CN117230016A - 分泌抗人副流感病毒2型n蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、及应用、及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请公开了分泌抗人副流感病毒(HPIV)2型N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、及应用、及试剂盒，该杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株PIV2‑1G1和/或杂交瘤细胞株PIV2‑3E2，杂交瘤细胞株PIV2‑1G1的保藏编号为CCTCC NO：C2023200，杂交瘤细胞株PIV2‑3E2的保藏编号为CCTCCNO：C2023201。采用本申请提供的单克隆抗体制备的试剂盒检测副流感病毒2型，操作简单、灵敏度高、特异性强，可实现对副流感病毒2型的快速监测及预防。

Description

分泌抗人副流感病毒2型N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞 株、单克隆抗体、及应用、及试剂盒

技术领域

本申请涉及免疫检测技术领域，具体涉及分泌抗人副流感病毒(HPIV)2型N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、及应用、及试剂盒。

背景技术

人副流感病毒(HPIV)发现于1950年，是副病毒科的单链、包膜RNA病毒，病毒粒子具有多形性，直径在150nm到200nm之间。人副流感病毒RNA以保守的顺序编码六种必需蛋白质：核衣壳蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合糖蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶糖蛋白(HN)和RNA聚合酶(L)。副流感病毒有4种血清型，分别为副流感1、2、3、4型，N蛋白是副流感病毒保守蛋白，也是4种血清型的特意蛋白。副流感病毒主要引起儿童和成人的呼吸系统疾病，尤其可造成儿童多种严重的呼吸系统疾病，目前尚无有效的预防或治疗方法。季节性HPIV流行导致儿童呼吸道疾病占儿童下呼吸道疾病住院病例40％以上，HPIV感染占成人呼吸系统疾病的15％以上。副流感病毒与一系列疾病有关，包括常见的中耳炎、咽炎、结膜炎、咽炎、气管支气管炎和肺炎，HPIV还会造成老年人和免疫功能低下成年人的严重疾病和致命肺炎。

人副流感病毒的诊断主要包括：病毒核酸检测、病毒抗原检测、病毒培养分离以及血清学检测等方式。其中，病毒抗原检测主要是采用酶免疫法、胶体金法和免疫荧光法等方法检测呼吸道标本中HPIV抗原，是目前发展快速、实时性较强的诊断方法。但目前的病毒抗原检测缺乏高灵敏性和高特异性的抗体，而且抗体的原料价格较高，提高了检测成本。

发明内容

鉴于此，为了解决以上缺陷中的至少之一，本申请实施例提供了一种分泌抗人副流感病毒(HPIV)2型N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、及应用、及试剂盒。

第一方面，本申请实施例提供了一种分泌抗人副流感病毒(HPIV)2型N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株PIV2-1G1和/或杂交瘤细胞株PIV2-3E2，所述杂交瘤细胞株PIV2-1G1的保藏编号为CCTCC NO：C2023200，所述杂交瘤细胞株PIV2-3E2的保藏编号为CCTCC NO：C2023201。

第二方面，本申请实施例提供了一种如上第一方面所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括：由如上所述的杂交瘤细胞株PIV2-1G1分泌的单克隆抗体；和/或，由如上所述的杂交瘤细胞株PIV2-3E2分泌的单克隆抗体。

在一些可能的实施例中，所述单克隆抗体可结合标记物，所述标记物包括荧光材料、生物素、放射性同位素、金属和酶中的至少一种。

在一些可能的实施例中，本申请实施例还提供了如上第一方面所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体或如上第二方面所述的单克隆抗体在制备产品中的应用，所述产品可以用于实现检测副流感病毒2型的N蛋白、检测副流感病毒、检测待测样本中是否含有副流感病毒这几种功能中的至少一种。例如，该产品可以用于检测或诊断人副流感病毒感染。

在一些可能的实施例中，所述产品为试剂或试剂盒。

第三方面，本申请实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如上第一方面所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体或如上第二方面所述的单克隆抗体。

在一些可能的实施例中，所述试剂盒可以用于实现检测副流感病毒的N蛋白、检测副流感病毒、以及检测待测样本中是否含有副流感病毒这几种功能中的至少一种。

在一些可能的实施例中，所述试剂盒包括试剂条，所述单克隆抗体位于所述试剂条上。

在一些可能的实施例中，所述试剂条包括样品垫和检测垫，所述样品垫上包被标记的检测抗体，所述检测垫的检测线(T线)上包被捕获抗体，所述检测垫的质控线(C线)上包被抗鼠IgG抗体，所述检测抗体为如上所述的杂交瘤细胞株PIV2-3E2分泌的单克隆抗体；和/或，所述捕获抗体为如上所述的杂交瘤细胞株PIV2-1G1分泌的单克隆抗体。

在一些可能的实施例中，所述试剂条为胶体金试纸条或荧光试纸条，

在所述胶体金试纸条上，所述检测抗体上标记胶体金；在所述荧光试纸条上，所述检测抗体上标记荧光材料。

进一步，所述胶体金试纸条按照连接顺序依次包括胶体金垫，检测垫，吸水垫及位于下方的作为组装平台使用的底板，所述胶体金垫与检测垫之间有搭接，所述检测垫与吸水垫之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的PIV2-3E2抗体的玻璃纤维纸组成，所述检测垫上具有羊抗鼠IgG抗体包被的质控线(即C线)，以及PIV2-1G1抗体包被的检测线(即T线)。

进一步，所述荧光试纸条按照连接顺序依次包括荧光垫，检测垫，吸水垫及位于下方的作为组装平台使用的底板，所述荧光垫与检测垫之间有搭接，所述检测垫与吸水垫之间有搭接，所述荧光垫是由吸附有荧光微球标记的PIV2-3E2抗体的玻璃纤维纸组成，所述检测垫上具有羊抗鼠IgG抗体包被的质控线(即C线)，以及PIV2-1G1抗体包被的检测线(即T线)。

本申请实施例基于单克隆抗体技术获得了抗HPIV 2型的N蛋白的高特异性及高灵敏性的单克隆抗体，该单克隆抗体具有纯度高、效价高、制备成本低廉的特点，可用于生产各种基于抗原-抗体反应的原理的高灵敏度检测HPIV的检测试剂盒，采用这两种不同的免疫层析试剂盒进行生物样品中的HPIV的检测/诊断。两种试剂盒均可实现HPIV感染的快速检测及辅助诊断等，具有更高的灵敏性与特异性，同时兼顾了操作简单、快速、稳定以及制造成本低等优势，适用于临床标本的检查，而且由于可以进行大批量的快速检查，也适合于流行病学调查，实现HPIV的快速监测和预防。因此，本申请所述的抗HPIV 2型的N蛋白的抗体、及相应的检测试剂盒均具有广泛的应用前景和实用价值。

附图说明

为了使本申请所解决的技术问题、采用的技术手段及取得的技术效果更加清楚，下面将参照附图详细描述本申请的具体实施例。但需声明的是，下面描述的附图仅仅是本申请的示例性实施例的附图，对于本领域的技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据这些附图获得其他实施例的附图。

图1为本申请实施例2中单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2与副流感病毒2型的N蛋白的结合曲线。

具体实施方式

现在将参考附图来更加全面地描述本申请的示例性实施例，虽然各示例性实施例能够以多种具体的方式实施，但不应理解为本申请仅限于在此阐述的实施例。相反，提供这些示例性实施例是为了使本申请的内容更加完整，更加便于将申请构思全面地传达给本领域的技术人员。在符合本申请的技术构思的前提下，在某个特定的实施例中描述的结构、性能、效果或者其他特征可以以任何合适的方式结合到一个或更多其他的实施例中。

在对于具体实施例的介绍过程中，对结构、性能、效果或者其他特征的细节描述是为了使本领域的技术人员对实施例能够充分理解。但是，并不排除本领域技术人员可以在特定情况下，以不含有上述结构、性能、效果或者其他特征的技术方案来实施本申请。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。Balb/c小鼠：广东省实验动物中心，5周龄。副流感病毒2型的N蛋白由本实验室重组表达。

本申请实施例提供了两种单克隆抗体，能够特异性地识别人副流感病毒(HPIV)2型的N蛋白。

单克隆抗体是一种以特异性地识别单一抗原为特征的均质抗体类型，单克隆抗体由单一的杂交细胞(杂交瘤)产生。单克隆抗体能够特异性并以高亲和力与抗原结合，在科学研究、临床检测和工业应用等场景具有很大的应用价值。

本申请实施例提供的两种单克隆抗体分别由被命名为PIV2-1G1和PIV2-3E2的杂交瘤细胞株所分泌，并且能够特异性识别HPIV 2型的N蛋白。其中，杂交瘤细胞株PIV2-1G1和杂交瘤细胞株PIV2-3E2已于2023年7月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，杂交瘤细胞株PIV2-1G1的保藏编号为CCTCC NO：C2023200，杂交瘤细胞株PIV2-3E2的保藏编号为CCTCC NO：C2023201。将杂交瘤细胞株PIV2-1G1分泌的单克隆抗体命名为单克隆抗体PIV2-1G1，和杂交瘤细胞株PIV2-3E2分泌的单克隆抗体命名为单克隆抗体PIV2-3E2。

其中，单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2这两种抗体在与抗原的结合位点方面不存在相互竞争，且两种抗体在与抗原结合时，互相之间不会产生结合障碍。单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2可以用于HPIV感染的检测、诊断和/或测定的检定试验。

在一些实施例中，前述单克隆抗体还可以结合标记物，所述标记物可以包括荧光材料、生物素、放射性同位素、金属纳米材料和酶中的至少一种。例如，单克隆抗体PIV2-3E2上可以标记荧光材料(例如荧光微球)或胶体金等。

本申请实施例还提供了如上所述单克隆抗体在制备用于检测或诊断人副流感病毒感染的产品中的应用，所述产品可以是但不限于试剂或试剂盒。所述产品可以用于实现以下功能(a)、(b)和(c)中的至少一种：(a)检测副流感病毒2型的N蛋白；(b)检测副流感病毒、或(c)检测待测样本中是否含有副流感病毒。采用本申请实施例提供的单克隆抗体制备的产品用途较广，能够用于多种应用场景，以实现不同的检测目的。

本申请实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的单克隆抗体。具体地，可以包含以上两种单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2中的至少一种。

在一些实施例中，该检测用的试剂盒包括试剂条，所述单克隆抗体位于所述试剂条上。具体地，该试剂条至少包括样品垫和检测垫，所述样品垫上包被标记的检测抗体，所述检测垫的检测线(T线)上包被捕获抗体，所述检测垫的质控线(C线)上包被抗鼠IgG抗体，所述检测抗体为如上所述的杂交瘤细胞株PIV2-3E2分泌的单克隆抗体PIV2-3E2；和/或，所述捕获抗体为如上所述的杂交瘤细胞株PIV2-1G1分泌的单克隆抗体PIV2-1G1。

其中，以上两种单克隆抗体可以单独使用，也可以同时使用。同时使用以上两种单克隆抗体可以增加检测灵敏度，尤其能增加当待测样本中抗原含量较少时的检测灵敏度。例如，单克隆抗体PIV2-1G1能够在临床样品中有效地捕获HPIV 2型的N蛋白，即单克隆抗体PIV2-1G1可以作为捕获抗体；随后，用单克隆抗体PIV2-3E2(其结合对生色底物起作用的标记物)来检测这些被捕获且经固定的HPIV 2型N蛋白，即单克隆抗体PIV2-3E2可以作为检测抗体。采用以上两种抗体相结合，可以用于抗原含量较少的待测样本的检测，有利于提高检测灵敏度。可以理解的，也可以采用单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2这两种抗体中的一种结合其他常规抗体进行HPIV 2型N蛋白的检测。例如，单独采用单克隆抗体PIV2-1G1作为捕获抗体，则可以采用常规HPIV 2型N蛋白的检测抗体；而，单独采用单克隆抗体PIV2-3E2作为检测抗体，则可以采用常规HPIV 2型N蛋白的捕获抗体。可以理解的，选择的常规检测抗体和捕获抗体与本申请提供的相应抗体在与抗原的结合位点方面不存在相互竞争，且在与抗原结合时，互相之间不会产生结合障碍。

在一些实施例中，所述试剂条可以为胶体金试纸条或荧光试纸条，其中，在所述胶体金试纸条上，所述检测抗体上标记胶体金；在所述荧光试纸条上，所述检测抗体上标记荧光材料，具体为荧光微球。

具体地，所述胶体金试纸条按照连接顺序依次包括胶体金垫，检测垫，吸水垫及位于下方的作为组装平台使用的底板，所述胶体金垫与检测垫之间有搭接，所述检测垫与吸水垫之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的PIV2-3E2抗体的玻璃纤维纸组成，所述检测垫上具有羊抗鼠IgG抗体包被的C线，以及PIV2-1G1抗体包被的T线。

所述荧光试纸条按照连接顺序依次包括荧光垫，检测垫，吸水垫及位于下方的作为组装平台使用的底板，所述荧光垫与检测垫之间有搭接，所述检测垫与吸水垫之间有搭接，所述荧光垫是由吸附有荧光微球标记的PIV2-3E2抗体的玻璃纤维纸组成，所述检测垫上具有羊抗鼠IgG抗体包被的C线，以及PIV2-1G1抗体包被的T线。

以上两种试剂条中各个垫的连接顺序为沿样品的流动方向依次连接。

在一些实施例中，检测垫的材质具体可以是硝酸纤维素膜。

在一些实施例中，胶体金垫的材质具体可以是玻璃纤维纸。

在一些实施例中，荧光垫的材质具体可以是玻璃纤维纸。

通过研究表明，本申请实施例提供的单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2针对副流感病毒2型N蛋白的优势表位，在特异性和灵敏度上具有显著的优势。

本申请实施例基于单克隆抗体技术获得了抗HPIV 2型的N蛋白的高特异性及高灵敏性的单克隆抗体，该单克隆抗体具有纯度高、效价高、制备成本低廉的特点，可用于生产各种基于抗原-抗体反应的原理的高灵敏度检测HPIV的检测试剂盒，采用这两种不同的免疫层析试剂盒进行生物样品中的HPIV的检测/诊断。两种试剂盒均可实现HPIV感染的快速检测及辅助诊断等，具有更高的灵敏性与特异性，同时兼顾了操作简单、快速、稳定以及制造成本低等优势，适用于临床标本的检查，而且由于可以进行大批量的快速检查，也适合于流行病学调查，实现HPIV的快速监测和预防。因此，本申请所述的抗HPIV2型的N蛋白的单克隆抗体、及相应的检测试剂盒均具有广泛的应用前景和实用价值。

下面通过具体实施例对本申请实施例技术方案进行进一步的说明。

实施例1、可分泌抗副流感病毒2型的N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的获得

将副流感病毒2型的N蛋白用生理盐水稀释后与Montanide Gel 01PR佐剂混合配制为浓度100μg/mL，后小腿肌肉注射免疫2只Balb/c小鼠，第14天按同样方式加强免疫。第21天自小鼠尾部取血，分离血清后采用间接ELISA法检测血清效价，效价达到融合要求。在细胞融合前3天，用100μg蛋白进行脾脏加强免疫。

将Balb/c小鼠脾脏细胞与对数生长期的NS1骨髓瘤细胞按1:9的比例混合后，在50％的PEG1500作用下进行融合。融合后细胞于HAT半固体筛选培养基培养8-10天，挑取细胞克隆到HT培养基筛选培养2天后，采用间接ELISA法检测细胞培养上清中的抗体特异性。将阳性细胞再用HT半固体培养基克隆1次，获得能稳定分泌抗体的单克隆细胞株，扩大培养后，用含10％ DMSO的FBS冻存，细胞密度为10⁶个/mL。采用体内诱生法制备腹水，腹水经Protein A亲和层析纯化得到纯化的抗体，于0.01mol/L磷酸盐缓冲液中透析后，用Nanodrop测定蛋白浓度。获得了多株单克隆细胞株，经过对抗体效价进行鉴定，从单克隆细胞株中筛选到一株能稳定分泌单克隆抗体且单克隆抗体效价最高的细胞株，将其命名为杂交瘤细胞株PIV2-1G1和杂交瘤细胞株PIV2-3E2。

杂交瘤细胞株PIV2-1G1和杂交瘤细胞株PIV2-3E2，已于2023年7月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号分别为CCTCC NO：C2023200和CCTCC NO：C2023201。杂交瘤细胞株PIV2-1G1和杂交瘤细胞株PIV2-3E2可分泌抗副流感病毒2型的N蛋白的单克隆抗体，将杂交瘤细胞株PIV2-1G1和杂交瘤细胞株PIV2-3E2分泌的单克隆抗体分别命名为单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2。

实施例2、单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2的制备、纯化以及效价

一、单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2的制备

1、增量培养法

细胞培养基(pH 7.4)的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加胎牛血清，胎牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)。

将杂交瘤细胞株PIV2-1G1和杂交瘤细胞株PIV2-3E2分别置于细胞培养基中，37℃培养3-4天，细胞培养上清液用Protein A亲和层析纯化，得到单克隆抗体(-20℃保存)。

2、腹水制备

Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.5mL/只)，10天后腹腔注射杂交瘤细胞株PIV2-1G1(5×10⁵个细胞/只)或杂交瘤细胞株PIV2-3E2(5×10⁵个细胞/只)，8-10天后采集腹水，采用Protein A亲和层析纯化，然后转移到透析袋中在pH 7.4、0.01M的PBS缓冲液中进行透析，然后收集透析袋中的液体，得到单克隆抗体PIV2-1G1或单克隆抗体PIV2-3E2，-20℃保存。

后续步骤以及后续实施例中所用的单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2均为腹水制备得到的。

另，本申请实施例通过采用“或”的描述形式，表示该方法即可以制备单克隆抗体PIV2-1G1，也可以制备单克隆抗体PIV2-3E2，后续步骤中同理。

二、效价检测(间接ELISA法)

步骤1、取酶标板，加入包被液(100μL/孔)，4℃包被过夜。包被液：取副流感病毒2型的N蛋白，用pH 9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为5μg/mL，即为包被液。

步骤2、完成步骤1后，取所述酶标板，用PBST溶液洗涤4次，然后加入封闭液(200μL/孔)，37℃孵育2小时。封闭液：含1g/100mL BSA的PBST溶液。

步骤3、完成步骤2后，取所述酶标板，用PBST溶液洗涤4次，然后加入抗体稀释液(100μL/孔)，37℃孵育1h。抗体稀释液：取单克隆抗体PIV2-1G1或单克隆抗体PIV2-3E2，用pH 7.4、0.02M的PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，得到不同浓度的单克隆抗体PIV2-1G1或单克隆抗体PIV2-3E2的抗体稀释液。

步骤4、完成步骤3后，取所述酶标板，用PBST溶液洗涤4次，然后加入HRP标记二抗工作液，37℃孵育1h。HRP标记二抗工作液：HRP标记二抗的1:4000稀释液。HRP标记二抗：洛阳佰奥通实验材料中心，货号为C030205。

步骤5、完成步骤4后，取所述酶标板，用PBST溶液洗涤4次，然后加入底物反应液显色10分钟，然后加入2M硫酸溶液终止显色，然后用酶标仪测定490nm吸光值。

结果：单克隆抗体PIV2-1G1和单克隆抗体PIV2-3E2的效价均能达到1:10000000。

三、EC₅₀值检测(间接ELISA法)

制备抗体稀释液：取单克隆抗体PIV2-1G1或单克隆抗体PIV2-3E2，用pH 7.4、0.02M的PBS缓冲液稀释至蛋白浓度为10μg/mL，然后进行10倍梯度稀释。

替换步骤二的效价检测过程中步骤3的抗体稀释液，其他步骤同前述步骤二的效价检测过程。

结果如图1所示：单克隆抗体PIV2-1G1的EC₅₀低于2.29ng/mL；单克隆抗体PIV2-3E2的EC₅₀低于1.68ng/mL。

四、抗体亚型鉴定

采用商品化抗体Ig类/亚类/亚型鉴定试剂盒(洛阳佰奥通实验材料中心，货号C060101-L)鉴定抗体亚型，结果如表1所示。

表1抗体亚型测试结果

结果表明单克隆抗体PIV2-1G1为IgG3亚型，单克隆抗体PIV2-3E2为IgG1亚型，抗体轻链均为Kappa链。

实施例3、胶体金快速检测试纸的制备

一、胶体金标记抗体的制备

步骤1、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金

用量筒量取495ml去离子水，倒入玻璃两颈瓶中，加入5ml 1g/100mL氯金酸水溶液；在玻璃两颈瓶中放入一个磁力搅拌子，连接球形冷凝管，用可控温电磁加热搅拌器加热至沸腾；边搅动边加入1g/100mL柠檬酸三钠水溶液5ml，金黄色的氯金酸溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸5分钟，然后自然冷却，即为胶体金溶液。

步骤2、制备胶体金标记的PIV2-3E2抗体

取20体积份胶体金溶液，用0.1M碳酸钾水溶液调pH至7.5，然后加入单克隆抗体PIV2-3E2(每毫升胶体金溶液配比8微克抗体)，室温搅拌反应1小时，然后加入BSA并使其浓度为1g/100mL反应1小时；反应完毕后，置于离心机中4℃、12000rpm离心20分钟，弃除上清，剩余的红色沉淀物用1体积份含1g/100mL BSA的PBS缓冲液(pH7.4、0.02M)重悬，即为胶体金标记的PIV2-3E2抗体溶液，4℃保存。

二、胶体金试纸条的制备

步骤1、制备检测垫

取硝酸纤维素膜，采用BioDot的XYZ3050喷膜系统将C溶液喷至质控线(C线)位置，将T溶液喷至检测线(T线)位置，于相对湿度为10％以下的干燥车间抽湿4小时，得到检测垫。C溶液：采用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液，将羊抗鼠IgG抗体配制为浓度0.5mg/ml的溶液，即为C溶液。T溶液：采用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液，将单克隆抗体PIV2-1G1，配制为浓度1.5mg/ml的溶液(以蛋白浓度计)，即为T溶液。

羊抗鼠IgG抗体：洛阳佰奥通实验材料中心，货号为C020201。

步骤2、制备胶体金垫(即样品垫)

(1)取玻璃纤维纸，置于含0.1g/100mL Tween-20、1g/100mL BSA、5g/100mL蔗糖的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液中37℃浸泡半小时，然后于相对湿度为10％以下的干燥车间抽湿4小时。

(2)完成步骤(1)后，取所述玻璃纤维纸，采用BioDot的XYZ3050喷膜系统喷涂金标抗体溶液，然后于相对湿度为10％以下的干燥车间抽湿4小时，得到胶体金垫。金标抗体溶液：取步骤一制备的胶体金标记的PIV2-3E2抗体溶液，用含0.1g/100mL Tween-20、1g/100mL BSA、5g/100mL蔗糖的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液稀释，使胶体金标记的PIV2-3E2抗体的浓度为2μg/ml(以蛋白浓度计)。

步骤3、试纸条的组装

在10万级洁净和干燥的车间中进行试纸条的组装。

试纸条包括底板(又称为背衬)、胶体金垫(又称为样品垫)、检测垫和吸水垫。沿样品流动方向，胶体金垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上(相邻两个垫之间略重叠)。

沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向。试纸条的宽度大致为3.5mm。试纸条的总长度大致为6cm，其中胶体金垫的长度大致为2cm，检测垫的长度大致为2.5cm，吸水垫的长度大致为2cm。C线靠近吸水垫、远离胶体金垫。T线靠近胶体金垫、远离吸水垫。

吸水垫的材质为吸水纸。

底板仅起支撑作用，常规材质均可，例如PVC。

三、试纸条的使用方法

将60μl待检样品垂直缓慢滴入胶体金试纸条的加样端(胶体金试纸条的加样端即胶体金垫中靠近游离端的部分)，室温水平放置10-15分钟，然后进行如下结果判断：

C线显色，表示结果可信；

如果T线显色，说明待检样品中含有副流感病毒2型的N蛋白，从而判断受试者为副流感病毒2型感染者；

如果T线不显色，说明待检样品中不含有副流感病毒2型的N蛋白，从而判断受试者为非副流感病毒2型感染者。

四、试纸条的工作原理

C线上的羊抗鼠IgG抗体捕获胶体金标记的PIV2-3E2抗体，从而显色；

如果待检样品中含有副流感病毒2型的N蛋白，副流感病毒2型的N蛋白将与胶体金垫上的胶体金标记的PIV2-3E2抗体形成复合物，经过检测垫时，T线上的PIV2-1G1抗体通过与副流感病毒2型的N蛋白的特异性结合捕获复合物从而显色；

如果待检样品中不含有副流感病毒2型的N蛋白，经过检测垫时，T线上的PIV2-1G1抗体无法捕获胶体金标记的PIV2-3E2抗体，从而不显色。

实施例4、荧光快速检测试纸的制备

一、荧光微球标记抗体的制备

步骤1、制备羧基修饰的荧光微球

将苯乙烯和甲基丙烯酸甲脂按1:1的体积比混合，加入稀土络合物Eu(TTA)₃Phen并使其在体系中的浓度为1g/100mL，超声混匀，得到a液。将羧基化聚乙烯醇和碳酸氢钠溶于水，使羧基化聚乙烯醇的浓度为0.05g/100mL、碳酸氢钠的浓度为0.05g/100mL，得到b液。将1体积份a液加入10体积份b液中，然后超声15分钟，然后通氮气30分钟搅拌除氧，然后加热至80℃，然后加入过硫酸钾并使其在体系中的浓度为0.1g/100mL(实际情况中，0.01-0.1g/100mL均可)，然后反应12小时，然后依次进行过滤、离心和去离子水清洗，得到羧基修饰的荧光微球。

步骤2、活化

取10mg羧基修饰的荧光微球，用pH4.7、0.1M的MES缓冲液洗涤并离心，然后用1mlpH4.7、0.1M的MES缓冲液重悬，加入EDC(使其在体系中的浓度为5mM)和NHS(使其在体系中的浓度为10mM)，室温避光反应半小时，得到活化后羧基修饰的荧光微球。EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。NHS：N-羟基丁二酰亚胺。

步骤3、制备荧光微球标记抗体

(1)取步骤2得到的活化后羧基修饰的荧光微球，用pH8.5、50mM的硼砂缓冲液洗涤。

(2)取单克隆抗体PIV2-3E2(抗体含量为0.7mg)和完成步骤(1)的微球，在pH8.5、50mM的硼砂缓冲液中充分混匀，室温避光反应2小时(抗体和微球形成稳定的肽键共价结合从而得到偶联物)，然后加入BSA并使其在体系中的浓度为1g/100mL以封闭剩余活性羧基位点，室温避光反应0.5小时，然后用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液洗涤、重悬，得到荧光微球标记的PIV2-3E2抗体溶液(浓度均为5mg/ml，以微球浓度计)，4℃保存。

二、荧光试纸条的制备

步骤1、制备检测垫

同实施例3的中检测垫的制备步骤1。

步骤2、制备荧光垫(即样品垫)

(1)取玻璃纤维纸，置于含0.1g/100mL Tween-20、1g/100mL BSA、5g/100mL蔗糖的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液中37℃浸泡半小时，于相对湿度为10％以下的干燥车间抽湿4小时。

(2)完成步骤(1)后，取所述玻璃纤维纸，采用BioDot的XYZ3050喷膜系统喷涂荧光标记抗体溶液，于相对湿度为10％以下的干燥车间抽湿4小时，得到荧光垫。荧光标记抗体溶液：取第一步制备的荧光微球标记的PIV2-3E2抗体溶液，用含0.1g/100mL Tween-20、1g/100mL BSA、5g/100mL蔗糖的pH7.4、0.02M的PBS缓冲液稀释，使荧光微球标记的PIV2-3E2抗体的浓度为2μg/ml(以蛋白浓度计)。

步骤3、试纸条的组装

在10万级洁净和干燥的车间中进行试纸条的组装。

试纸条包括底板(又称为背衬)、荧光垫(又称为样品垫)、检测垫和吸水垫。沿样品流动方向，荧光垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上(相邻两个垫之间略重叠)。

沿样品流动方向作为试纸条的长度方向，与长度方向垂直的方向作为试纸条的宽度方向。试纸条的宽度大致为3.5mm。试纸条的总长度大致为6cm，其中荧光垫的长度大致为2cm，检测垫的长度大致为2.5cm，吸水垫的长度大致为2cm。C线靠近吸水垫、远离荧光垫。T线靠近荧光垫、远离吸水垫。

吸水垫的材质为吸水纸。

底板仅起支撑作用，常规材质均可，例如PVC。

三、试纸条的使用方法

将60μl待检样品垂直缓慢滴入荧光试纸条的加样端(荧光试纸条的加样端即荧光垫中靠近游离端的部分)，室温水平放置10-15分钟，然后进行如下结果判断：

用365nm激发光源紫外灯或者365nm激发光源的荧光检测仪检测，C线显色荧光条带，表示结果可信；

如果T线显色荧光条带，说明待检样品中含有副流感病毒2型的N蛋白，从而判断受试者为副流感病毒2型感染者；

如果T线不显色荧光条带，说明待检样品中不含有副流感病毒2型的N蛋白，从而判断受试者为非副流感病毒2型感染者。

四、试纸条的工作原理

C线上的羊抗鼠IgG抗体捕获荧光微球标记的PIV2-3E2抗体，从而显色荧光条带；

如果待检样品中含有副流感病毒2型的N蛋白，副流感病毒2型的N蛋白将与荧光垫上的荧光微球标记的PIV2-3E2抗体形成复合物，经过检测垫时，T线上的PIV2-1G1抗体通过与副流感病毒2型的N蛋白的特异性结合捕获复合物从而显色荧光条带；

如果待检样品中不含有副流感病毒2型的N蛋白，经过检测垫时，T线上的PIV2-1G1抗体无法捕获荧光微球标记的PIV2-3E2抗体，从而不显色荧光条带。

实施例5、试纸条的性能

一、检测灵敏度

待检样品：取副流感病毒2型的N蛋白，用含1g/100mL BSA的7.4、0.02MPBS缓冲液稀释，使副流感病毒2型的N蛋白的浓度分别为1000、100、10、1、0.1、0.01或0.001ng/mL。

分别采用实施例3制备的试纸条或实施例4制备的试纸条检测具有不同浓度副流感病毒2型的N蛋白的待检样品，结果如表2所示。

表2

由表2的检测结果可看出，胶体金快速检测试纸条的灵敏度为0.01ng/mL，荧光快速检测试纸条的灵敏度为0.001ng/mL。

二、精密性检测

待检样品：取副流感病毒2型的N蛋白，用含1g/100mL BSA的7.4、0.02MPBS缓冲液稀释，使副流感病毒2型的N蛋白的浓度分别为0.1、1或10ng/mL。

分别采用实施例3制备的试纸条或实施例4制备的试纸条检测具有不同浓度副流感病毒2型的N蛋白的待检样品。

每个待检样品重复检测10次，测试结果无差异。

三、交叉反应测试

与呼吸道感染相关病毒和细菌：甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Victoria、乙型Yamagata、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、偏肺病毒、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、新型冠状病毒N蛋白、副流感病毒1、3、4型N蛋白。

分别采用实施例3制备的试纸条或实施例4制备的试纸条对呼吸道感染相关病毒和细菌进行检测。结果表明，均为阴性，即对各供试微生物和蛋白均无交叉反应，提高了检测准确性。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

需要说明的是，对于前述的各方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本申请并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本申请，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和模块并不一定是本申请所必须的。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：在不脱离本申请的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本申请；且依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.分泌抗人副流感病毒(HPIV)2型N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株PIV2-1G1和/或杂交瘤细胞株PIV2-3E2，所述杂交瘤细胞株PIV2-1G1的保藏编号为CCTCC NO：C2023200，所述杂交瘤细胞株PIV2-3E2的保藏编号为CCTCC NO：C2023201。

2.由如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括：

由所述杂交瘤细胞株PIV2-1G1分泌的单克隆抗体；和/或

由所述杂交瘤细胞株PIV2-3E2分泌的单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体可结合标记物，所述标记物包括荧光材料、生物素、放射性同位素、金属纳米材料和酶中的至少一种。

4.由如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体或如权利要求2所述的单克隆抗体在制备产品中的应用，其特征在于，所述产品用于检测副流感病毒2型的N蛋白、检测副流感病毒、以及检测待测样本中是否含有副流感病毒中的至少一种。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体或如权利要求2所述的单克隆抗体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测副流感病毒2型的N蛋白、检测副流感病毒、以及检测待测样本中是否含有副流感病毒中的至少一种。

8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂条，所述单克隆抗体位于所述试剂条上。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂条包括样品垫和检测垫，所述样品垫上包被标记的检测抗体，所述检测垫的检测线上包被捕获抗体，所述检测垫的质控线上包被羊抗鼠IgG抗体，

所述检测抗体为由如权利要求1所述的杂交瘤细胞株PIV2-3E2分泌的单克隆抗体或如权利要求2所述的杂交瘤细胞株PIV2-3E2分泌的单克隆抗体；和/或

所述捕获抗体为由如权利要求1所述的杂交瘤细胞株PIV2-1G1分泌的单克隆抗体或如权利要求2所述的杂交瘤细胞株PIV2-1G1分泌的单克隆抗体。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂条为胶体金试纸条或荧光试纸条，

在所述胶体金试纸条上，所述检测抗体上标记胶体金；在所述荧光试纸条上，所述检测抗体上标记荧光材料。