JPH01247094A - Ｂｃｇ菌由来のｍｐｂ６４蛋白及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はＢＣＧ菌由来のＭＰ　Ｂ６４蛋白（ＢＣＧ菌の
６４番目のミコバクチリアル　プロティンのことをＭＰ
Ｂ６４蛋白と略する）、ＢＣＧ菌由来のＭＰＢ６４蛋白
をコードする遺伝子、及びＢＣＧ菌由来のＭＰ　Ｂ　６
４蛋白をコードする遺伝子を含有するグラスミドにより
形質転換された形質転換体を培養して、目的とするＢＣ
Ｇ菌由来のＭＰＧ６４蛋白を生産する製造法に関する。

〈従来技術〉 臨床医が胸部写真と病状から結核症と疑われる場合でも
、一般に患者の痰から検鏡で結核菌を見出すことが困難
な場合が多い。このような場合には、菌の培養を行なっ
て菌を検出するが培養に約３週間かかる。また、肺結核
と肺ガンの症状の類似性（胸部写真）から、肺ガンを肺
結核と誤診して抗結核薬を試験投与するうちに肺ガンが
進行して手遅れになるケースが増えている。更Ｋ、最近
結核症と良く似た症状を示す非定型抗酸菌症（以下ＡＭ
症とする）の患者も増加している。このＡＭ症も肺ガン
と混同される危険性が有る。

また現在、生化学的手法による抗酸菌同定用のキットが
市販されているが、■菌の培養に時間がかかる　■操作
性が悪い　■発色による判足が困難な場合があることな
どの理由で、より迅速で確実な同定法の開発が望まれて
いる。

このような情況下において、本発明者等は結核菌由来の
α抗原はＢＣＧ菌や抗酸菌（Ｍｙｃｏｂａｃ　ｔｅｒｉ
ｕｍｉｎｔｒａｅｅｌｌｕｌａｒｅ、　Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｌｕｍ　ｋａｎｓａａｌｉ）等に広く分布する交
差反応物質（Ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｎｇｍａｔｅｒｌ
ｍｌ　）であるという知見（結核、６１，６６３゜（１
９８６））に基すいて、結核菌、ＢＣＧ菌あるいは抗酸
菌のいずれかのα抗原を遺伝子工学的手法によシ純粋な
形で大量に取得すべき研究を開始した。何故ならば、と
のα抗原を利用する抗原抗体反応（ＥＬＩＳｋ法）を駆
使する診断薬を開発できたならば極めて正確かつ迅速に
肺ガンと結核及びＡＭ症を見分けることができるからで
ある。

通ずるα抗原を産生ずることが可能となった（特願昭６
２−３０５２５０号）。これによシ、正確かつ迅速に肺
ガンと結核及びＡＭ症を見分けることができるようにな
ったわけである。

しかしながら、この知見によシ確かに肺ガンと結核症及
びＡＭ症との区別はできるようになったわけであるが、
まだ類似した症状を呈する結核症とＡＭ症を判別する診
断薬は開発されていない。

従って、結核症とＡＭ症を正確かつ迅速に判別する診断
薬の開発は急務なわけである。

さて、一方、Ｍ、　Ｈａｒｂｏｅらは、ＢＣＧ菌が生産
するＭＰＢ６４蛋白を分離、精製し、全アミノ酸配列は
決定されていないが、そのＮ末端付近のアミノ酸配列を
既に決定している（　ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ　ＡＮＤ生し
ないがＢＣＧ菌及び結核菌は産生ずる特異的な分泌蛋白
である。

従ってこのＭＰＢ６４蛋白を純粋な形で得ることができ
たならば、このＭＰＢ６４蛋白を利用する抗原抗体反応
（ＥＬＩＳＡ法）を活用すれば結核とＡＭ症とを正確か
つ迅速に判別することは可能なわけである。

しかし、現実的には、結核菌及びＢＣＧ菌が分泌する蛋
白は約３００種にのぼり、この中から結核菌及びＢＣＧ
菌由来のＭＰＢ６４蛋白を純粋にとり出すためには、電
気泳動や数種類の複雑なカラム操作が必要である。

従って菌の培養でＭＰＢ　６４蛋白を大量にしかも純粋
な形で得ることは極めて難しい。

このことよシ、遺伝子工学的手法により、結核菌及びＢ
ＣＧ菌が分泌するＭＰＢ　６４蛋白を純粋な形で大量に
提供することが望まれている。

〈本発明が解決すべき課題〉 本発明の課題は、ＢＣＧ菌由来のＭＰＢ６４蛋白をコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えＤＮＡにより
形質転換された形質転換体を用いるＢＣＧ菌由来のＭＰ
Ｂ６４蛋白の製造法、及び目的とするＢＣＧ菌由来のＭ
ＰＢ６４蛋白の提供である。

〈課題を解決する為の手段〉 本発明者等は、上記課題を解決すべき鋭意研究を重ねた
結果、既に決定されているＢＣＧ菌由来のＭＰＢ６４蛋
白のＮ末端付近のアミノ酸配列に対応する化学合成オリ
がヌクレオチドグローブを作成し、これを基に、ＭＰＢ
６４蛋白を分泌するＢＣＧ菌からＭＰＢ６４蛋白をコー
ドする遺伝子を単離し、その塩基配列を決定し、次に該
遺伝子を適当な発埃ベクターに組み込むことにより、大
腸菌で、該ＭＰＢ６４蛋白を大量に製造提供することが
でき、本発明全完成に至らしめた。

以下に本発明を、 に分けて説明する。

（１）　　ＢＣＧＣ集菌体ＤＮＡの調製ＢＣＧ菌の染色
体ＤＮＡは、鈴木らの方法（Ｊ。

Ｂａａｔａｒｌｏｌ、　１６９　（２）　８３９　（１
９８７）　）により調製できる。抽出したＤＮＡは、塩
化セシウム−エチジウムプロミド密度勾配遠心分離法に
よ＃）鞘型する。

（２）　　ＭＰＢ　６４蛋白をコードする遺伝子のクロ
ーニング上記（１）で得た染色体ＤＮＡの種々の制限酵
素による消化物を７ガロースｒル電気泳動による分画し
、次に、サデンらの方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ、
　９８−５０３（１９７５））によ、！７　ＤＮＡ断片
を結合したフィルターにトロセルロース又ハナイロンメ
ンプラン）ヲ調製する。

ついで、このフィルターに対し、５′リン酸基を５２　
ｐで標識した合成オリゴヌクレオチドグローブをハイブ
リダイゼーション〔メソッド　イン　エンデイモロジー
６８，４１９（１９７９）’）させることにより、ＭＰ
Ｂ６４遺伝子を含むＤＮＡ断片を検出することができる
。このＤＮＡ断片をアがロースデル電気泳動により分画
した後回収バッファー（５０％グリセロール泳動バッフ
ァー）で溶出することによシ、目的ＤＮＡバンドを回収
する。

次に、このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵｃ１８に導入し
、ハナハ７の方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ−、１６
６，５５７（１９８３）］に準じて宿主細胞（例えばＩ
ＩＥ、　ｅｏｌｌＪＭＩ　Ｏ９株など）に導入して形質
転換させ選択（Ｅ。

ｃｏｌｌ　ＪＭ１０９株であれば、アンピシリン耐性で
β−ガラクトシダーゼ活性非保有株を選択）することに
よ、９　ＤＮＡライブラリーを炸裂する。

このＤＮＡライブラリーについて、前述の　Ｐｉ識オリ
ゴヌクレオチドグローブヲ用いたコロニーハイツリダイ
ゼーションテスト（メゾット　インエンデイモロジー６
８　３７９　　（１９７９））を行ない、目的のクロー
ンをスクリーニングする。

かぐして得たクローンからクローン化ＤＮＡ断片を調製
し、メッシング等の方法ＣＮ、　Ａ、　Ｌ、　９　。

３０９（１９８１）］によって塩基配列を解析し、ＭＰ
Ｂ６４蛋白のアミノ末端部分のアミノ酸配列をコードす
る塩基配列を求め、最終的にＭＰＢ６４蛋白の全翻訳領
域に対応する塩基配列を含むクローン化ＤＮＡを得るこ
とができる。

（３）　　ＭＰＢ６４蛋白をコードする遺伝子の形質発
現上記（２）で得たＭＰＢ６４蛋白をコードする遺伝子
を用いてＭＰＢ　６４蛋白を生産するにはまず、クロー
ン化ＤＮＡの実質的な配列を形質発現ベクターに組み込
ｔ−，：　）：　Ｃ１ｋ　リ、ＭＰＢ６４蛋白生産用の
組み換えＤＮＡを炸裂する。ついで、この組み換えＤＮ
Ａを適当な宿主細胞に導入して形質転換する。

このようＫして得られた形質転換株を培地中で培養する
ことにより、目的とするＭＰＢ６４蛋白を得ることがで
きる。

本発明において、クローン化したＭＰＢ６４蛋白の遺伝
子を形質発現させる際には、広範囲の原核生物もしくは
、真核生物の宿主細胞と形質発現ベクターの組み合わせ
を採用することができる。

宿主細胞として原核生物を用いる場合には、軽圧制限は
ないが例えば大腸菌に１２株（尚、以下、大腸菌をＥ、
　ｃｏｉｌと表わす）に属する（　Ｅ、　ｃｏｉｌＸ１
７７６株、Ｅ、　ｃｏｉｌ　ＪＭ１０３株（Ｎ、　Ａ、
　Ｒ，９，３０９（１９８１）　）　Ｅ、　ｃｏｌｌ　
ＪＭ１０９株が好ましい。また、仁の他、枯草菌をも用
いることができる。ま九真核生物を用いる場合にも特に
制限はないが、例えば、サツカロマイセス　セレビシェ
等が好ＩＬい。

また、形質発現用ベクターとしては、上記宿主細胞に適
合し得るレグリコンと調節機能を含むベクター及び該宿
主細胞がそれ自身の蛋白質を発現するのに必要なプロモ
ーターを含有するか、もしくは含有するように改良さ・
れたものが好ましい。

これらの各組み合わせの具体例を示すと以下の通りであ
る。

・宿主細胞がＥ、　ｃｏｌｉの場合ニ ゲラスミドとしてｐＢＲ３２２（Ｇｏｎｅ、　２　、９
５（１９７７））、プロモーターとしてラクトース（ｌ
ａｃ）ｆｏモモ−−（Ｎａｔｕｒｓ、　２８１　＋　５
４４（１９７９））、トリブトファン（ｔｒｐ　）プロ
モーター［：Ｎ、Ａ、Ｒ，８，４５０７（１９８０）］
およびタック（ｔａｃ）７’ｏモーターＣＰｒｏ、　Ｎ
、　Ａ、Ｓ、、　７８２１　（１９８３）　）などを有
するものがあげられる。

形質発現用ベクターとしては、ｐＢＲ３２２に前記プロ
モーターを含有するｐＵｃ１８などのｐＵＣベクター〔
メンラド　イン　エンデイモロジー１０１　。

２０　（１９８３）：）あるいはｐＫＫ２３３−２　（
スウェーデン、ファルマシア社製）などがあげられる。

・宿主細胞がサツカロマイセス　セレビシェノ場合ニ ゲラスミドとしてＹＲｐ７　（Ｎａｔｕｒｅ、　２８２
　、３９（１９７９））が、またプロモーターとしてグ
リセルアルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロゲナー
ゼプロモーター［Ｊ、　Ｂ、　Ｃ，、罎■、　９８３９
（１９７９）　］や、］α−ファクターグモロータなど
があげられる。

本発明においては宿主細胞として、原核生物細胞を用い
ても真核生物を用いてもよいが、より好ましくは、原核
生物を用いる方が良い。

かくして得られるＭＰＢ６４蛋白生産用の組み換えＤＮ
Ａを含有する宿主細Ｍ＆（形質転換体）の培養は、液体
培地中、好気的に行なえばよい。”培地としては、例え
ばポリペプトン、酵母抽出物、食塩、グルコースなどを
含有する通常の栄養培地の他、Ｍ９最小培地などを用い
ることができる。培養は、約３０〜４０℃で行なうのが
好ましい。

また培養に際し用いたプロモーターに応じて適当な訪導
剤、例えばｌａｃグロモーターの場合であれば、イング
ロビルーβ−〇−チオがラクトシトを培地中に添加する
ことにより、形質転換体の培養をより効率的に行うこと
ができる。

尚、本発明においては以下の略号を使用する。

Ａ：アデニン Ｃ：シトシン Ｇ：ダ７ニン Ｔ：チミン ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 ｋｂ：キロ塩基 ｋｂｐ　：キロ塩基対 ｎｇａｇ　ニジエチルアミノエチル ｓｎｓ　：　ドデシル硫酸ナトリウム ＳＳＣ：　０．１５Ｍ塩化ナトリウム ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）緩衝液 ＩＰＴＯ：イソグロビルーβ−Ｄ−チオガラクトシドＸ
−ｇａｌ　：　５−プロモー４−クロロ−３−インドリ
ル−β−〇−ガラクトピラノシド 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。

〈実施例１〉 （１）　　ＢＣＧ菌染色体ＤＮＡの調製Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔａｒｌｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ　Ｔｏｋｙｏ株をツ
ートン培地（組成：アスパライン０．４チ、クエン酸０
．２チ、クエン酸ナトリウム０．２８％、リン酸カリウ
ム０．０５ｑ６、硫酸マグネシウム０．０５１クエン酸
第１鉄アンモニウム０．００５％、グリセリン６％）ｌ
ｌ中、３７℃で培養し、対数増殖期に達した時点で遠心
分離により集菌した。菌体を１０ｍＭ）！Ｊスス−酸（
ｐＨ８，０）　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡバッファー５ｄに懸
濁し、リゾチーム５〜を加えて、３７℃１５分間インキ
ュベートしたのち、１０　％　ＳＤＳ水溶液０、５　ａ
ｌ　ｔ−加、ｔた。フェノール：クロロホルム：イソア
ミルアルコール＝２５：２４：１の混合液６ばて３回抽
出したのち、水層ｔとって、エタノール１０ｄを加え、
沈澱するＤＮＡ　ｔ−ガラス棒にまきとった。このＤＮ
Ａを１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）１　ｍＭ　Ｉ
ＥＤＴＡバッファー６．６　ａｔに溶解し、塩化セシウ
ム７１１．エチデウムプロミド水溶液（５ｒＩ９／＃ｌ
１）Ｑ、　７　ｍｌを加えて溶解した。

該溶液を遠心チューブ（米国ペックマン社製クイックシ
ールチューブ）中に入れ、６００００ｒｐｍ。

６時間遠心して、染色体ＤＮＡのバンドを遠心チューブ
上方より採取した。このＤＮＡ溶液を１０ｍＭ）リス−
塩酸（ｐＨ８，０）　１　ｍＭ　ＥＤＴＡバッファーに
対して透析することによシ脱塩して精製ＢＣＧ染色体Ｄ
ＮＡを得た。

（２）　　合成オリゴヌクレオチドグローブの調製Ｍ、
　Ｈａｒｂ６＠らによって既に決定されているＢＣＧ菌
由来のＭＰＢ６４蛋白のＮ末端よ９３０個のアミノ酸配
列、即ち、 に対する３種類の合成オリゴヌクレオチドグローブを調
製した。

つまシ下記のグローブＩ、ＩＩ及び■である。

グローブＩ　（Ｇｌｕ　〜Ｇｌｙに対応）：”ＧＡＧＧ
ＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣ（２
７ｍａ　ｒ　）３′ グローブ■（Ａｓｐ−Ｍｅｔに対応）：５′ ＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣ
ＡＧＡＴＧ”　（３０ｍａ　ｒ　）プローブｌ［（Ａｓ
ｐ　−Ａｓｎに対応）：”ＧＡＣＣＣＧＧＣＣＴＡＣＡ
ＡＣＡＴＣＡＡＣ”　　　　　（２１ｍｓ、）具体的に
合成操作を以下に示した。まず、自動ＤＮＡ合成装置（
米国、アゲライド　バイオシステムズ社、３８０Ａ型）
で目的とするＤＮＡ　グローブを合成したのち、ジメト
キシトリチル基以外の保護基を除去し、逆相中圧カラム
クロマトグラフィー（条件二０１８−シリカｒルカラム
を用い、移動相として１００ｍＭ）リエチルアミンアセ
テートパッファー（ｐＨ７，０）中、アセトニトリルか
らなる濃度勾配液を用いる）で精製した。

ついで８０％酢酸を用いてジメトキシトリチル基を除去
した後、逆相面ＬＣ（条件：　ＹＭＣＰＡＣＫ店−３１
４０ＤＳカラムを用い、移動相として１１００ｒｆ１ト
リエチルアミンアセテートバツフアーＣＰＨ７，０）中
アセトニトリルからなる濃度勾配液を用いる）で精製し
、凍結乾燥した。

かくして、得られた３種類のオリゴヌクレオチドグロー
ブを０．００２０Ｄ／μｔの濃度になるように１０ｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ８，０）　１　ｍＭＥＤＴＡパフ　７
７−に溶解した。このオリゴヌクレオチド溶液１００１
００ｐとキナーゼ反応バッファー（５０ｍＭ）リスー塩
酸バッファー（ＰＩ（７，５）、１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１０ｒｎＭジチオスレイトール、０．６６　ｔｉ
Ｍ　ＡＴＰｌｌ　００　μｃ＋　［ｒ、−”ＰコＡＴＰ
　（比活性３０００Ｃｉ／ｍｍｏＬ　）、１５単位　ポ
リヌクレオチドキナーゼ〕の総、ｉ５０μｔで３７℃１
時間反応させた。この反応液をフェノール！抽出し、ク
ロロホルムで洗浄後、ＮＥＮ　５ＯＲＢ　”　２０　Ｄ
ＮＡ精製用カートリップを通し、未反応の　Ｐや共存蛋
白質、塩を取り除き、５０％メタノール溶液としてラベ
ル化ヌクレオチドグロープを回収した。次に溶媒を留去
した後５２ｐのｃ　ｏｕｎ　ｔを測定し、１１０５Ｃｐ
／μを以上の濃度になるようにｌ　ＯｒｎＭ　トリス−
塩酸（Ｐｌ（８，０）１＋ｎＭＥＤＴＡバッファーに溶
解した。

（３）　　サデンハイプリダイゼーションＭＰＢ６４蛋
白の遺伝子を持つ染色体ＤＮＡ断片を検出、分画するた
め、サデンハイプリダイゼーションテストｆ　５ｏｕｔ
ｈｅｒｎらの方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　９８５
０３（１９７５））Ｋ従って行なった。すなわち、（１
）で得た染色体ＤＮＡ約３μｇｔ−制限酵素Ｋｐｎ　ｌ
で完全消化し、０．８チアガロースダル電気泳動にて分
画したのち、このアがロースダルを１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で、４０分間振
とうした。

次に、このｒルミ３Ｍ塩化ナトリウム、０．５）リスー
塩酸バッファー（ｐＨ７，０）中で、１時間撮とうした
。最後に２００倍濃のＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム０．
３　Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐ）１７．０）
中で３０分間振と９する。このダルに、２００倍濃のＳ
ＳＣ溶液にひたしたナイロンメンブランフィルタ−（米
国、ＮＦＪ’Ｊ社製Ｇｅｎｅ　ＳｃｒｅｅｎＰｌｕｇ　
）をのせ、ＤＮＡを吸着させた。このフィルターを２倍
濃度のＳＳＣで洗浄したのち、室温で３０分間、３７℃
で１８時間乾燥することによりＤＮＡ結合フィルターを
調製した。

このフィルターをハイブリダイゼーション溶孜〔５倍濃
度Ｄｅｎｈａｒｄｔ　（０，１％フィコール、０．１％
ポリビニルぎロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）
、５倍濃度ＳＳＣ、０，Ｉ　ＳＤＳ溶液〕に浸し、６５
℃で６時間静置した。次に上記ハイツリダイゼーション
溶液５ｍ１Ｋ前記（２）の　Ｐ標識グローブ４０μｔを
加え、５５℃で１８時間静置した。次にフィルターを２
倍濃度のＳＳＣＯ，１チＳＤＳ中５５℃２０分間洗浄し
た。この操作を３回繰り返し行なった後風乾し、オート
ラジオグラフィーを行ないＭＰＢ６４蛋白の遺伝子を含
むＤＮＡ断片を検出した（第１図）。

第１図の結果よシ分かるようにグローブ！、■及び■の
いずれにも反応した約４４００ｂｐにバンドを示したＤ
ＮＡ断片だけであった。

（４）　　ＤＮＡライブラリーの作成 ■　Ｋｐｎ）　ＤＮＡ断片の調製 （３）によって検出できた約４４００ｂｐの制限酵素Ｋ
ｐｎｌ消化ＤＮＡ断片をクローン化するためＢＣＱ染色
体ＤＮＡ　２０μｍ１を制限酵素Ｋｐｎ　ｌで完全消化
した後、０．８％アガロースダル電気泳動によシ分画し
た。

目的とする４４００ｂｐのバンドの下流に溝を作り、回
収バッファ（５０％グリセロール、４０ｍＭトＪス、２
０ｍＭ酢酸ナトリウム、　２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　１８　
ｍＭＮａＣｌ　）を加え、ＤＮＡを泳動させ回収した。

この溶液に２倍量のエタノール、０．０５５倍量５　Ｍ
　ＮａＣ６を加え、ＤＮＡを沈澱させた。この沈ｍを減
圧乾燥後２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）　１ｍＭ
ＥＤＴＡバッファーに溶解してＫｐｎｌ　ＤＮＡ断片溶
液とした。

■　クローニングベクターｐＵｃ１８の処理１０　ｍＭ
　）リス塩酸バッファー（ｐＨ７，ｓ　）、１０ｍＭ塩
化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、４μ９ベ
クター１）ＵＣｌ３　（宝酒造製）、２０単位制限酵累
Ｋｐｎｌの混合物を３７℃で２時間反応させた後、フェ
ノール、クロロホルムでそれぞれ１回ずつ抽出し九のち
、エタノール沈澱させた。この沈澱全減圧乾燥したのち
、５０ｍＭ）ＩＪス塩酸バッファー（ｐＨ８，４）１９
４μｌに溶解し、１．５単位アルカリホスファターゼ（
Ｅ、　ｃｏｉｌ　Ｃ７５）を加えて、６５℃で１時間反
応させた。さらに、１．５単位のアルカリホスファター
ゼを加えて、６５℃で１時間反応させた後、フェノール
、クロロホルムでそれぞれ２回ずつ抽出し、水層にエタ
ノールを加えて、ＤＮＡを沈澱させた。この沈澱を１０
ｍＭト！Ｊス塩酸バッファ　　（ＰＨ８，０）　１　ｍ
ＭＦ、ＤＴＡ　２０μ！に溶解し、約２．７　ｋｂｐの
ベクターＤＮＡ溶液を調製した。

■　組み換えＤＮＡおよびＤＮＡライブラリーの作成 （３）−ので調製したＫｐ　ｎ　Ｉ　ＤＮＡ断片溶液４
μｌ　（０，１μＦ）、（３）−〇で調製したベクター
ＤＮＡ溶液１μｇ（０，１μｇ）　トＤＮＡライダージ
ョンキット（宝酒造製）のＡ溶ｉ３０μｌ、Ｂ溶液５μ
ｌの混合物を１６℃で３０分間反応させた後、反応混合
物１６μｌをＥ、　ｃａｌｌ　ＪＭ１０９株コンピテン
トセル（宝酒造製）１００μノに加え、０℃で６０分間
静置した。この後、更に４２℃で９０秒間、次いで０℃
で５分間静置した。

この混合物にバクトドリプトン１％、酵母抽出ｉ　０．
５　％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．１チ
、からなるＬ−プロス培地３００μｌを加えて３７℃で
３０分間静置した。次に５０００ｒｐｍ５分間遠心し、
上清を半分量捨てた後再懸濁し、アンピシリン５０　ｐ
ｇ／　ｍｌ、０．１　ｍＭ　ＩＰＴＧ　、　０．００４
％Ｘ−ｇａｔｋ含むＬ−寒天培地（Ｌ−ｂｒｏｔｈに１
．３チ寒天を加える）に塗布し、３７℃で約１６時間培
養し、アンピシリン耐性、β−ガラクトシダーゼ活性非
保持菌のクローンを得て、形質転換株からなるＤＮＡラ
イブラリーを作成した。

（５）　　ＭＰＢ６４蛋白の遺伝子を有するクローンの
選択（コロニーハイブリダイゼーションテスト）上記（
４）−■のＢＣＧ　ＤＮＡライブラリーについてＭＰ　
Ｂ６４遺伝子を含む形質転換株を選択するため、上記（
２）で調製した３２ｐ標識オリゴヌクレオチドゾロープ
を用いるコロニーハイブリダイゼーションテスト’を行
なった。即ち、ニトロセルロースメンブレンフィルター
（ミリボア社製ＨＡフィルター）上で、上記（４）−■
で調製したＤＮＡライブラリーの形質転換株を培養し常
法に従ってフィルターをアルカリ処理後、１Ｍトリス−
塩酸バッファー（Ｐ）（７，５）による中和を行い、そ
してＩ　Ｍ　）　ＩＪス塩酸バッファー（ＰＨ７，５）
１．５Ｍ塩化ナトリウムで処理した。次に２倍濃度のＳ
ＳＣバッファーに浸した後、室温で風乾した後、８０℃
３時間ペイキングし、ＤＮＡ結合フィルターを調製した
。

このフィルターを上記（３）のサデンノ１イプリダイゼ
ーシ、ンと同様の操作全行ない、グローブ■。

グローブｆｌ、ｆロープＩ［１に強く結合する塩基配列
を含む組み換えＤＮＡ分子を有する形質転換株を選択す
ることにより、約１００個のコロニーから１個のコロニ
ーを得た。

この形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽出精製した後
制限酵累Ｋｐｎｌ及びＰｓｔｌで消化しく３）と同様の
操作によりサデンハイプリダイゼーシ、ンを行なった０ この結果、４，４ｋｂのＫｐｎｌ切断フラグメント、及
び１．５ｋｂのＰｓｔｌ切断フラグメントに結合した。

両断片とも！ｖｉＰＢ６４蛋白の遺伝子を含有す・ると
考えられるが、塩基配列の決定の容易さなどからＰｓｔ
ｌ切断１．５ｋｂフラグメントをクローン化することに
した。

即ち上記で得た形質転換株のグラスミドＤＮＡを制限酵
素ＰｓＬＩで切断後ベクターｐ［Ｊｃ１８の制限酵素Ｐ
ａｔＩ切断物とライダージョンし、宿主Ｅ、　ｃｏｌｉ
ＪＭＩ　０９を形質転換した後、再度コロニーノーイブ
リダイゼーションを行ない前述したグローブＩ、ＩＩ及
び■のいずれにも結合するクローンを取得した。

（６）　　クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定前述（５
）のクローンから！ラスミド金単難梢製し、制限酵素Ｐ
ｓｔ）で切断したもつをアガロースゲル電気泳動により
分画し、仄７こ前述の方法を用いてＰｓｔｌ　１．５　
ｋｂフラグメント全分離ｒＩ製した。

このＤＮＡをメッシングらの方法（Ｇｏｎｅ、３３１０
３（１９８５）　）　、　Ｐｒｏ、　Ｎ、　Ａ、、Ｓ、
、　７４．５４６３（１９７７））により、１．５ｋｂ
フラグメントの塩基配列を決定した。

このようにして決定したＢＣＧ菌由来のＭＰＢ６４蛋白
全コードする遺伝子の塩基配列を第２図に示した。

この決定した塩基配列と既に知られているＭＰＢ６４蛋
白のＮ末端付近のアミノ酸配列を比較することよシ、第
２図の２１２〜２１４番目ＧＣＧがＭＰＢ６４蛋白のＮ
末端アミノ酸Ａ１ｍに対応し、８２７〜８２９番目のＴ
ＡＧが終止コドンに該当すると判断した。

従って、ＢＣＧ菌由来のＭＰＢ６４蛋白をコードする遺
伝子、即ちＭＰＢ６４蛋白の構造遺伝子は第２図の２１
２〜８２６番に該当することを見い出した（図中の下線
部分）。

また、１４３〜２１２番目の塩基配列ＭＰＢ６４蛋白の
分泌に必要なシグナル配列に相当する。

ＭＰＢ６４蛋白全コードする塩基配列から翻訳されるア
ミノ酸残基叡は２０５個であシ、その計算分子量は２２
，４００で、そのアミノ酸配列を第３図に示し次。

尚、今回全アミノ酸配列を決定し九ことより、本発明者
等は以前Ｍ−Ｈａｒｂｏｅらが報告しているＭＰＢ６４
蛋白のＮ末端付近アミノ酸配列が弱冠誤っていることに
気すいた。

即ち、Ｎ末端から６番目及び１２番目のアミノ酸が誤っ
て報告されていることを見い出したわけである。

〈実施例２〉 形質発現ベクターＰＫＫ２３３−２（スウェーデン。

ファルマシア社製）と化学合成オリゴヌクレオチドを用
いてＭＰＢ　６４蛋白の遺伝子を連結させＭＰＢ６４蛋
白を生産した。

このＭＰＢ　６４蛋白の生産の詳細は以下に示した。

（１）　　ＭＰＢ６４蛋白の遺伝子を含むＰｇｔｌ　１
．５　ｋｂフラグメントの制限酵素Ｂａｎ）による切断
第２図に示した塩基配列において２４２番目からのＧＧ
ＣＡＣＣが制限酵素Ｂａｎ１の認識サイトである。

従って、Ｐｓｔｌ　１．５　ｋｂフラグメントｔ−Ｂａ
ｎ（で切断することによりＭＰＢ６４遺伝子のほとんど
の部分を含むフラグメントが得られるわけである。

即ち〈実施例１〉の（５）で調製したクローンから単離
したプラスミドを制限酵素Ｐｓｔｌで切断した後にアが
ロース電気泳動等の操作により目的とするＰｓｔｌ　１
．５　ｋｂフラグメントを調製した。

このＰｓｔｌ　１．５　ｋｂフラグメント１０μｇｔｌ
ＯｍＭＴｒｌｓ−ＨＣｌ（ｐＪ（８，Ｑ　）　、　７　
ｍＭＭｇ（’ｔ２．７ｍＭＤＴＴ存在下、制限酵素Ｂａ
ｎ１　（東洋紡製）　１２　ｕｎｉｔｓで５０℃３時間
反応させた。

この後、アガロース電気泳動よシ分離ｎ梨を行ない目的
とするＢａｎ１−　Ｐａｔｌフラグメントを回収した。

尚このＢａｎ１−　ＰＩｌｔｌフラグメントを２０μｌ
のＴＥバッファーに溶解（０，１２μＩ／ｌｉｌ　）さ
せた。

■　化学合成オリコ９ヌクレオチドの調製リンカ−（上
）　　　ＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＧ
ＣＧＡ（Ｘ２ＡＧＴＴＧＡＡＡＧリンカ−（下）　　　
ＧＴＧＣＣＴｒＴＣＡＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＧＴＡＧＧ
ＴＣＴｒＧＧＧＣＧＣ０２種をそれぞれ〈実施例１　＞
　−（２）と同様に合成、精製した。

このリンカ−（１）　、　　ＣＦ）各々を１００　ｐｍ
ｏｔずつとｆｉ、ＡＴＰ存在下、Ｔ４Ｊリヌクレオチド
キナーゼ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ａ１９　）　（全酒造製）
　ｚｕｎｉｔａ　金加え、３７℃３０分間の条件で反応
させた。

反応終了後、フェノール処理、クロロホルム処理を行っ
た後に６５℃、５分間加熱した。

加熱後、徐冷することにより、目的とする下記のような
リンカ−を得た。

ＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＧ
ＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧ”ダ ３・ＣＧＣＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＣＧＣＴＣＣＴ
ＣＡＡＣＴＴＴＣＣＧＴＧ５・このようにして調製され
たリンカ−は前述〈実施例２〉の（１）のＢ１ｎ１−　
ＰｓｔｌフラグメントのＭＰＢ６４蛋白の遺伝子の不足
部分、即ち２１２番目〜２４１番目の塩基配列（第２図
参考）、を補うばかりではなく、ｐＫＫ２３３−２のＮ
ｃ　ｏ　Ｉサイトにも連結する構造をも有していた。

（３）形質発現ベクターｐＫＫ２３３−２の処理ベクタ
ーｐＫＫ２３３−２　２　μｍを２０　ｒｎＭ　Ｔｒｌ
ａ−ＨＣ６ｐ）Ｉ　７．５　、１０ｍＭＭｇＣｔ２．１
０　ＯｍＭ　ＮａＣｔ中において制限酵素ＰｓｔＩ　（
１６ｕｎｌｔｓ）　、　Ｎｃｏｌ　（１２ｕｎｉｔｓ）
で３７℃２時間処理した。

次に、アルカリホスファターゼ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ａ１
９　）（全酒造製）３ユニツトを加え、６５℃で１時間
、さらにアルカリホスファターゼ３ユニｙトを追加し、
６５℃で１時間反応させた。

この後、フェノール処理、クロロホルム処理、エタノー
ル沈澱、更には８０チエタノール水で洗浄した後乾燥さ
せることによυ目的とするＰｓｔｌ−Ｎｃｏｌ切断、ｐ
ＫＫ２３３−２を調製した。

（４）発現ベクターｐＫＫＭ６４の構築〈実施例２〉の
（３）で得たベクターｐＫＫ２３３−２（ＰｓｔＩ　−
Ｎｃｏｌ断片）　ｏ、ｌａ＆　、　＜実施例２〉の（１
）で得たＢａｎ１−　Ｐｓｔｌフラグメント０．１２μ
ｇ　、　（実施例２〉の（２）で得たリンカ−３，３ｐ
ｍｏｔおよびＤＮＡライダージョンキット（全酒造製）
のＡ溶液２４μｌ、　Ｂ溶液４μｌの混合物を１６℃で
３０分間反応させた。即ち、この操作によりＭＰＢ　６
４蛋白の構造遺伝子含有する発現ベクターｐＫＫＭ６４
を構築した。

さて、次に、この反応混合物７６μｌ　ｋ　Ｌ　ｃａｌ
ｌＪＭｉ０９株コンビラントセル（宝酒造製）１００μ
ｌに加え、６００分間静置更に、４２℃で９０秒間、次
いで０℃で５分間静置することにより形質転換させた。

この反応溶液をＬ−プロス培地３００μｌを加え、３７
℃で３００分間静置た。

次に５００Ｏｒｐｍ５分間遠心し、上清全半分量捨てた
後再懸濁し、アンピシリン５０μｌ／ｍ１．ｏ、１ｍＭ
　ＩＰＴＧ　、　０．００４　％　Ｘ−ｇａｔ　ｆ：含
むＬ−寒天培地（Ｌ　−ｂｒｏｔｈに１．３％寒天を加
える）に塗布し、３７℃で約１６時間培養し、アンピシ
リン耐性。

β−ガラクトシダーゼ活性非保持菌のクローンを得た。

即ち、このようにして発現ベクターｐＫＫＭ　６４を含
むクローンを得た。

尚、この線程は第４図に示した。

（５）　　大腸菌によるＭＰＢ６４蛋白の生産発現ベク
ターｐＫＫＭ　６４を含むＥ、　ｃｏｉｌ　ＪＭ１０９
株（Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＡＪ１２３６９．　ＦＥＲＭ　Ｐ
−９８４６）及びコントロールとしてｐＫＫ２３３−２
を含むＥ、　ｃａｌｌ　ＪＭ１０９株を２倍濃度のＹＴ
培地（トリフトン１６タ／ｌ　。

抽出物イーストイクストラクト１０　ｆ）／ｌ　、　Ｎ
ａＣｌ３　Ｍｌ　）　１０　ｒｎｌ　（アンピシリン５
０μｉ／ｍｌ含有）中で３７℃で５時間培養した後、Ｉ
ＰＴＧを２００μｙ／ｄになるように添加し、さらに１
５時間培養した。

この培養液を遠心（１２，０００ｒｐｔｎ　１０分間）
し、集菌した後、この菌体をｌ　ｔｎｌの滅菌水中に懸
濁し、超音波処理を行なった。そして再度、集菌し、上
清に２倍濃度の試料緩衝液を等竜角え、１００℃３分間
煮沸し、菌体抽出液とした。２種の菌体抽出液および標
準のＭＰＢ６４蛋白を５ＤＳ−ポリアクリルアミドｇ気
泳ｅをした後、ニトロセルロースフィルタ、−に蛋白２
写し、抗ＭＰＢ６４蛋白Ｉリクローナル抗体との反応ｆ
：調べた（第９図）。

第Ｓ図に示したように、標準サンダルと全く同じ位置に
生じるバンドはｐＫＫＭ　６４ベクターを含む大腸菌（
ＦＥＲＭ　Ｐ　−９８４６）の菌体抽出液にのみにしか
見られなかったことより、大腸菌内でＭＰＢ６４蛋白の
遺伝子が発現され、ＭＰＢ６４蛋白が生産されていたこ
とが確認できた。

く効果〉 本発明により提供されるＢＣＧ菌由米のＭＰＢ６４蛋白
は、抗原抗体反応（Ｅｌ：ＩＪＳＡ法）による結核とＡ
Ｍ症とを識別する診断薬として使用できる。

また、本発明により提供されるＢＣＧ菌のＭＰ　Ｂ　６
４蛋白をコードする遺伝子及びそれを用いた遺伝子工学
的手法によるＢＣＧ菌由来のＭＰＢ６４蛋白の製造法は
結核の診断薬として有用なＭＰＢ６４蛋白全大量かつ純
粋に提供する為に重要である。

更に本発明により提供されるＭＰＢ６４蛋白をコードす
るＤＮＡ配列から好ましい配列を選び、ビオチン又はラ
ジオアイソトープで標識したＤＮＡグローブを調製すれ
ば、これによる結核の診断も可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＢＣＧ菌染色体ＤＮＡの制限酵素Ｂ　ａｍＨ
Ｉ　＋Ｋｐｎｌ及びＰａＬｌによる消化物に対するプロ
ーブＩ。 ■、■のサデンハイグリダイゼーシ、ンを示す図であシ
、矢印で示した４、　４　ｋｂ　Ｋｐｎ■断片をクロー
ニングした。 第２図は、決定した９１９ｂｐのＤＮＡの塩基配列金示
す。 第３図は、ＭＰＢ６４蛋白のアミノ酸配列を示す。 第４図は、成熟型ＭＰ８６４発現ベクター・ｐＫＫＭ６
４の構築を示す図である。 第５図は、ｐＫＫ２３３−２を含む大腸菌ＪＭ１０９と
ｐＫＫＭ　６４を含む大腸菌ＪＭ１０９の菌体抽出液を
クエスタンプロフト法で分析し死因である。 第　　　３ Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ　　
Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　ＬｙｓＧｌ
ｎ　　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ａｌ
ａ　　Ｔｙｒ　　Ａｓｎ　　Ｉｌａ　　ＡｓｎＬｙｓ　
　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　
　ｌｉｅ　　Ａｌａ　　Ｇｌｎ　　ＴｈｒＳｅｒ　　Ｔ
ｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｐ
ｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ１１ｅ　　Ｐｒｏ
　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｎ
　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｖａ１Ｈｉｓ　　Ｐｒｏ　　
Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ　　
Ａｌａ　　Ｐｈｅ　　ＡｓｐＴｙｒ　　Ａｓｐ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｌｅｕ　　Ｔｒｐ　　Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　Ａｓ
ｐ　　Ｔｈｒ　　ＡｓｐＧｌｙ　　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ　
　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　
　Ｇｉｎ　　ＧｌｎＰｒｏ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｔ
ｙｒ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｖ
ａｌ　　ＴｈｒＧｌｙ　　Ｃ＋ｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｐｒ。 Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　ＡｌａＧｌ
ｙ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｉ
ｎ　　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　　Ｇｉｎ　　ＩＩｓ１１ｅ　
　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　
　Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　ＧｌｎＡｒｇ　　Ａ
ｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａ
ｌａ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　ＳｅｒＡｓｎ　　Ｉｌｅ
　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ
　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　ＡｌａＬｅｕ　　Ｌｙｓ　　
Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　
Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　ＴｈｒＴｒｐ　　Ａｓｐ　　Ｇｌ
ｎ　　Ａｌａ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｔｉｅ　　ＴｈｒＰｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　
　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　ｌｉｅ　
　Ｖａｌ　　ＧｌｎＶａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ａ
ｌａ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｌ
ｅｕ　　ＡｓｐＡｓｎ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ
　　Ｉｌｅ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ
　　Ｐｒ。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列（ I ）を有するミコバクテ
   リウムボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂ
   ｏｖｉｓＢＣＧ、以下ＢＣＧ菌と称する）由来のＭＰＢ
   ６４蛋白￥アミノ酸配列（ I ）：￥ （Ｎ末端） 【遺伝子配列があります。】 （Ｃ末端）
2. （２）請求項（１）記載のＭＰＢ６４蛋白をコードする
   遺伝子
3. （３）遺伝子が下記の塩基配列（ａ）で示されるもので
   ある請求項（２）記載の遺伝子 ￥塩基配列（ａ）：￥ （５′末端） 【遺伝子配列があります。】 （３′末端）
4. （４）請求項（２）記載の遺伝子が組み込まれたプラス
   ミドにより形質転換された形質転換体を培地中で培養し
   、生産されたＭＰＢ６４蛋白を採取することを特徴とす
   るＢＣＧ菌由来のＭＰＢ６４蛋白。