
  • the bacteriolysis method of the present invention can be said to be a bacteriolysis method for detection by an immunological technique.
  • the step of lysing the plurality of types of bacteria may be any method as long as the sample is treated in a solution containing a surfactant and a lytic enzyme.
  • a predetermined amount of a solution containing a surfactant and a predetermined amount of a solution containing a lytic enzyme to each predetermined amount of a sample, treatment in the solution containing the surfactant and the lytic enzyme is achieved. be done.
  • Such treatment may be referred to as reaction.
  • the reaction in the solution containing the analyte surfactant and lytic enzyme occurs if the analyte, surfactant, and lytic enzyme are present in the solution, and may optionally be mixed or stirred.
  • the solution containing the surfactant and the solution containing the lytic enzyme may be provided as separate solutions or previously provided as one solution.
  • at least one or both of the surfactant and lytic enzyme may be provided as a dry product and reconstituted in any liquid for use.
  • Any such liquid may be a liquid sample.
  • the liquid sample may be a sample itself that is liquid, or if the sample is solid, it may be a sample suspended in a liquid such as a buffer solution.
  • a solution may be obtained by adding at least one or both of the surfactant and the lytic enzyme dried product directly to the liquid sample, or a solution obtained by adding the dried product to a liquid such as water may be used as the sample. may be reacted.
  • a solution or dry product containing the lytic enzyme and/or surfactant may be provided in an encapsulated form.
  • a solution may be formed by previously placing a dried surfactant and/or lytic enzyme or capsules in a container for holding a liquid sample, and then adding the liquid sample. Dry matter or capsules may be added separately to the liquid specimen.
  • a dry product or capsule of a surfactant and a lytic enzyme is placed in the pad of an immunochromatographic strip, and when a liquid sample is applied to the strip, the reaction with the solution containing the surfactant and the lytic enzyme may be achieved.
  • the reaction time in the solution containing the surfactant of the specimen and the lytic enzyme may be any time that causes bacteriolysis, for example, 10 seconds or longer, 30 seconds or longer, or 1 minute or longer. Although the upper limit of the reaction time is not particularly limited, it is preferably within 1 hour, within 30 minutes, within 10 minutes, or within 5 minutes from the viewpoint of performing the operation quickly.
  • the specimen and the solution containing the surfactant and the lytic enzyme may be further stirred.
  • the plurality of bacterial groups to be lysed are not limited, but are selected from at least one or more Gram-positive bacteria and at least one or more Gram-negative bacteria. More preferably, the multi-species bacterial group includes at least one or more Gram-positive bacteria and at least one or more Gram-negative bacteria. Even more preferably, the multi-species bacterial group includes bacteria of the genus Staphylococcus, which are Gram-positive bacteria, and other bacteria.
  • Gram-positive and Gram-negative bacteria are classified by Gram staining, and are known to have significant differences in cell wall composition and structure. That is, they all contain peptidoglycan, but peptidoglycan forms a thick layer with teichoic acid, lipoteichoic acid, and other proteins in the cell walls of Gram-positive bacteria, whereas the cell walls of Gram-negative bacteria have peptidoglycan.
  • the peptidoglycan is localized in a relatively thin layer, with an outer layer consisting of an outer leaflet composed of lipopolysaccharides and an inner leaflet composed of phospholipids.
  • Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Staphylococcus, Bacillus, Streptococcus, Corynebacterium, Bacteria such as Listeria and Clostridium can be mentioned. Among them, bacteria belonging to the genus Staphylococcus or Bacillus are preferably included.
  • Gram-negative bacteria include, but are not limited to Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Helicobacter, Legionella. , Campylobacter, Vibrio, Yersinia and other bacteria. Among them, bacteria belonging to the genus Escherichia or Pseudomonas are preferably included.
  • the specimen is preferably, but not limited to, a food or environmental specimen.
  • a food sample refers to any sample obtained from any food or drink.
  • the food sample may be the food product itself, or a sample obtained by diluting, crushing, swabbing and/or suspending the food product.
  • An environmental analyte refers to any analyte obtained from the environment.
  • An example is a sample that is swabbed from the surface of a material and dispersed in a solution.
  • any surfactant can be used as the surfactant as long as it has a bacteriolytic action. be done.
  • sodium dodecyl sulfate is a strong surfactant and can lyse almost all bacteria, but it destroys the structure of antibodies used in immunological techniques, so it is used in the lysis method of the present invention.
  • Surfactants that do not interfere with immunological techniques after lysis, particularly immunochromatography include, but are not limited to, amine oxides, quaternary ammonium salts, aliphatic amine salts, betaine, and the like. Among them, amine oxides and quaternary ammonium salts are preferred.
  • Amine oxides include, but are not limited to, N,N-dimethyl-C 8-20 alkyl-amine N-oxides (eg, N,N-dimethyldodecylamine N-oxide, N,N-dimethylcaprylamine N-oxide), pyridine N-oxide, N-methylmorpholine N-oxide and the like. Among them, N,N-dimethyldodecylamine N-oxide and the like are preferable.
  • Quaternary ammonium salts include, but are not limited to, benzalkonium chloride (benzalkonium chloride), tetramethylammonium chloride, tetraethylammonium chloride, tetrapropylammonium chloride, tetrabutylammonium chloride, benzyltrimethylammonium chloride. , benzyltriethylammonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride, benzethonium chloride, benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride and the like. Among them, benzalkonium chloride and the like are preferable.
  • the concentration of the surfactant in the bacteriolysis of the present invention is not limited, but the concentration in the liquid during the reaction with the specimen is, for example, 0.005% by mass or more, or 0.01% by mass or more, or 0 02% by mass or more, and preferably 0.2% by mass or less, or 0.15% by mass or less, or 0.1% by mass or less, for example.
  • the concentration of the amine oxide in the bacteriolysis method of the present invention is not limited.
  • the concentration in the liquid during the reaction with is preferably 0.01% by mass or more, or 0.025% by mass or more, or 0.05% by mass or more.
  • the concentration in the liquid during the reaction with the specimen is, for example, 0.2% by mass or less, or 0.15% by mass or less, or 0.1% by mass or less. is preferred.
  • the concentration of the quaternary ammonium salt in the bacteriolysis method of the present invention is not limited.
  • the concentration in the liquid during the reaction with is preferably 0.005% by mass or more, or 0.01% by mass or more, or 0.02% by mass or more. From the viewpoint of suppressing aggregation of the labeling antibody, it is preferably 0.08% by mass or less, 0.075% by mass or less, or 0.065% by mass or less.
  • bacteriolytic enzymes include, but are not limited to, protein hydrolases, carbohydrate hydrolases, and the like.
  • proteolytic enzymes include lysostaphin, pepsin, glucosidase, galactosidase, acromopeptidase and the like.
  • Carbohydrate hydrolases include lysozyme, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, and the like. Among them, proteolytic enzymes are preferred, and lysostaphin and the like are particularly preferred.
  • the concentration of the bacteriolytic enzyme in the bacteriolysis method of the present invention is not limited, and may be appropriately selected according to the type of bacteriolytic enzyme.
  • the concentration in the liquid at the time of reaction with the specimen is preferably 0.01 ⁇ g/mL or more, or 0.025 ⁇ g/mL or more, or 0.05 ⁇ g/mL or more, and is also tested by an immunological method.
  • the concentration in the liquid during the reaction with the sample is preferably 5.0 ⁇ g/mL or less, 3.0 ⁇ g/mL or less, or 2.5 ⁇ g/mL or less.
  • the lysis method of the present invention specifies that the specimen is reacted in a solution containing at least one surfactant and at least one lytic enzyme specified in the present invention
  • the intended lytic effect is
  • the solution may further contain one or more other components as long as they do not significantly impair the composition.
  • Such other ingredients include, for example, nonionic surfactants, buffers, lysis promoters. These components may be added to facilitate lysis or to allow detection after lysis.
  • a nonionic surfactant can be added for the purpose of ensuring the flow of a developing solution when immunochromatography is used after bacteriolysis.
  • the nonionic surfactant is not limited, but any of ester ether type, ester type and ether type can be suitably used. More specifically, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene Alkyl phenyl ethers, fatty acid sorbitan esters, alkyl polyglucosides, fatty acid diethanolamides, alkyl monoglyceryl ethers and the like can be mentioned. Among them, Tween (registered trademark) , Triton (registered trademark) and the like are preferable.
  • the concentration of the nonionic surfactant is limited as long as it does not significantly inhibit bacteriolysis in the bacteriolysis method of the present invention, detection by immunochromatography after bacteriolysis, and antigen-antibody reaction in immunoassay methods.
  • the concentration in the liquid at the time of reaction with the specimen is preferably 0.03% by mass or more, or 0.05% by mass or more, or 0.1% by mass or more. From the viewpoint of not significantly inhibiting enzymatic reactions and antigen-antibody reactions, it is preferably 10% by mass or less, 5% by mass or less, or 3% by mass or less.
  • the buffer solution is not limited, but a buffer solution with a pH of 6.0 to 9.5 is preferable. From the viewpoint of maintaining lytic enzyme activity during bacteriolysis, maintaining antigen-antibody reaction activity in detection after bacteriolysis, and avoiding false positives, a pH of 6.4 or higher, or 6.9 or higher is preferable, and 9.0. or less, or a pH of 8.5 or less is preferred.
  • buffers include, but are not limited to, Tris buffers, MOPSO buffers, HEPES buffers, citrate buffers, phosphate buffers, acetate buffers, and the like. Among them, Tris-HCl buffer, MOPSO buffer and the like are preferable.
  • the lysis method of the present invention specifies that the specimen is reacted in a solution containing at least one surfactant and at least one lytic enzyme specified in the present invention.
  • a solution containing a surfactant and a lytic enzyme is obtained by mixing a solution containing a surfactant and a solution containing a lytic enzyme.
  • a solution containing a surfactant and a lytic enzyme may contain a dye to prevent accidental ingestion.
  • the solution containing the surfactant and/or the solution containing the lytic enzyme may be colored by adding a dye in advance, and when the solution containing the surfactant and the solution containing the lytic enzyme are mixed, Coloring may be performed by adding a solution containing a dye. Solutions containing dyes include buffers.
  • the dye can be selected so as not to interfere with the examination performed after bacteriolysis, for example any dye selected from red, blue, yellow and green can be used.
  • any dye selected from red, blue, yellow and green can be used.
  • colloidal gold exhibits a red coloration, so yellow, blue, or green coloring is preferable.
  • the colorant any colorant may be used, but a water-soluble colorant is preferable, and a food colorant is preferable from the viewpoint of ensuring safety in the event of oral ingestion.
  • bacteriolytic agent for lysing multiple types of bacterial groups containing at least one or more Gram-positive bacteria and/or Gram-negative bacteria in a specimen. Also related.
  • a solution containing the lytic agent of the present invention is also referred to as a “reaction solution”.
  • the lytic agent of the present invention contains at least a surfactant and a lytic enzyme.
  • the bacteriolytic agent of the present invention may be provided in the form of a solution or in the form of a dry product.
  • the bacteriolytic enzyme may be padded or encapsulated and provided in a dry matter or solution from the viewpoint of maintaining activity.
  • the surfactant and lytic enzyme may be provided in the same form or in different forms. Lysing agents are usually provided as one formulation containing a surfactant and a lytic enzyme.
  • a lysis kit includes one formulation containing a surfactant and a lytic enzyme (ie, a lytic agent) and a separate formulation of the surfactant and lytic enzyme.
  • the bacteriolytic agent of the present invention may further contain one or more other components as long as it does not significantly impair the intended bacteriolytic effect, and may contain a pigment to prevent accidental ingestion.
  • Such other ingredients include, for example, non-ionic detergents, buffers, lysis-enhancing agents, which are added to facilitate lysis or to allow detection after lysis. can be
  • surfactants and lytic enzymes other ingredients, and pigments contained in the lytic agent, the ingredients described herein are used.
  • Bacteria detection method One aspect of the present invention is a method for detecting a plurality of bacterial groups selected from at least one or more Gram-positive bacteria and at least one or more Gram-negative bacteria in a sample (hereinafter referred to as "bacteria of the present invention”). (referred to as “detection method”).
  • the method for detecting bacteria of the present invention comprises the steps of lysing multiple genera of bacteria in a specimen, and extracting antigens of bacteria released from the lysed bacterial group by carrying out the lysis method of the present invention. and detection using an antibody that produces an antigen-antibody reaction. Therefore, the method for detecting bacteria of the present invention relates to immunological techniques using antibodies.
  • Immunological methods include immunochromatography, immunoprecipitation, immunoturbidimetry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), etc. Any detection technique using a reaction may be used, but immunochromatography is particularly preferable from the viewpoint of easily examining the sample.
  • the multiple species of bacteria detected by the bacteria detection method of the present invention relate to some or all of the bacteria lysed by the bacteriolysis method of the present invention.
  • the antigen of the bacteria is preferably an intracellular antigen.
  • the intracellular antigen is a substance whose antigen is the intracellular substance of bacteria released by the lysis method of the present invention. More specifically, from the viewpoint of detecting bacteria, the intracellular antigen is preferably a ribosomal protein, particularly L7/L12 protein.
  • the L7/L12 ribosomal protein is one of the ribosomal proteins essential for protein synthesis in microorganisms, and is a protein commonly possessed by various bacteria.
  • L7/L12 ribosomal proteins have high detection sensitivity because multiple molecules exist in cells.
  • Antibodies that cause an antigen-antibody reaction against bacterial ribosomal proteins L7/L12 and methods for producing them are described in, for example, International Publication No. 2000/006603, which is a patent publication related to a previous patent application by the inventors of the present application. You can refer to it.
  • Immunochromatography uses a labeling antibody with a label for detection and a capturing antibody immobilized on a strip. The labeling antibody and the capturing antibody each bind to intracellular antigens.
  • an “antibody” is a protein that recognizes and binds to a specific antigen or substance, and is sometimes called immunoglobulin (Ig).
  • a typical antibody usually has two light chains (light chains) and two heavy chains (heavy chains) inter-connected by disulfide bonds. There are two types of light chains, called ⁇ and ⁇ chains, and five types of heavy chains, called ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ chains. Depending on the type of heavy chain, antibodies have five isotypes: IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, respectively.
  • Each heavy chain comprises a heavy chain constant (CH) region and a heavy chain variable (VH) region.
  • Each light chain comprises a light chain constant (CL) region and a light chain variable (VL) region.
  • the light chain constant (CL) region is composed of a single domain.
  • the heavy chain constant (CH) region is composed of three domains, CH1, CH2 and CH3.
  • the light chain variable (VL) region and the heavy chain variable (VH) region each comprise four highly conserved regions (FR-1, FR-2, FR-3, FR-4) called framework regions (FR). and three hypervariable regions (CDR-1, CDR-2, CDR-3) called complementarity determining regions (CDRs).
  • the heavy chain constant (CH) region has 3 CDRs (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) and 4 FRs (FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4), These are arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the order FR-H1, CDR-H1, FR-H2, CDR-H2, FR-H3, CDR-H3, FR-H4.
  • the light chain constant (CL) region has 3 CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3) and 4 FRs (FR-L1, FR-L2, FR-L3, FR-L4), These are arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the order FR-L1, CDR-L1, FR-L2, CDR-L2, FR-L3, CDR-L3, FR-L4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain the binding domains that interact with antigen.
  • the antibody of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • a polyclonal antibody is an antibody usually prepared from the serum of an animal immunized with an antigen and is a mixture of various antibody molecular species with different structures.
  • a monoclonal antibody refers to an antibody consisting of a single type of molecule containing a combination of light chain variable (VL) regions and heavy chain variable (VH) regions having specific amino acid sequences.
  • Monoclonal antibodies can also be produced from clones derived from antibody-producing cells, but can also be produced by obtaining a nucleic acid molecule having a gene sequence that encodes the amino acids of the antibody protein and genetically engineering it using such a nucleic acid molecule. It is also possible to In addition, it is well known to those skilled in the art that genetic information such as heavy and light chains or their variable regions and CDRs are used to modify antibody binding properties and specificity. It is a known technique.
  • Antibodies of the present invention may also be antibody fragments and/or derivatives.
  • Antibody fragments include F(ab') 2 , Fab, Fv, and the like.
  • Examples of antibody derivatives include antibodies in which amino acid mutations are artificially introduced into the constant region of the light chain and/or heavy chain, antibodies in which the domain structure of the constant region of the light chain and/or heavy chain is altered, and 2 per molecule.
  • antibody or fragment or derivative thereof when the antibody or fragment or derivative thereof is derived from a non-human animal, a chimeric antibody or humanized antibody in which part or all of the sequence other than the CDRs is replaced with the corresponding sequence of a human antibody is also an antibody of the present invention.
  • antibody used in the present invention also includes antibody fragments and/or derivatives.
  • An antibody of the present invention produces an antigen-antibody reaction with a certain bacterium
  • the bacterial component that serves as an antigen for the antibody of the present invention is not limited. It may be a component contained in the cell wall or cell membrane that is exposed outside the bacterial cell, or a component contained in the cytoplasm, cell organelle, nucleus, or the like that is not exposed outside the bacterial cell.
  • the degree of antigen-antibody reaction between the antibody of the present invention and the bacterium to be detected is not particularly limited, it suffices that at least an antigen-antibody reaction that can be detected by some known detection method occurs.
  • the antibody of the present invention preferably does not cross-react with one or more non-bacterial components that may be present in the sample.
  • non-bacterially derived components include, but are not limited to, various bio-organic compounds derived from, for example, viruses, plants, and/or animals, which are not possessed by bacteria.
  • bioorganic compounds include proteins, sugars, glycoproteins, lipids, complex lipids, nucleic acids and the like.
  • the antibody of the present invention comprises at least one, or two or more, usually three or more, further four or more, or five or more, or six or more, or seven or more of these non-bacterial-derived components, Alternatively, it preferably does not cross-react with 8 or more, especially 9 or more, especially 10 or more non-bacterial components.
  • the antibody of the present invention is not limited as long as it undergoes an antigen-antibody reaction with the bacterium to be detected. is preferably used in combination with a universal antibody and a specific antibody. It is preferable that a universal antibody causes an antigen-antibody reaction with as many genera of bacteria as possible. Specifically, a universal antibody produces an antigen-antibody reaction with at least four genera of bacteria. Among them, it is preferable to generate an antigen-antibody reaction with at least five or more genera of bacteria, and more preferably to generate an antigen-antibody reaction with at least six or more genera of bacteria.
  • the specific genus of bacteria in which the general-purpose antibody produces an antigen-antibody reaction is not limited, at least the genus Escherichia, the genus Staphylococcus, the genus Pseudomonas, and the genus Bacillus (Bacillus), Klebsiella, Serratia, Rahnella, Citrobacter, Listeria, Enterobacter, and Salmonella It is preferable to generate an antigen-antibody reaction with one or more genera of bacteria.
  • specific antibodies cause antigen-antibody reactions only with bacteria of a limited genus.
  • the range of bacteria in which a specific antibody causes an antigen-antibody reaction is matched with the range of bacteria to be detected.
  • the range of bacteria with which the specific antibody causes an antigen-antibody reaction is matched with the range of bacteria to be detected.
  • the combined range of bacteria in which each of the specific antibodies causes an antigen-antibody reaction may match the range of bacteria to be detected.
  • by appropriately combining a plurality of specific antibodies that cause antigen-antibody reactions with different bacteria it is possible to variously adjust the range of bacteria to be detected, which is extremely advantageous. .
  • Each specific antibody of the present invention may generate an antigen-antibody reaction with at least one genus of bacteria.
  • the specific genus of bacteria that causes an antigen-antibody reaction with each specific antibody is not limited, but at least the genus Escherichia, the genus Staphylococcus, the genus Pseudomonas, and the genus Bacillus from the genera Bacillus, Klebsiella, Serratia, Rahnella, Citrobacter, Listeria, Enterobacter and Salmonella It is preferable to generate an antigen-antibody reaction with one or more selected genera of bacteria.
  • a labeling antibody is an antibody attached with a label for detection, and is an antibody that forms a complex by an antigen-antibody reaction with a target bacterium-derived antigen released from the lysed target bacterium.
  • the composite formed in this way is called a first composite.
  • the type of detection label used for the labeling antibody is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the detection method. Specifically, metal colloids such as gold colloid, platinum colloid, and palladium colloid; selenium colloid, and alumina.
  • Non-metallic colloids such as colloids and silica colloids; Insoluble particulate materials such as colored resin particles, dye colloids and colored liposomes; Catalytic enzymes for coloring reactions such as alkaline phosphatase, peroxidase and luciferase; Fluorescent dyes and radioisotopes; Examples include luminescent labels, electrochemiluminescent labels, and the like.
  • Techniques for adding labels to antibodies are not particularly limited, but specific examples include techniques such as physical adsorption utilizing the hydrophobicity of antibodies and chemical bonding utilizing functional groups of antibodies.
  • the capturing antibody is an antibody that forms a complex with the first complex through antigen-antibody reaction.
  • the complex thus formed is called a second complex.
  • the capture antibody is more specifically immobilized on a membrane carrier for chromatographic development located in the detection region of the immunochromatography strip.
  • the method of immobilizing the antibody on the solid phase member is not particularly limited, but specific examples include immobilization by physical adsorption using the hydrophobicity of the antibody, immobilization by chemical bonding using the functional group of the antibody, and the like.
  • the universal antibody may be a labeling antibody and the specific antibody may be a capturing antibody, or the specific antibody may be a labeling antibody and the universal antibody may be a capturing antibody.
  • the general-purpose antibody is preferably a labeling antibody
  • the specific antibody is preferably a capturing antibody.
  • the second complex Due to the antigen-antibody reaction caused by the immobilized capturing antibody, the second complex is retained at the immobilization position of the capturing antibody (capturing antibody immobilization site), where the label of the labeling antibody is detected.
  • the target bacterium is detected in the sample liquid when the label is detected at the position where the capturing antibody is immobilized.
  • a group of bacteria selected from at least one Gram-positive bacterium and at least one Gram-negative bacterium in the specimen used in the lysis method of the present invention is The present invention relates to a lysis kit for lysing bacteria (hereinafter appropriately referred to as "the lysis kit of the present invention").
  • a lysis kit includes one formulation containing a surfactant and a lytic enzyme (ie, a lytic agent) and a separate formulation of the surfactant and lytic enzyme.
  • a lysis kit is used for detection of bacterial groups after lysis, and more preferably relates to a lysis kit for immunochromatographic detection. Bacterial groups to be lysed, surfactants, and lytic enzymes are as described above.
  • the lysis kit may provide a surfactant and a lytic enzyme in the form of a solution or solid in one container or divided into two or more containers.
  • Still another aspect of the present invention is selected from at least one or more bacteria, for example, at least one or more Gram-positive bacteria and at least one or more Gram-negative bacteria, used in the aforementioned method for detecting bacteria of the present invention.
  • a detection kit for a group of bacteria selected from a plurality of species of bacteria hereinafter referred to as the "bacteria detection kit of the present invention" as appropriate.
  • the bacterium detection kit of the present invention may contain a lysis kit, or the surfactant and the bacteriolytic enzyme may be pre-arranged in the device or container used in the bacterium detection kit.
  • Such a bacteria detection kit detects bacterial groups based on immunological techniques.
  • Immunological methods include immunochromatography, immunoprecipitation, immunoturbidimetry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), etc. Any detection technique using a reaction may be used, but immunochromatography is particularly preferable from the viewpoint of easily examining the sample.
  • the multiple species of bacteria detected by the bacteria detection kit of the present invention relate to some or all of the bacteria lysed by the lysis method of the present invention.
  • the surfactant and lytic enzyme used in the bacteria detection kit of the present invention are as described above.
  • the bacteria detection kit of the present invention includes the above-described capturing antibody and labeling antibody.
  • the capture antibody is usually provided in an appropriate form (a container containing a porous membrane, a container containing a channel, a plate capable of holding a solution, etc.) according to the type of solid phase carrier.
  • the labeling antibody is usually provided in the form of an aqueous reagent containing the labeling antibody in an aqueous medium or a dry reagent obtained by drying the labeling antibody.
  • the bacteria detection kit of the present invention comprises, in addition to the capturing antibody and labeling antibody described above, one or more reagents and a detection device necessary for carrying out the method of the present invention using these antibodies. or components thereof and/or instructions describing procedures for practicing the methods of the invention.
  • the types of such reagents, the contents of the instructions, and other components contained in the kit of the present invention may be appropriately determined according to the type of specific immunoassay method.
  • the device constructed by such kit carries out the method of the invention using the labeling antibody and/or capturing antibody of the invention. It is a device (hereinafter abbreviated as "the device of the present invention” as appropriate) provided with the necessary components for. Specific components of the device of the present invention can be adjusted as appropriate according to the type of immunoassay that is a specific embodiment of the method of the present invention.
  • immunoassay methods include ELISA (enzyme-linked immunosorbent) using antibody-loaded microtiter plates; antibody-loaded latex particles ( latex particle agglutination assay using, for example, polystyrene latex particles, etc.); immunochromatography using a membrane carrying an antibody, etc.; colored particles or particles having coloring ability, labeling antibodies labeled with enzymes or fluorescent substances, and magnetic fine particles.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent
  • antibody-loaded latex particles latex particle agglutination assay using, for example, polystyrene latex particles, etc.
  • immunochromatography using a membrane carrying an antibody, etc.
  • colored particles or particles having coloring ability labeling antibodies labeled with enzymes or fluorescent substances, and magnetic fine particles.
  • sandwich assay method using a capture antibody immobilized on a solid phase carrier such as
  • the device with the components is the device of the invention. It is also possible to detect two or more types of bacteria in a sample with a single capturing antibody-
  • immunochromatographic detection devices include a lateral flow device and a flow-through device.
  • the lateral flow method means that the analyte to be detected and the labeling antibody are developed in parallel with respect to the membrane including the detection region on which the capture antibody is immobilized on the surface, and the target substance captured in the detection region of the membrane.
  • is a method for detecting Lateral flow kits are roughly classified into dipstick types and cassette types. In the dipstick type, the specimen solution is developed by immersing the immersion area (or sample pad) of the detection device in the specimen solution, whereas in the cassette type, the specimen addition member (sample pad) (3 ) to develop the sample solution.
  • the flow-through method is a method in which a target substance to be detected and a labeling antibody are vertically passed through a membrane having a capturing antibody immobilized on the surface, and the target substance captured on the surface of the membrane is detected.
  • the method of the present invention can be applied to both lateral-flow and flow-through devices.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing a schematic configuration of a strip-shaped detection mechanism, which is an example of a detection mechanism of a lateral flow type immunochromatographic detection device.
  • the immunochromatographic detection apparatus (10) in FIG. 1 has a strip-shaped labeling antibody-attached member (conjugate pad) on one end in the length direction of the strip (on the upstream side of the sample flow B) on the membrane carrier for chromatography development (1).
  • (2) A labeling antibody is attached to this pad.
  • a specimen addition member sample pad
  • an absorption member absorption It is provided on the substrate (5) with the pads (4) arranged thereon.
  • the labeling antibody adhered to the labeling antibody-attached member (conjugate pad) (2) may be eluted into the specimen solution.
  • a capture antibody immobilization site (6) to which a capture antibody was immobilized was arranged at the center of the strip length direction on the membrane carrier for chromatography development (1), and a control reagent was immobilized as necessary.
  • a control reagent immobilization site (7) is provided.
  • the control reagent is a reagent that does not bind to the analyte but binds to the labeling antibody.
  • the strip may have a lysing agent disposed therein so as to be elutable into the sample solution.
  • sample pad when the sample A is applied onto the sample addition member (sample pad) (3), the sample A passes through the labeling antibody attachment member (conjugate pad) (2) and onto the membrane carrier for chromatography development (1 ) flows in the direction of sample flow B.
  • the analyte in the sample in the present invention, L7/L12, which is an antigen derived from bacteria
  • the sample A passes through the capturing antibody immobilization site (6), the analyte in the sample binds to the capturing antibody to form a second complex of capturing antibody-analyte-labeling antibody.
  • the specimen A passes through the control reagent immobilization site (7), those of the labeling antibodies that do not bind to the analyte bind to the control reagent, thereby completing the test (i.e., passage through the antibody-immobilized site (6)).
  • the label of the labeling antibody may be sensitized by a known technique to facilitate detection.
  • the labeling antibody attachment member (conjugate pad) (2), the specimen addition member (sample pad) (3), and/or the control reagent immobilization site (7) can be omitted arbitrarily.
  • the present mechanism does not have a labeling antibody attachment member (conjugate pad) (2), the sample A and the labeling antibody are mixed in advance or separately, and simultaneously or sequentially, the membrane carrier for chromatographic development ( 1) By applying it to the upper end, the same inspection as the above inspection can be performed.
  • a detection kit capable of similar detection can be constructed even if the capturing antibody and the labeling antibody are replaced.
  • a method for detecting the presence and/or abundance of bacteria in a specimen comprising: (I) a step of treating the specimen with a solution containing a surfactant and a lytic enzyme; (II) Through an antigen-antibody reaction between the sample, the capturing antibody immobilized on the solid-phase carrier, and the labeling antibody having a label for detection, the antigen derived from the bacteria in the sample is captured and the antigen derived from the bacteria in the sample is captured.
  • One of the capturing antibody and the labeling antibody is one or more general-purpose antibodies that cause an antigen-antibody reaction with antigens derived from bacteria of five or more genera including bacteria, and the capturing antibody and the labeling antibody A method, wherein the other of the antibodies is one or more specific antibodies that cause an antigen-antibody reaction with one or more genera of bacteria.
  • the surfactant is one or more amine oxides.
  • the amine oxide is N,N-dimethyldodecylamine N-oxide (DDAO).
  • DDAO N,N-dimethyldodecylamine N-oxide
  • 26 The method according to item 24 or 25, wherein the concentration of the amine oxide in solution during treatment with the specimen is 0.01 to 0.2% by mass.
  • the surfactant is one or more quaternary ammonium salts.
  • a method according to item 30, wherein the concentration of the lysostaphin in the solution during treatment with the specimen is 0.01 ⁇ g/mL to 5.0 ⁇ g/mL.
  • a specific surfactant and an enzyme are treated with a solution adjusted to a specific concentration to enable more reliable lysis treatment, and to improve the efficiency and speed of lysis treatment. not only can be achieved, but also more reliable detection can be realized.
  • the Gram-positive bacterium comprises at least a bacterium of the genus Staphylococcus.
  • the solution containing the surfactant and the lytic enzyme contains a dye selected from red, blue and green.
  • the method according to any one of items 22 to 33 which is used for detecting at least one or more bacteria in a sample by immunochromatography.
  • Example 1 Preparation of Immunochromatographic Test Strips for Detecting Multiple Species of Bacterial Groups Containing At least One Gram-Positive Bacteria and/or Gram-Negative Bacteria ⁇ Preparation of general-purpose antibody Pseudomonas aeruginosa was used as an immunogen. Antibodies against Pseudomonas aeruginosa ribosomal protein L7/L12 were generated with reference to the method described in WO2000/06603. Specifically, E.
  • mice After confirming an increase in the serum antibody titer by test blood collection, the spleen cells of the mice were excised. The excised mouse spleen cells were fused with myeloma cells to obtain various hybridomas. The obtained various hybridomas were cultured in HAT medium and screened using antibodies in the culture supernatant. Screening is carried out by ELISA method, antibodies showing simultaneous reactivity with bacterial lysate of at least 4 strains of Escherichia coli (EC), Staphylococcus aureus (SA), Pseudomonas aeruginosa (PA) and Bacillus subtilis (BS). were selected.
  • EC Escherichia coli
  • SA Staphylococcus aureus
  • PA Pseudomonas aeruginosa
  • BS Bacillus subtilis
  • Selected hybridomas were cultured in TIL Media I medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) according to a standard method for monoclonal antibody production, and intraperitoneally administered to mice, and ascites was collected.
  • the recovered ascitic fluid was centrifuged to separate suspended matter and erythrocytes, and then filtered through a filter with an opening of 0.45 ⁇ m.
  • the obtained filtrate was passed through a Protein G column to adsorb the antibody, and the obtained general-purpose antibody was purified and obtained from mouse ascitic fluid.
  • Immunochromatographic Test Strip was prepared using the obtained general-purpose antibody as a labeling antibody and specific antibodies I and II as capturing antibodies.
  • ⁇ Assembly of immunochromatographic test strips In addition to the membrane carrier for immunochromatographic development prepared by the above procedure and the labeling antibody-attached member using colloidal gold as a label, cotton cloth as a sample addition member and filter paper as an absorption member were prepared. These members were attached to a commercially available polyethylene base material, cut into 5 mm widths, and immunochromatographic test strips having the same structure as in FIG.
  • Example 2 Evaluation of bacteriolysis and detection performance with various reaction solution (bacteriolytic agent) compositions ⁇ Preparation of bacterial solution for evaluation: Escherichia coli (EC) and Pseudomonas aeruginosa (PA) were selected as Gram-negative bacteria, and Staphylococcus aureus (SA) and Bacillus subtilis (BS) were selected as Gram-positive bacteria. bottom. In addition, physiological saline was used as the liquid without bacteria.
  • Escherichia coli (EC) and Pseudomonas aeruginosa (PA) were selected as Gram-negative bacteria
  • SA Staphylococcus aureus
  • BS Bacillus subtilis
  • physiological saline was used as the liquid without bacteria.
  • ⁇ Detection performance evaluation by immunochromatography The bacterial solution for evaluation and the various reaction solutions were mixed at a ratio of 1:1, and the immunochromatographic test strip prepared in Example 1 was inserted into the mixture to evaluate detection performance by bacteriolysis and antigen-antibody reaction. For the evaluation, the degree of redness due to the gold colloid in the test line portion was visually determined. Table 2 shows the results. Visually positive is indicated as +, visually weakly positive as ⁇ , and visually negative as -.
  • a lytic enzyme lysostaphin or lysozyme
  • DDAO benzalkonium chloride
  • benzalkonium chloride condition 2-12 to 2-15.
  • a positive SA signal was confirmed under the conditions (2-12, 2-13) in which lysostaphin was added.
  • no bacterium was negative, and bacteria other than SA were also positive.
  • lysozyme added 2-14, 2-15
  • there was no change from the conditions without lysozyme added 2-2, 2-3
  • the SA signal remained weakly positive.
  • Example 3 Preparation of bacterial solution (specimen) for examination and evaluation of concentration of DDAO or benzalkonium chloride : Escherichia coli (EC) was selected as a Gram-negative bacterium, and Staphylococcus aureus (SA) was selected as a Gram-positive bacterium. In addition, physiological saline was used as the liquid without bacteria.
  • Escherichia coli EC
  • SA Staphylococcus aureus
  • physiological saline was used as the liquid without bacteria.
  • ⁇ Detection performance evaluation by immunochromatography The bacterium solution for evaluation and the various reaction solutions described above were mixed at a ratio of 1:1, and the immunochromatographic test strip prepared in Example 1 was inserted to evaluate the detection performance by bacteriolysis and antigen-antibody reaction. In the evaluation, the degree of redness due to the gold colloid in the test line portion was photographed with a camera, and then quantified by image processing (the value of G, which indicates red absorption in RGB, was used. ”). A higher test line intensity indicates a higher degree of redness, and a test line intensity of 10 or more is visually positive.
  • Fig. 2 shows the relationship between DDAO concentration and test line strength. No poor development of immunochromatography was observed at any concentration where DDAO was added.
  • the evaluation results for Escherichia coli (EC) showed that the higher the final concentration of DDAO, the higher the bacteriolysis, and the higher the strength of the test line due to the antigen-antibody reaction, compared to the case without DDAO.
  • SA Staphylococcus aureus
  • SA Staphylococcus aureus
  • test line strength increases, becomes almost constant between 0.05 to 0.1% by mass, and decreases when it exceeds 0.1% by mass. (higher test line strength than without DDAO).
  • DDAO final concentration 0.1% by mass
  • the synergistic effect of the lysostaphin enzyme and DDAO on the lysis of Staphylococcus aureus is exhibited, but when the DDAO final concentration exceeds 0.1% by mass, the activity of the lysostaphin enzyme It is believed to cause inhibition, reducing lysis efficiency and test line strength.
  • FIG. 3 shows the relationship between the final concentration of benzalkonium chloride and the strength of the test line.
  • the final concentration of benzalkonium chloride was between 0 and 0.05% by mass, no poor development of the immunochromatography was observed.
  • the antibody was not developed on the nitrocellulose membrane and was retained in the sample addition member), and when the content exceeded 0.075% by mass, the tendency toward poor liquid development became stronger.
  • the evaluation results for Escherichia coli (EC) showed higher bacteriolysis efficiency and higher test line strength due to antigen-antibody reaction up to a final concentration of 0.075% by mass of benzalkonium chloride compared to the case without benzalkonium chloride. rice field.
  • benzalkonium chloride final concentration 0.065% by mass
  • a synergistic effect of the lysostaphin enzyme and benzalkonium chloride is exerted on the lysis of Staphylococcus aureus, but the benzalkonium chloride final concentration is 0.07 mass%. %, the above-mentioned poor flow of liquid and inhibition of lysostaphin enzyme activity are caused, and the bacteriolysis efficiency and test line strength are considered to decrease.
  • DDAO DDAO
  • benzalkonium chloride is preferably added at a final concentration of 0.08% by mass, more preferably up to 0.065% by mass, and used in combination with the lysostaphin enzyme.
  • coccus was shown to be efficiently lysed and immunochromatographically detected.
  • Example 4 Examination of Lysostaphin Concentration ⁇ Preparation of bacterial solution (specimen) for evaluation: To see the effect of lysostaphin, Staphylococcus aureus (SA) was prepared in saline to 1e6 cfu/ml. In addition, physiological saline was used as the liquid without bacteria.
  • SA Staphylococcus aureus
  • ⁇ Detection performance evaluation by immunochromatography The bacterial solution for evaluation and the various reaction solutions described above were mixed at a ratio of 1:1, the immunochromatographic test strip prepared in Example 1 was inserted, and the detection performance (test line strength) by bacteriolysis and antigen-antibody reaction was evaluated. .
  • FIG. 4 shows the relationship between the final concentration of lysostaphin and the test line strength when DDAO was used as a surfactant.
  • FIG. 4(a) shows all the data
  • FIG. 4(b) shows the horizontal axis (lysostaphin final concentration) enlarged.
  • Addition of lysostaphin tended to promote lysis of Staphylococcus aureus (SA) compared to the case without lysostaphin.
  • SA Staphylococcus aureus
  • the final concentration of lysostaphin exceeded 0.01 ⁇ g/ml, sufficient bacteriolytic performance (catalytic action of the enzyme) was observed, resulting in high test line strength due to antigen-antibody reaction.
  • the final concentration of lysostaphin is preferably in the range of 0.01 to 5.0 ⁇ g/ml.
  • FIG. 5 shows the relationship between the final concentration of lysostaphin and the test line strength when benzalkonium chloride is used as a surfactant.
  • FIG. 5(a) shows all the data
  • FIG. 5(b) shows the horizontal axis (lysostaphin final concentration) enlarged.
  • Addition of lysostaphin tended to promote lysis of Staphylococcus aureus (SA) compared to the case without lysostaphin.
  • SA Staphylococcus aureus
  • the final concentration of lysostaphin exceeded 0.01 ⁇ g/ml, sufficient bacteriolytic performance (catalytic action of the enzyme) was observed, resulting in high test line strength due to antigen-antibody reaction.
  • the final concentration of lysostaphin exceed 5.0 ⁇ g/ml, a test line (false positive thought to be caused by lysostaphin) was confirmed (test line intensity ⁇ 10) even in the absence of bacteria. Therefore, it was confirmed that the final concentration of lysostaphin is preferably in the range of 0.01 ⁇ g/ml or more to 5.0 ⁇ g/ml.
  • lysostaphin as a lytic enzyme in the final concentration range of 0.01 ⁇ g / ml to 5.0 ⁇ g / ml and using it in combination with the surfactant DDAO or benzalkonium chloride, Staphylococcus aureus bacteriolysis and It was shown that detection by immunochromatography was performed efficiently.
  • Example 5 Confirmation of lysis and detection performance near boundary conditions ⁇ Preparation of various reaction solutions: As confirmation of the above-mentioned surfactant DDAO or combination of benzalkonium chloride and lysostaphin enzyme in the preferred range, 0.2% by mass of Tween 20 was added to 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4) buffer for immunochromatographic development. A reaction solution having the conditions shown in Table 3 was prepared using the added solution as a mother liquor.
  • EC Escherichia coli
  • PA Pseudomonas aeruginosa
  • SA Staphylococcus aureus
  • BS Bacillus subtilis
  • a solution containing both Escherichia coli (EC) and Staphylococcus aureus (SA) at a concentration of 1e6 cfu/ml was prepared with physiological saline. In addition, physiological saline was used as the liquid without bacteria.
  • ⁇ Detection performance evaluation by immunochromatography The bacterial solution for evaluation and the various reaction solutions described above were mixed at a ratio of 1:1, the immunochromatographic test strip prepared in Example 1 was inserted, and the detection performance by bacteriolysis and antigen-antibody reaction was visually evaluated. Table 4 shows the results. Under any condition, visually negative for no bacteria, Escherichia coli (EC), Pseudomonas aeruginosa (PA), Staphylococcus aureus (SA), Bacillus subtilis (BS), and Escherichia coli (EC) and Staphylococcus aureus ( SA) was visually positive. From the above results, it was shown that the use of the surfactant DDAO or benzalkonium chloride and the lysostaphin enzyme at suitable concentrations enabled efficient lysis and immunochromatographic detection of multiple genera of bacteria.
  • Example 6 Investigation of the pH of the reaction solution ⁇ Preparation of various reaction solutions: DDAO of 0.15% by mass (final concentration of 0.075% by mass after mixing with bacterial solution for evaluation (specimen)) in 0.1M Tris-HCl (or MOPSO) buffer, or 0.05% by mass ( Benzalkonium chloride at a final concentration of 0.025% by mass after mixing with the evaluation bacterial solution (specimen) and lysostaphin enzyme 5.0 ug / ml (final concentration after mixing with the evaluation bacterial solution (specimen) 2.5 ug) /ml), and 0.2% by mass of Tween 20 for immunochromatographic development was added as a mother liquor for pH adjustment to prepare reaction solutions with different pH (6.0 to 9.5).
  • EC Escherichia coli
  • PA Pseudomonas aeruginosa
  • SA Staphylococcus aureus
  • BS Bacillus subtilis
  • ⁇ Detection performance evaluation by immunochromatography The bacterial solution for evaluation and the various reaction solutions described above were mixed at a ratio of 1:1, the immunochromatographic test strip prepared in Example 1 was inserted, and the detection performance by bacteriolysis and antigen-antibody reaction was visually evaluated. Table 5 shows the results. At pH 6.0-6.2, the Staphylococcus aureus (SA) test line gave a negative result, and pH 9.5 gave a weakly positive result. At this pH, the enzymatic activity of lysostaphin appears to be reduced.
  • SA Staphylococcus aureus
  • Example 7 Examination of coloring of reaction solution ⁇ Selection of coloring agent We examined the coloring of the reaction solution as a means of preventing accidental ingestion at food sites.
  • Commercially available water-soluble dyes (26 types such as Blue No. 1, Yellow No. 4, Green No. 3, etc.) were obtained, and absorption spectra were measured.
  • Four types of dyes (Blue No. 1, Yellow No. 4, Green No. 3, and a mixture of Blue No. 1 and Yellow No. 4) that do not interfere in absorption with colloidal gold (red) used for labeling were selected.
  • ⁇ Preparation of bacterial solution (specimen) for evaluation: Escherichia coli (EC) and Pseudomonas aeruginosa (PA) were selected as Gram-negative bacteria, and Staphylococcus aureus (SA) and Bacillus subtilis (BS) were selected as Gram-positive bacteria. bottom. In addition, physiological saline was used as the liquid without bacteria.
  • ⁇ Detection performance evaluation by immunochromatography The bacterial solution for evaluation and the various reaction solutions described above were mixed at a ratio of 1:1, the immunochromatographic test strip prepared in Example 1 was inserted, and the detection performance by bacteriolysis and antigen-antibody reaction was visually evaluated. Table 7 shows the results.
  • the present invention can be widely applied to the food and medical fields such as bacterial lysis and bacterial detection, and its utility value is extremely high.
  • Immunochromatographic detection device 1 Membrane carrier for chromatographic development 2 Labeling antibody-attached member (conjugate pad) 3 Specimen addition member (sample pad) 4 Absorbent member (absorbent pad) 5 substrate 6 capture antibody immobilization site 7 control reagent immobilization site A sample B sample flow

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Abstract

複数種の細菌を溶菌することができ、溶菌処理の効率化・迅速化が可能となる、新たな溶菌方法を提供する。検体中の複数種の細菌群を溶菌するための溶菌方法であって、検体を界面活性剤及び溶菌酵素と、液中で反応させて、検体中に存在する前記複数種の細菌群を溶菌する工程により、複数種の細菌群の溶菌が可能になる。

Description

溶菌方法、及び細菌検出方法
　本発明は、検体中の複数種の細菌群を溶菌するための溶菌方法、並びに溶菌方法を用いた細菌検出方法に関する。本発明は、さらに、溶菌方法に用いる溶菌剤、溶菌キット、並びに細菌検出方法に用いる細菌検出キットにも関する。
　従来、検体中の細菌をその細胞内成分に基づき検出する等の目的で、検体中の細菌を溶菌する技術が種々用いられている。例えば特許文献１及び２（特開２０１７－３２５７９公報及び国際公開２０１５／０９３５４４号）には、黄色ブドウ球菌をそのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に基づき抗原抗体反応で検出する技術が開示されており、その際に溶菌剤としてリゾスタフィンを用いて検体中の細菌を溶菌する旨が記載されている。また、特許文献３（国際公開２０１５／０９３５４５号）には、大腸菌をそのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に基づき抗原抗体反応で検出する技術が開示されており、その際に溶菌剤としてリゾチーム酵素を用いて検体中の細菌を溶菌する旨が記載されている。
特開２０１７－３２５７９公報 国際公開２０１５／０９３５４４号 国際公開２０１５／０９３５４５号
　しかし、特許文献１～３等の従来の溶菌方法では、複数種の細菌を同時に溶菌することはできなかった。このため、複数種の細菌を同時に検出する場合等は、細菌属毎に個別の溶菌剤で溶菌を行う必要があり、溶菌処理の煩雑化・遅延を招いていた。
　本発明者等は鋭意検討の結果、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶菌剤を用いて溶菌を行うことにより、複数種の細菌を同時に溶菌することができ、溶菌処理の効率化・迅速化が可能となることを見出して、本発明を完成させた。
　即ち、本発明の趣旨は、例えば以下に関する。
［１］　検体中の少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群の溶菌方法であって、検体を、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液で処理する工程を含み、前記界面活性剤がアミンオキシド及び第四級アンモニウムから選ばれる、前記方法。
［２］　前記複数種の細菌群が、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び少なくとも１種以上のグラム陰性細菌を共に含む、項目１に記載の方法。
［３］　前記界面活性剤が、１種又は２種以上のアミンオキシドである、項目１又は２に記載の方法。
［４］　前記アミンオキシドが、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド（ＤＤＡＯ）である、項目３に記載の方法。
［５］　前記検体との処理時における溶液中の前記アミンオキシドの濃度が０．０１～０．２質量％である、項目３又は４に記載の方法。
［６］　前記界面活性剤が、１種又は２種以上の第四級アンモニウム塩である、項目１又は２に記載の方法。
［７］　前記第四級アンモニウム塩が、塩化ベンザルコニウムである、項目６に記載の方法。
［８］　前記検体との処理時における溶液中の前記第四級アンモニウム塩の濃度が０．００５～０．０８質量％である、項目６又は７に記載の方法。
［９］　前記溶菌酵素が、リゾスタフィンである、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
［１０］　前記検体との処理時における溶液中の前記リゾスタフィンの濃度が、０．０１μｇ／ｍＬ～５．０μｇ／ｍＬである、項目９に記載の方法。
［１１］　前記グラム陽性細菌が、少なくともスタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）の細菌を含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
［１２］　前記界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液が、赤、青、及び緑から選択されるいずれかの色素を含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
［１３］　イムノクロマト法による検体中の少なくとも１種以上の細菌を検出するために用いる、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
［１４］　検体中の複数種の細菌群の検出方法であって、
　項目１～１３のいずれか一項に記載の方法により、検体中の複数種の細菌群を溶菌する工程、及び
　溶菌された細菌群から放出された細菌の抗原を、当該抗原と抗原抗体反応を生じる抗体を用いて検出する工程
を含む検出方法。
［１５］　前記検出の対象となる検体中の複数種の細菌群が、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌と、少なくとも１種以上のグラム陰性細菌とを共に含む、項目１４に記載の方法。
［１６］　前記検出する工程がイムノクロマト法により行われる、項目１４又は１５に記載の方法。
［１７］　前記溶菌する工程により放出される細菌の抗原がＬ７抗原である、項目１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
［１８］　項目１～１３のいずれか一項に記載の方法において用いる、検体中の少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群を溶菌するための溶菌キットであって、界面活性剤及び溶菌酵素を含む、溶菌キット。
［１９］　検体中の少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群を検出するための細菌検出キットであって、
　項目１～１３のいずれか一項に記載の方法で用いられる、界面活性剤及び溶菌酵素と、
以下の：
　　（ａ）対象細菌由来抗原と抗原抗体反応により第１の複合体を形成する標識用抗体が添着された標識用抗体添着部材、及び、
　　（ｂ）第１の複合体と抗原抗体反応により第２の複合体を形成する捕捉用抗体が固定化された検出領域を有するストリップ
　を含むイムノクロマト検出装置と
　を含む、前記細菌検出キット。
［２０］　検体中の細菌の有無及び／又は存在量を検出するための方法であって、
（Ｉ）　項目１～１３のいずれか一項に記載の方法により、検体中の細菌を溶菌する工程、
（ＩＩ）検体と、固相担体と固定された捕捉用抗体と、検出用標識を有する標識用抗体との抗原抗体反応により、検体中の細菌由来の抗原を捕捉すると共に、検体中の細菌由来の抗原を標識する工程、及び
（ＩＩＩ）検体中の細菌を検出用標識に基づき検出する工程を含み、
捕捉用抗体及び標識用抗体のうち一方が、細菌を含む５以上の属の細菌由来の抗原と抗原抗体反応を生じる、１種又は２種以上の汎用性抗体であり、捕捉用抗体及び標識用抗体のうち他方が、１又は２以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じる、１種又は２種以上の特異性抗体である、方法。
［２１］　検体中の２種以上の細菌を単一の捕捉用抗体固定部位で検出する、項目２０に記載の方法。
　本発明によれば、界面活性剤及び溶菌酵素を用いて溶菌を行うことにより、複数の属の細菌（複数種の細菌群）を同時に溶菌することができ、溶菌処理の効率化・迅速化が可能となる。これにより、細菌の細胞内抗原等を用いた複数属の細菌検出等も効率化・迅速化することができる。
図１は、ラテラルフロー方式のイムノクロマト検出装置の検出機構の一例である、ストリップ状の検出機構の概略構成を示す断面図である。 図２は、大腸菌（ＥＣ）又は黄色ブドウ球菌（ＳＡ）を含む検体をイムノクロマト法で検出した場合に、界面活性剤として用いたＮ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド（ＤＤＡＯ）の終濃度を変化させて、テストライン強度を測定した結果を示す。 図３は、大腸菌（ＥＣ）又は黄色ブドウ球菌（ＳＡ）を含む検体をイムノクロマト法で検出した場合に、界面活性剤として用いた塩化ベンザルコニウムの終濃度を変化させて、テストライン強度を測定した結果を示す。 図４は、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）を含む検体をイムノクロマト法で検出した場合に、界面活性剤としてＤＤＡＯを用い、溶菌酵素として用いたリゾスタフィンの終濃度を変化させて、テストライン強度を測定した結果を示す。図４（ａ）は、全データを、図４（ｂ）は、横軸（リゾスタフィン終濃度）を０～１．０μｇ／ｍｌの領域に拡大表示したものである。 図５は、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）を含む検体をイムノクロマト法で検出した場合に、界面活性剤として塩化ベンザルコニウムを用い、溶菌酵素として用いたリゾスタフィンの終濃度を変化させて、テストライン強度を測定した結果を示す（図５ａ）。図５ｂは、図５ａの横軸を０～１．０μｇ／ｍｌの領域に拡大したグラフを示す。
　以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
　本発明の一の態様は、複数種の細菌群を溶菌するための方法に関する。また、本発明の別の態様は、複数種の細菌群を溶菌する工程を含む、検体中の複数種の細菌群を検出するための方法に関する。さらに別の態様では、溶菌方法に用いる溶菌剤又は溶菌キット、並びに検体中の複数種の細菌群を検出する細菌検出キットにも関する。
［Ｉ．溶菌方法］
　本発明の一の態様は、検体中の複数種の細菌群を溶菌する方法（以下適宜「本発明の溶菌方法」と称する。）に関する。本発明の溶菌方法は、検体を、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液中で処理して、検体中に存在する前記複数種の細菌群を溶菌する工程を含む。本発明の溶菌方法により溶菌された細菌群は、その後免疫学的手法に供される。免疫学的手法としては、イムノクロマト法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫比濁法など抗原抗体反応を用いた任意の検出手法であってよいが、検体を簡易に検査する観点からは、特にイムノクロマト法が好ましい。本発明の溶菌方法により溶菌された複数種の細菌群は、後の工程において免疫学的手法による検出が可能なように溶菌される必要がある。したがって、本発明の溶菌方法は、免疫学的手法による検出のための溶菌方法ということができる。
　前記複数種の細菌群を溶菌する工程は、検体を、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液中で処理すれば、任意の手法であってもよい。一例として、界面活性剤を含む所定量の溶液と、溶菌酵素を含む所定量の溶液を、それぞれ所定量の検体に添加することで、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液中での処理が達成される。かかる処理を反応といってもよい。検体の界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液中での反応は、溶液中に、検体、界面活性剤、及び溶菌酵素が存在していれば生じ、場合により混合又は撹拌が行われてもよい。ここで界面活性剤を含む溶液と、溶菌酵素を含む溶液とは、別個の溶液として提供されてもよいし、予め１つの溶液として提供されてもよい。別の例として、界面活性剤及び溶菌酵素の少なくとも１又は両方が乾燥物として提供され、任意の液体中で再構成されて使用されてもよい。かかる任意の液体としては、液体検体であってもよい。液体検体は、検体自体が液体のものでもあってもよいし、検体が固体の場合は、検体を緩衝液等の液体に懸濁したものでもよい。一例として、界面活性剤及び溶菌酵素の少なくとも１又は両方の乾燥物を直接液体検体中に添加することで溶液としてもよいし、乾燥物を水などの液体に添加して得た溶液を検体と反応させてもよい。溶菌酵素及び/又は界面活性剤を含む溶液又は乾燥物はカプセル化されて提供されてもよい。液体検体を入れる容器内に予め界面活性剤及び／又は溶菌酵素の乾燥物又はカプセルを配置し、液体検体を入れることで、溶液を形成してもよいし、界面活性剤及び／又は溶菌酵素の乾燥物又はカプセルを液体検体に別途添加してもよい。また別の例では、イムノクロマトのストリップのパッド中に界面活性剤及び溶菌酵素の乾燥物又はカプセルを配置し、ストリップに液体検体を適用した際に、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液との反応が達成されてもよい。検体の界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液中での反応時間は、溶菌が生じる時間であればよく、一例として１０秒以上、３０秒以上、又は１分以上反応される。反応時間の上限は特に限定されないが、操作を迅速に行う観点から、１時間以内、３０分以内、１０分以内、又は５分以内が好ましい。検体と、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液とをさらに撹拌してもよい。
　本発明の溶菌方法において、溶菌対象となる前記複数種の細菌群は、限定されるものではないが、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌と、少なくとも１種以上のグラム陰性細菌から選択される。より好ましくは、前記複数種の細菌群は、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌と、少なくとも１種以上のグラム陰性細菌とを含む。さらにより好ましくは、前記複数種の細菌群は、グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）の細菌と、その他の細菌とを含む。
　グラム陽性細菌とグラム陰性細菌とは、グラム染色により峻別される細菌の分類であって、細胞壁の組成及び構造に大きな違いがあることが知られている。即ち、何れもペプチドグリカンを含有する点では共通であるが、グラム陽性細菌の細胞壁ではペプチドグリカンがタイコ酸、リポタイコ酸、その他のタンパク質等と厚い層を形成しているのに対し、グラム陰性細菌の細胞壁ではペプチドグリカンは比較的薄い層に局在しており、その外側にはリポ多糖で構成される外葉とリン脂質で構成される内葉からなる外層が存在する。
　このような細胞壁の組成及び構造の大きな違いにより、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌とを同一の溶菌剤で一度に溶解することは、従来は極めて困難であった。特にスタフィロコッカス属の細菌は、他の細菌を溶菌可能な界面活性剤又は酵素を用いたとしても溶菌することができず、複数種の細菌群を溶菌するにあたり問題となる。これに対して、本発明の溶菌方法を用いれば、スタフィロコッカス属を含む、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌とを一度に溶解することが可能となり、溶菌処理の大幅な効率化及び迅速化が可能となる。
　本発明において、グラム陽性細菌としては、限定されるものではないが、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）、バシラス属（Bacillus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、リステリア属(Listeria)、クロストリジウム属(Clostridium)等の細菌が挙げられる。なかでも、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）又はバシラス属（Bacillus）の細菌が含まれることが好ましい。
　本発明において、グラム陰性細菌としては、限定されるものではないが、エシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属(Salmonella)、ヘリコバクター属（Helicobacter）、レジオネラ属（Legionella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ビブリオ属（Vibrio）、エルシニア属（Yersinia）
等の細菌が挙げられる。なかでも、エシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）又はシュードモナス属（Pseudomonas）の細菌が含まれることが好ましい。
　本発明の溶菌方法において、前記検体は、制限されるものではないが、食品又は環境検体であることが好ましい。食品検体は、任意の飲食品から得られた任意の検体を指す。一例として、食品検体は、飲食品自体であってもよいし、又は飲食品を希釈、粉砕、スワブによる表面ふき取り及び/又は懸濁された検体であってもよい。環境検体は、環境から得られた任意の検体を指す。一例として、物質表面をスワブによりふき取り、溶液に分散させた検体が挙げられる。
　本発明において、界面活性剤としては、溶菌作用を有する界面活性剤であれば任意の界面活性剤を使用することができるが、溶菌後の免疫学的手法による測定を妨げることがないように選択される。例えば、ドデシル硫酸ナトリウムは強力な界面活性剤であり、ほぼすべての細菌を溶菌することができるが、免疫学的手法において用いる抗体の構造を破壊してしまうため、本発明の溶菌方法に使用する界面活性剤としては適していない。溶菌後の免疫学的手法、特にイムノクロマト法による測定を妨げない界面活性剤としては、限定されるものではないが、アミンオキシド、第四級アンモニウム塩、脂肪族アミン塩、ベタイン等が挙げられる。なかでもアミンオキシド、第四級アンモニウム塩が好ましい。
　アミンオキシドとしては、限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｃ8-20アルキル－アミンＮ－オキシド（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルカプリルアミンＮ－オキシド）、ピリジンＮ－オキシド、Ｎ－メチルモルホリンＮ－オキシド等が挙げられる。なかでもＮ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド等が好ましい。
　第四級アンモニウム塩としては、限定されるものではないが、ベンザルコニウムクロリド（塩化ベンザルコニウム）、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムクロリド、テトラプロピルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド等が挙げられる。なかでも塩化ベンザルコニウム等が好ましい。
　本発明の溶菌における界面活性剤の濃度は、限定されるものではないが、検体との反応時における液中の濃度において、例えば０．００５質量％以上、又は０．０１質量％以上、又は０．０２質量％以上とすることが好ましく、また、例えば０．２質量％以下、又は０．１５質量％以下、又は０．１質量％以下とすることが好ましい。
　界面活性剤がＮ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド等のアミンオキシドの場合、本発明の溶菌方法におけるアミンオキシドの濃度は、限定されるものではないが、溶菌作用を発揮する観点から、検体との反応時における液中の濃度において例えば０．０１質量％以上、又は０．０２５質量％以上、又は０．０５質量％以上とすることが好ましい。また、併用される酵素の活性を維持する観点から、検体との反応時における液中の濃度において例えば０．２質量％以下、又は０．１５質量％以下、又は０．１質量％以下とすることが好ましい。
　界面活性剤が塩化ベンザルコニウム等の第四級アンモニウム塩の場合、本発明の溶菌方法における第四級アンモニウム塩の濃度は、限定されるものではないが、溶菌作用を発揮する観点から、検体との反応時における液中の濃度において例えば０．００５質量％以上、又は０．０１質量％以上、又は０．０２質量％以上とすることが好ましい。また、標識用抗体の凝集を抑制する観点から、例えば０．０８質量％以下、０．０７５質量％以下、又は０．０６５質量％以下とすることが好ましい。
　溶菌酵素としては、限定されるものではないが、タンパク質加水分解酵素、糖質加水分解酵素等が挙げられる。タンパク質加水分解酵素としては、リゾスタフィン、ペプシン、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アクロモペプチダーゼ等が挙げられる。糖質加水分解酵素としては、リゾチーム、β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ等が挙げられる。なかでもタンパク質加水分解酵素が好ましく、リゾスタフィン等がとりわけ好ましい。
　本発明の溶菌方法における溶菌酵素の濃度は、限定されるものではなく、溶菌酵素の種類に応じて適宜選択すればよいが、溶菌作用を発揮する観点から、例えばリゾスタフィン等のタンパク質加水分解酵素の場合、検体との反応時における液中の濃度において例えば０．０１μｇ／ｍＬ以上、又は０．０２５μｇ／ｍＬ以上、又は０．０５μｇ／ｍＬ以上とすることが好ましく、また、免疫学的手法による検査において偽陽性を生じさせない観点から検体との反応時における液中の濃度において例えば５．０μｇ／ｍＬ以下、又は３．０μｇ／ｍＬ以下、又は２．５μｇ／ｍＬ以下とすることが好ましい。
　本発明の溶菌方法は、検体を本発明において特定された少なくとも１種の界面活性剤及び少なくとも１種の溶菌酵素とを含む溶液中で反応させることを特定しているが、意図した溶菌効果を著しく損なわない限り、溶液中には、１種又は２種以上の他の成分を更に含有していてもよい。そのような他の成分として、例えば、非イオン性界面活性剤、緩衝液、溶菌促進剤が挙げられる。これらの成分は、溶菌を促進するか、又は溶菌後の検出を可能にするために添加されうる。
　非イオン性界面活性剤は、溶菌後にイムノクロマト法を用いる場合において、展開液の流れを確保することを目的として添加されうる。非イオン性界面活性剤としては、限定されるものではないが、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも好適に用いることができ、より具体的にはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどがあげられる。なかでもＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）等が好ましい。非イオン性界面活性剤の濃度は、本発明の溶菌方法における溶菌、さらには溶菌後のイムノクロマト法による検出における展開、さらには免疫学的測定法における抗原抗体反応を著しく阻害しない濃度であれば限定されるものではないが、例えば検体との反応時における液中の濃度で０．０３質量％以上、又は０．０５質量％以上、又は０．１質量％以上とすることが好ましく、また、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない観点から、例えば１０質量％以下、又は５質量％以下、又は３質量％以下とすることが好ましい。
　緩衝液としては、限定されるものではないが、ｐＨが６．０～９．５である緩衝液が好ましい。溶菌において溶菌酵素活性を維持する観点、溶菌後の検出において、抗原抗体反応活性を維持する観点、偽陽性を避ける観点から、６．４以上、又は６．９以上のｐＨが好ましく、９．０以下、又は８．５以下のｐＨが好ましい。斯かる緩衝液の例としては、限定されるものではないが、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳＯ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられる。なかでもＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ＭＯＰＳＯ緩衝液等が好ましい。
　本発明の溶菌方法は、検体を本発明において特定された少なくとも１種の界面活性剤及び少なくとも１種の溶菌酵素とを含む溶液中で反応させることを特定している。一例として、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液は、界面活性剤を含む溶液と溶菌酵素を含む溶液とを混合することにより得られる。界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液は、誤飲食防止のために色素を含んでもよい。界面活性剤を含む溶液及び／又は溶菌酵素を含む溶液に予め色素を添加することで着色してもよいし、界面活性剤を含む溶液と、溶菌酵素を含む溶液とを混合する際に、さらに色素を含む溶液を添加することにより着色してもよい。色素を含む溶液として、緩衝液が挙げられる。色素としては、溶菌後に行われる検査を妨げないように選択することができ、例えば赤、青、黄、及び緑から選択されるいずれかの色素を利用することができる。一例として、後の工程で金コロイドを用いたイムノクロマト法を用いる場合には、金コロイドが赤の呈色を示すことから、黄色、青又は緑の着色が好ましい。色素としては、任意の色素が用いられてもよいが、水溶性の色素が好ましく、万が一経口摂取された場合の安全性を担保する観点から、食用色素が好ましい。
［II.溶菌剤］
　本発明の一態様は、検体中の少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群を溶菌するための溶菌剤（以下、本発明の溶菌剤とも称する）にも関する。本発明の溶菌剤を含む溶液を「反応液」とも称する。本発明の溶菌剤は、少なくとも界面活性剤及び溶菌酵素を含有する。本発明の溶菌剤は、溶液の形態で提供されてもよいし、乾燥物の形態で提供されてもよい。特に溶菌酵素は、活性を維持する観点から、パッド化やカプセル化されて、乾燥物又は溶液中に提供されてもよい。界面活性剤及び溶菌酵素は、同一形態で提供されてもよいし、異なる形態で提供されてもよい。溶菌剤は、通常、界面活性剤及び溶菌酵素を含む１の製剤として提供される。溶菌キットは、界面活性剤及び溶菌酵素を含む１の製剤（すなわち溶菌剤）と、界面活性剤及び溶菌酵素を別個に提供された製剤とを包含する。本発明の溶菌剤は、意図した溶菌効果を著しく損なわない限り、１種又は２種以上の他の成分を更に含有していてもよく、誤飲食防止のために色素を含んでもよい。そのような他の成分として、例えば、非イオン性界面活性剤、緩衝液、溶菌促進剤が挙げられ、これらの成分は、溶菌を促進するか、又は溶菌後の検出を可能にするために添加されうる。溶菌剤に含まれる、界面活性剤及び溶菌酵素、他の成分、並びに色素については、本明細書に記載される成分が使用される。
［III．細菌検出方法］
　本発明の一の態様は、検体中の少なくとも１種以上のグラム陽性細菌と、少なくとも１種以上のグラム陰性細菌から選択される複数種の細菌群を検出する方法（以下適宜「本発明の細菌検出方法」と称する。）に関する。本発明の細菌検出方法は、前記の本発明の溶菌方法を実施することにより、検体中の複数属の細菌を溶菌する工程と、溶菌された細菌群から放出された細菌の抗原を、当該抗原と抗原抗体反応を生じる抗体を用いて検出することを含む。したがって、本発明の細菌検出方法は、抗体を用いた免疫学的手法に関する。免疫学的手法としては、イムノクロマト法、免疫沈降法、免疫比濁法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射能免疫測定法（ＲＩＡ法）、または蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）など抗原抗体反応を用いた任意の検出手法であってよいが、検体を簡易に検査する観点からは、特にイムノクロマト法が好ましい。本発明の細菌検出方法により検出される複数種の細菌群は、本発明の溶菌方法により溶菌された細菌の一部又は全部に関する。
　本発明の細菌検出方法において、前記細菌の抗原が、細胞内抗原であることが好ましい。細胞内抗原とは、本発明の溶菌方法により、放出される細菌の細胞内物質が抗原となる物質である。より具体的に、細菌を検出する観点からは、細胞内抗原としては、リボソームタンパク質、特にＬ７／Ｌ１２タンパク質であることが好ましい。Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質は、微生物のタンパク質合成に必須のリボソームタンパク質の１種であり、種々の細菌が共通して有するタンパク質である。また、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質は、細胞内に複数分子存在するために検出感度が高い。細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対して抗原抗体反応を生じる抗体及びその作製方法については、例えば本願発明者等の以前の特許出願に係る特許公報である国際公開第２０００／００６６０３号等の記載を参照することができる。イムノクロマト法では、検出用標識が付された標識用抗体と、ストリップ上に固定された捕捉用抗体を用いる。標識用抗体と捕捉用抗体は、それぞれ細胞内抗原に結合する。
［抗体］
　本発明において「抗体」とは、特定の抗原又は物質を認識しそれに結合するタンパク質で、免疫グロブリン（Ｉｇ）という場合もある。一般的な抗体は、通常、ジスルフィド結合により相互結合された２つの軽鎖（軽鎖）及び２つの重鎖（重鎖）を有する。軽鎖にはλ鎖及びκ鎖と呼ばれる２種類が存在し、重鎖にはγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖と呼ばれる５種類が存在する。その重鎖の種類によって、抗体には、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという５種類のアイソタイプが存在する。
　重鎖は各々、重鎖定常（ＣＨ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。軽鎖は各々、軽鎖定常（ＣＬ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。軽鎖定常（ＣＬ）領域は単一のドメインから構成される。重鎖定常（ＣＨ）領域は、３つのドメイン、即ちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域は各々、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い４つの領域（ＦＲ－１、ＦＲ－２、ＦＲ－３、ＦＲ－４）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の３つの領域（ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２、ＣＤＲ－３）とから構成される。重鎖定常（ＣＨ）領域は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）及び４つのＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４）を有し、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４の順番で配列される。軽鎖定常（ＣＬ）領域は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）及び４つのＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４）を有し、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４の順番で配列される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。ポリクローナル抗体は、通常は抗原で免疫した動物の血清から調製される抗体で、構造の異なる種々な抗体分子種の混合物である。一方、モノクローナル抗体とは、特定のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域の組み合わせを含む単一種類の分子からなる抗体をいう。モノクローナル抗体は、抗体産生細胞由来のクローンから産生することも可能であるが、抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子配列を有する核酸分子を取得し、斯かる核酸分子を用いて遺伝子工学的に作製することも可能である。また、重鎖及び軽鎖、或いはそれらの可変領域やＣＤＲ等の遺伝子情報を用いて抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことも、この分野での当業者にはよく知られた技術である。
　また、本発明の抗体は、抗体の断片及び／又は誘導体であってもよい。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ等が挙げられる。抗体の誘導体としては、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域部分に人工的にアミノ酸変異を導入した抗体、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域のドメイン構成を改変した抗体、１分子あたり２つ以上のＦｃ領域を有する抗体、糖鎖改変抗体、二重特異性抗体、抗体又は抗体の断片を抗体以外のタンパク質と結合させた抗体コンジュゲート、抗体酵素、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）等が挙げられる。更には、前記の抗体又はその断片若しくは誘導体が非ヒト動物由来の場合、そのＣＤＲ以外の配列の一部又は全部をヒト抗体の対応配列に置換したキメラ抗体又はヒト化抗体も、本発明の抗体に含まれる。なお、別途明記しない限り、本発明において単に「抗体」という場合、抗体の断片及び／又は誘導体も含むものとする。
　本発明の抗体が、ある細菌と抗原抗体反応を生じるとは、斯かる細菌が有する何らかの成分を抗原として、特異的に結合することをいう。本発明の抗体の抗原となる細菌の成分は制限されない。細菌の細胞外に露出する細胞壁や細胞膜等に含まれる成分でもよく、細菌の細胞外に露出しない細胞質、細胞小器官、核等に含まれる成分でもよい。
　本発明の抗体と検出対象となる細菌との抗原抗体反応の程度は特に制限されないが、少なくとも公知の何らかの検出手法により検出できる程度の抗原抗体反応が生じればよい。
　また、本発明の抗体は、検体中に存在しうる１種又は２種以上の非細菌由来成分と交差反応を生じないことが好ましい。斯かる非細菌由来成分の例としては、制限されるものではないが、例えばウイルス、植物、及び／又は動物に由来する各種の生体有機化合物であって、細菌が有さない化合物が挙げられる。斯かる生体有機化合物の具体例としては、タンパク質、糖類、糖タンパク質、脂質、複合脂質、核酸等が挙げられる。本発明の抗体は、これらの非細菌由来成分のうち、少なくとも１種、又は２種以上、通常３種以上、更には４種以上、又は５種以上、又は６種以上、又は７種以上、又は８種以上、とりわけ９種以上、特に１０種以上の非細菌性成分と交差反応しないことが好ましい。
　　本発明の抗体は、検出対象となる細菌と抗原抗体反応するものであれば限定されないが、下記汎用性抗体及び／又は特異性抗体を用いることが好ましく、細菌抗原をサンドイッチ型で検出する場合には、汎用性抗体と特異性抗体を組み合わせて用いることが好ましい。汎用性抗体は、できるだけ多数の属の細菌と広く抗原抗体反応を生じることが好ましい。具体的には、汎用性抗体は、少なくとも４つの属の細菌と抗原抗体反応を生じる。中でも、少なくとも５つ以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じることが好ましく、少なくとも６つ以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じることがより好ましい。汎用性抗体が抗原抗体反応を生じる具体的な細菌の属は限定されないが、少なくともエシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、バシラス属（Bacillus）、クレブシェラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、ラーネラ（Rahnella）属、シトロバクター（Citrobacter）属、リステリア（Listeria）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、及びサルモネラ（Salmonella）属から選択される１種以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じることが好ましい。
　一方、特異性抗体は、限定された属の細菌とのみ抗原抗体反応を生じることが好ましい。具体的には、特異性抗体が抗原抗体反応を生じる細菌の範囲を、検出対象となる細菌の範囲と一致させる。単一の特異性抗体のみを用いる場合には、その特異性抗体が抗原抗体反応を生じる細菌の範囲を、検出対象となる細菌の範囲と一致させる。一方、２以上の特異性抗体を併用する場合には、それら特異性抗体が各々抗原抗体反応を生じる細菌の範囲を合わせた場合に、検出対象となる細菌の範囲と一致すればよい。特に後者の態様によれば、各々別の細菌と抗原抗体反応を生じる複数の特異性抗体を適切に組み合わせることによって、検出対象とする細菌の範囲を種々調整することが可能となり、極めて有利である。
　なお、本発明の各々の特異性抗体は、少なくとも１つの属の細菌と抗原抗体反応を生じればよい。各特異性抗体が抗原抗体反応を生じる具体的な細菌の属は限定されないが、少なくともエシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、バシラス属（Bacillus）、クレブシェラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、ラーネラ（Rahnella）属、シトロバクター（Citrobacter）属、リステリア（Listeria）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、及びサルモネラ（Salmonella）属から選択される１以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じることが好ましい。
［標識用抗体］
　標識用抗体は、検出用標識が付された抗体であって、溶菌された対象細菌から放出される対象細菌由来抗原と抗原抗体反応により複合体を形成する抗体である。こうして形成された複合体を第１の複合体と呼ぶものとする。標識用抗体に使用する検出用標識の種類も特に制限されず、検出方法に応じて適宜選択すればよいが、具体的には金コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド等の金属コロイド；セレニウムコロイド、アルミナコロイド、シリカコロイド等の非金属コロイド；着色樹脂粒子、染料コロイド、着色リポソーム等の不溶性粒状物質；アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等の発色反応触媒酵素；蛍光色素、放射性同位体；化学発光標識、生物発光標識、電気化学発光標識等が挙げられる。抗体に標識を付加する手法も特に制限されないが、具体的には抗体の疎水性を利用した物理吸着、抗体の官能基を利用した化学結合等の手法が挙げられる。
［捕捉用抗体］
　捕捉用抗体は、第１の複合体と抗原抗体反応により複合体を形成する抗体である。こうして形成された複合体を第２複合体と呼ぶものとする。イムノクロマト法において用いる場合、捕捉用抗体はより具体的に、イムノクロマト法のストリップの検出領域に位置するクロマト展開用膜担体上に固定される。固相部材に抗体を固定する手法も特に制限されないが、具体的には抗体の疎水性を利用した物理吸着による固定、抗体の官能基を利用した化学結合による固定等の手法が挙げられる。
　汎用性抗体が標識用抗体、特異性抗体が捕捉用抗体でもよく、特異性抗体が標識用抗体、汎用性抗体が捕捉用抗体でもよい。イムノクロマト検出装置の作製が容易になる観点から、好ましくは、汎用性抗体が標識用抗体、特異性抗体が捕捉用抗体である。
　第２の複合体は、固定された捕捉用抗体による抗原抗体反応により、捕捉用抗体の固定位置（捕捉用抗体固定部位）に留め置かれ、そこで標識用抗体の標識が検出される。捕捉用抗体が固定された位置において標識が検出された場合に、検体液中に対象細菌が検出される。
［IV．キット］
　本発明の別の態様は、前述の本発明の溶菌方法に用いられる、検体中の少なくとも１種以上のグラム陽性細菌と、少なくとも１種以上のグラム陰性細菌から選択される複数種の細菌群を溶菌する溶菌キット（以下、適宜「本発明の溶菌キット」と称する。）に関する。溶菌キットは、界面活性剤及び溶菌酵素を含む１の製剤（すなわち溶菌剤）と、界面活性剤及び溶菌酵素を別個に提供された製剤とを包含する。かかる溶菌キットは、溶菌後に細菌群の検出のために用いられ、より好ましくはイムノクロマト法検出のための溶菌キットに関する。溶菌される細菌群、界面活性剤、及び溶菌酵素については前述のとおりである。
　溶菌キットは、界面活性剤及び溶菌酵素を、溶液又は固体の形態で、１の容器又は２以上の容器に分けて提供されてもよい。
　本発明のさらに別の態様は、前述の本発明の細菌検出方法に用いられる、少なくとも１種以上の細菌、例えば少なくとも１種以上のグラム陽性細菌と、少なくとも１種以上のグラム陰性細菌から選択される複数種の細菌から選ばれる複数種の細菌群の検出キット（以下、適宜「本発明の細菌検出キット」と称する。）に関してもよい。本発明の細菌検出キットは、溶菌キットを含んでいてもよいし、界面活性剤及び溶菌酵素を、細菌検出キットに用いられる装置又は容器に予め配置していてもよい。斯かる細菌検出キットは、免疫学的手法に基づいて細菌群を検出する。免疫学的手法としては、イムノクロマト法、免疫沈降法、免疫比濁法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射能免疫測定法（ＲＩＡ法）、または蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）など抗原抗体反応を用いた任意の検出手法であってよいが、検体を簡易に検査する観点からは、特にイムノクロマト法が好ましい。本発明の細菌検出キットにより検出される複数種の細菌群は、本発明の溶菌方法により溶菌された細菌の一部又は全部に関する。本発明の細菌検出キットに用いられる、界面活性剤、及び溶菌酵素については前述のとおりである。
　本発明の細菌検出キットは、前述した捕捉用抗体と標識用抗体とを含む。捕捉用抗体は、通常は固相担体の種類に応じた適切な形態（多孔膜を含む容器、流路を含む容器、溶液を保持できるプレート等）で提供される。標識用抗体は、通常は標識用抗体を水性媒体中に含む水系試薬又は標識用抗体を乾燥した乾燥試薬の形態で提供される。
　本発明の細菌検出キットは、前述した捕捉用抗体と標識用抗体に加えて、これらの抗体を使用して本発明の方法を実施するのに必要な１種又は２種以上の試薬、検出装置若しくはその構成部材、及び／又は、本発明の方法を実施するための手順を記載した指示書を含む。斯かる試薬の種類や指示書の記載内容、更には本発明のキットに含まれる他の構成要素は、具体的な免疫学的測定法の種類に応じて適宜決定すればよい。
　本発明の細菌検出キットが検出装置又はその構成部材を含む場合、斯かるキットにより構成される装置は、本発明の標識用抗体及び／又は捕捉用抗体を使用して本発明の方法を実施するのに必要な構成要素を備えた装置（以下適宜「本発明の装置」と略称する。）である。本発明の装置の具体的な構成要素は、本発明の方法の具体的な実施形態である免疫学的測定法の種類に応じて、適宜調整することができる。前述のように、免疫学的測定法の例としては、限定されるものではないが、抗体を担持させたマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着）法；抗体を担持させたラテックス粒子（例えばポリスチレンラテックス粒子等）を用いるラテックス粒子凝集測定法；抗体を担持させたメンブレン等を用いるイムノクロマト法；着色粒子又は発色能を有する粒子、酵素若しくは蛍光体等で標識した標識用抗体と、磁気微粒子等の固相担体に固定化した捕捉用抗体とを用いるサンドイッチアッセイ法等、種々の公知の免疫学的測定法が挙げられるところ、斯かる種々の免疫学的測定法を実施するために必要な構成要素を備えた装置が、本発明の装置となる。なお、検体中の２種以上の細菌を単一の捕捉用抗体固定部位で検出することもできる。この場合、１種又は２種以上の単一の捕捉用抗体固定部位に固定する。単一の捕捉用抗体固定（連結）部位とすることで、検体中の２種以上の細菌を同時に検出（細菌の総量を検出）することができる。
　イムノクロマト検出装置の具体例としては、ラテラルフロー方式の装置と、フロースルー方式の装置とを挙げることができる。ここで、ラテラルフロー方式とは、捕捉用抗体を表面に固定化させた検出領域を含むメンブレンに対し、検出対象検体及び標識用抗体を平行に展開させ、メンブレンの検出領域に捕捉された目的物質を検出する方法である。ラテラルフロー方式キットは、主にディップスティック型とカセット型に大別される。ディップスティック型は、検出装置の浸漬領域（サンプルパッドでもよい）を検体溶液に浸すことで、検体溶液を展開させるのに対し、カセット型は、検出装置の検体添加用部材（サンプルパッド）（３）に検体を添加することで、検体溶液を展開させる。一方、フロースルー方式とは、捕捉用抗体を表面に固定化させたメンブレンに、検出対象検体及び標識用抗体を垂直に通過させ、メンブレンの表面に捕捉された目的物質を検出する方法である。本発明の方法は、ラテラルフロー方式の装置とフロースルー方式の装置の何れに対しても適用することが可能である。
　ラテラルフロー方式の装置及びフロースルー方式のイムノクロマト検出装置はいずれも公知であり、本開示で説明する事項以外の手順については当業者が技術常識に基づいて適宜設計できる。以下、ラテラルフロー方式のイムノクロマト検出装置の検出機構の概略構成について、図面を参照しながら説明するが、これらはあくまでも検出手順の概略構成の一例に過ぎず、ラテラルフロー方式のイムノクロマト検出装置の構成は図面に例示する態様には何ら限定されない。
　図１は、ラテラルフロー方式のイムノクロマト検出装置の検出機構の一例である、ストリップ状の検出機構の概略構成を示す断面図である。図１のイムノクロマト検出装置（１０）は、クロマト展開用膜担体（１）上のストリップ長さ方向一端側（検体流れＢの上流側）に、ストリップ状の標識用抗体添着部材（コンジュゲートパッド）（２）（このパッドに標識用抗体が添着されている。）及び検体添加用部材（サンプルパッド）（３）が配置され、他端側（検体流れＢの下流側）に吸収用部材（吸収パッド）（４）が配置された状態で、基材（５）上に設けられている。標識用抗体添着部材（コンジュゲートパッド）（２）に添着された標識用抗体は、検体溶液中に溶出してもよい。クロマト展開用膜担体（１）上のストリップ長さ方向中央部には、捕捉用抗体が固定された捕捉用抗体固定部位（６）が配置されると共に、必要に応じて対照試薬が固定された対照試薬固定部位（７）が配置されている。なお、対照試薬は、被分析物質とは結合せず標識用抗体とは結合する試薬である。さらに、このストリップに、溶菌剤を検体溶液中に溶出可能に配置してもよい。
　使用時には、検体Ａを検体添加用部材（サンプルパッド）（３）上に適用すると、検体Ａは、標識用抗体添着部材（コンジュゲートパッド）（２）を通過してクロマト展開用膜担体（１）を検体流れＢの方向に流れる。この際に、検体中の被分析物質（本発明では細菌由来抗原であるＬ７／Ｌ１２）が標識用抗体と結合して、被分析物質－標識用抗体の第１の複合体が形成される。検体Ａが捕捉用抗体固定部位（６）を通過すると、検体中の被分析物質が捕捉用抗体と結合して、捕捉用抗体－被分析物質－標識用抗体の第２複合体が形成される。さらに、検体Ａが対照試薬固定部位（７）を通過すると、標識用抗体のうち被分析物質と結合していないものが対照試薬と結合し、これによって、検査の終了（すなわち検体Ａが捕捉用抗体固定部位（６）を通過したこと）を確認できる。ここで、捕捉用抗体固定部位（６）に存在する捕捉用抗体－被分析物質－標識用抗体の第２複合体中の標識用抗体が有する標識を、公知の手段で検出することにより、被分析物質の有無又は存在量を検出することができる。必要に応じて、標識用抗体の標識を公知の手法により増感して、検出を容易にしてもよい。
　なお、標識用抗体添着部材（コンジュゲートパッド）（２）、検体添加用部材（サンプルパッド）（３）、及び／又は対照試薬固定部位（７）は、任意に省略することもできる。本機構において標識用抗体添着部材（コンジュゲートパッド）（２）を有しない場合、検体Ａ及び標識用抗体を、予め混合した状態又は別々の状態で、同時に又は順次に、クロマト展開用膜担体（１）上の一端に適用することにより、上記の検査と同様の検査を行うことができる。
　また、捕捉用抗体と標識用抗体とを入れ替えても、同様の検出が可能な検出キットを構築することができる。
　本発明の別の態様としては、以下、項目２２～３４に挙げられる。
［２２］　検体中の細菌の有無及び／又は存在量を検出するための方法であって、
（Ｉ）　検体を、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液で処理する工程、
（ＩＩ）検体と、固相担体と固定された捕捉用抗体と、検出用標識を有する標識用抗体との抗原抗体反応により、検体中の細菌由来の抗原を捕捉すると共に、検体中の細菌由来の抗原を標識する工程、及び
（ＩＩＩ）検体中の細菌を検出用標識に基づき検出する工程を含み、
捕捉用抗体及び標識用抗体のうち一方が、細菌を含む５以上の属の細菌由来の抗原と抗原抗体反応を生じる、１種又は２種以上の汎用性抗体であり、捕捉用抗体及び標識用抗体のうち他方が、１又は２以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じる、１種又は２種以上の特異性抗体である、方法。
　この態様によれば、検体中に複数種の細菌が存在していたとしても同時に溶菌することができ、溶菌処理の効率化・迅速化が可能となる。その結果、検出についても効率化・迅速化が可能となる。
［２３］　前記細菌が、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び少なくとも１種以上のグラム陰性細菌を共に含む、項目２２に記載の方法。
［２４］　前記界面活性剤が、１種又は２種以上のアミンオキシドである、項目２２又は２３に記載の方法。
［２５］　前記アミンオキシドが、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド（ＤＤＡＯ）である、項目２４に記載の方法。
［２６］
　前記検体との処理時における溶液中の前記アミンオキシドの濃度が０．０１～０．２質量％である、項目２４又は２５に記載の方法。
［２７］　前記界面活性剤が、１種又は２種以上の第四級アンモニウム塩である、項目２２又は２３のいずれか一項に記載の方法。
［２８］　前記第四級アンモニウム塩が、塩化ベンザルコニウムである、項目２７に記載の方法。
［２９］　前記検体との処理時における溶液中の前記第四級アンモニウム塩の濃度が０．００５～０．０８質量％である、項目２７又は２８に記載の方法。
［３０］
　前記溶菌酵素が、リゾスタフィンである、項目２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
［３１］　前記検体との処理時における溶液中の前記リゾスタフィンの濃度が、０．０１μｇ／ｍＬ～５．０μｇ／ｍＬである、項目３０に記載の方法。
　上記項目２３～３１の態様によれば、特定の界面活性剤と酵素を、特定の濃度で調整した溶液で処理することで、より確実な溶菌処理を可能とし、溶菌処理の効率化・迅速化が可能となるだけでなく、より確実な検出も実現できる。
［３２］　前記グラム陽性細菌が、少なくともスタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）の細菌を含む、項目２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
［３３］　前記界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液が、赤、青、及び緑から選択されるいずれかの色素を含む、項目２２～３２のいずれか一項に記載の方法。
［３４］　イムノクロマト法による検体中の少なくとも１種以上の細菌を検出するために用いる、項目２２～３３のいずれか一項に記載の方法。
　以下、本発明を実施例に則して更に詳細に説明するが、これらの実施例はあくまでも説明のために便宜的に示す例に過ぎず、本発明は如何なる意味でもこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群を検出するためのイムノクロマトテストストリップの作製
・汎用性抗体の作製
　免疫原の細菌として緑膿菌を用いた。緑膿菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を、国際公開第２０００／０６６０３号公報に記載の方法を参照して作製した。具体的には、緑膿菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列の全部をコードしたＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで形質転換した大腸菌をＬＢ培地等を用いて培養し、アフィニティカラムにより発現ベクター由来のタグ配列を利用して融合タンパク質として精製した。この緑膿菌Ｌ７／Ｌ１２全長タンパク質を免疫原として、ハイブリドーマ取得の定法に従い、免疫原の濃度が０．４ｍｇ／ｍＬとなるようＰＢＳで調製し、フロイントのアジュバントを同量加え、免疫原量が５０μg／回となるようマウスに４回免疫した。試験採血により血清抗体価上昇を確認後、マウスの脾臓細胞を摘出した。摘出したマウス脾臓細胞をミエローマ細胞と融合し、種々のハイブリドーマを取得した。
　取得した種々のハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養し、培養上清中の抗体を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ法により実施し、少なくとも、大腸菌（ＥＣ）、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、緑膿菌（ＰＡ）、枯草菌（ＢＳ）という４菌種の細菌溶解物と同時に反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
　モノクローナル抗体産生の定法に従い、選択したハイブリドーマをウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したＴＩＬ ＭｅｄｉａＩ培地で培養し、マウスの腹腔内に投与し、腹水を回収した。回収した腹水は遠心により浮遊物・赤血球を分離後、目開き０．４５μｍのフィルタでろ過した。得られたろ液をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムに通して抗体を吸着させることにより、得られた汎用性抗体をマウス腹水から精製取得した。
・特異性抗体Ｉの作製
　同様に、免疫原の細菌としてインフルエンザ菌（ＨＩ）を用い、インフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を免疫原とした他は、汎用性抗体取得の手順と同様の手順で、種々のハイブリドーマを取得したのち、少なくとも、大腸菌（ＥＣ）、緑膿菌（ＰＡ）という２菌種の細菌溶解物と反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択した。その後、汎用性抗体取得の手順と同様の手順で、特異性抗体Ｉを作製した。
・特異性抗体ＩＩの作製
　同様に、免疫原の細菌として黄色ブドウ球菌（ＳＡ）を用い、黄色ブドウ球菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を免疫原とした他は、汎用性抗体取得の手順と同様の手順で、種々のハイブリドーマを取得したのち、少なくとも、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）及び枯草菌（ＢＳ）という２菌種の細菌溶解物と反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択した。その後、汎用性抗体取得の手順と同様の手順で特異性抗体ＩＩを作製した。
・イムノクロマトテストストリップの作製
　取得した汎用性抗体を標識用抗体、特異性抗体ＩとＩＩを捕捉用抗体として、下記イムノクロマトテストストリップを作製した。
・イムノクロマト展開用膜担体の作製
　１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液溶液中に、特異性抗体ＩとＩＩを各１．５ｍｇ／ｍＬとなるよう混合し、トレハロース３％（ｖ／ｖ）を添加した溶液を調製した。得られた溶液を、幅２．５ｃｍ、長さ１５ｃｍにカットした市販のニトロセルロース膜に１ｃｍ2あたり１μＬ液量で１本のラインとなるよう塗布し、乾燥させて、イムノクロマト展開用膜担体とした。
・金コロイドを標識として用いた標識用抗体及び金コロイドを標識として用いた標識用抗体添着部材の作製：
　市販の金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）に、汎用性抗体１／１０量を加えて混合し、抗体濃度０．１ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。この溶液を室温で３０分間静置して、抗体を金コロイド粒子表面に結合させた。その後、金コロイド溶液における最終濃度が０．１％となるようにＢＳＡ溶液を加えてブロッキングし、金コロイドを標識として用いた標識用抗体溶液を調製した。この抗体溶液を市販のガラス繊維シートに浸み込ませた後、乾燥させて、金コロイドを標識として用いた標識用抗体添着部材とした。
・イムノクロマトテストストリップの組み立て：
　上述した手順で作製したイムノクロマト展開用膜担体及び金コロイドを標識として用いた標識用抗体添着部材に加えて、さらに検体添加用部材として綿布と、吸収用部材として濾紙を用意した。そして、これらの部材を市販のポリエチレン基材に貼り合せた後、５ｍｍ幅に切断し、図１と同様（対照試薬固定部位７は省略）の構成のイムノクロマトテストストリップを作製した。
実施例２：各種反応液（溶菌剤）組成での溶菌および検出性能評価
・評価用菌液の調製：
　グラム陰性細菌として、大腸菌（ＥＣ）及び緑膿菌（ＰＡ）、グラム陽性細菌として、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）及び枯草菌（ＢＳ）を選定し、それぞれ１ｅ６ｃｆｕ／ｍｌとなるよう生理食塩水で調製した。また、菌なしの液は生理食塩水とした。
・各種反応液の調製：
　０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液に、イムノクロマト展開用に０．２％のＴｗｅｅｎ２０を添加したものを母液として、表１に示す条件の各種反応液を調製した。各種界面活性剤の濃度は、０．１％（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０．０５％）、各種溶菌酵素の濃度は、２．０ｕｇ／ｍｌ（評価用菌液（検体）との混合後終濃度１．０ｕｇ／ｍｌ）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
・イムノクロマトでの検出性能評価：
　上記評価用菌液と、上記各種反応液を１：１で混合し、実施例１で作製したイムノクロマトテストストリップを挿入して、細菌の溶菌と抗原抗体反応による検出性能を評価した。なお評価は、テストライン部分の金コロイドによる赤色度合を目視で判定した。結果を表２に示す。目視陽性を＋、目視弱陽性を±、目視陰性を－として表記した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　界面活性剤を添加しない条件（２－１）では、ＰＡ、ＢＳの弱陽性シグナルのみが確認された。これは、イムノクロマト展開用に添加したＴｗｅｅｎ２０により溶菌が僅かに起こったためと考えられる。一方、種々の界面活性剤を添加した条件（２－２～２－１１）では、菌なしでは全て目視陰性、菌ありでは、菌の種類ごとに異なる結果となった。特に、ＥＣとＳＡは、ほとんどの界面活性剤で溶菌が困難であったが、ＤＤＡＯ（条件２－２）または塩化ベンザルコニウム（条件２－３）では、ＥＣで陽性、ＳＡで弱陽性と溶菌およびイムノクロマト検出可能であった。
　次に、ＳＡのシグナルを増強させるために、ＤＤＡＯまたは塩化ベンザルコニウムを含む反応液に溶菌酵素（リゾスタフィンまたはリゾチーム）をさらに添加した（条件２－１２～２－１５）。リゾスタフィンを添加した条件（２－１２、２－１３）では、ＳＡの陽性シグナルが確認された。また、菌なしは陰性、ＳＡ以外の菌も陽性となった。リゾチームを添加した条件（２－１４、２－１５）では、リゾチームを添加しない条件（２－２、２－３）に対して変化がなく、ＳＡのシグナルは弱陽性のままであった。
　以上の結果より、界面活性剤としてＤＤＡＯまたは塩化ベンザルコニウム、溶菌酵素としてリゾスタフィンを用いることで、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群が同時に溶菌されイムノクロマトで検出できることが示された。
実施例３：ＤＤＡＯまたは塩化ベンザルコニウムの濃度検討
・評価用菌液（検体）の調製：
　グラム陰性細菌として、大腸菌（ＥＣ）を、グラム陽性細菌として、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）を選定し、それぞれ１ｅ５ｃｆｕ／ｍｌとなるよう生理食塩水で調製した。また、菌なしの液は生理食塩水とした。
・各種反応液の調製：
　０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液に、２．０ｕｇ／ｍｌ（評価用菌液（検体）との混合後終濃度１．０ｕｇ／ｍｌ）のリゾスタフィン酵素と、イムノクロマト展開用に０．２質量％のＴｗｅｅｎ２０を添加したものを母液として、ＤＤＡＯを０～０．５質量％（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０～０．２５質量％）、または、塩化ベンザルコニウムを０～０．５質量％（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０～０．２５質量％）の各種反応液を調製した。
・イムノクロマトでの検出性能評価：
　評価用菌液と、上記各種反応液を１：１で混合し、実施例１で作製したイムノクロマトテストストリップを挿入して、細菌の溶菌と抗原抗体反応による検出性能を評価した。なお評価は、テストライン部分の金コロイドによる赤色度合をカメラで撮影したのち、画像処理によって数値化した（ＲＧＢの内、赤色吸収を示すＧの値を用いた。後述のグラフでは「テストライン強度」と表示）。テストライン強度が高いほど、赤色度合が高いことを示し、テストライン強度が１０以上で目視陽性となる。
　ＤＤＡＯ濃度とテストライン強度の関係を図２に示す。ＤＤＡＯを添加した何れの濃度においても、イムノクロマトの液展開不良は見られなかった。大腸菌（ＥＣ）の評価結果は、ＤＤＡＯが無い場合に比べ、ＤＤＡＯの終濃度が高いほど溶菌が促進され、抗原抗体反応によるテストライン強度が高い結果となった。黄色ブドウ球菌（ＳＡ）の評価結果は、ＤＤＡＯが無い場合に比べ、何れの濃度においてもＤＤＡＯ添加により溶菌が促進され、抗原抗体反応によるテストライン強度が高い結果となったが、ＤＤＡＯ終濃度に応じて異なる挙動が示された。ＤＤＡＯの終濃度が０～０．０５質量％の範囲で、テストライン強度が増加したのち、０．０５～０．１質量％の間でほぼ一定となり、０．１質量％を超えると減少する（ＤＤＡＯを加えない場合よりは高いテストライン強度）結果となった。ＤＤＡＯ終濃度が０．１質量％までは、黄色ブドウ球菌の溶菌に対してリゾスタフィン酵素とＤＤＡＯの相乗効果が発揮されるが、ＤＤＡＯ終濃度が０．１質量％を超えると、リゾスタフィン酵素の活性阻害を引き起こし、溶菌効率及びテストライン強度が低下すると考えられる。
　次に、塩化ベンザルコニウム終濃度とテストライン強度の関係を図３に示す。塩化ベンザルコニウムが終濃度０～０．０５質量％の間では、イムノクロマトの液展開不良は見られなかったが、０．０５質量％を超えると液流れの一部に展開不良（金コロイド標識抗体がニトロセルロース膜に展開されず検体添加用部材部分に滞留する）が見られ、０．０７５質量％を超えると液展開不良傾向が強くなる結果となった。大腸菌（ＥＣ）の評価結果は、塩化ベンザルコニウムが無い場合に比べ、塩化ベンザルコニウムの終濃度が０．０７５質量％までは、溶菌効率および抗原抗体反応によるテストライン強度が高い結果となった。終濃度が０．０７５質量％を超えると先述の液流れ展開不良により、テストライン強度が減少する結果となった。黄色ブドウ球菌（ＳＡ）の評価結果は、塩化ベンザルコニウムが無い場合に比べ、塩化ベンザルコニウム添加により溶菌が促進され、抗原抗体反応によるテストライン強度が高い結果となったが、塩化ベンザルコニウム終濃度に応じて異なる挙動が示された。塩化ベンザルコニウムの終濃度が０～０．０６５質量％の範囲で、テストライン強度が増加したが、０．０７質量％を超えると減少する結果となった。塩化ベンザルコニウム終濃度が０．０６５質量％までは、黄色ブドウ球菌の溶菌に対してリゾスタフィン酵素と塩化ベンザルコニウムの相乗効果が発揮されるが、塩化ベンザルコニウム終濃度が０．０７質量％を超えると、前述の液流れ不良とリゾスタフィン酵素の活性阻害を引き起こし、溶菌効率及びテストライン強度が低下すると考えられる。
　以上の結果より、界面活性剤としてＤＤＡＯを好ましくは０．２質量％、より好ましくは０．１質量％までの終濃度で添加し、リゾスタフィン酵素と併用することにより、複数属細菌（大腸菌および黄色ブドウ球菌）の溶菌およびイムノクロマトによる検出が効率的に行われることが示された。
　また、界面活性剤として塩化ベンザルコニウムを好ましくは０．０８質量％、より好ましくは０．０６５質量％までの終濃度で添加し、リゾスタフィン酵素と併用することにより複数属細菌（大腸菌および黄色ブドウ球菌）の溶菌およびイムノクロマトによる検出が効率的に行われることが示された。
実施例４：リゾスタフィンの濃度検討
・評価用菌液（検体）の調製：
　リゾスタフィンの効果を見るため、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）を、１ｅ６ｃｆｕ／ｍｌとなるよう生理食塩水で調製した。また、菌なしの液は生理食塩水とした。
・各種反応液の調製：
　０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液に、０．１５質量％（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０．０７５質量％）のＤＤＡＯ、または、０．０５質量％（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０．０２５質量％）の塩化ベンザルコニウムと、イムノクロマト展開用に０．２質量％のＴｗｅｅｎ２０を添加したものを母液として、リゾスタフィン酵素を０～５０μｇ／ｍｌ（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０～２５μｇ／ｍｌ）の各種反応液を調製した。
・イムノクロマトでの検出性能評価：
　評価用菌液と、上記各種反応液を１：１で混合し、実施例１で作製したイムノクロマトテストストリップを挿入して、細菌の溶菌と抗原抗体反応による検出性能（テストライン強度）を評価した。
　界面活性剤としてＤＤＡＯを用いた場合の、リゾスタフィン終濃度とテストライン強度の関係を図４に示す。図４（ａ）は、全データを、図４（ｂ）は、横軸（リゾスタフィン終濃度）を拡大表示したものである。リゾスタフィンが無い場合に比べ、リゾスタフィンを添加することにより、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）の溶菌が促進される傾向が見られた。リゾスタフィン終濃度が０．０１μｇ／ｍｌを超えると十分な溶菌性能（酵素の触媒的作用）が見られ、抗原抗体反応によるテストライン強度が高い結果となった。一方、リゾスタフィン終濃度が５．０μｇ／ｍｌを超えると、菌がいない場合でもテストライン（リゾスタフィンによる偽陽性）が確認（テストライン強度≧１０）された。したがって、リゾスタフィン終濃度は、０．０１～５．０μｇ／ｍｌの範囲が好適であることが確認された。
　界面活性剤として塩化ベンザルコニウムを用いた場合の、リゾスタフィン終濃度とテストライン強度の関係を図５に示す。図５（ａ）は、全データを、図５（ｂ）は、横軸（リゾスタフィン終濃度）を拡大表示したものである。リゾスタフィンが無い場合に比べ、リゾスタフィンを添加することにより、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）の溶菌が促進される傾向が見られた。リゾスタフィン終濃度が０．０１μｇ／ｍｌを超えると十分な溶菌性能（酵素の触媒的作用）が見られ、抗原抗体反応によるテストライン強度が高い結果となった。一方、リゾスタフィン終濃度が５．０μｇ／ｍｌを超えると、菌がいない場合でもテストライン（リゾスタフィンが原因と思われる偽陽性）が確認（テストライン強度≧１０）された。したがって、リゾスタフィン終濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ以上～５．０μｇ／ｍｌの範囲が好適であることが確認された。
　以上の結果より、溶菌酵素としてリゾスタフィンを終濃度０．０１μｇ／ｍｌ～５．０μｇ／ｍｌの範囲で用い、界面活性剤のＤＤＡＯまたは塩化ベンザルコニウムと併用することにより、黄色ブドウ球菌の溶菌およびイムノクロマトによる検出が効率的に行われることが示された。
実施例５：境界条件付近での溶菌・検出性能確認
・各種反応液の調製：
　上述の界面活性剤ＤＤＡＯまたは塩化ベンザルコニウム及びリゾスタフィン酵素の好適範囲の組み合わせの確認として、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液に、イムノクロマト展開用に０．２質量％のＴｗｅｅｎ２０を添加したものを母液として、表３の条件の反応液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
・評価用菌液（検体）の調製：
　グラム陰性細菌として、大腸菌（ＥＣ）及び緑膿菌（ＰＡ）、グラム陽性細菌として、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）及び枯草菌（ＢＳ）を選定し、それぞれ１ｅ６ｃｆｕ／ｍｌとなるよう生理食塩水で調製した。また、菌の混合液の代表として、大腸菌（ＥＣ）と黄色ブドウ球菌（ＳＡ）双方を１ｅ６ｃｆｕ／ｍｌの濃度で含む液を生理食塩水で調製した。また、菌なしの液は生理食塩水とした。
・イムノクロマトでの検出性能評価：
　評価用菌液と、上記各種反応液を１：１で混合し、実施例１で作製したイムノクロマトテストストリップを挿入して、細菌の溶菌と抗原抗体反応による検出性能を目視で評価した。結果を表４に示す。何れの条件においても、菌なしの場合は目視陰性、大腸菌（ＥＣ）、緑膿菌（ＰＡ）、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、枯草菌（ＢＳ）、および、大腸菌（ＥＣ）と黄色ブドウ球菌（ＳＡ）の混合液の場合は目視陽性となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　以上の結果より、界面活性剤ＤＤＡＯまたは塩化ベンザルコニウムとリゾスタフィン酵素を好適濃度で用いることにより、複数属細菌の溶菌およびイムノクロマトによる検出が効率的に行われることが示された。
実施例６：反応液のｐＨ検討
・各種反応液の調製：
　０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（またはＭＯＰＳＯ）緩衝液に、０．１５質量％（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０．０７５質量％）のＤＤＡＯ、または、０．０５質量％（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０．０２５質量％）の塩化ベンザルコニウムと、リゾスタフィン酵素５．０ｕｇ／ｍｌ（評価用菌液（検体）との混合後終濃度２．５ｕｇ／ｍｌ）、イムノクロマト展開用に０．２質量％のＴｗｅｅｎ２０を添加したものを母液としてｐＨ調製を行い、ｐＨの異なる（６．０～９．５）反応液を調製した。
・評価用菌液（検体）の調製：
　グラム陰性細菌として、大腸菌（ＥＣ）及び緑膿菌（ＰＡ）、グラム陽性細菌として、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）及び枯草菌（ＢＳ）を選定し、それぞれ１ｅ６ｃｆｕ／ｍｌとなるよう生理食塩水で調製した。また、菌なしの液は生理食塩水とした。
・イムノクロマトでの検出性能評価：
　評価用菌液と、上記各種反応液を１：１で混合し、実施例１で作製したイムノクロマトテストストリップを挿入して、細菌の溶菌と抗原抗体反応による検出性能を目視で評価した。結果を表５に示す。ｐＨ６．０～６．２では、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）のテストラインは陰性に、ｐＨ９．５では弱陽性の結果となった。当該ｐＨでは、リゾスタフィンの酵素活性が低下するものと思われる。それ以外のｐＨでは、菌なしの場合は目視陰性、大腸菌（ＥＣ）、緑膿菌（ＰＡ）、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、枯草菌（ＢＳ）は目視陽性となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　以上の結果より、反応液のｐＨを６．４～９．０の範囲で用いることにより、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群の溶菌およびイムノクロマトによる検出が効率的に行われることが示された。
実施例７：反応液の着色検討
・着色剤の選定
　食品現場での誤飲食防止手段として反応液の着色を検討した。市販の水溶性色素（青色１号、黄色４号、緑色３号など２６種類）を入手し、吸収スペクトルを測定した。標識に用いた金コロイド（赤色）と吸収が干渉しない色素４種類（青色１号、黄色４号、緑色３号、および、青色１号と黄色４号を混合したもの）を選定した。
・着色反応液の調製
　０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液に、０．１５質量％（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０．０７５質量％）のＤＤＡＯ、または、０．０５質量％（評価用菌液（検体）との混合後終濃度０．０２５質量％）の塩化ベンザルコニウムと、リゾスタフィン酵素５．０ｕｇ／ｍｌ（評価用菌液（検体）との混合後終濃度２．５ｕｇ／ｍｌ）、イムノクロマト展開用に０．２質量％のＴｗｅｅｎ２０を添加したものを母液として、表６に示す条件の着色剤を添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
・評価用菌液（検体）の調製：
　グラム陰性細菌として、大腸菌（ＥＣ）及び緑膿菌（ＰＡ）、グラム陽性細菌として、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）及び枯草菌（ＢＳ）を選定し、それぞれ１ｅ６ｃｆｕ／ｍｌとなるよう生理食塩水で調製した。また、菌なしの液は生理食塩水とした。
・イムノクロマトでの検出性能評価：
　評価用菌液と、上記各種反応液を１：１で混合し、実施例１で作製したイムノクロマトテストストリップを挿入して、細菌の溶菌と抗原抗体反応による検出性能を目視で評価した。結果を表７に示す。各種着色を施した場合も、着色なしの場合と同様に、菌なしの場合は陰性、菌がある場合は陽性となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　以上の結果より、反応液に誤飲食防止手段としての着色を施しても、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群の溶菌およびイムノクロマトによる検出が効率的に行われることが示された。
　本発明は、細菌溶菌、細菌検出等の食品、医療の分野等に広く適用でき、その利用価値は極めて大きい。
１０ イムノクロマト検出装置
１ クロマト展開用膜担体
２ 標識用抗体添着部材（コンジュゲートパッド）
３ 検体添加用部材（サンプルパッド）
４ 吸収用部材（吸収パッド）
５ 基材
６ 捕捉用抗体固定部位
７ 対照試薬固定部位
Ａ 検体
Ｂ 検体流れ

Claims (21)

  1. 　検体中の少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群の溶菌方法であって、検体を、界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液で処理する工程を含み、前記界面活性剤がアミンオキシド及び第四級アンモニウムから選ばれる、前記方法。
  2. 　前記複数種の細菌群が、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び少なくとも１種以上のグラム陰性細菌を共に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記界面活性剤が、１種又は２種以上のアミンオキシドである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記アミンオキシドが、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド（ＤＤＡＯ）である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記検体との処理時における溶液中の前記アミンオキシドの濃度が０．０１～０．２質量％である、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 　前記界面活性剤が、１種又は２種以上の第四級アンモニウム塩である、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 　前記第四級アンモニウム塩が、塩化ベンザルコニウムである、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記検体との処理時における溶液中の前記第四級アンモニウム塩の濃度が０．００５～０．０８質量％である、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　前記溶菌酵素が、リゾスタフィンである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記検体との処理時における溶液中の前記リゾスタフィンの濃度が、０．０１μｇ／ｍＬ～５．０μｇ／ｍＬである、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記グラム陽性細菌が、少なくともスタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）の細菌を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記界面活性剤及び溶菌酵素を含む溶液が、赤、青、及び緑から選択されるいずれかの色素を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　イムノクロマト法による検体中の少なくとも１種以上の細菌を検出するために用いる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　検体中の複数種の細菌群の検出方法であって、
    　請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法により、検体中の複数種の細菌群を溶菌する工程、及び
    　溶菌された細菌群から放出された細菌の抗原を、当該抗原と抗原抗体反応を生じる抗体を用いて検出する工程
    を含む検出方法。
  15. 　前記検出の対象となる検体中の複数種の細菌群が、少なくとも１種以上のグラム陽性細菌と、少なくとも１種以上のグラム陰性細菌とを共に含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記検出する工程がイムノクロマト法により行われる、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 　前記溶菌する工程により放出される細菌の抗原がＬ７抗原である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法において用いる、検体中の少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群を溶菌するための溶菌キットであって、界面活性剤及び溶菌酵素を含む、溶菌キット。
  19. 　検体中の少なくとも１種以上のグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌を含む複数種の細菌群を検出するための細菌検出キットであって、
    　請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法で用いられる、界面活性剤及び溶菌酵素と、
    以下の：
    　　（ａ）対象細菌由来抗原と抗原抗体反応により第１の複合体を形成する標識用抗体が添着された標識用抗体添着部材、及び、
    　　（ｂ）第１の複合体と抗原抗体反応により第２の複合体を形成する捕捉用抗体が固定化された検出領域を有するストリップ
    　を含むイムノクロマト検出装置と
    　を含む、前記細菌検出キット。
  20. 　検体中の細菌の有無及び／又は存在量を検出するための方法であって、
    （Ｉ）　請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法により、検体中の細菌を溶菌する工程、
    （ＩＩ）検体と、固相担体と固定された捕捉用抗体と、検出用標識を有する標識用抗体との抗原抗体反応により、検体中の細菌由来の抗原を捕捉すると共に、検体中の細菌由来の抗原を標識する工程、及び
    （ＩＩＩ）検体中の細菌を検出用標識に基づき検出する工程を含み、
    捕捉用抗体及び標識用抗体のうち一方が、細菌を含む５以上の属の細菌由来の抗原と抗原抗体反応を生じる、１種又は２種以上の汎用性抗体であり、捕捉用抗体及び標識用抗体のうち他方が、１又は２以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じる、１種又は２種以上の特異性抗体である、方法。
  21. 　検体中の２種以上の細菌を単一の捕捉用抗体固定部位で検出する、請求項２０に記載の方法。
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