CN117405887A - 腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用。本发明提供了腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用。本发明无需逐个检测致病细菌的类型，通过本发明的标志物可以高效、经济、便捷地检测腹泻样本中有无致病细菌；同时检测结果与目前临床使用的显微镜检和细菌培养鉴定方法相比，符合率极高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用。
背景技术
腹泻是多种病原、多种因素引起的以大便次数增多和大便性状改变为特点的一组疾病，是儿童患病和死亡的主要原因，也是营养不良的重要原因。腹泻通常是胃肠道感染的一种症状，可由多种细菌、病毒和寄生虫引起，感染造成的腹泻是发展中国家普遍存在的问题，发病率一直位居肠道传染病的首位，主要通过污染的食物或饮用水传播，或由于卫生条件恶劣在人与人之间传播。
引起感染性腹泻的病原体包括细菌、病毒、寄生虫和真菌等。根据病理生理学将感染性腹泻分为分泌性腹泻、渗出性腹泻和渗透性腹泻。其中细菌型腹泻根据细菌毒素以及细菌对肠道黏膜的侵袭程度，将发病机制进一步分为肠毒素性、侵袭性和黏附性3种。各种细菌产生的肠毒素类作为分泌性腹泻的一种，其分泌的细菌毒素会与肠道上皮细胞刷状缘上的受体结合，激活肠上皮细胞内的腺苷酸环化酸酶系统，使细胞内第二信使cAMP、cGMP及钙离子增加，聚积在小肠粘膜上皮细胞内，致使隐窝细胞对水、氯和碳酸氢盐分泌增强，同时又抑制绒毛上皮细胞对钠及氯的吸收，甚至可通过神经反射增加小肠细胞释放五羟色胺而增加肠液分泌，引起腹泻。
针对细菌感染性腹泻，目前临床主要采用显微镜检配合病原微生物检测及药敏试验，对病原微生物进行培养分离与鉴定，或是基于核酸分子生物学鉴定技术，如16S rRNA序列分析技术鉴定病原微生物类型。显微镜检使用生理盐水进行湿片镜下检测，通过观察样本中的中性粒细胞、红细胞及其数量、酵母样真菌、真菌丝和假菌丝、细菌动力学特征等进行常见的致病细菌的观察鉴定。病原微生物培养分离及鉴定需要结合病人的临床特征和镜检结果筛选合适的培养基以明确细菌类型。16S rRNA序列分析技术是近些年常用于微生物实验室的分子生物学鉴定方法，通过对16S rRNA基因特定区域进行扩增和测序，可以研究样品中微生物群落组成以及相对丰度。
目前临床可引起腹泻的病原体众多，但患者的临床表现却有许多相似之处，不利于细菌性腹泻、病毒性腹泻及非感染性腹泻的早期诊断及鉴别。现有的细菌检测技术中，病原微生物培养及鉴定存在操作步骤繁琐，检测费时又滞后的缺点，不利于早期诊断。16SrRNA序列分析技术需要用到昂贵的试剂和仪器，对实验人员的专业性和操作性要求极高，不适用于基层医院对临床腹泻致病细菌的快速鉴定。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用。本发明无需逐个检测致病细菌的类型，通过本发明的标志物可以高效、经济、便捷地检测腹泻样本中有无致病细菌；同时检测结果与目前临床使用的显微镜检和细菌培养鉴定方法相比，符合率极高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述病原体包括：细菌。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述产品的检测样品包括：粪便和/或小肠黏膜。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述产品的检测样品包括：粪便。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述诊断和/或鉴别的方法包括：同位素标记法、色谱法、免疫法和/或化学显色法中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述诊断和/或鉴别的方法包括：免疫法。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述免疫法包括：胶体金免疫层吸法和/或酶联免疫吸附测定法。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述诊断和/或鉴别包括如下步骤：取待测样品与缓冲液混合后，离心，取上清，检测，获得检测结果。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述检测包括检测所述腺苷酸环化酶的活性。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述待测样品与抗原和/或抗体特异性结合后，显色，所述腺苷酸环化酶为阳性，所述待测样品的病原体为细菌；
所述待测样品与抗原和/或抗体特异性结合后，不显色，所述腺苷酸环化酶为阴性，所述待测样品的病原体不为细菌。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述待测样品的环磷酸腺苷的生成量≤20pmol/mg/min时，所述腺苷酸环化酶为阴性，所述待测样品的病原体不为细菌；
所述待测样品的环磷酸腺苷的生成量＞20pmol/mg/min时，所述腺苷酸环化酶为阳性，所述待测样品的病原体为细菌。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述待测样品与所述缓冲液的质量体积比为：1:9；所述缓冲液包括：0.01M pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述离心的转速为5000×g，时间为10min。
本发明提供了腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用。
本发明的有益效果包括：
(1)、使用本发明提供的标志物，可高效、经济、便捷地检测腹泻样本中有无致病细菌。
(2)、本发明提供的标志物可以检测腹泻样本中是否存在致病细菌，不限于单种细菌的检测，检测结果与目前临床使用的显微镜检和细菌培养鉴定方法相比，符合率极高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1提供的试纸条的结构示意图；
图2示实施例1提供的检测卡壳体的结构示意图；
其中：1示底板；2示样品垫；3示结合垫；4示检测膜；5示吸水垫；6示检测区；7示质控区；8示加样区；9示观察区。
具体实施方式
本发明公开了腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明利用一种检测腺苷酸环化酶的方法检测腹泻样本，即可通过酶活的高低检测腹泻样本中是否存在致病细菌，腺苷酸环化酶活性高的样本被认为是存在致病细菌的腹泻样本。利用本方法，与显微镜检和细菌培养鉴定方法相比，符合率极高。
本发明所述的腹泻样本，包括粪便样本和小肠黏膜样本，优选为粪便样本。
本发明所述的检测腺苷酸环化酶活性的方法，包括同位素标记法、色谱法、免疫法、化学显色法中的任意一种方法但不限于上述检测方法，优选为免疫法，更进一步的，优选为免疫法中的胶体金免疫层析法。
进一步的，本发明中所述的检测腺苷酸环化酶活性的检测方法中，以胶体金免疫层析法为例，其具体原理如下：
将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果，使用十分方便。
本发明实施例1和实施例2中，cAMP标准品(阿拉丁，K1808062)；HRP-cAMP偶联物(公司内部)
本发明实施例1和实施例2中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1胶体金免疫层析法检测腹泻粪便样本的腺苷酸环化酶
取新鲜腹泻粪便样本，加入预冷(4℃)的0.01M，pH＝7.4磷酸盐缓冲液(PBS)，得到的混合液为：粪便质量(g):PBS体积(mL)＝1:9，在4℃条件下5000×g离心10分钟，得到粪便上清。
使用腺苷酸环化酶胶体金检测卡，腺苷酸环化酶胶体金检测卡包括腺苷酸环化酶试纸条和检测卡壳体。腺苷酸环化酶试纸条包括底板1(70mm×8mm)，底板1依次设置有样品垫2(20mm×8mm)、结合垫3(10mm×8mm)、检测膜4(20mm×8mm)、吸水纸5(20mm×8mm)。结合垫3上设置有胶体金标记的腺苷酸环化酶单克隆抗体1(郑州伊美诺生物技术有限公司，腺苷酸环化酶单克隆抗体2H11，2022110301)；检测膜4上设置有检测区6、质控区7；检测区6设置有腺苷酸环化酶单克隆抗体2(郑州伊美诺生物技术有限公司，腺苷酸环化酶单克隆抗体8E9，2022110301)，质控区7设置有抗腺苷酸环化酶单克隆抗体1(郑州伊美诺生物技术有限公司，抗腺苷酸环化酶单克隆抗体2H11，2022111501)。检测卡壳体上设有加样区8(8mm×5mm)和观察区9(18mm×5mm)。具体如图1和图2所示。
将检测卡平放，取100μL粪便上清滴入加样区，15min后观察结果。如果检测区、质控区均出现红色条带，则判定腺苷酸环化酶阳性，腹泻粪便标本中存在致病细菌；如果质控区出现红色条带，检测区处不显示颜色，则判定腺苷酸环化酶阴性，腹泻粪便标本中不存在致病细菌；如果质控区不显示颜色，则判定结果无效，需更换检测卡重新检测。
腹泻粪便样本临床试验对比：从医疗机构获得腹泻粪便标本共560份。利用一种腺苷酸环化酶胶体金检测卡检测腹泻粪便样本的腺苷酸环化酶活性，对比临床腹泻粪便样本的显微镜检结果、细菌培养及鉴定结果，并进行结果比较，计算本发明提供的腺苷酸环化酶检测卡的灵敏度、特异性和符合率。临床腹泻粪便样本的显微镜检、细菌培养及鉴定操作按照临床试验标准操作规程进行。检测结果如表1所示。
表1腺苷酸环化酶检测卡的灵敏度、特异性和符合率检测结果
实施例2ELISA法检测腹泻粪便样本的腺苷酸环化酶
取新鲜腹泻粪便样本，加入预冷(4℃)的0.01M，pH＝7.4磷酸盐缓冲液(PBS)，得到的混合液为：粪便质量(g):PBS体积(ml)＝1:9，在4℃条件下5000×g离心10分钟，得到粪便上清。
使用ELISA法检测腹泻粪便样本地腺苷酸环化酶活性，具体操作如下。取粪便上清/cAMP标准品，按照每孔75μL添加到抗cAMP的96孔板中，在37℃孵育10min；向每孔加入25μL的HRP-cAMP偶联物溶液，37℃孵育2h后，吸出板内容物，使用0.1M，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液洗涤4次，每次200μL。向每孔加入100μL荧光红染料，37℃避光孵育20min，使用荧光酶标仪检测Ex/Em＝540/590nm时的荧光增加，并计算得到样本腺苷酸环化酶的活性。
腹泻粪便样本临床实验对比：从医疗机构获得腹泻粪便标本共560份。ELISA法检测腹泻粪便样本地腺苷酸环化酶活性，以环腺苷酸(cAMP)的生成量20pmol/mg/min作为阴阳性界值，cAMP≤20pmol/mg/min判定腺苷酸环化酶阴性，cAMP＞20pmol/mg/min判定腺苷酸环化酶阳性。与腹泻粪便样本的显微镜检、细菌培养及鉴定结果进行对比，结果如表2所示。
表2ELISA法的灵敏度、特异性和符合率检测结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病原体包括：细菌。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品的检测样品包括：粪便和/或小肠黏膜。
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断和/或鉴别的方法包括：同位素标记法、色谱法、免疫法和/或化学显色法中的一种或多种。
5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断和/或鉴别包括如下步骤：取待测样品与缓冲液混合后，离心，取上清，检测，获得检测结果。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述待测样品与抗原和/或抗体特异性结合后，显色，所述腺苷酸环化酶为阳性，所述待测样品的病原体为细菌；
所述待测样品与抗原和/或抗体特异性结合后，不显色，所述腺苷酸环化酶为阴性，所述待测样品的病原体不为细菌。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述待测样品的环磷酸腺苷的生成量≤20pmol/mg/min时，所述腺苷酸环化酶为阴性，所述待测样品的病原体不为细菌；
所述待测样品的环磷酸腺苷的生成量＞20pmol/mg/min时，所述腺苷酸环化酶为阳性，所述待测样品的病原体为细菌。
8.如权利要求5至7任一项所述的应用，其特征在于，所述待测样品与所述缓冲液的质量体积比为：1:9；所述缓冲液包括：0.01M pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求5至8任一项所述的应用，其特征在于，所述离心的转速为5000×g，时间为10min。
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