WO2024111665A1

WO2024111665A1 - 溶菌方法、溶菌助液、及び細菌の有無の判定方法

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Publication number: WO2024111665A1
Application number: PCT/JP2023/042246
Authority: WO
Inventors: 優安藤
Original assignee: 旭化成株式会社
Priority date: 2022-11-24
Filing date: 2023-11-24
Publication date: 2024-05-30

Abstract

溶菌対象が異なる細菌を検出する場合には、溶菌対象毎に適した溶菌酵素を含む溶菌溶液で、別個に溶菌を行う必要があり、溶菌処理の煩雑化・遅延を招いていた。そこで、検体中の複数の細菌群を溶菌することができ、溶菌処理の効率化・迅速化が可能となる、新たな溶菌方法の提供を目的とする。　検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合する工程を含む、検体中の細菌群を溶菌する方法において、前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素を含み、溶菌助液のｐＨが６．０～７．０、溶菌助液の電気伝導度が２～８ｍＳ／ｃｍとすることにより、複数の細菌群の溶菌が可能になる。

Description

溶菌方法、溶菌助液、及び細菌の有無の判定方法

　本発明は、検体中の複数種の細菌群を溶菌するための溶菌方法に関する。さらに、本発明は、本発明に係る溶菌方法に用いる溶菌助液、溶菌助液を含む溶菌キット、細菌検出方法に用いる細菌検出キット、並びに細菌の有無の判定方法にも関する。

　従来、検体中の細菌をその細胞内成分に基づき検出する等の目的で、検体中の細菌を溶菌する技術が種々用いられている。例えば特許文献１及び２には、黄色ブドウ球菌をそのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に基づき抗原抗体反応で検出する技術が開示されており、その際に溶菌酵素としてリゾスタフィンを用いて検体中の細菌を溶菌する旨が記載されている。また、特許文献３には、大腸菌をそのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に基づき抗原抗体反応で検出する技術が開示されており、その際に溶菌酵素としてリゾチームを用いて検体中の細菌を溶菌する旨が記載されている。特許文献４には、ストレプトコッカスをそのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に基づき抗原抗体反応で検出する技術が開示されており、その際に溶菌酵素としてリゾチーム及びラビアーゼを用いて検体中の細菌を溶菌する旨が記載されている。

特開２０１７－３２５７９号公報国際公開第２０１５／０９３５４４号国際公開第２０１５／０９３５４５号国際公開第２０１５／０９３５４６号

　特許文献１～４等の従来の溶菌方法では、各溶菌酵素の活性を維持する条件が異なっていた。このため、溶菌対象が異なる細菌を検出する場合には、溶菌対象毎に適した溶菌酵素を含み、溶菌酵素について最適化された条件の溶菌溶液で、別個に溶菌を行う必要があり、溶菌処理の煩雑化・遅延を招くとともに、溶菌対象に対応する溶菌溶液の取り違えも生じていた。

　本発明者等はリゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素を使用して、溶菌を可能とする条件について鋭意検討を行った。その結果、反応液のｐＨ、及び反応液の電気伝導度を調整することで、選択された溶菌酵素のいずれもが活性を有し、使用された溶菌酵素に対応する細菌を溶菌し検出するが可能になることを見出し、本発明に至った。

　そこで本発明は、例えば以下に関する：
［１］　　検体中の細菌群を溶菌する方法であって、
　検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合して得られる混合液中で検体中の細菌群を溶菌する工程を含み、
　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素を含み、
　前記混合液のｐＨが６．０～７．０であり、
　前記混合液の電気伝導度が２．５～８．５ｍＳ／ｃｍである、前記方法。
［２］　前記溶菌酵素と、前記溶菌助液とが予め混合されている、項目１に記載の方法。
［３］　前記溶菌助液が、緩衝剤、界面活性剤を含む、項目１に記載の方法。
［４］　前記溶菌助液が、さらに塩を含む、項目３に記載の方法。
［５］　前記界面活性剤が少なくとも非イオン性界面活性剤を含む、項目３に記載の方法。
［６］　前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン鎖を有し、前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７～１１かつ、ＨＬＢ値が１２．０以上１４．５未満である第一の非イオン性界面活性剤を含む、項目５に記載の方法。
［７］　前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７．５～１０かつ、ＨＬＢ値が１２．４～１４．１である、項目６に記載の方法。
［８］　前記混合液中の前記第一の非イオン性界面活性剤の濃度が１．２５～３．１２５％である、項目６に記載の方法。
［９］　前記溶菌助液が、５～５００ｍＭの緩衝剤を含む、項目５に記載の方法。
［１０］　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる４つ全ての溶菌酵素を含む、項目１に記載の方法。
［１１］　前記方法の溶菌対象が、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌からなる群から選ばれる少なくとも１の細菌を含む、項目１に記載の方法。
［１２］　前記方法の溶菌対象が、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌を含む、項目１０に記載の方法。
［１３］　前記方法が、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原検出の前処理として行われる、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
［１４］　前記検体が、乳汁である、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
［１５］　検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合する工程を含む、検体中の細菌群を溶菌する方法であって、前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素を含み、溶菌助液のｐＨが６．０～７．０、溶菌助液の電気伝導度が２．０～８．０ｍＳ／ｃｍである、前記方法。
［１６］　前記溶菌酵素と、前記溶菌助液とが予め混合されて提供される、項目１５に記載の方法。
［１７］　前記溶菌助液が、緩衝剤及び界面活性剤を含む、項目１５に記載の方法。
［１８］　前記溶菌助液が、さらに塩を含む、項目１７に記載の方法。
［１９］　前記界面活性剤が少なくとも非イオン性界面活性剤を含む、項目１７に記載の方法。
［２０］　前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン鎖を有し、前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７～１１かつ、ＨＬＢ値が１２．０以上１４．５未満である第一の非イオン性界面活性剤を含む、項目１９に記載の方法。
［２１］　前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７．５～１０かつ、ＨＬＢ値が１２．４～１４．１である、項目２０に記載の方法。
［２２］　溶菌助液中の前記非イオン性界面活性剤の濃度が２～５％である、項目１９に記載の方法。
［２３］　前記溶菌助液が、５～５００ｍＭの緩衝剤を含む、項目１７に記載の方法。
［２４］　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる４つ全ての溶菌酵素を含む、項目１５に記載の方法。
［２５］　前記方法の溶菌対象が、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌からなる群から選ばれる少なくとも１の細菌を含む、項目１５に記載の方法。
［２６］　前記方法の溶菌対象が、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌を含む、項目２４に記載の方法。
［２７］　前記方法が、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原検出の前処理として行われる、項目１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
［２８］　前記検体が、乳汁である、項目１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
［２９］　前記検体と、前記溶菌助液とが、１：５～３：１で混合される、項目１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
［３０］　０～１．５Ｍの塩濃度、５～５００ｍＭの緩衝剤、２～５％の非イオン性界面活性剤を含み、ｐＨが６．０～７．０、溶菌助液の電気伝導度が２．０～８．０ｍＳ／ｃｍである、検体中の大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌を含む細菌群を、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１の溶菌酵素と共に用いて溶菌するための溶菌助液。
［３１］　リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素と、項目３０に記載の溶菌助液とを含む、細菌溶菌キット。
［３２］　リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素と、項目３０に記載の溶菌助液と、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原を検出する検出装置を含む、細菌検出キット。
［３３］　検体中の、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌からなる群から選ばれる少なくとも１種の細菌の有無を判定する方法であって、
　検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合して混合液を取得する工程、及び
　免疫学的手法により、前記混合液中に含まれる細菌由来のＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質を検出することで細菌の有無を判定する工程を含み、
　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素を含み、
　前記混合液のｐＨが６．０～７．０であり、
　前記混合液の電気伝導度が２．５～８．５ｍＳ／ｃｍであり、
　前記混合液を取得する工程において、リゾチームが大腸菌を、リゾスタフィンがブドウ球菌を、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼがストレプトコッカス属細菌を溶菌し得ることを特徴とする、前記方法。
［３４］　前記溶菌助液が、緩衝剤、界面活性剤を含む、項目３３に記載の方法。
［３５］　前記界面活性剤が少なくとも非イオン性界面活性剤を含む、項目３４に記載の方法。
［３６］　前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン鎖を有し、前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７～１１かつ、ＨＬＢ値が１２．０以上１４．
５未満である第一の非イオン性界面活性剤を含む、項目３５に記載の方法。
［３７］　前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７．５～１０かつ、ＨＬＢ値が１２．４～１４．１である、項目３６に記載の方法。
［３８］　前記混合液中の前記第一の非イオン性界面活性剤の濃度が１．２５～３．１２５％である、項目３６に記載の方法。
［３９］　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる４つ全ての溶菌酵素を含む、項目３３に記載の方法。
［４０］　前記工程において、前記溶菌酵素が大腸菌、ブドウ球菌、ストレプトコッカス属細菌を全て溶菌し得ることを特徴とする、項目３９に記載の方法。

　本発明によれば、異なる溶菌酵素を用いた場合も、同じ溶菌助液を用いて溶菌が可能になる。これにより、溶菌酵素に応じた溶菌助液を選択する必要がなくなり、溶菌助液の取り違えを防ぐことができる。また、複数の溶菌酵素を同時に用いる態様では、複数種の細菌群を同時に溶菌することができ、溶菌処理の効率化・迅速化が可能となる。これにより、細菌の細胞内抗原等を用いた複数属の細菌検出等も効率化・迅速化することができる。

図１は、黄色ブドウ球菌、大腸菌、及びレンサ球菌からなる群から選ばれる少なくとも１菌種検出用のラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ法検出装置の一例である、ストリップ状の検出装置の概略構成を示す断面図である。図２は、黄色ブドウ球菌検出用のラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ法検出装置の一例である、ストリップ状の検出装置の概略構成を示す断面図である。図３は、大腸菌検出用のラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ法検出装置の検出装置の一例である、ストリップ状の検出装置の概略構成を示す断面図である。図４は、ストレプトコッカス検出用のラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ法検出装置の一例である、ストリップ状の検出装置の概略構成を示す断面図である。図５は、図２～図４に記載のストリップ状の検出装置を、検体及び溶菌助液の混合液に浸漬して検査を行っていることを示す模式図である。点線は液面を表す。図６は、黄色ブドウ球菌、大腸菌、及びレンサ球菌を同時検出用のラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ法検出装置の一例である、ストリップ状の検出装置の概略構成を示す断面図である。図７は、黄色ブドウ球菌、大腸菌、及びレンサ球菌を同時検出用のラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ法検出装置を、検体及び溶菌助液の混合液に浸漬して検査を行っていることを示す模式図である。点線は液面を表す。

　以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。

　本発明の一の態様は、検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合する工程を含む検体中の細菌群を溶菌するための方法に関する。混合する工程により混合液を調製し、混合液のｐＨ及び電気伝導度が所定の値となるように調整することで、使用された溶菌酵素に対応する細菌を溶菌し検出することが可能になる。さらに別の態様では、溶菌方法に用いる溶菌助液、当該溶菌助液と溶菌酵素とを含む細菌溶菌キット、並びに当該溶菌助液と、溶菌酵素と、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原を検出する検出装置とを含む細菌検出キットにも関する。

［Ｉ．溶菌方法］
　本発明の一の態様は、検体中の細菌群を溶菌する方法（以下適宜「本発明の溶菌方法」と称する。）に関する。本発明の溶菌方法は、検体を、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合する工程を含んでおり、ここで溶菌酵素は、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ、及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１の溶菌酵素である。混合後の混合液のｐＨ及び電気伝導度が、それぞれ６．０～７．０であり、かつ２．５～８．５ｍＳ／ｃｍ（以下、所定のｐＨ範囲及び所定の電気伝導度の範囲）となるように溶菌助液の成分及び濃度が調整される。所定の電気伝導度の範囲の上限は、８．５、８．０、７．５、７．０、又は６．５を用いてもよく、下限は、２．６又は２．７を用いてもよい。混合後の混合液のｐＨ及び電気伝導度がそれぞれ所定のｐＨ範囲及び所定の電気伝導度の範囲となることで、選択された溶菌酵素の全てにおいて活性が維持され、溶菌酵素に応じた細菌の溶菌が可能になる。１つの溶菌酵素が用いられてもよいし、２つの溶菌酵素が用いられてもよく、３つの溶菌酵素が用いられてもよく、４つ全ての溶菌酵素が用いられてもよい。溶菌酵素は、溶菌助液に予め添加されて提供されてもよいし、検体と、溶菌助液とを混合する際に別途添加されてもよい。

　一の例では、本発明は、検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合する工程を含む、検体中の細菌群を溶菌する方法であって、溶菌助液のｐＨが６．０～７．０、溶菌助液の電気伝導度が２．０～８．０ｍＳ／ｃｍとなる、方法に関する。この場合、検体と溶菌助液とは、所定の混合比で混合される。異なる溶菌酵素についても、同じ溶菌助液及び所定の混合比を用いて溶菌が可能であり、溶菌助液の取り違えを防止することができる。所定のｐＨ範囲及び所定の電気伝導度の範囲を達成する観点から、その混合比は、１：５～３：１、好ましくは１：３～２：１、より好ましくは１：２～３：２の範囲で混合されうる。検体と溶菌助液の混合液が所定のｐＨ範囲及び所定の電気伝導度の範囲となるように、混合比が選択されうる。この混合比で検体と溶菌助液が混合されることにより、混合液のｐＨが６．０～７．０となり、かつ電気伝導度が２．５～９.０ｍＳ／ｃｍとなる。検体として用いられる乳汁は、細菌感染により、そのｐＨ及び電気伝導度が変化しうる。しかしながら、溶菌助液には十分量の緩衝剤が含まれていることから、検体のｐＨが変動している場合も、上述の混合比で混合される場合に、混合液は所定のｐＨ範囲に収まる蓋然性が高く、また、乳汁の電気伝導度の変動を考慮すると、電気伝導度についても所定の電気伝導度範囲に収まる蓋然性が高い。したがって、上述の溶菌助液を、上述の混合比で用いることで、混合液について所定のｐＨ及び電気伝導度の範囲を達成することができる。

　本発明の溶菌方法により溶菌された細菌群は、その後免疫学的手法に供されるが、溶菌が必要とされる他の手法に用いられてもよい。免疫学的手法としては、イムノクロマトグラフ法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫比濁法など抗原抗体反応を用いた任意の検出手法であってよいが、検体を簡易に検査する観点からは、特にイムノクロマトグラフ装置を用いたイムノクロマトグラフ法が好ましい。本発明の溶菌方法により溶菌された細菌群は、後の工程において免疫学的手法による検出が可能なように溶菌される必要がある。したがって、本発明の溶菌方法は、免疫学的手法、好ましくはイムノクロマトグラフ法、さらに好ましくはラテラルフローイムノクロマトグラフ法による検出のための溶菌方法ということができる。

　前記細菌群を溶菌する工程は、検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合させた混合液中で反応させれば、任意の手法であってもよい。一例として、容器に検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを入れて撹拌・混合することで、反応させることができる。溶菌酵素は、粉末として添加されていてもよいし、予め容器などに配置されていてもよいし、イムノクロマトグラフ装置の部材に添着して配置されていてもよい。容器やイムノクロマトグラフ装置の部材に配置された溶菌酵素は、検体と溶菌助液と接触することで溶解して再構成され、溶菌酵素の活性を生じる。検体と、溶菌酵素と、溶菌助液との混合液での反応時間は、溶菌が生じる時間であればよく、一例として１０秒以上、３０秒以上、又は１分以上反応される。反応時間の上限は特に限定されないが、操作を迅速に行う観点から、１時間以内、３０分以内、１０分以内、又は５分以内が好ましい。検体と、複数の溶菌酵素と、溶菌助液とを含む溶液とをさらに撹拌してもよい。

　本発明の溶菌方法において、溶菌対象となる細菌群は、使用する溶菌酵素に応じて、エシェリキア（Escherichia）属の細菌（大腸菌）、スタフィロコッカス（（Staphylococcus）属の細菌（ブドウ球菌）、及びストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌からなる群から選ばれうる。溶菌対象となる細菌群は、上述の少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、より好ましくは上述の３種の細菌の全てを含みうる。これらの細菌は、乳房炎の起炎菌であり、検出対象細菌として重要である。溶菌対象となる細菌群は、本発明に係る溶菌酵素が溶菌可能な細菌であれば、他の細菌を含んでもよい。一例として、クレブシエラ(Klebsiella)属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、シュードモナス属（Pseudomonas）、バシラス（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、ラーネラ（Rahnella）属、シトロバクター（Citrobacter）属、リステリア（Listeria）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、及びサルモネラ（Salmonella）属などの細菌を含んでいてもよい。

　本発明の溶菌方法は、検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合することを特定しているが、意図した溶菌効果を著しく損なわない限り、混合液中には、１種又は２種以上の他の成分を更に含有していてもよい。これらの成分は、一例として、溶菌を促進するか、又は溶菌後の検出を可能にするために添加されうる。本発明の溶菌方法は、細菌の検出方法における前処理として行われうる。したがって、本発明の溶菌方法で溶菌された検体は、そのまま又はさらなる処理が行われて、免疫学的測定方法に供される。

　［ＩＩ．溶菌助液］
　溶菌助液は、検体及び溶菌酵素と混合された際に、混合液において所定のｐＨ及び電気伝導度の範囲を達成するように調整された溶液を指す。このような溶菌助液として、ｐＨが６．０～７．０、溶菌助液の電気伝導度が２．０～８．０ｍＳ／ｃｍである溶菌助液を使用することができる（以下適宜「本発明の溶菌助液」ということができる）。本発明の溶菌助液は、緩衝剤及び界面活性剤を含む。本発明の溶菌助液は、さらに塩を含んでもよい。本発明の溶菌助液は、溶菌反応や、溶菌後の免疫学的手法による測定を妨げない任意的成分をさらに含んでもよい。そのような任意的成分としては、溶菌後の免疫学的手法による測定において、交差反応を抑制することを目的として、γグロブリンなどのタンパク質や、溶菌助液の保存性を高める目的で防腐剤が添加されてもよい。γグロブリンなどのタンパク質は、溶菌助液中に１～２０μｇ／ｍｌの濃度で添加されうる。より好ましくは、５～１５μｇ／ｍｌの濃度で添加されうる。さらには溶菌助液と検体とが混合されたことを示すために、着色剤が含まれてもよい。

　溶菌助液のｐＨは、緩衝剤の種類に応じ、適宜塩酸及び／又は水酸化ナトリウムなどのｐＨ調整剤を用いて調整されうる。乳汁検体は、通常ｐＨ６．４程度であるが、乳房炎罹患牛の乳汁検体では、ｐＨは６．０～７．８に変動しうる。乳汁検体のｐＨが変動した場合でも、検体と溶菌助液と混合後の混合液のｐＨが６．０～７．０（以下、所定のｐＨという）となるように、緩衝剤の種類及び濃度が選択される。

　溶菌助液の電気伝導度は、溶菌助液に含まれる各成分のイオン濃度に応じて変化するが、特に、量が多い緩衝剤及び緩衝剤の濃度が、電気伝導度に影響し、さらに塩の濃度により電気伝導度を調整することができる。溶液の電気伝導度は、電気伝導率計を用いることで測定することができる。乳汁検体は、通常４ｍＳ／ｃｍ程度の電気伝導度を有する。一方で、乳房炎罹患牛の乳汁検体では、大幅に変動しうる。乳汁検体の電気伝導度が変動した場合でも、溶菌助液と混合後の混合液の電気伝導度が、２．５～８．５ｍＳ／ｃｍ（以下、所定の電気伝導度という）となるように、溶菌助液の成分の濃度を選択することができる。所定の電気伝導度の範囲の上限は、８．５、８．０、７．５、７．０、又は６．５を用いてもよく、下限は、２．６又は２．７を用いてもよい。溶菌助液の成分のなかでも特に、濃度が高いことから、塩類及び緩衝剤の濃度が電気伝導度に対する影響が大きい。さらに、混合後の混合液において所定の電気伝導度を達成するように、溶菌助液と、検体との混合比が決定される。

　溶菌助液に含まれる緩衝剤としては、検体との混合後の混合液のｐＨが６．０～７．０を達成可能な緩衝剤であれば任意の緩衝剤を用いることができる。斯かる緩衝剤の例としては、限定されるものではないが、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、リン酸、酢酸等が挙げられる。なかでもＴｒｉｓ、ＭＯＰＳＯが好ましい。緩衝剤の濃度は、菌助液と混合後の混合液の所望のｐＨ及び電気伝導度を達成するように適宜選択されればよい。一例として混合液中の最終濃度として１．２～４２０ｍＭ、好ましくは５～１００ｍＭ、より好ましくは２０～１００ｍＭが使用されうる。緩衝剤は、溶液の電気伝導度に影響する。溶菌助液中の濃度として、検体と溶菌助液との混合比と、混合液中最終濃度とを考慮して配合することができる。一例として、溶菌助液中の緩衝剤の濃度は、５～５００ｍＭ、好ましくは１０～２５０ｍＭ、より好ましくは２０～１００ｍＭ濃度で、溶菌助液に配合することができる。

　溶菌助液に含まれる界面活性剤は、化学溶菌作用を目的として、又は免疫学的手法、特にイムノクロマトグラフ法による測定の促進を目的として、配合されうる。界面活性剤は、任意の界面活性剤を使用することができるが、溶菌酵素の活性や、溶菌後の免疫学的手法による測定を妨げることがないように選択される。例えば、ドデシル硫酸ナトリウムは強力な界面活性剤であり、通常の使用濃度ではほぼすべての細菌を溶菌することができるが、免疫学的手法において用いる抗体の構造を破壊してしまうため、本発明の溶菌方法に使用する界面活性剤としては適していない。溶菌後の免疫学的手法、特にイムノクロマトグラフ法による測定を妨げない界面活性剤としては、限定されるものではないが、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、及び両イオン界面活性剤が使用されうる。陰イオン界面活性剤、及び両イオン界面活性剤の濃度は電気伝導度に影響する。

　非イオン性界面活性剤は、溶菌後にイムノクロマトグラフ法を用いる場合において、展開液の流れを確保することを目的として主に添加され、さらには化学溶菌を目的としてもよい。非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチレン鎖、ソルビタン（又はその誘導体）、糖、エタノールアミド、グリセリン等の親水性部分と、アルキル基や脂肪酸等の疎水性部分とが結合された界面活性剤である。非イオン界面活性剤としては、限定されるものではないが、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも好適に用いることができる。より具体的には、ポリオキシエチレン鎖を親水性部分として有する界面活性剤として、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）シリーズ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）シリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）シリーズ、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）シリーズが挙げられ、ソルビタン（又はその誘導体）を親水性部分として有する界面活性剤として、脂肪酸ソルビタンエステル、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）シリーズが挙げられる。その他の親水性部分を有する非イオン性界面活性剤としては、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどがあげられる。

　非イオン性界面活性剤の親水性と親油性のバランスは、ＨＬＢ（hydrophile-lipophile balance）値により表されうる。溶菌と溶菌後のイムノクロマトグラフ法における展開とを達成する観点から、ＨＬＢ値は、１２．０以上１４．５未満を選択することができ、好ましくは１２．１～１４．４、さらにより好ましくは１２．４～１４．１を使用することができる。ＨＬＢ値は、本技術分野に周知の定法に基づいて決定することができる。一例として、グリフィン法、デイビス法、及び川上法により決定することができる。

　ポリオキシエチレン鎖を親水性部分として有する非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数に基づいて定めることができる。本発明では、溶菌と溶菌後のイムノクロマトグラフ法における展開とを達成する観点から、通常平均で７～１１個、好ましくは７．５～１０個のポリオキシエチレン鎖の繰り返し数を有する。ポリオキシエチレン鎖は、通常以下の式：
で表されており、重合度の違いにより、平均繰り返し数で表現される。（ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ）の分子量が４４であるため、ポリオキシエチレン鎖の平均分子量を測定することにより、平均繰り返し数を決定することができる。ポリオキシエチレン鎖の平均分子量は、界面活性剤の分子の平均分子量から、疎水性部分の分子量を減じることで決定することができる。界面活性剤の分子の平均分子量は、本技術分野に既知の方法により決定することができ、一例としてクロマトグラフィー法、例えばゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等を用いて決定することができる。

　本発明の１の態様では、ポリオキシエチレン鎖を親水性部分として有する非イオン性界面活性剤は、１２．０以上１４．５未満、好ましくは１２．１～１４．４、さらにより好ましくは１２．４～１４．１のＨＬＢ値、及び平均で７～１１個、好ましくは７．５～１０個の繰り返し数を有することにより規定することができる。このような非イオン性界面活性剤を第一の非イオン性界面活性剤と呼ぶこととする。第一の非イオン性界面活性剤を用いることにより、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌を含む溶菌対象を溶菌することができ、及び／又はイムノクロマトグラフ法を用いたこれらの細菌の検出が可能になる。このような非イオン性界面活性剤として、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（ｒｅｄｕｃｅｄ）、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ－０８０、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）１５－Ｓ－９、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＴＭＮ－１００Ｘ（９０％）、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＴＭＮ－６　（９０％）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１１４、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）１５－Ｓ－７、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＴＭＮ－１０　（９０％）を使用することができる。

　非イオン性界面活性剤の濃度は、本発明の溶菌方法における溶菌、さらには溶菌後のイムノクロマトグラフ法による検出における展開、さらには免疫学的測定法における抗原抗体反応を著しく阻害しない濃度であれば限定されるものではないが、例えば検体と溶菌助液の混合液における液中の濃度で０．６５％～５％である。非イオン性界面活性剤の濃度は、例えば１％以上、より好ましくは１．２５％以上である。また、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない観点から、非イオン性界面活性剤の濃度は、例えば４％以下、より好ましくは３．１２５％以下である。溶菌助液中の濃度として、検体と溶菌助液との混合比と、混合後の濃度とを考慮して決定することができる。一例として、０．５５％～２０％、好ましくは１～１０％、より好ましくは２～５％の濃度で、溶菌助液に配合することができる。

　陰イオン界面活性剤は、化学溶菌を主な目的として添加される。陰イオン界面活性剤としてはアルキル硫酸ナトリウム、N-ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、N-ミリストイルサルコシン酸ナトリウム等のN-アシルサルコシン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、N-パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のN-アシルグルタミン酸塩、N-メチル-N-アシルアラニンナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウムなどがあげられる。溶菌剤中での陰イオン界面活性剤の含量（複数の陰イオン界面活性剤を用いる場合は、陰イオン界面活性剤総量としての含量を指す。）は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されないが、下限値に関しては、溶菌酵素の含量がいずれの場合であっても、乳汁と混合した場合の混合液における終濃度が０．０１％以上となるようにすることができ、好ましくは０．０５％以上であり、より好ましくは０．１％以上である。また陰イオン界面活性剤の含量の上限値は、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、２％以下とすることができ、好ましくは１％以下であり、より好ましくは０．５％以下である。溶菌助液中の濃度として、検体と溶菌助液との混合比と、最終濃度とを考慮して決定することができる。一例として０．０１２％～８％の濃度、好ましくは０.０５～４％の濃度、より好ましくは０．１～１％の濃度で陰イオン界面活性剤を溶菌助液に配合することができる。

　両イオン界面活性剤は、化学溶菌を主な目的として添加される。両性界面活性剤としては、アミノ酸系（アルキルアミノ脂肪酸塩）、ベタイン系（アルキルベタイン）、アミンオキシド系（アルキルアミンオキシド）等があげられる。より具体的な例としては、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチレイト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインがあげられる。より具体的な例としては、Zwittergent（登録商標）シリーズの両イオン性界面活性剤が使用されてもよい。Zwittergent（登録商標）シリーズとしては、Zwittergent（登録商標）３－１４、Zwittergent（登録商標）３－１２、Zwittergent（登録商標）３－１０、Zwittergent（登録商標）３－８などが使用されうる。両イオン界面活性剤は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されないが、下限値に関しては、溶菌酵素の含量がいずれの場合であっても、乳汁と混合した場合の混合液における終濃度が０．０１％以上となるようにすることができ、好ましくは０．０５％以上であり、より好ましくは０．１％以上である。また陰イオン界面活性剤の含量の上限値は、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、２％以下とすることができ、好ましくは１％以下であり、より好ましくは０．５％以下である。溶菌助液中の濃度として、検体と溶菌助液との混合比と、最終濃度とを考慮して決定することができる。一例として、０．０１２％～８％の濃度、好ましくは０.０５～４％の濃度、より好ましくは０．１～１％の濃度で両イオン界面活性剤を溶菌助液に配合することができる。

　溶菌助液に含まれる塩類は、電気伝導度を調節するために添加される。塩類としては、任意の塩類が使用されうるが、溶菌、並びに溶菌後の免疫学的手法による測定を妨げることがないように選択される。一例として、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウムなどが使用されうる。溶菌助液の電気伝導度を２～８ｍＳ／ｃｍとする観点から、濃度を適宜選択することができる。一例として、溶菌助液中に、１５ｍM～７５ｍM、好ましくは２０～６０ｍＭ、より好ましくは３０～５０ｍＭ添加されうる。

［ＩＩＩ．溶菌酵素］
　溶菌酵素は、検体中に含まれる細菌を溶菌する酵素をいう。このような溶菌酵素としては、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ、及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる溶菌酵素が用いられる。上述の溶菌酵素のうち、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全ての溶菌酵素の組み合わせが使用されうる。これらの酵素は複合酵素として提供されていてもよい。一例として、アセチルグルコサミニダーゼは、ストレプトマイシス　フルビシムス（Streptomyces fulvissimus）、特にTU-6株の培養上清から調製され、ラビアーゼという名で販売される。ラビアーゼには、アセチルグルコサミニダーゼ以外にも、エンドペプチダーゼ活性及びムラミダーゼ（リゾチーム）活性を有し、これらの複合酵素であることが知られている。したがって、本発明の範囲からラビアーゼの組み合わせは除かれてもよい。一例として、溶菌酵素が少なくとも２つ用いられる際には場合に応じてリゾチームとアセチルグルコサミニダーゼの組み合わせ、リゾチームとエンドペプチダーゼの組み合わせ、エンドペプチダーゼとアセチルグルコサミニダーゼの組み合わせは除かれてもよい。溶菌酵素が少なくとも３つ用いられる際には場合に応じて、リゾチームとアセチルグルコサミニダーゼとエンドペプチダーゼの組み合わせは除かれてもよい。溶菌酵素は粉末で提供されてもよいし、濃縮溶液として提供されてもよく、溶菌酵素を乾燥固着させた部材と共に提供されてもよい。溶菌酵素は、溶菌助液に予め添加されて提供されてもよいし、検体と、溶菌助液とを混合する際に別途添加されてもよい。一例として、イムノクロマトグラフ装置の液体浸漬部位に乾燥固着させておき、イムノクロマトグラフ装置を使用の際に、溶菌酵素が溶出して、検体と、溶菌助液と混合されてもよい。また、別の例では、検体と溶菌助液とを入れて混合する容器内に乾燥粉末として提供されていてもよい。

　本発明の溶菌方法における溶菌酵素の濃度は、限定されるものではなく、溶菌酵素の種類に応じて個別に適宜選択される。溶菌作用を発揮する観点から、検体との反応時における液中の濃度において例えば０．０１μｇ／ｍＬ以上、又は０．０２５μｇ／ｍＬ以上、又は０．０５μｇ／ｍＬ以上とすることが好ましく、また、免疫学的手法による検査において偽陽性を生じさせない観点から検体との反応時における液中の濃度において例えば２０ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下、又は５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることが好ましい。

　リゾチームは、約１４．６ｋＤａの単一ペプチドのタンパク質であり、ペプチドグリカン層でＮ－アセチルムラミン酸とＮ－アセチルグルコサミンとの間のβ（１－４）グリコシド結合を切断することにより細菌の細胞を溶解することができる。リゾチームは、特に、エシェリキア（Escherichia）属の細菌（大腸菌）、クレブシエラ(Klebsiella)属の細菌を溶菌することができるが、これらの細菌に限られるものではない。リゾチームは市販品の購入により入手することが可能である。リゾチームは、検体と混合した場合の終濃度が、０．１ｍｇ／ｍＬ以上となるようにすることができ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１．０ｍｇ／ｍＬ以上である。また溶菌酵素の含量の上限は、経済的な観点等から適宜決定することができ、下限がいずれの場合であっても、２００ｍｇ／ｍＬ以下とすることができ、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以下である。

　ラビアーゼ（Labiase）は、StreptomycesfulvissimusTU-6株の培養液上清より調製され、β－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミニダーゼ、ムラミダーゼ、エンドペプチダーゼを主体とする複合酵素である。ラビアーゼは、ストレプトコッカス属細菌、バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌などを溶菌することができるが、これらの細菌に限られるものではない。ラビアーゼは、上記菌株の培養上清から調製することもでき、また市販品の購入により入手することが可能である。ラビアーゼは、終濃度として、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／ｍＬ以上とすることができる。また溶菌酵素の含量の上限は、経済的な観点等から適宜決定することができ、下限がいずれの場合であっても、２０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。

　リゾスタフィンは、Staphylococcussimulansが生産する亜鉛プロテアーゼであり、黄色ブドウ球菌またはその同属菌の細胞壁ペプチドグリカンのグリコペプチド鎖中のグリシルグリシン結合を加水分解する。したがって、リゾスタフィンは、スタフィロコッカス（（Staphylococcus）属の細菌（ブドウ球菌）を溶菌するが、これらの細菌に限られるものではない。本明細書において、リゾスタフィンには、天然型リゾスタフィンと、加水分解活性を失わない範囲で変異や修飾が導入された変異型及び／又は修飾型リゾスタフィンが包含される。これらのリゾスタフィンは、特開平11-28099号公報に記載された培養方法または遺伝子工学的手法で得るか、市販品の購入により入手することが可能である。リゾスタフィンは、終濃度として、０．１μｇ／ｍＬ以上となるようにすることができ、好ましくは０．５μｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１．０μｇ／ｍＬ以上である。また溶菌酵素の含量の上限は、経済的な観点等から適宜決定することができ、下限がいずれの場合であっても、２００μｇ／ｍＬ以下とすることができ、好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ以下であり、特に好ましい。

［ＩＶ．検体］
　本発明における検体は、細菌の有無を検査する必要のある試料であれば任意の試料であってもよい。一例として、検体は、乳汁である。乳汁は、任意の動物由来の乳汁であってよいが、特にウシ由来の乳汁である。乳汁のｐＨは、通常、約６．４であり、乳汁の電気伝導度は、約４ｍＳ／ｃｍである。一方で、乳房が細菌感染を起こし、炎症を起こしていると、乳汁のｐＨ及び電気伝導度は変動しうる。細菌感染を起こした乳房炎の個体から得た乳汁のｐＨは、６．０～７．８の範囲で変化しうる。

［Ｖ．細菌検出方法］
　本発明に係る溶菌方法は、細菌検出方法の前工程として行われうる。検体中の細菌群を溶菌する方法の後に、細菌群を検出する方法又は細菌の有無を判定する方法（以下適宜「本発明の細菌検出方法」と称する。）が行われうる。本発明の細菌検出方法は、前記の本発明の溶菌方法を実施することにより、検体中の細菌群を溶菌する工程と、溶菌された細菌群から放出された細菌の抗原を、当該抗原と抗原抗体反応を生じる抗体を用いて検出することを含む。より具体的に、かかる方法は、検体中の、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌からなる群から選ばれる少なくとも１種の細菌の有無を判定することができる。かかる方法は、以下の：
　検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合して混合液を取得する工程、及び
　免疫学的手法によりＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質を検出する工程を含み、
　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素を含む。ここで、前記混合液のｐＨが６．０～７．０であり、前記混合液の電気伝導度が２．５～８．５ｍＳ／ｃｍである。本発明の方法では、また、リゾチームが大腸菌を、リゾスタフィンがブドウ球菌を、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼがストレプトコッカス属細菌を溶菌し得ることを特徴とする。したがって、本発明の細菌検出方法は、抗体を用いた免疫学的手法に関する。免疫学的手法としては、イムノクロマトグラフ法、免疫沈降法、免疫比濁法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射能免疫測定法（ＲＩＡ法）、または蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）など抗原抗体反応を用いた任意の検出手法であってよいが、検体を簡易に検査する観点からは、特にイムノクロマトグラフ法であり、さらに好ましくはラテラルフローイムノクロマトグラフ法が好ましい。

　本発明の細菌検出方法において、前記細菌の抗原が、細胞内抗原であることが好ましい。細胞内抗原とは、本発明の溶菌方法により、放出される細菌の細胞内物質が抗原となる物質である。より具体的に、細菌を検出する観点からは、細胞内抗原としては、リボソームタンパク質、特にＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質であることが好ましい。Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質は、微生物のタンパク質合成に必須のリボソームタンパク質の１種であり、種々の細菌が共通して有するタンパク質である。また、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質は、細胞内に複数分子存在するために検出感度が高い。細菌のＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質に対して抗原抗体反応を生じる抗体及びその作製方法については、例えば本願発明者等の以前の特許出願に係る特許公報である国際公開第２０００／００６６０３号等の記載を参照することができる。イムノクロマトグラフ法では、検出用標識が付された標識抗体と、ストリップ上に固定された捕捉用抗体を用いる。標識抗体と捕捉用抗体は、それぞれ細胞内抗原に結合する。

［ＶＩ．抗体］
　本発明において「抗体」とは、特定の抗原又は物質を認識しそれに結合するタンパク質で、免疫グロブリン（Ｉｇ）という場合もある。一般的な抗体は、通常、ジスルフィド結合により相互結合された２つの軽鎖（軽鎖）及び２つの重鎖（重鎖）を有する。軽鎖にはλ鎖及びκ鎖と呼ばれる２種類が存在し、重鎖にはγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖と呼ばれる５種類が存在する。その重鎖の種類によって、抗体には、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという５種類のアイソタイプが存在する。

　重鎖は各々、重鎖定常（ＣＨ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。軽鎖は各々、軽鎖定常（ＣＬ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。軽鎖定常（ＣＬ）領域は単一のドメインから構成される。重鎖定常（ＣＬ）領域は、３つのドメイン、即ちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域は各々、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い４つの領域（ＦＲ－１、ＦＲ－２、ＦＲ－３、ＦＲ－４）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の３つの領域（ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２、ＣＤＲ－３）とから構成される。重鎖定常（ＣＨ）領域は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）及び４つのＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４）を有し、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４の順番で配列される。軽鎖定常（ＣＬ）領域は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）及び４つのＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４）を有し、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｌ３、ＦＲ－Ｌ４の順番で配列される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。

　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。ポリクローナル抗体は、通常は抗原で免疫した動物の血清から調製される抗体で、構造の異なる種々な抗体分子種の混合物である。一方、モノクローナル抗体とは、特定のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域の組み合わせを含む単一種類の分子からなる抗体をいう。モノクローナル抗体は、抗体産生細胞由来のクローンから産生することも可能であるが、抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子配列を有する核酸分子を取得し、斯かる核酸分子を用いて遺伝子工学的に作製することも可能である。また、重鎖及び軽鎖、或いはそれらの可変領域やＣＤＲ等の遺伝子情報を用いて抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことも、この分野での当業者にはよく知られた技術である。

　また、本発明の抗体は、抗体の断片及び／又は誘導体であってもよい。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ等が挙げられる。抗体の誘導体としては、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域部分に人工的にアミノ酸変異を導入した抗体、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域のドメイン構成を改変した抗体、１分子あたり２つ以上のＦｃ領域を有する抗体、糖鎖改変抗体、二重特異性抗体、抗体又は抗体の断片を抗体以外のタンパク質と結合させた抗体コンジュゲート、抗体酵素、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）等が挙げられる。更には、前記の抗体又はその断片若しくは誘導体が非ヒト動物由来の場合、そのＣＤＲ以外の配列の一部又は全部をヒト抗体の対応配列に置換したキメラ抗体又はヒト化抗体も、本発明の抗体に含まれる。なお、別途明記しない限り、本発明において単に「抗体」という場合、抗体の断片及び／又は誘導体も含むものとする。

　本発明の抗体が、ある細菌と抗原抗体反応を生じるとは、斯かる細菌が有する何らかの成分を抗原として、特異的に結合することをいう。本発明の抗体の抗原となる細菌の成分は制限されない。細菌の細胞外に露出する細胞壁や細胞膜等に含まれる成分でもよく、細菌の細胞外に露出しない細胞質、細胞小器官、核等に含まれる成分でもよい。

　本発明の抗体と検出対象となる細菌との抗原抗体反応の程度は特に制限されないが、少なくとも公知の何らかの検出手法により検出できる程度の抗原抗体反応が生じればよい。

　また、本発明の抗体は、検体中に存在しうる１種又は２種以上の非細菌由来成分と交差反応を生じないことが好ましい。斯かる非細菌由来成分の例としては、制限されるものではないが、例えばウイルス、植物、及び／又は動物に由来する各種の生体有機化合物であって、細菌が有さない化合物が挙げられる。斯かる生体有機化合物の具体例としては、タンパク質、糖類、糖タンパク質、脂質、複合脂質、核酸等が挙げられる。本発明の抗体は、これらの非細菌由来成分のうち、少なくとも１種、又は２種以上、通常３種以上、更には４種以上、又は５種以上、又は６種以上、又は７種以上、又は８種以上、とりわけ９種以上、特に１０種以上の非細菌性成分と交差反応しないことが好ましい。

　本発明の抗体は、検出対象となる細菌と抗原抗体反応するものであれば限定されないが、下記汎用性抗体及び／又は特異性抗体を用いることが好ましく、細菌抗原をサンドイッチ型で検出する場合には、汎用性抗体と特異性抗体を組み合わせて用いることが好ましい。汎用性抗体は、できるだけ多数の属の細菌と広く抗原抗体反応を生じることが好ましい。具体的には、汎用性抗体は、少なくとも４つの属の細菌と抗原抗体反応を生じる。中でも、少なくとも５つ以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じることが好ましく、少なくとも６つ以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じることがより好ましい。汎用性抗体が抗原抗体反応を生じる具体的な細菌の属は限定されないが、少なくともエシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、シュードモナス属（Pseudomonas）、バシラス属（Bacillus）、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、ラーネラ（Rahnella）属、シトロバクター（Citrobacter）属、リステリア（Listeria）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、及びサルモネラ（Salmonella）属から選択される１種以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じることが好ましい。特に、乳房炎の原因細菌である、エシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌と抗原抗体反応を生じることが好ましい。

　一方、特異性抗体は、限定された属の細菌とのみ抗原抗体反応を生じることが好ましい。具体的には、特異性抗体が抗原抗体反応を生じる細菌の範囲を、検出対象となる細菌の範囲と一致させる。単一の特異性抗体のみを用いる場合には、その特異性抗体が抗原抗体反応を生じる細菌の範囲を、検出対象となる細菌の範囲と一致させる。一方、２以上の特異性抗体を併用する場合には、それら特異性抗体が各々抗原抗体反応を生じる細菌の範囲を合わせた場合に、検出対象となる細菌の範囲と一致すればよい。特に後者の態様によれば、各々別の細菌と抗原抗体反応を生じる複数の特異性抗体を適切に組み合わせることによって、検出対象とする細菌の範囲を種々調整することが可能となり、極めて有利である。

　なお、本発明の各々の特異性抗体は、少なくとも１つの属の細菌と抗原抗体反応を生じればよい。各特異性抗体が抗原抗体反応を生じる具体的な細菌の属は限定されないが、少なくともエシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、シュードモナス属（Pseudomonas）、バシラス属（Bacillus）、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、ラーネラ（Rahnella）属、シトロバクター（Citrobacter）属、リステリア（Listeria）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、及びサルモネラ（Salmonella）属から選択される１以上の属の細菌と抗原抗体反応を生じることが好ましい。特に、乳房炎の原因細菌である、エシェリキア（大腸菌）属（Escherichia）、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の細菌由来の抗原と抗原抗体反応を生じることが好ましい。

［標識抗体］
　標識抗体は、検出用標識が付された抗体であって、溶菌された対象細菌から放出される対象細菌由来抗原と抗原抗体反応により複合体を形成する抗体である。こうして形成された複合体を第１複合体と呼ぶものとする。標識抗体に使用する検出用標識の種類も特に制限されず、検出方法に応じて適宜選択すればよいが、具体的には金コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド等の金属コロイド；セレニウムコロイド、アルミナコロイド、シリカコロイド等の非金属コロイド；着色樹脂粒子、染料コロイド、着色リポソーム等の不溶性粒状物質；アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等の発色反応触媒酵素；蛍光色素、放射性同位体；化学発光標識、生物発光標識、電気化学発光標識等が挙げられる。抗体に標識を付加する手法も特に制限されないが、具体的には抗体の疎水性を利用した物理吸着、抗体の官能基を利用した化学結合等の手法が挙げられる。

［捕捉抗体］
　捕捉抗体は、第１の複合体と抗原抗体反応により複合体を形成する抗体である。こうして形成された複合体を第２複合体と呼ぶものとする。イムノクロマトグラフ法において用いる場合、捕捉抗体はより具体的に、イムノクロマトグラフ法のストリップの検出領域に位置するクロマトグラフ展開用膜担体上に固定される。固相部材に抗体を固定する手法も特に制限されないが、具体的には抗体の疎水性を利用した物理吸着による固定、抗体の官能基を利用した化学結合による固定等の手法が挙げられる。

　汎用性抗体が標識抗体、特異性抗体が捕捉抗体でもよく、特異性抗体が標識抗体、汎用性抗体が捕捉抗体でもよい。イムノクロマトグラフ検出装置の作製が容易になる観点から、好ましくは、汎用性抗体が標識抗体、特異性抗体が捕捉抗体である。

　第２の複合体は、固定された捕捉抗体による抗原抗体反応により、捕捉用抗体の固定位置（捕捉部位）に留め置かれ、そこで標識抗体の標識が検出される。捕捉抗体が固定された位置において標識が検出された場合に、検体液中に対象細菌が検出される。

［ＶＩＩ．キット］
　本発明の別の態様は、前述の本発明の溶菌方法に用いられる、検体中の細菌群を溶菌する溶菌キット（以下、適宜「本発明の溶菌キット」と称する。）に関する。本発明の溶菌キットは、リゾスタフィン、リゾチーム、及びラビアーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素と、本発明の溶菌助液とを含む。溶菌キットは、予め溶菌酵素と、溶菌助液とが混合された溶菌液として提供されてもよい。かかる溶菌キットは、溶菌後に細菌群を免疫学的測定法により検出するために用いられ、より好ましくはイムノクロマトグラフ法検出のための溶菌キットに関する。溶菌される細菌群や、溶菌助液に含まれる界面活性剤、及び溶菌酵素については前述のとおりである。本発明の溶菌キットは、溶菌酵素を、溶液又は粉末の形態で提供してもよいし、グラスファイバーなどの部材に添着させた形態で提供してもよい。

　本発明のさらに別の態様は、前述の本発明の細菌検出方法に用いられる、細菌群の検出キット（以下、適宜「本発明の細菌検出キット」と称する。）に関してもよい。本発明の細菌検出キットは、本発明の溶菌キットと、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原を検出する検出装置とを含んでもよいし、又はリゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素と、本発明の溶菌助液と、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原を検出する検出装置とを含んでもよい。さらに、検体と、溶菌助液と、溶菌酵素とを混合する容器や製品の取扱説明書などを含んでもよい。本発明の細菌検出キットに用いられる、溶菌酵素、溶菌助液については前述のとおりである。

　本発明のＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原を検出する検出装置は、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原を、免疫学的手法により検出する検出装置であれば任意の装置であってもよく、一例としてイムノクロマトグラフ装置である。イムノクロマトグラフ装置は、前述した捕捉抗体と標識抗体とを含む。捕捉抗体は、通常は固相担体の種類に応じた適切な形態（多孔膜を含む容器、流路を含む容器、溶液を保持できるプレート等）で提供される。一例として、捕捉抗体は、イムノクロマトグラフ装置のストリップの検出領域に位置するクロマトグラフ展開用膜担体上に固定される。標識抗体は、通常は標識抗体を水性媒体中に含む水系試薬又は標識抗体を乾燥した乾燥試薬の形態で提供される。異なる細菌に対する複数の標識抗体及び複数の捕捉抗体を使用した１つのイムノクロマトグラフ装置を使用することもできる。複数の捕捉抗体は、ストリップの検出領域に位置するクロマトグラフ展開用膜担体上に、それぞれ離して固定される。これにより、異なる細菌由来のＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原が、それぞれ標識抗体により標識され、所定の位置の捕捉抗体により捕捉されることで、それぞれの細菌の検出が可能になる。

　本発明の細菌検出キットは、前述した捕捉抗体と標識抗体に加えて、これらの抗体を使用して本発明の方法を実施するのに必要な１種又は２種以上の試薬、検出用装置若しくはその構成部材、及び／又は、本発明の方法を実施するための手順を記載した指示書を含む。斯かる試薬の種類や指示書の記載内容、更には本発明のキットに含まれる他の構成要素は、具体的な免疫学的測定法の種類に応じて適宜決定すればよい。

　本発明の細菌検出キットが検出用装置又はその構成部材を含む場合、斯かるキットにより構成される装置は、本発明の標識抗体及び／又は捕捉抗体を使用して本発明の方法を実施するのに必要な構成要素を備えた装置（以下適宜「本発明の装置」と略称する。）である。本発明の装置の具体的な構成要素は、本発明の方法の具体的な実施形態である免疫学的測定法の種類に応じて、適宜調整することができる。前述のように、免疫学的測定法の例としては、限定されるものではないが、抗体を担持させたマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着）法；抗体を担持させたラテックス粒子（例えばポリスチレンラテックス粒子等）を用いるラテックス粒子凝集測定法；抗体を担持させたメンブレン等を用いるイムノクロマトグラフ法；着色粒子又は発色能を有する粒子、酵素若しくは蛍光体等で標識した標識抗体と、磁気微粒子等の固相担体に固定化した捕捉抗体とを用いるサンドイッチアッセイ法等、種々の公知の免疫学的測定法が挙げられるところ、斯かる種々の免疫学的測定法を実施するために必要な構成要素を備えた装置が、本発明の装置となる。なお、検体中の２種以上の細菌を単一の捕捉部位で検出することもできる。この場合、１種又は２種以上の単一の捕捉部位に固定する。単一の捕捉抗体固定（連結）部位とすることで、検体中の２種以上の細菌を同時に検出（細菌の総量を検出）することができる。

　イムノクロマトグラフ検出装置の具体例としては、ラテラルフロー方式の装置と、フロースルー方式の装置とを挙げることができる。ここで、ラテラルフロー方式とは、捕捉抗体を表面に固定化させた検出領域を含むメンブレンに対し、検出対象検体及び標識抗体を平行に展開させ、メンブレンの検出領域に捕捉された目的物質を検出する方法である。ラテラルフロー方式キットは、主にディップスティック型とカセット型に大別される。ディップスティック型は、検出装置の浸漬領域（サンプルパッドでもよい）を検体溶液に浸すことで、検体溶液を展開させるのに対し、カセット型は、検出装置の検体接触部材（サンプルパッド）に検体を添加することで、検体溶液を展開させる。一方、フロースルー方式とは、捕捉抗体を表面に固定化させたメンブレンに、検出対象検体及び標識抗体を垂直に通過させ、メンブレンの表面に捕捉された目的物質を検出する方法である。本発明の方法は、ラテラルフロー方式の装置とフロースルー方式の装置の何れに対しても適用することが可能である。

　ラテラルフロー方式の装置及びフロースルー方式のイムノクロマトグラフ検出装置はいずれも公知であり、本開示で説明する事項以外の手順については当業者が技術常識に基づいて適宜設計できる。以下、ラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ検出装置の検出機構の概略構成について、図面を参照しながら説明するが、これらはあくまでも検出手順の概略構成の一例に過ぎず、ラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ検出装置の構成は図面に例示する態様には何ら限定されない。

　図１～４は、ラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ検出装置の検出機構の一例である、ストリップ状の検出機構の概略構成を示す断面図である。図１～４のイムノクロマトグラフ検出装置１０は、クロマトグラフ展開用膜担体２と、その一端（検体流れＢの上流側）にフィルター部材６及び検体接触部材（サンプルパッド）５が配置され、他端側（検体流れＢの下流側）に吸収用部材（吸収パッド）７が配置された状態で、基材８上に設けられている。検体接触部材５は、検体と接触する部材であり、検体の展開を妨げなければ任意の部材であってもよい。検体接触部材５及びフィルター部材６は、検体中に含まれる固形分や脂肪球を除去可能な保持粒子サイズを有する。検体接触部材５の保持粒子サイズは、フィルター部材６と比較して大きく設定することができ、これにより比較的大きい粒子が検体接触部材５により除去され、次いで小さい粒子がフィルター部材６により除去される。固形分や一定以上の粒子サイズの粒子が除去されることにより、クロマトグラフ展開用膜担体において展開不良を避けることができる。標識抗体添着部材（コンジュゲートパッド）１（このパッドに標識抗体が添着されている）は、添着された抗体がクロマトグラフ展開用膜担体において展開されるようにクロマトグラフ展開用膜担体２の上流側に配置される。標識抗体添着部材（コンジュゲートパッド）１は、検体接触部材（サンプルパッド）５と、フィルター部材６との接続位置に配置されてもよいし（図１）、検体接触部材（サンプルパッド）５の上流末端側の内部に配置してもよい（図２～４）。検体接触部材（サンプルパッド）５の上流末端側に配置することで、標識抗体添着部材（コンジュゲートパッド）１に添着された標識抗体は、検体溶液中に溶出してもよい。標識抗体添着部材（コンジュゲートパッド）１と同様に、溶菌酵素添着部材４を、溶液に溶出するように、検体接触部材（サンプルパッド）５の上流末端側に配置してもよい（図２～４）。クロマトグラフ展開用膜担体２のストリップ長さ方向中央部には、捕捉抗体が固定された捕捉部位３が配置されると共に、必要に応じて対照試薬が固定された部位が配置されている。なお、対照試薬は、被分析物質とは結合せず標識抗体とは結合する試薬である。さらに、このストリップに、溶菌剤を検体溶液中に溶出可能に配置してもよい。標識抗体添着部材に、大腸菌検出用、黄色ブドウ球菌検出用、及びストレプトコッカス属細菌検出用の標識抗体をそれぞれ添着させてもよい。その場合、捕捉抗体として、大腸菌検出用、黄色ブドウ球菌検出用、及びストレプトコッカス属細菌検出用の捕捉抗体をそれぞれ離してクロマトグラフ担体上に配置することで、捕捉部位に生じた標識により、それぞれの細菌種について検出が可能になる。

　使用時には、検体Ａを検体接触部材（サンプルパッド）５上に適用すると、検体Ａは、標識抗体添着部材（コンジュゲートパッド）１を通過し、フィルター部材を通過して、クロマトグラフ展開用膜担体２を検体流れＢの方向に流れる。この際に、検体中の被分析物質（本発明では細菌由来抗原であるＬ７／Ｌ１２）が標識抗体と結合して、被分析物質－標識抗体の第１複合体が形成される。検体Ａが捕捉部位３を通過すると、検体中の被分析物質が捕捉抗体と結合して、捕捉抗体－被分析物質－標識抗体の第２複合体が形成される。さらに、検体Ａが対照試薬固定部位を通過すると、標識抗体のうち被分析物質と結合していないものが対照試薬と結合し、これによって、検査の終了（すなわち検体Ａが捕捉部位３を通過したこと）を確認できる。ここで、捕捉部位３に存在する捕捉抗体－被分析物質－標識抗体の第２複合体中の標識抗体が有する標識を、公知の手段で検出することにより、被分析物質の有無又は存在量を検出することができる。必要に応じて、標識抗体の標識を公知の手法により増感して、検出を容易にしてもよい。

　なお、標識抗体添着部材（コンジュゲートパッド）１、溶菌酵素添着部材４、フィルター部材６、検体接触部材（サンプルパッド）５、及び／又は対照試薬固定部位は、任意に省略することもできる。本機構において標識抗体添着部材（コンジュゲートパッド）１及び／又は溶菌酵素添着部材４を有しない場合、検体Ａと標識抗体及び／又は溶菌酵素を、予め混合した状態又は別々の状態で、同時に又は順次に、クロマトグラフ展開用膜担体２上の一端に適用することにより、上記の検査と同様の検査を行うことができる。

　また、捕捉抗体と標識抗体とを入れ替えても、同様の検出が可能な検出キットを構築することができる。

　本発明の１の実施形態では、本発明に係る溶菌助液と、本発明に係るラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ検出装置とを含む細菌検出キットに関していてもよい。かかる細菌検出キットは、さらに検出する細菌に応じた添加用の溶菌酵素をさらに含んでもよい。添加用の溶菌酵素に代えて、溶菌酵素はラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ検出装置の溶菌酵素添着部材４に添着されていてもよい。ここで、検出装置としては、大腸菌検出用の検出装置、黄色ブドウ球菌検出用の検出装置、及びストレプトコッカス属検出用の検出装置から選ばれる少なくとも１つであってよく、検出対象である細菌に基づいて検出装置を選択してもよい。検出対象の細菌に応じて、検出装置が選択されて使用される。溶菌酵素が添加される場合、検出対象の細菌に応じて、溶菌酵素が選択される。

　さらに別の実施形態では、細菌検出キットは、本発明に係る溶菌助液と、本発明に係るラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフ検出装置として、大腸菌検出用の検出装置、黄色ブドウ球菌検出用の検出装置、及びストレプトコッカス属検出用の検出装置とを含み、３種の検出用装置が同時に使用されてもよい。溶菌酵素は、それぞれ検出用装置に添着されていてもよいし、別途溶菌酵素として添加されてもよい。

　大腸菌検出用の検出装置は、大腸菌検出用の標識抗体及び捕捉抗体をそれぞれ、標識抗体添着部材１、及びクロマトグラフ展開用膜担体２に添着して含んでおり、さらにリゾチームを添着させた溶菌酵素添着部材４を備えてもよい。
　黄色ブドウ球菌検出用の検出装置は、黄色ブドウ球菌検出用の標識抗体及び捕捉抗体をそれぞれ、標識抗体添着部材１、及びクロマトグラフ展開用膜担体２に添着して含んでおり、さらにリゾスタフィンを添着させた溶菌酵素添着部材４を備えてもよい。
　ストレプトコッカス属検出用の検出装置は、ストレプトコッカス属検出用の標識抗体及び捕捉抗体をそれぞれ、標識抗体添着部材１、及びクロマトグラフ展開用膜担体２に添着して含んでおり、さらにリゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１の溶菌酵素を添着させた溶菌酵素添着部材４を備えてもよい。

　さらに別の態様では、本発明に係る溶菌助液と、大腸菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス属細菌を同時に検出するための３種同時検出用の検出装置とを含む細菌検出キットに関していてもよい。３種同時検出用の検出装置は、大腸菌検出用の標識抗体、黄色ブドウ球菌検出用の標識抗体、及びストレプトコッカス属検出用の標識抗体と、大腸菌検出用の捕捉抗体、黄色ブドウ球菌検出用の捕捉抗体、及びストレプトコッカス属検出用の捕捉抗体とをそれぞれ含むように構成される。溶菌酵素は、検出用装置の１又は複数の溶菌酵素添着部材４されていてもよいし、別途溶菌酵素として添加されてもよい。

　より具体的に、３種同時検出用の検出装置は、大腸菌検出用の標識抗体、黄色ブドウ球菌検出用の標識抗体、及びストレプトコッカス属検出用の標識抗体をまとめて１の標識抗体添着部材１に添着させて、かかる標識抗体添着部材１を備えてもよいし、大腸菌検出用の標識抗体、黄色ブドウ球菌検出用の標識抗体、及びストレプトコッカス属検出用の標識抗体をそれぞれ別々又は一緒に添着された２以上（すなわち２又は３）の標識抗体添着部材１を備えてもよい。

　さらにより具体的に、３種同時検出用の検出装置は、大腸菌検出用の捕捉抗体、黄色ブドウ球菌検出用の捕捉抗体、及びストレプトコッカス属検出用の捕捉抗体をそれぞれ、クロマトグラフ展開用膜担体２の異なる位置又は同じ位置にそれぞれ添着させて含んでもよい。一例として、黄色ブドウ球菌検出用の捕捉抗体及びストレプトコッカス属検出用の捕捉抗体をそれぞれ、同じ位置に添着させてもよく、その場合この添着位置において、捕捉された標識抗体－抗原複合体が検出された場合に、グラム陽性細菌が検出されたと判定することができる。

　３種の捕捉抗体を添着させる位置は、クロマトグラフ展開用膜担体２上において、検体流れに対し垂直方向に横に並べて配置させてもよいし、検体流れ方向に離して配置させてもよい。３種の捕捉抗体を添着させる順番は特に限定されないが、一例として、上流側から、黄色ブドウ球菌検出用捕捉抗体、ストレプトコッカス属検出用捕捉抗体、大腸菌検出用捕捉抗体の順番で配置することができる。さらに別の例では、３種同時検出用の検出装置は大腸菌検出用の捕捉抗体、黄色ブドウ球菌検出用の捕捉抗体、及びストレプトコッカス属検出用の捕捉抗体をそれぞれ添着させた２以上（すなわち２又は３個の）クロマトグラフ展開用膜担体２を備えていてもよい。

　以下、本発明を実施例に則して更に詳細に説明するが、これらの実施例はあくまでも説明のために便宜的に示す例に過ぎず、本発明は如何なる意味でもこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトコッカスウベリス（Streptococcus uberis）の検出におけるｐＨと電気伝導度の効果
（１）乳汁中黄色ブドウ球菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置の作製
イムノクロマトグラフ検出装置を以下の記載に従って作製した。
（ａ）リボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体の作製
　金コロイド標識する抗体には、スタフィロコッカス　アウレウス（Staphylococcus aureus）（黄色ブドウ球菌）リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２モノクローナル抗体を使用した。国際公開ＷＯ００／０６６０３号パンフレットの実施例5に記載の方法に準じて、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＬ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記Ｌ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる２種（ＳＡ－１およびＳＡ－２）の組合せを選択した。

（ｂ）金コロイド標識含浸部材
　ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）０．９ｍＬに０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＳＡ－２を１００μｇ／ｍＬ加え室温で１０分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が１％となるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０％水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体ＳＡ－２（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（１５０００×ｒｐｍ、５分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５％ＢＳＡ、２．５％スクロース、３５ｍＭ　ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。５ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液１ｍＬを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて標識抗体添着部材１として、金コロイド標識抗体含浸部材（以下、金コロイド標識抗体含浸部材１とする）を調製した

（ｃ）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
　幅２５ｍｍ、長さ３００ｍｍのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマトグラフ展開用膜担体２（第２部分）として用意した。モノクローナル抗体ＳＡ－１　１．５ｍｇ／ｍＬが含有されてなる溶液を、このクロマトグラフ展開用膜担体２におけるクロマトグラフ展開開始点側の末端から１０ｍｍの位置に１μＬ／ｃｍでライン状に塗布して、これを５０℃で３０分間乾燥し、その後、０．５％スクロース溶液に３０分浸し、一晩室温で乾燥させた。スタフィロコッカス　アウレウスリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３とした。

（ｄ）溶菌酵素添着部材
　富士フィルム和光純薬製の組換えリゾスタフィンを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に濃度１００μｇ／ｍＬになるように溶解し、５ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、酵素溶液１ｍＬを含浸せしめ、これを室温で風乾させて溶菌酵素添着部材４とした。

（ｅ）イムノクロマトグラフ装置の作製
　イムノクロマトグラフ検出装置の断面図を図１に示す。
　上記金コロイド標識抗体含浸部材１、上記クロマトグラフ展開用膜担体２の他に、検体接触部材５、フィルター部材６、及び吸収用部材７を基材８に張り合わせた後、５ｍｍ幅に切断し、イムノクロマトグラフ検出装置１０を作製した。検体接触部材５として２０ｍｍのＧＦ／ＤＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み７７６μｍ、保持粒子サイズ３．５μｍのフィルター部材）を用いた。この部材は、脂肪球除去用部材としての役割を兼ねる部材である。フィルター部材６として１５ｍｍのＧＦ／ＡＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み２９９μｍ、保持粒子サイズ１．７μｍのフィルター部材）を用い、吸収用部材７として濾紙を用い、そして、基材８として厚さ２５４μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたものを用いた。

（２）乳汁中大腸菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置の作製
イムノクロマトグラフ検出装置を以下の記載に従って作製した。
（ａ）リボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体の作製
金コロイド標識する抗体には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（大腸菌）リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２モノクローナル抗体を使用した。国際公開ＷＯ００／０６６０３号パンフレットの実施例５に記載の方法に準じて、大腸菌大腸菌のＬ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記およびその他の大腸菌群の菌種のＬ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる２種（ＥＣ－１およびＥＣ－２）の組合せを選択した。

（ｂ）金コロイド標識含浸部材
　ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）０．９ｍＬに０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＥＣ－２を１００μｇ／ｍＬ加え室温で１０分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が１％となるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０％水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体ＥＣ－２（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（１５０００×ｒｐｍ、５分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５％ＢＳＡ、２．５％スクロース、３５ｍＭ　ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。１０ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液２ｍＬを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて標識抗体添着部材１として、金コロイド標識抗体含浸部材（以下、金コロイド標識抗体含浸部材１とする）を調製した。

（ｃ）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
　幅２５ｍｍ、長さ３００ｍｍのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマトグラフ展開用膜担体２として用意した。モノクローナル抗体ＥＣ－１　１．５ｍｇ／ｍＬが含有されてなる溶液を、このクロマトグラフ展開用膜担体２におけるクロマトグラフ展開開始点側の末端から１０ｍｍの位置に１μＬ／ｃｍでライン状に塗布して、これを５０℃で３０分間乾燥し、その後、０．５％スクロース溶液に３０分浸し、一晩室温で乾燥させた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３とした。

（ｄ）溶菌酵素添着部材
　Ｃｒｅａｔｉｖｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ製のリゾチームを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に濃度５０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、５ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、酵素溶液１ｍＬを含浸せしめ、これを室温で風乾させて溶菌酵素添着部材４とした。

（ｅ）イムノクロマトグラフ検出装置の作製
　イムノクロマトグラフ検出装置の断面図を図１に示す。
　上記金コロイド標識抗体含浸部材１、上記クロマトグラフ展開用膜担体２の他に、検体接触部材５、フィルター部材６、及び吸収用部材７を基材８に張り合わせた後、５ｍｍ幅に切断し、イムノクロマトグラフ検出装置１０を作製した。検体接触部材５として２０ｍｍのＧＦ／ＤＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み７７６μｍ、保持粒子サイズ３．５μｍのフィルター部材）を用いた。この部材は、脂肪球除去用部材としての役割を兼ねる部材である。フィルター部材６として１５ｍｍのＧＦ／ＡＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み２９９μｍ、保持粒子サイズ１．７μｍのフィルター部材）を用い、吸収用部材７として濾紙を用い、そして、基材８として厚さ２５４μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたものを用いた。

（３）乳汁中ストレプトコッカス検出用イムノクロマトグラフ検出装置の作製
イムノクロマトグラフ検出装置を以下の記載に従って作製した。
（ａ）リボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体の作製
国際公開ＷＯ００／０６６０３号パンフレットの実施例に記載の方法に準じて、ストレプトコッカス・ウベリスＬ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記Ｌ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる２種の組合せを選択した。

（ｂ）金コロイド標識含浸部材
ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）０．９　ｍＬに０．１Ｍ　リン酸カリウム　ｐＨ７．０を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＳＵ－２を１００　μｇ／ｍＬ加え室温で１０分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が１％となるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０％水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体ＳＵ－２（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（１５０００×ｒｐｍ、５分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５％ＢＳＡ、２．５％スクロース、３５ｍＭ　ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。１０ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液２ｍＬを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて、標識抗体添着部材１として金コロイド標識抗体含浸部材（以下、金コロイド標識抗体含浸部材１とする）を調製した。

（ｃ）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
　幅２５ｍｍ、長さ３００ｍｍのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマトグラフ展開用膜担体２として用意した。モノクローナル抗体ＳＵ－１　１．５ｍｇ／ｍＬが含有されてなる溶液を、このクロマトグラフ展開用膜担体２におけるクロマトグラフ展開開始点側の末端から１０ｍｍの位置に１μＬ／ｃｍでライン状に塗布して、これを５０℃で３０分間乾燥し、その後、０．５％スクロース溶液に３０分浸し、一晩室温で乾燥させた。ストレプトコッカスウベリスリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３とした。

（ｄ）溶菌酵素添着部材
　コスモバイオ製のラビアーゼを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に濃度３０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、５ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、酵素溶液１ｍＬを含浸せしめ、これを室温で風乾させて溶菌酵素添着部材４とした。

（ｅ）イムノクロマトグラフ検出装置の作製
　イムノクロマトグラフ検出装置断面図を図１に示す。
　上記金コロイド標識抗体含浸部材１、上記クロマトグラフ展開用膜担体２の他に、検体接触部材５、フィルター部材６、及び吸収用部材７を基材８に張り合わせた後、５ｍｍ幅に切断し、イムノクロマトグラフ検出装置１０を作製した。検体接触部材５として、２０ｍｍのＧＦ／ＤＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み７７６μｍ、保持粒子サイズ３．５μｍのフィルター部材）を用いた。この部材は、脂肪球除去用部材としての役割を兼ねる部材である。フィルター部材６として１５ｍｍのＧＦ／ＡＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み２９９μｍ、保持粒子サイズ１．７μｍのフィルター部材）を用い、吸収用部材７として濾紙を用い、そして基材８として、厚さ２５４μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたものを用いた。

（４）試験　イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳汁の測定
　イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳汁の測定は以下のように行った。５ｍｍ×５ｍｍに裁断した黄色ブドウ球菌検出用の溶菌酵素添着部材４（リゾスタフィンが添着）を1枚ずつ入れたマイクロチューブに表１に記載の溶菌助液５００μＬを分取し、終濃度２×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）の黄色ブドウ球菌を添加した乳汁３００μＬを混合し室温で３０分間処理した。この時、溶菌助液のｐＨと電気伝導度はコンパクトｐＨメータ　ＬＡＱＵＡ　ｔｗｉｎとコンパクト電気伝導率計ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて測定し、牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液のｐＨと電気伝導度を測定した後、乳汁中黄色ブドウ球菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０の検体接触部材５の一部を浸漬して、室温で３０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。

　また、５ｍｍ×５ｍｍに裁断した大腸菌検出用の溶菌酵素添着部材4（リゾチームが添着）を1枚ずつ入れたマイクロチューブに表１に記載の溶菌助液５００μＬを分取し、終濃度２×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）の大腸菌を添加した乳汁３００μＬを混合し室温で３０分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液に乳汁中大腸菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０の検体接触部材５の一部を浸漬して、室温で３０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。

　同様に、５ｍｍ×５ｍｍに裁断したストレプトコッカス検出用の溶菌酵素添着部材4（ラビアーゼが添着）を1枚ずつ入れたマイクロチューブに表１に記載の溶菌助液５００μＬを分取し、終濃度2×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）のストレプトコッカス・ウベリスを添加した乳汁３００μＬを混合し室温で３０分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液に乳汁中ストレプトコッカス検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０の検体接触部材５の一部を浸漬して、室温で３０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。

　イムノクロマトグラフ検出装置１０において、それぞれ目視陽性となった場合＋、目視陰性となった場合－と表記し、牛乳汁と各種溶菌液混合後のｐＨと電気伝導度の測定結果と合わせて表２に記載した。表２より酵素としてリゾスタフィン、リゾチーム、ラビアーゼを用い、溶菌助液と牛乳汁混合後のｐＨが６．０～７．０かつ電気伝導度が２．５～８．５の時３菌種全て検出可能となった。

実施例２：イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトコッカス・ウベリスの検出における非イオン性界面活性剤の効果
（１）イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳汁の測定は実施例１に準じて行った。
　実施例１と同様に各菌種検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０についてそれぞれ目視陽性となった場合＋、目視陰性となった場合－と表記し、牛乳汁と各種溶菌液混合後のｐＨと電気伝導度の測定結果と合わせて表４に記載した。表４より酵素としてリゾスタフィン、リゾチーム、ラビアーゼを用い、溶菌助液に用いる非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルであり、牛乳汁混合後の非イオン性界面活性剤濃度が１．２５％～３．１３％、ｐＨが６．０～７．０かつ電気伝導度が２．５～８．５の時３菌種全て検出可能となった。使用した溶菌助液を表３にまとめた。

実施例２－１：イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトコッカス・ウベリスの検出における非イオン性界面活性剤の物性と効果
（１）イムノクロマトグラフ検出装置の作製は実施例１に準じて行い、試験に用いた溶菌助液を表４－１にまとめた。

（２）乳汁中黄色ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトコッカス検出用イムノクロマトグラフ検出装置は実施例1（１）（２）（３）に準じて行った。イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳中の測定は実施例１（４）に準じて行い、4×１０^５、2×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）の黄色ブドウ球菌、または大腸菌、レンサ球菌をそれぞれ添加した乳汁用いた。
実施例１と同様に各菌種検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０についてそれぞれ目視陽性となった場合＋、目視陰性となった場合－と表記し、牛乳汁と各種溶菌液混合後のｐＨと電気伝導度の測定結果と合わせて表４－２に記載した。
表４－２より、酵素としてリゾスタフィン、リゾチーム、ラビアーゼを用い、溶菌助液と牛乳汁混合後のｐＨが６．０～７．０かつ電気伝導度が２．５～８．５であり、溶菌助液に用いる非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン鎖を有し、ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数が７から１１かつＨＬＢ値が１２．０以上１４．５未満であり、前記非イオン性界面活性剤濃度が１．８８％の時、３菌種全て４×１０^５［ＣＦＵ／ｍＬ］の濃度の細菌が検出可能となった。また、溶菌助液に用いる非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン鎖を有し、ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数が７．５から１０かつＨＬＢ値が１２．４から１４．１であり、前期非イオン性界面活性剤濃度が１．８８％の時、３菌種全て２×１０^５［ＣＦＵ／ｍＬ］の濃度の細菌が検出可能となった。

実施例３：イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトコッカス・ウベリスの検出における陰イオン性界面活性剤と両イオン性界面活性剤、γグロブリンの効果
（１）試験　イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳汁の測定
　イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳汁の測定は以下のように行った。５ｍｍ×５ｍｍに裁断した黄色ブドウ球菌検出用の溶菌酵素添着部材４（リゾスタフィンが添着）を１枚ずつ入れたマイクロチューブに表５に記載の溶菌助液５００μＬを分取し、終濃度１×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）の黄色ブドウ球菌を添加した乳汁を３００μＬ混合し室温で３０分間処理した。この時、溶菌助液のｐＨと電気伝導度はコンパクトｐＨメータ　ＬＡＱＵＡ　ｔｗｉｎとコンパクト電気伝導率計ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて測定し、牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液のｐＨと電気伝導度を測定した後、実施例１の乳汁中黄色ブドウ球菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０の検体接触部材５の一部を浸漬して、室温で３０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。

　また、５ｍｍ×５ｍｍに裁断した大腸菌検出用の溶菌酵素添着部材４（リゾチームが添着）を１枚ずつ入れたマイクロチューブに表５に記載の溶菌助液５００μＬを分取し、終濃度１×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）の大腸菌を添加した乳汁３００μＬを混合し室温で３０分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液に実施例１の乳汁中大腸菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０の検体接触部材５の一部を浸漬して、室温で３０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。

　同様に、５ｍｍ×５ｍｍに裁断したストレプトコッカス検出用の溶菌酵素添着部材４（ラビアーゼが添着）を１枚ずつ入れたマイクロチューブに表５に記載の溶菌助液を５００μＬを分取し、終濃度１×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）のストレプトコッカス・ウベリスを添加した乳汁を３００μＬ混合し室温で３０分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液に実施例１の乳汁中ストレプトコッカス検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０の検体接触部材５の一部を浸漬して、室温で３０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。

　実施例１と同様に各菌種検出用イムノクロマトキット１０についてそれぞれ目視陽性となった場合＋、目視陰性となった場合－と表記し、牛乳汁と各種溶菌液混合後のｐＨと電気伝導度の測定結果と合わせて表６に記載した。表６より酵素としてリゾスタフィン、リゾチーム、ラビアーゼを用い、溶菌助液に用いる非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルでありと牛乳汁混合後の非イオン性界面活性剤濃度が１．２５％～３．１３％、ｐＨが６．０～７．０かつ電気伝導度が２．５～８．５であり、陰イオン性界面活性剤ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム濃度が０．３１％、両イオン性界面活性剤Zwittergent３－１２濃度が０．０９％，γグロブリン濃度が６．２５　ｕｇ／ｍＬの時、３菌種全て１×１０^５が検出可能となった。

　実施例１及び２では、条件１において２×１０^５ｃｆｕ／ｍＬの各菌種の有無を判定できていた一方、実施例３では同じ条件１では１×１０^５ｃｆｕ／ｍＬの細菌の検出ができなかった。一方、陰イオン界面活性剤及びγグロブリンを添加することにより、同細菌数の検出が可能になり、イムノクロマトグラフ検出装置の感度が増大することが示された。

実施例４：イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトコッカス・ウベリスの検出における溶菌助液と検体の混合比率の効果
（１）試験　イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳汁の測定
　イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳汁の測定は以下のように行った。５ｍｍ×５ｍｍに裁断した黄色ブドウ球菌検出用の溶菌酵素添着部材４（リゾスタフィンが添着）を１枚ずつ入れたマイクロチューブに表７に記載の溶菌助液５００μＬまたは３００μＬを分取し、終濃度１×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）の黄色ブドウ球菌を添加した乳汁３００μＬを混合し室温で３０分間処理した。この時、溶菌助液のｐＨと電気伝導度はコンパクトｐＨメータ　ＬＡＱＵＡ　ｔｗｉｎとコンパクト電気伝導率計ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて測定し、牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液のｐＨと電気伝導度を測定した後、実施例１の乳汁中黄色ブドウ球菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０の検体接触部材５の一部を浸漬して、室温で３０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。

　また、５ｍｍ×５ｍｍに裁断した大腸菌検出用の溶菌酵素添着部材４（リゾチームが添着）を１枚ずつ入れたマイクロチューブに表7に記載の溶菌助液を５００μＬまたは３００μＬを分取し、終濃度１×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）の大腸菌を添加した乳汁を３００μＬ混合し室温で３０分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液に実施例１の乳汁中大腸菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０の検体接触部材５の一部を浸漬して、室温で３０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。

　同様に、５ｍｍ×５ｍｍに裁断したストレプトコッカス検出用の溶菌酵素添着部材４（ラビアーゼが添着）を１枚ずつ入れたマイクロチューブに表7に記載の溶菌助液を５００μＬまたは３００μＬを分取し、終濃度１×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）のストレプトコッカス・ウベリスを添加した乳汁を３００μＬ混合し室温で３０分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液に実施例１の乳汁中ストレプトコッカス検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０の検体接触部材５の一部を浸漬して、室温で３０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。

　実施例１と同様に、各菌種検出用イムノクロマトグラフ検出装置１０についてそれぞれ目視陽性となった場合＋、目視陰性となった場合－と表記し、牛乳汁と各種溶菌液混合後のｐＨと電気伝導度の測定結果と合わせて表８に記載した。表８より酵素としてリゾスタフィン、リゾチーム、ラビアーゼを用い、溶菌助液に用いる非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルでありと牛乳汁混合後の非イオン性界面活性剤濃度が１．２５％～３．１３％、ｐＨが６．０～７．０かつ電気伝導度が２．５～８．５であり、陰イオン性界面活性剤ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム濃度が０．３１％、両イオン性界面活性剤Zwittergent3-12濃度が０．０９％，γグロブリン濃度が６．２５　ｕｇ／ｍＬの時、溶菌助液と検体の混合比が５：３～１：１において３菌種全て１×１０^５ｃｆｕ／ｍＬの細菌が検出可能となった。

実施例５　イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトコッカス・ウベリスの同時検出
（１）乳汁中黄色ブドウ球菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置の作製
イムノクロマトグラフ検出装置を以下の記載に従って作製した。
（ａ）リボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体の作製
　金コロイド標識する抗体には、スタフィロコッカス　アウレウス（Staphylococcus aureus）（黄色ブドウ球菌）リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２モノクローナル抗体を使用した。国際公開ＷＯ００／０６６０３号パンフレットの実施例5に記載の方法に準じて、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＬ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記Ｌ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる２種（ＳＡ－１およびＳＡ－２）の組合せを選択した。

（ｂ）金コロイド標識含浸部材
　ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）０．９ｍＬに０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＳＡ－２を１００μｇ／ｍＬ加え室温で１０分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が１％となるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０％水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体ＳＡ－２（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（１５０００×ｒｐｍ、５分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５％ＢＳＡ、２．５％スクロース、３５ｍＭ　ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。５ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液１ｍＬを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて標識抗体添着部材１として、金コロイド標識抗体含浸部材（以下、金コロイド標識抗体含浸部材１とする）とした。

（ｄ）溶菌酵素添着部材
　富士フィルム和光純薬製の組換えリゾスタフィンを２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に濃度５０μｇ／ｍＬになるように溶解し、１０ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、酵素溶液２ｍＬを含浸せしめ、これを室温で風乾させて溶菌酵素添着部材４とした。

（ｅ）イムノクロマトグラフ装置の作製
　イムノクロマトグラフ検出装置断面図を図２に示す。
上記金コロイド標識抗体含浸部材１、上記溶菌酵素添着部材４、上記クロマトグラフ展開用膜担体２の他に、検体接触部材５、フィルター部材６、及び吸収用部材７を基材８に張り合わせた後、５ｍｍ幅に切断し、イムノクロマトグラフ検出装置２０を作製した。溶菌酵素添着部材４は、検体接触部材５の上流末端側に、基材８と検体接触部材との間に配置した。溶菌酵素添着部材４の下流側に、基材８と溶菌酵素添着部材４との間に、金コロイド標識抗体含浸部材１を配置した。検体接触部材５として２６ｍｍのＧＦ／ＤＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み７７６μｍ、保持粒子サイズ３．５μｍのフィルター部材）を用いた。この部材は、脂肪球除去用部材としての役割を兼ねる部材である。フィルター部材６として１５ｍｍのＧＦ／ＡＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み２９９μｍ、保持粒子サイズ１．７μｍのフィルター部材６）を用い、吸収用部材７として濾紙を用い、そして、基材８として厚さ２５４μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたものを用いた。

（ｂ）金コロイド標識含浸部材
　ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）０．９ｍＬに０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＥＣ－２を１００μｇ／ｍＬ加え室温で１０分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が１％となるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０％水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体ＥＣ－２（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（１５０００×ｒｐｍ、５分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５％ＢＳＡ、２．５％スクロース、３５ｍＭ　ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。１０ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液２ｍＬを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて、標識抗体添着部材１として、金コロイド標識抗体含浸部材（以下、金コロイド標識抗体含浸部材１とする）とした。

（ｅ）イムノクロマトグラフ検出装置の作製
　イムノクロマトグラフ検出装置断面図を図３に示す。
　上記金コロイド標識抗体含浸部材１、上記溶菌酵素添着部材４、上記クロマトグラフ展開用膜担体２の他に、検体接触部材５、フィルター部材６、及び吸収用部材７を基材８に張り合わせた後、５ｍｍ幅に切断し、イムノクロマトグラフ検出装置３０を作製した。金コロイド標識抗体含浸部材１は、検体接触部材５の上流末端側において、基材８と検体接触部材との間に配置した。金コロイド標識抗体含浸部材１の下流側において、基材８と金コロイド標識抗体含浸部材１との間に溶菌酵素添着部材４を配置した。検体接触部材５として２３ｍｍのＧＦ／ＤＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み７７６μｍ、保持粒子サイズ３．５μｍのフィルター部材）を用いた。この部材は、脂肪球除去用部材としての役割を兼ねる部材である。フィルター部材６として１６ｍｍのＧＦ／ＡＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み２９９μｍ、保持粒子サイズ１．７μｍのフィルター部材６）を用い、吸収用部材７として濾紙を用い、そして基材８として厚さ２５４μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたものを用いた。

（３）乳汁中ストレプトコッカス検出用イムノグラフ検出装置の作製
　イムノクロマトグラフ検出装置を以下の記載に従って作製した。
（ａ）リボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体の作製
　国際公開ＷＯ００／０６６０３号パンフレットの実施例に記載の方法に準じて、ストレプトコッカス・ウベリスＬ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記Ｌ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる２種の組合せを選択した。

（ｂ）金コロイド標識含浸部材
　ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）０．９　ｍＬに０．１Ｍ　リン酸カリウム　ｐＨ７．０を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＳＵ－２を１００　μｇ／ｍＬ加え室温で１０分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が１％となるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０％水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体ＳＵ－２（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（１５０００×ｒｐｍ、５分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５％ＢＳＡ、２．５％スクロース、３５ｍＭ　ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。１０ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液２ｍＬを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて、標識抗体添着部材１として、金コロイド標識抗体含浸部材（以下、金コロイド標識抗体含浸部材１とする）とした。

（ｄ）溶菌酵素添着部材
　Ｃｒｅａｔｉｖｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ製のリゾチームを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に濃度５０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、５ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、酵素溶液１ｍＬを含浸せしめ、これを室温で風乾させて溶菌酵素添着部材４－１とした。
コスモバイオ製のラビアーゼを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に濃度３０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、５ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、酵素溶液１ｍＬを含浸せしめ、これを室温で風乾させて溶菌酵素添着部材４-２とした。

（ｅ）イムノクロマトグラフ検出装置の作製
　イムノクロマトグラフ検出装置断面図を図４に示す。
　上記金コロイド標識抗体含浸部材１、上記溶菌酵素添着部材４－１及び溶菌酵素添着部材４－２、上記クロマトグラフ展開用膜担体２の他に、検体接触部材５、フィルター部材６、及び吸収用部材７を基材８に張り合わせた後、５ｍｍ幅に切断し、イムノクロマトグラフ検出装置４０を作製した。金コロイド標識抗体含浸部材１は、検体接触部材５の上流末端側において、基材８と検体接触部材５との間に配置した。金コロイド標識抗体含浸部材１の下流側において、基材８と金コロイド標識抗体含浸部材１との間に溶菌酵素添着部材４－１及び溶菌酵素添着部材４－２をそれぞれ重畳して配置した。検体接触部材５として３２ｍｍのＧＦ／ＤＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み７７６μｍ、保持粒子サイズ３．５μｍのフィルター部材）を用いた。この部材は、脂肪球除去用部材としての役割を兼ねる部材である。フィルター部材６として１６ｍｍのＧＦ／ＡＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み２９９μｍ、保持粒子サイズ１．７μｍのフィルター部材）を用い、吸収用部材７として濾紙を用い、基材８として厚さ２５４μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたものを用いた。

（４）試験　イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳汁の測定
　イムノクロマトグラフ検出装置２０、３０、４０による牛乳汁の測定は以下のように行った。内径１７ｍｍの円筒形の容器に、表８の条件２１に記載の溶菌助液を９００μＬ分取し、表９の条件２３～２７に記載の条件で終濃度１×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）の黄色ブドウ球菌および／または大腸菌および／またはレンサ球菌を添加した乳汁を９００μＬ混合した。この時、溶菌助液のｐＨと電気伝導度はコンパクトｐＨメータ　ＬＡＱＵＡ　ｔｗｉｎとコンパクト電気伝導率計ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて測定し、牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液のｐＨと電気伝導度を測定した後、上記各種細菌検出用イムノクロマトグラフ検出装置２０、３０、４０について、図５に示すように検体接触部材５の一部を同時に浸漬し、イムノクロマトグラフ検出装置で混合溶液を攪拌したのち、室温で６０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。結果は表９に記載した。

本発明の溶菌助液を使用することで、容器内の牛乳中に含まれる黄色ブドウ球菌および／または大腸菌および／またはレンサ球菌を１回の検査で検出することが可能になった。

実施例６　イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトコッカス・ウベリスの同時検出－２
（１）乳汁中黄色ブドウ球菌、大腸菌、レンサ球菌一括検出用イムノクロマトグラフ検出装置の作製
イムノクロマトグラフ検出装置を以下の記載に従って作製した。

（ａ）実施例１（１）（a）と同じ手法でリボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体を作製した。

（ｂ）金コロイド標識含浸部材
　ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）０．９ｍＬに０．０５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．７３を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＳＡ－２を１００μｇ／ｍＬ加え室温で３０分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が０．０００２４％となるように０．００５％ＳＨ－ＰＥＧ５０００（ＰＥＧ）水溶液を加え、３０分静置することで、この金コロイド粒子の残余の表面をＰＥＧでブロッキングした。続けて、金コロイド溶液における最終濃度が０．８７％となるように１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を加え、金コロイド粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングする。６５００Ｇで２０分間遠心分離した後、上清を取り除き、０．５％ＢＳＡ、０．１２５％カゼイン、７５ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）（以下「金コロイド分散液」）で再分散させる。再度同条件で遠心分離を行い、５４０ｎｍの吸光度が１５になるように金コロイド分散液で希釈することで黄色ブドウ球菌用金コロイド標識抗体溶液を得た。

続いて、ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）０．９ｍＬに０．２ＭＣＡＰＳＯ緩衝液ｐＨ９．３を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＥＣ－２を１００μｇ／ｍＬ加え室温で３０分間静置することでこの抗体を金コロイド粒子表面に結合させた。次に金コロイド溶液における最終濃度が０．０００２４％となるように０．００５％ＳＨ－ＰＥＧ５０００（ＰＥＧ）水溶液を加え、６０分静置することで、この金コロイド粒子の残余の表面をＰＥＧでブロッキングした。続けて、金コロイド溶液における最終濃度が０．２１７％となるように２．５％カゼイン水溶液を加え、金コロイド粒子の残余の表面をカゼインでブロッキングする。６５００Ｇで２０分間遠心分離した後、上清を取り除き、金コロイド分散液で再分散させる。再度同条件で遠心分離を行い、５４０ｎｍの吸光度が１３．５になるように金コロイド分散液で希釈することで大腸菌用金コロイド標識抗体溶液を得た。

続いて、ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）０．９ｍＬに０．１ＭＴＡＰＳ緩衝液ｐＨ７．７５を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＳＵ－２を１００μｇ／ｍＬ加えることでこの抗体を金コロイド粒子表面に結合させた。次に金コロイド溶液における最終濃度が０．０００２４％となるように０．００５％ＳＨ－ＰＥＧ５０００（ＰＥＧ）水溶液を加え、１５分静置することで、この金コロイド粒子の残余の表面をＰＥＧでブロッキングした。続けて、金コロイド溶液における最終濃度が０．４３４％となるように５.０％カゼイン水溶液を加え、金コロイド粒子の残余の表面をカゼインでブロッキングする。６５００Ｇで２０分間遠心分離した後、上清を取り除き、金コロイド分散液で再分散させる。再度同条件で遠心分離を行い、５４０ｎｍの吸光度が１５.０になるように金コロイド分散液で希釈することでレンサ球菌用金コロイド標識抗体溶液を得た。

　黄色ブドウ球菌用金コロイド標識抗体溶液と大腸菌用金コロイド標識抗体溶液、レンサ球菌用金コロイド標識抗体溶液を等比で混合し、１０ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液１．８ｍＬを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて、標識抗体添着部材１として、金コロイド標識抗体含浸部材（以下、金コロイド標識抗体含浸部材１とする）を調製した

（ｃ）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
　幅２５ｍｍ、長さ３００ｍｍのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマトグラフ展開用膜担体２（第２部分）として用意した。０．１５％カゼイン、１％スクロースを含有する３．０ｍｇ / ｍLモノクローナル抗体ＳＡ－１溶液と、０．１０％カゼイン、２％スクロースを含有する１．０ｍｇ / ｍLモノクローナル抗体ＥＣ－１溶液と、０．１％カゼイン、０．５％スクロースを含有する２．５ｍｇ / ｍLモノクローナル抗体ＳＵ－１溶液を、このクロマトグラフ展開用膜担体２におけるクロマトグラフ展開開始点側の末端からそれぞれ５、６．５、８ｍｍの位置に０．５７１μＬ／ｃｍでライン状に塗布した。これを６０℃で一晩乾燥させることで、スタフィロコッカス　アウレウス、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、ストレプトコッカスウベリスのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３とした。

（ｄ）溶菌酵素添着部材
　富士フィルム和光純薬製の組換えリゾスタフィンとＣｒｅａｔｉｖｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ製のリゾチームを５％スクロース含有１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.０）にそれぞれ０．１３３、１３３ｍｇ / ｍＬになるように溶解し、５ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、酵素溶液０．９ｍＬを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて溶菌酵素添着部材４－１とした。
コスモバイオ製のラビアーゼを５％スクロース含有マッキルベイン緩衝液（ｐＨ４）に濃度３０ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、５ｍｍ×３００ｍｍの帯状のグラスファイバーットに、酵素溶液０．９ｍＬを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて溶菌酵素添着部材４-２とした。

（ｅ）イムノクロマトグラフ検出装置の作製
　イムノクロマトグラフ検出装置断面図を図６に示す。
　上記金コロイド標識抗体含浸部材１、上記溶菌酵素添着部材４－１及び溶菌酵素添着部材４－２、上記クロマトグラフ展開用膜担体２の他に、検体接触部材５、フィルター部材６、及び吸収用部材７を基材８に張り合わせた後、５ｍｍ幅に切断し、イムノクロマトグラフ検出装置４０を作製した。金コロイド標識抗体含浸部材１は、検体接触部材５の上流末端側において、基材８と検体接触部材５との間に配置した。金コロイド標識抗体含浸部材１の下流側において、基材８と金コロイド標識抗体含浸部材１との間に溶菌酵素添着部材４－１及び溶菌酵素添着部材４－２をそれぞれ重畳して配置した。検体接触部材５として３２ｍｍのＧＦ／ＤＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み７７６μｍ、保持粒子サイズ３．５μｍのフィルター部材）を用いた。この部材は、脂肪球除去用部材としての役割を兼ねる部材である。フィルター部材６として１６ｍｍのＧＦ／ＡＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み２９９μｍ、保持粒子サイズ１．７μｍのフィルター部材）を用い、吸収用部材７として濾紙を用い、基材８として厚さ２５４μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたものを用いた。

（２）試験　イムノクロマトグラフ検出装置による牛乳汁の測定
　イムノクロマトグラフ検出装置２０、３０、４０による牛乳汁の測定は以下のように行った。内径１７ｍｍの円筒形の容器に、表８の条件２１に記載の溶菌助液を３００μＬ分取し、表９の条件２３～２７に記載の条件で終濃度１×１０^５（ｃｆｕ／ｍＬ）の黄色ブドウ球菌および／または大腸菌および／またはレンサ球菌を添加した乳汁を３００μＬ混合した。この時、溶菌助液のｐＨと電気伝導度はコンパクトｐＨメータ　ＬＡＱＵＡ　ｔｗｉｎとコンパクト電気伝導率計ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて測定し、牛乳汁は市販の飲用品（ｐＨ６．４、電気伝導度４．０ｍＳ／ｃｍ）を用いた。同混合溶液のｐＨと電気伝導度を測定した後、上記黄色ブドウ球菌、大腸菌、レンサ球菌一括検出用イムノクロマトグラフ検出装置について、図７に示すように検体接触部材５の一部を同時に浸漬し、イムノクロマトグラフ検出装置で混合溶液を攪拌したのち、室温で６０分静置して展開後、赤紫色のラインを目視により判定した。結果は表１０に記載した。

　本発明は、細菌溶菌、細菌検出等の食品、畜産の分野等に広く適用でき、その利用価値は極めて大きい。

１０　イムノクロマトグラフ検出装置
２０　黄色ブドウ球菌検出用イムノクロマトグラフ装置
３０　大腸菌検出用イムノクロマトグラフ装置
４０　ストレプトコッカス検出用イムノクロマトグラフ装置
５０　３種検出用イムノクロマトグラフ装置
１　標識抗体添着部材（コンジュゲートパッド）／金コロイド標識抗体含浸部材
２　クロマトグラフ展開用膜担体
３　捕捉部位
４　溶菌酵素添着部材
４－１　溶菌酵素添着部材
４－２　溶菌酵素添着部材
５　検体接触部材（サンプルパッド）
６　フィルター部材
７　吸収用部材（吸収パッド）
８　基材
９　容器
Ａ　検体
Ｂ　検体流れ
Ｃ　検体液面

Claims

　検体中の細菌群を溶菌する方法であって、
　検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合して得られる混合液中で検体中の細菌群を溶菌する工程を含み、
　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素を含み、
　前記混合液のｐＨが６．０～７．０であり、
　前記混合液の電気伝導度が２．５～８．５ｍＳ／ｃｍである、前記方法。
　前記溶菌酵素と、前記溶菌助液とが予め混合されている、請求項１に記載の方法。
　前記溶菌助液が、緩衝剤、界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
　前記溶菌助液が、さらに塩を含む、請求項３に記載の方法。
　前記界面活性剤が少なくとも非イオン性界面活性剤を含む、請求項３に記載の方法。
　前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン鎖を有し、前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７～１１かつ、ＨＬＢ値が１２．０以上１４．５未満である第一の非イオン性界面活性剤を含む、請求項５に記載の方法。
　前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７．５～１０かつ、ＨＬＢ値が１２．４～１４．１である、請求項６に記載の方法。
　前記混合液中の前記第一の非イオン性界面活性剤の濃度が１．２５～３．１２５％である、請求項６に記載の方法。
　前記溶菌助液が、５～５００ｍＭの緩衝剤を含む、請求項５に記載の方法。
　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる４つ全ての溶菌酵素を含む、請求項１に記載の方法。
　前記方法の溶菌対象が、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌からなる群から選ばれる少なくとも１の細菌を含む、請求項１に記載の方法。
　前記方法の溶菌対象が、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌を含む、請求項１０に記載の方法。
　前記方法が、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原検出の前処理として行われる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
　前記検体が、乳汁である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
　検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合する工程を含む、検体中の細菌群を溶菌する方法であって、前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素を含み、溶菌助液のｐＨが６．０～７．０、溶菌助液の電気伝導度が２．０～８．０ｍＳ／ｃｍである、前記方法。
　前記溶菌酵素と、前記溶菌助液とが予め混合されて提供される、請求項１５に記載の方法。
　前記溶菌助液が、緩衝剤及び界面活性剤を含む、請求項１５に記載の方法。
　前記溶菌助液が、さらに塩を含む、請求項１７に記載の方法。
　前記界面活性剤が少なくとも非イオン性界面活性剤を含む、請求項１７に記載の方法。
　前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン鎖を有し、前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７～１１かつ、ＨＬＢ値が１２．０以上１４．５未満である第一の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１９に記載の方法。
　前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７．５～１０かつ、ＨＬＢ値が１２．４～１４．１である、請求項２０に記載の方法。
　溶菌助液中の前記非イオン性界面活性剤の濃度が２～５％である、請求項１９に記載の方法。
　前記溶菌助液が、５～５００ｍＭの緩衝剤を含む、請求項１７に記載の方法。
　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる４つ全ての溶菌酵素を含む、請求項１５に記載の方法。
　前記方法の溶菌対象が、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌からなる群から選ばれる少なくとも１の細菌を含む、請求項１５に記載の方法。
　前記方法の溶菌対象が、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌を含む、請求項２４に記載の方法。
　前記方法が、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原検出の前処理として行われる、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
　前記検体が、乳汁である、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
　前記検体と、前記溶菌助液とが、１：５～３：１で混合される、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
　０～１．５Ｍの塩濃度、５～５００ｍＭの緩衝剤、２～５％の非イオン性界面活性剤を含み、ｐＨが６．０～７．０、溶菌助液の電気伝導度が２．０～８．０ｍＳ／ｃｍである、検体中の大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌を含む細菌群を、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１の溶菌酵素と共に用いて溶菌するための溶菌助液。
　リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素と、請求項３０に記載の溶菌助液とを含む、細菌溶菌キット。
　リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素と、請求項３０に記載の溶菌助液と、Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質抗原を検出する検出装置を含む、細菌検出キット。
　検体中の、大腸菌、ブドウ球菌、及びストレプトコッカス属細菌からなる群から選ばれる少なくとも１種の細菌の有無を判定する方法であって、
　検体と、溶菌酵素と、溶菌助液とを混合して混合液を取得する工程、及び
　免疫学的手法により、前記混合液中に含まれる細菌由来のＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質を検出することで細菌の有無を判定する工程を含み、
　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの溶菌酵素を含み、
　前記混合液のｐＨが６．０～７．０であり、
　前記混合液の電気伝導度が２．５～８．５ｍＳ／ｃｍであり、
　前記混合液を取得する工程において、リゾチームが大腸菌を、リゾスタフィンがブドウ球菌を、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼがストレプトコッカス属細菌を溶菌し得ることを特徴とする、前記方法。
　前記溶菌助液が、緩衝剤、界面活性剤を含む、請求項３３に記載の方法。
　前記界面活性剤が少なくとも非イオン性界面活性剤を含む、請求項３４に記載の方法。
　前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン鎖を有し、前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７～１１かつ、ＨＬＢ値が１２．０以上１４．５未満である第一の非イオン性界面活性剤を含む、請求項３５に記載の方法。
　前記ポリオキシエチレン鎖の繰り返し数の平均値が７．５～１０かつ、ＨＬＢ値が１２．４～１４．１である、請求項３６に記載の方法。
　前記混合液中の前記第一の非イオン性界面活性剤の濃度が１．２５～３．１２５％である、請求項３６に記載の方法。
　前記溶菌酵素が、リゾスタフィン、リゾチーム、アセチルグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼからなる群から選ばれる４つ全ての溶菌酵素を含む、請求項３３に記載の方法。
　前記工程において、前記溶菌酵素が大腸菌、ブドウ球菌、ストレプトコッカス属細菌を全て溶菌し得ることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。