KR19990047385A - 항-결핵균 항체 및 나균 항원에 대한 항혈청을 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트 - Google Patents

항-결핵균 항체 및 나균 항원에 대한 항혈청을 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 항체 및 나균(Mycobacterium leprae) 항원에 대한 항혈청을 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 결핵균의 파쇄항원에 대한 항혈청으로부터 정제한 항-결핵균 항체 및 나균의 파쇄항원을 전기 결합균 항원으로 면역된 동물과는 다른 종류의 동물에 면역시켜 얻은 항혈청을 유효성분으로 포함하는 진단키트 및 그를 이용한 결핵균 항원의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단키트는 62.5% 민감도 및 96% 특이도로서 환자의 가검물에 존재하는 결핵균을 정확하고도 간단히 단시간내에 검출할 수 있으므로, 결핵균 감염여부의 판별에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

항-결핵균 항체 및 나균 항원에 대한 항혈청을 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트
본 발명은 항-결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 항체 및 나균(Mycobacterium leprae) 항원에 대한 항혈청을 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 결핵균의 파쇄항원에 대한 항혈청으로부터 정제한 항-결핵균 항체 및 나균의 파쇄항원을 전기 결핵균 항원으로 면역된 동물과는 다른 종류의 동물에 면역시켜 얻은 항혈청을 유효성분으로 포함하는 진단키트 및 그를 이용한 결핵균 항원의 검출방법에 관한 것이다.
결핵은 인체의 호흡기를 통하여 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)이 감염되어 발병되며, 폐에 감염된 경우 폐결핵, 폐이외의 장기 예를 들면 뇌막, 흉막, 골수 등에 감염된 경우 폐외 결핵으로 크게 분류된다. 전세계 인구의 3분의 1이 결핵균에 감염되어 있으며, 매년 300만명이 결핵으로 사망하고 있다.
인간 면역 결핍 바이러스(HIV)의 감염이 증가함에 따라서, 결핵은 HIV 감염자들 사이에서 가장 지독한 병 중의 하나로 여겨지고 있다.
그동안 결핵은 주로 개발도상국가에서 주요 보건문제로 여겨졌으나, 최근에는 AIDS의 확산과 다제 약제에 내성을 가진 결핵균의 감염 확산으로 선진국에서도 결핵환자의 발생이 점차 증가하는 추세에 있다. 따라서, 세계보건기구는 물론 각 선진국의 보건문제 정책담당자들은 결핵퇴치에 보다 큰 관심을 가지게 되었다.
결핵에 대한 완전하 예방백신이 없는 상태에서 결핵퇴치 전략의 하나는 결핵을 조기에 신속히 진단한 후 화학요법치료를 시행하므로써 결핵에 의한 질병을 치유하며, 결핵균의 전파를 최소화하는 것이다.
결핵의 진단은 임상적으로 결핵이 의심되는 환자의 가검물에서 결핵균의 존재를 현미경이나 배양검사를 통하여 증명하므로써 이루어진다. 그러나, 현미경 검사는 신속히 결과를 얻을 수 있으나 민감도가 낮으며, 배양검사는 민감도는 높으나 5~8주 가량 시일이 걸려야 그 결과를 확인할 수 있다는 단점이 있었다.
이러한 단점을 해결하기 위하여, 객담을 비롯한 환자의 가검물에서 결핵균 또는 결핵균의 구성성분(예: 핵산, 항원 등)을 검출하므로써, 결핵의 진단에 응용하려는 많은 연구가 진행되고 있다. 즉, 항원-항체 검출에 기초한 면역진단법과 PCR에 의한 진단법이 개발되고 있다. 그 중에서도, 항원-항체 검출법은 진단의 특이도(specificity)나 민감도(sensitivity)가 우수할 뿐만 아니라, 특수한 장비나 시설이 필요치 않아 경제적이므로, 임상 실험실에서 널리 사용될 수 있을 것이다.
이에, EIA(enzyme immunoassay)(참조: Chandramukhi A. et al., J. Med. Microbiol., 20:239-479(1985); Kadival G.V. et al., J. Clin. Microbiol., 23:901-904(1986); Sada E.G. et al., Lancet ii:651-652(1983); Yanez M.A. et al., J. Clin. Microbiol., 23:822-825(1986)), RIA(radio immunoassay)(참조: Straus E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:3214-3217(1981)), 웨스턴 블롯팅(참조: Wadee A.A. et al., J. Clin. Microbiol., 28:2786-2791(1990)), 라텍스 응집 테스트(참조: Krambovitis E. et al., Lancet, 2:1229-1231(1984))를 이용하여, 객담, 척수액, 혈청, 흉강액과 복강액에서 결핵균을 60~90%의 민감도 및 80~95%의 특이도로서 검출한 보고가 있다.
그러나, 이들 방법들은 단지 결핵균을 실험실 수준에서 검출할 수 있는 방법의 예로서, 이러한 방법들을 이용한 진단키트는 아직까지 개발되지 않고 있는 실정이다. 따라서, 환자의 가검물에서 결핵균을 정확하고도 간단히 단시간내에 검출할 수 있는 진단키트의 개발이 당업계에서 절실히 요구되었다.
이러한 기술 배경하에서, 본 발명자들은 환자의 가검물에 존재하는 결핵균을 보다 우수한 민감도와 특이도이므로 검출할 수 있는 진단키트를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, sELISA(sandwich enzyme linked immunosorbent assay)를 이용하면서, 결핵균 파쇄항원에 대한 항혈청으로부터 정제한 항-결핵균 항체 및 나균 파쇄항원을 전기 결합균 항원으로 면역된 동물과는 다른 종류의 동물에 면역시켜 얻은 항혈청을 유효성분으로 함유하는 진단키트가 62.5%의 민감도, 96%의 특이도로서 재현성 있게 결핵균 항원을 간단히 단시간내에 검출함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 정제 항-결핵균 항체 및 나균에 대한 항혈청을 유효성분으로 포함하는 전술한 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 진단키트를 이용하여 결핵균 항원의 검출방법을 제공하는 것이다.
제1도는 정제한 항-결핵균 항체를 이용하여 여러가지 농도의 표준항원을 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
제2도는 결핵균 항원을 검출하기 위한 객담의 전처리 과정중 비트비팅(bead-beading) 과정을 거치기 전과 후의 항원검출 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
항원-항체 검출에 기반한 면역진단법 중에서 검사시약의 취급이 안전하고, 검사가 간편하면서도 비교적 단시간내에 수행되는 방법은 EIA인데, 그 중에서도 sELISA를 이용하여, 본 발명자들은 환자의 가검물에 존재하는 결핵균의 검출을 위한 하기와 같은 진단키트 및 그를 이용한 결핵균의 검출방법을 개발하였다.
본 발명은 진단키트는 (ⅰ) 결핵균의 파쇄항원에 대한 동물의 항혈청으로부터 정제한 항-결핵균 항체 및 전기 동물의 정상 혈청이 각기 서로 다른 웰에 피복된 폴리스틸렌 플레이트; (ⅱ) 환자 가검물의 침전물을 분쇄하기 위한 직경 0.1mm 내지 3mm의 비드(bead)가 포함된 완충용액; (ⅲ) 결핵균 표준항원을 포함한 양성 대조구; (ⅳ) 나균의 파쇄항원을 전기 결핵균 항원으로 면역된 동물과는 다른 종류의 동물에 면역시켜 얻은 항혈청; (ⅴ) 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 효소를 2차 항체에 표지한 접합체(conjugate); (ⅵ) 전기 효소와 발색반응할 기질함유 용액; 및, (ⅶ) 효소반응 정지용액을 포함한다.
상기에서, 항-결핵균 항체는 결핵균 파쇄항원을 산양에 면역시켜 얻은 항혈청으로부터 정제되고, 나균에 대한 항혈청은 나균 파쇄항원을 토끼에 면역시켜 얻은 항혈청인 것이 바람직하고; 항-결핵균 항체는 폴리스틸렌 플레이트 웰당 5 내지 10μg/ml로 피복시키는 것이 바람직하며; 결핵균 표준항원은 동결건조의 결핵 균체에 동량의 증류수를 첨가하여 초음파 분쇄하고, 2000 x g에서 원심분리하여 상층액을 모으고, 이 상층액을 다시 27,000 x g에서 원심분리하여 미세한 균체를 침전시킨 다음, 상층액만을 수득하고, 다시 초원심분리기로 100,000 x g에서 원심분리하여 수득한 상층액이 바람직하고; 효소는 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)가 바람직하며; 기질함유 용액은 기질은 OPD(o-phenylenediamine), 구연산 완충용액(pH 5.0) 및 과산화수소수로 구성된 용액이 바람직하다.
이와 같은 진단키트를 이용한 결핵균 항원의 검출방법은 다음과 같다: 항-결핵균 항체 및 정상 혈청과, 환자 가검물의 침전물을 비드비팅한 파쇄액 및 결핵균 양성 대조구(표준항원)와 각각 반응시키고, 나균에 대한 항혈청을 가하여 반응시킨 다음, 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 효소가 표지된 2차 항체 접합체를 가하고, 전기 효소의 기질함유 용액을 첨가하여 발색반응시키고, 490nm에서의 흡광도를 측정하는 단계를 포함한다.
상기와 같은 본 발명의 진단키트를 이용한 결핵균 항원의 검출방법은 62.5%ㄹ의 민감도 및 96%의 특이도를 제공하므로, 결핵균 감염여부의 판별에 효과적으로 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
결핵균 항원에 대한 산양의 항혈청으로부터 항-결핵균 항체의 정제
우선, 결핵균 항원에 대한 항혈청을 제조하기 위하여, 결핵균(M. tuberculosis H37RV)을 Sauton 배지의 표면에 띄우고 5% CO2배양기에서 4~5주일간 배양한 후, 여과용 체로 균체를 모아 고압 멸균시켜 동결 건조하였다. 동결건조된 균체를 10mg/ml 농도로 PBS(phosphate buffered solution, pH 7.2)에 부유시키고, 초음파 분쇄기(ultrasonic cell disruptor, 3mm tip)로 3분씩 5회에 걸쳐 결핵균을 분쇄한 다음, 이를 후술하는 항체 제조용 결핵균체 항원으로 사용하였다.
상기에서 수득한 결핵균체 항원을 어쥬번트(Freund's incomplete adjuvant, Sigma Chemical Co., USA)와 동량 혼합한 다음, 산양의 근육에 2ml씩(실제 항원량은 약 10mg) 한달 간격으로 4~6회 주사하여 면역시켰다. 결핵균 항원에 대한 항체가 높아진 것을 확인한 후에 전혈 채혈하여 혈청을 분리한 다음, -70℃에 보관하였다.
한편, 상기에서 동결건조된 결핵 균체에 동량의 증류수를 첨가하고 초음파 분쇄기로 3분씩 20회에 걸쳐 결핵균을 분쇄한다음, 2000 x g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 모으고, 이 상층액을 27,000 x g에서 3분간 원심분리하여 미세한 균체를 침전시켰다. 상층액만을 수득하고 다시 초원심분리기로 100,000 x g에서 6시간 원신분리하여 상층액을 모으고 동결건조시킨 다음, 이를 "수용성 결핵균항원(M. tuberculosis soluble antigen: MTSA)"이라 하고, 후술하는 항체의 정제와 결핵균 표준항원으로 사용하였다.
상기에서 수득한 MTSA를 CNBr로 활성화된 Sepharose 4B(Sigma Chemical Co., USA)에 결합시켜, 그 MTSA-레진 5ml를 컬럼에 충진시키고, 0.1mM 트리스 완충용액(Tris buffer, Ph 8.6)으로 결합되지 않은 MTSA를 완전히 세척해 내었다.
그런 다음, 산양에서 얻은상기 항 혈청 10ml을 트리스완충용액과 동량씩 혼합한 후 컬럼에 주입하고, 트리스완충용액으로 결합되지 않은 혈청성분을 세척해 낸 다음, 소디움 티오설페이트 완충용액으로 MTSA에 결합된 항체를 탈리시키고, 그 용출액을 즉시 트리스완충용액으로 중성의 pH로 조정하는, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatorgraphy)로 항-결핵균 항체를 정제하였다.
[실시예 2]
나균 항원에 대한 토끼의 항혈청의 제조
결핵균 항원을 검출하기 위해서는 산양에서 얻은 MTSA에 대한 항체이외에, 산양이 아닌 다른 종류의 동물에서 얻은, MTSA외의 항산균 항원에 대한 항혈청을 이용해야 하는 바, 본 발명자들은 예비실험에서 여러 종류의 항산균에 대한 항체를 이용하여 비교 검토한 결과, 나균(Mycobacterium leprae)에 대한 토끼 항혈청이 결핵균 항원을 검출하는데 가장 효과적임을 발견하였다. 이에, 본 발명에서는 토끼에 나균 항원을 면역시켜 얻은 항체를 제2의 항체로 이용하였다.
나균 항원에 대한 토끼의 항혈청을 제조하기 위하여, 나균(M. leprae)을 2mg/ml의 농도로 인산완충용액에 부유시킨 다음, 초음파분쇄기로 3분씩 5회 파쇄시켰다. 이렇게 얻은 나균 파쇄항원 0.5ml과 어쥬번트(Freund's incomplets adjuvant)를 동량 혼합한 다음, 토끼의 근육에 한달 가격으로 6회 주사하여 면역시켰다. 나균 항원에 대한 높은 항체가가 형성된 것을 확인하고, 전혈 채혈하여 혈청을 분리하였다.
[실시예 3]
sELISA에 의한 결핵균 항원의 검출
결핵균 항원을 검출하기 위하여, ① ELISA 플레이트의 웰에 산양의 항혈청으로부터 정제한 항-결핵균 항체를 피복하는 과정, ② 가검물을 전처리하여 웰에 피복된 항체와 반응시키는 과정, 및 ③ 가검물에 존재하는 결핵균 항원이 웰의 항체와 결합되어 있는 것을 검출하는 과정 등의 3단계 과정에 의한 sELISA법을 이용하였다.
1) 항-결핵균 항체의 피복 과정
바닥이 평편한 96웰 또는 8웰 12열의 ELISA 플레이트(Costar, USA)에 MTSA 항원을 이용하여 정제한 항-결핵균 항체를 주입하고 덮개로 덮은 후, 4℃에서 16~18시간 피복시켰다. 이때, 정제한 항체는 5ug/ml 농도로 0.5M 탄산염 완충용액(pH 9.6)에 희석한 후, 짝수번호열의 웰에 100μl씩 주입하였다. 대조구로는 결핵균 항원으로 면역되지 않은 산양의 혈청(정상 산양의 혈청)을 탄산염 완충용액에 500배 희석하여, 홀수번호열의 웰에 100μl씩 분주하였다.
그런 다음, 플레이트의 웰을 세척용 완충용액(0.05% Tween 20을 포함한 PBS, pH 7.4)으로 4회 세척하고, 비특이적 단백질 결합부위를 차단하기 위하여 블로킹용액(0.05% Tween 20 및 0.1% ESA을 포함한 PBS, pH 7.4)을 300μl씩 분주한 다음, 37℃에서 2시간 방치하였다. 이어, 블로킹용액을 제거하고 진공포장하여 4℃에 보관하였다.
2) 가검물을 전처리하여 웰에 피복된 항체와 반응시키는 과정
객담 1ml당 10% NaOH를 100μl 씩 넣어 잘 혼입하고 균질화시킨 다음, 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 버리고 침전물을 90℃ 이상에서 10분간 열처리하였다. 이어, 침전물을 PBS에 부유시키고, 1.7ml 크기의 원추형 원심분리관에 옮기고 1회 세척한 다음, 침전물에 유리 비드(glass bead, 직경 0.1mm) 또는 지르코늄 비드(직경 0.1mm) 100μl와 PBS 900μl를 가하고, Mini-bead beater(Bioprospects, USA)로 1분간 침전물을 파쇄시켜, 실온에서 10분간 이상 정치시켰다.
상기 1)에서 준비한 항-결핵균 항체가 피복된 플레이트를 꺼내어 각 웰에 넣을 시료 번호를 배치하고, 객담 1개에 두개의 웰 즉, 결핵균 항원에 대한 항체가 피복된 웰과 정상 산양혈청이 피복된 웰을 배정하여, 1번부터 10번 스트립까지 40개의 객담을 100μl씩 주입하였다. 그리고, 11번 및 12번 스트립의 8웰 중 2개에는 객담, 4개에는 표준항원(MTSA 항원)을 PBS에 희석하여 10ng/ml, 5ng/ml, 2ng/ml, 1ng/ml의 최종농도가 되도록 100μl씩 넣고, 나머지 2개의 웰에는 PBS를 넣었다.
그런 다음, 플레이트를 37℃에서 1시간 30분간 정치한 후 각 웰을 세척용 완충용액으로 4회 씻어내고, 나균에 대한 토끼 항혈청을 1:2000으로 희석시켜 각 웰에 100μl씩 주입한 다음, 플레이트를 37℃에서 1시간 정치한 후 각 웰을 세척용 완충용액으로 4회 씻어내었다.
3) 항체-항원 결합의 검출 과정
고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)포 표지된 항-토끼 IgG(HRP-anti-rabbit IgG)를 1:2000으로 희석시켜, 상기의 플레이트 각 웰에 100μl씩 넣고, 플레이트를37℃에서 1시간 정치한 후 각 웰을 세척용 완충용액으로 4회 씻어내었다. 그런 다음, 기질인 OPD(o-phenylenediamine, Sigma Chemical Co., USA)를 기질용 완충용액(구연산 완충용액, pH 5.0)에 0.4mg/ml 농도로 용해시키고, 30% 과산화수소수를 0.4μl/ml 되게 첨가하여 기질용액을 제조하며, 그 기질용액 100μl씩을 웰에 넣고, 빛을 차단하여 실온에서 15분간 반응시킨 후, 2.5N H2SO4용액을 100μl 첨가하여 반응을 정지시켰다. 기질용액의 발색 반응정도는 490nm 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.
각 시료마다 결핵균 항원에 대한 항체가 피복된 웰의 흡광도에서 대조구의 정상 산양의 혈청이 피복된 웰의 흡광도와 PBS만을 넣은 웰의 흡광도를 감하고 남은 나머지를 결핵균 항원에 의한 흡광도로 추정하였다. 또한, 동일한 방법으로 표준항원(MTSA)의 흡광도를 계산한 후, MTSA 2ng/ml과 1ng/ml의 흡광도 평균값을 해당 플레이트의 양성기준 흡광도로 정하였다.
각 시료의 최종 흡광도와 양성기준 흡광도를 비교하여 양성기준 흡광도와 같거나 큰 경우는 항원 양성, 그리고 적은 경우는 항원 음성으로 판정하였다.
상술한 sELISA에 의해 결핵균 항원을 검출하여 양성, 음성으로 판정하는 예는 하기 표 1에 나타내었다. 아울러, 정제한 항-결핵균 항체를 이용하여 여러가지 농도의 표준항원을 검출한 결과는 제1도에 나타내었다. 제1도에서 보듯이, 표준항원의 농도에 비례하여 흡광도 값이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 결핵균 항원을 검출하기 위한 객담의 전처리 과정중 비드-비팅(bead-beating) 과정을 거치기 전과 후의 항원검출 결과는제2도에 나타내었다. 제2도에서 보듯이, 비드-비팅의 전처리 과정을 거친 객담의 흡광도가 월등히 높음을 알 수 있었다.
[표 1]
객담에 존재하는 결핵균 항원의 검출예
-#1 및 #3 스트립은 정상 산양의 혈청이 피복된 웰의 흡광도이며,
#2 및 #4 스트립은 결핵균 항원에 대한 항체가 피복된 웰의 흡광도이다.
-*는 표준항원(MTSA)의 ml당 첨가량이다.
-최종 O. D.는 각 혈청의 흡광도에서 PBS만 첨가된 웰의 흡광도(평균값 0.17)를 감하고 남은것을 나타낸다.
-결핵균 표준항원(MTSA) 2ng/ml과 1ng/ml가 첨가된 웰의 흡광도 평균값(0.16)을 기준으로 양성, 음성을 판정한다.
[실시예 4]
sELISA에 의한 결핵균 항원 검출법의 효율성
본 발명의 항원 검출 진단키트가 결핵의 실험실 진단에서 얼마나 효용성이 있는 지를 알아보기위하여, 결핵 증상을 나타내는 62명의 환자와 건강한 37명 대조구 사람들의 객담을 대상으로 실시예 3과 같이 실험하고, 그 결과를 결핵균의 배양결과와 비교하였다(참조: 표 2).
[표 2]
객담에 존재하는 결핵균 항원의 검출
*: 결핵균 배양결과 1+는 콜로니수가 100개 미만인 것을 나타내고;
2+는콜로니수가 100개 이상 내지 200개 이하인 것을 나타내며;
3+는 콜로니수가 200개 초과인 것을 나타낸다.
상기 표 2에서 보듯이, 24개의 배양균 양성 표본 중의 15개가 항원 양성으로 나타났는 바, 이는 62.5%의 민감도를 의미함을 알 수 있었다. 또한, 특이도는 건강한 대조구에서는 100%이었고, 결핵증상을 가진 배양균 음성 환자들에 대해서는 92.1%로서, 전체 96%의 특이도를 나타냄을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 진단키트는62.5% 민감도 및 96% 특이도로서 환자의 가검물에 존재하는 결핵균을 정확하고도 간단히 단시간내에 검출할 수 있으므로, 결핵균 감염여부의 판별에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 파쇄항원에 대한 항혈청으로부터 정제한 항-결핵균 항체, 및 나균(Mycobacterium leprae)의 파쇄항원을 전기 결합균 항원으로 면역된 동물과는 다른 종류의 동물에 면역시켜 얻은 항혈청을 유효성분으로 포함하는, 결핵균 항원 검출용 진단키트.
  2. (ⅰ) 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 파쇄항언에 대한 동물의 항혈청으로부터 정제한 항-결핵균 항체 및 전기 동물의 정상혈청이 각기 서로 다른 웰에 피복된 폴리스틸렌 플레이트;
    (ⅱ) 환자 가검물의 침전물을 분쇄하기 위한 직경 0.1mm 내지 3mm의 비드(bead)가 포함된 완충용액;
    (ⅲ) 결핵균 표준항원을 포함한 양성 대조구;
    (ⅳ) 나균(Mycobacterium leprae)의 파쇄항원을 전기 결핵균 항원으로 면역된 동물과는 다른 종류의 동물에 면역시켜 얻은 항혈청;
    (ⅴ) 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 효소를 2차 항체에 표지한 접합체(conjugate); 및.
    (ⅵ) 전기 효소와 발색반응할 기질함유 용액; 및,
    (ⅶ) 효소반응 정지용액을 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
  3. 제2항에 있어서,
    항-결핵균 항체는 결핵균 파쇄항원을 산양에 면역시켜 얻은 항혈청으로부터 정제되었으며, 나균에 대한 항혈청은 나균 파쇄항원을 토끼에 면역시켜 얻은 항혈청인 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
  4. 제2항에 있어서,
    항-결핵균 항체는 폴리스틸렌 플레이트 웰당 5 내지 10μg/ml로 피복시키는 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
  5. 제2항에 있어서,
    환자의 가검물은 객담인 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
  6. 제2항에 있어서,
    결핵균 표준항원 동결건조의 결핵 균체에 동량의 증류수를 첨가하여 초음파 분쇄하고, 2000 x g에서 원심분리하여 상층액을 모으고, 이 상층액을 다시 27,000 x g에서 원심분리하여 미세한 균체를침전시킨 다음, 상층액만을 수득하고 다시 초원심분리기로 100,000 x g에서 원심분리하여 수득한 상층액인 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
  7. 제2항에 있어서,
    효소는 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)인 것을 특징으로 하는
    결핵균 항원 검출용 진단키트.
  8. 제2항에 있어서,
    기질함유 용액은 기질인 OPD(o-phenylenediamine), 구연산 완충용액(pH 5.0) 및 과산화수소수로 구성되는 것을 특징으로 하는
    결핵균 항원 검출용 진단키트.
  9. 제2항의 진단키트를 사용하여, 항-결핵균항체 및 정상 혈청과, 환자 가검물의 침전물을 비드비팅(bead-beating)한 파쇄액 및 결핵균 양성 대조구와 각각 반응시키고, 나균(Mycobacterium leprae)에 대한 항혈청을 가하여 반응시킨 다음, 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 효과가 표지된2차 항체 접합체(conjugate)를 가하고, 전기 효소의 기질함유 용액을 첨가하여 발색반응시키는 단계를 포함하는, 결핵균 항원의 검출방법.
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