JPH07303489A - オーレオバシジウム プルランスの多剤耐性遺伝子 - Google Patents
オーレオバシジウム プルランスの多剤耐性遺伝子Info
- Publication number
- JPH07303489A JPH07303489A JP7093674A JP9367495A JPH07303489A JP H07303489 A JPH07303489 A JP H07303489A JP 7093674 A JP7093674 A JP 7093674A JP 9367495 A JP9367495 A JP 9367495A JP H07303489 A JPH07303489 A JP H07303489A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mdr
- compound
- dna
- yeast cell
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 オーレオバシジウム プルランス（Ａｕｒｅ
ｏｂａｓｉｄｉｕｍｐｕｌｌｕｌａｎｓ）の多剤耐性タ
ンパク（ＡＰ−ＭＤＲ）をコードする単離された核酸化
合物、及び該遺伝子を含有するベクター並びに宿主細
胞、さらに使用する形質転換宿主細胞の分析法を提供す
る。 【構成】 宿主細胞サッカロミセス セレビシエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をＡ
Ｐ−ＭＤＲ発現ベクター、プラスミドｐＰＳＲ３で形質
転換する方法、及び該形質転換宿主細胞を（ｉ）非形質
転換状態の酵母細胞は感受性を示し、形質転換酵母細胞
は耐性を示すような抗真菌剤、及び（ｉｉ）真菌ＭＤＲ
阻害活性を持つとみられる化合物の存在下に培養し、該
酵母細胞の成育を阻害する抗真菌剤の能力を測定し、こ
の化合物の真菌ＭＤＲ阻害活性を測定することからなる
真菌ＭＤＲ阻害活性化合物の分析法。
ｏｂａｓｉｄｉｕｍｐｕｌｌｕｌａｎｓ）の多剤耐性タ
ンパク（ＡＰ−ＭＤＲ）をコードする単離された核酸化
合物、及び該遺伝子を含有するベクター並びに宿主細
胞、さらに使用する形質転換宿主細胞の分析法を提供す
る。 【構成】 宿主細胞サッカロミセス セレビシエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をＡ
Ｐ−ＭＤＲ発現ベクター、プラスミドｐＰＳＲ３で形質
転換する方法、及び該形質転換宿主細胞を（ｉ）非形質
転換状態の酵母細胞は感受性を示し、形質転換酵母細胞
は耐性を示すような抗真菌剤、及び（ｉｉ）真菌ＭＤＲ
阻害活性を持つとみられる化合物の存在下に培養し、該
酵母細胞の成育を阻害する抗真菌剤の能力を測定し、こ
の化合物の真菌ＭＤＲ阻害活性を測定することからなる
真菌ＭＤＲ阻害活性化合物の分析法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組み換えＤＮＡ技術に関
し、特にオーレオバシジウム プルランス(Ａｕｒｅｏ
ｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ)の多剤耐性タ
ンパクをコードする核酸のクローニングに関する。
し、特にオーレオバシジウム プルランス(Ａｕｒｅｏ
ｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ)の多剤耐性タ
ンパクをコードする核酸のクローニングに関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトｍｄｒ−１遺伝子産物によって媒介
される多剤耐性（ＭＤＲ）は、癌の化学療法のための養
生法の開発の中で、始めて確認された（Ｆｏｊｏら，１
９８７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏ
ｎｃｏｌｏｇｙ ５：１９２２−１９２７）。多剤耐性
癌細胞系は、高レベルの様々な細胞毒性化合物に耐性を
示す。しばしば、これらの細胞毒性化合物は共通の構造
上の特徴を持たず、細胞内の共通の標的と相互作用しな
い。細胞毒性物質に対する耐性は、外側に向けられた、
ｍｄｒ−１遺伝子によってコードされたＡＴＰ依存ポン
プによって媒介される。この機構は、特定の細胞毒性化
合物を毒性レベルで細胞内に蓄積させない。
される多剤耐性（ＭＤＲ）は、癌の化学療法のための養
生法の開発の中で、始めて確認された（Ｆｏｊｏら，１
９８７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏ
ｎｃｏｌｏｇｙ ５：１９２２−１９２７）。多剤耐性
癌細胞系は、高レベルの様々な細胞毒性化合物に耐性を
示す。しばしば、これらの細胞毒性化合物は共通の構造
上の特徴を持たず、細胞内の共通の標的と相互作用しな
い。細胞毒性物質に対する耐性は、外側に向けられた、
ｍｄｒ−１遺伝子によってコードされたＡＴＰ依存ポン
プによって媒介される。この機構は、特定の細胞毒性化
合物を毒性レベルで細胞内に蓄積させない。
【０００３】ＭＤＲ様遺伝子は、多数の細菌種、ショウ
ジョウバエ ドロソフィラ メラノガスター(Ｄｒｏｓ
ｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ)、プラスモ
ジウムファルシパルム(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ)、酵母 サッカロミセス セレビシエ
(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ)、カエノルハブディティス エレガンス(Ｃａｅｎｏ
ｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ)、レイシュマニ
ア ドノバニ(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎ
ｉｉ)、海綿、植物 アラビドプシス タリアナ(Ａｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、ホモ サピエン
ス(Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ)を含む多数の分岐した生
物において同定されている。広範囲の調査は多剤耐性ヒ
ト癌細胞系の表現型を逆転し、細胞毒性化合物の影響を
受けやすくさせることができる数種の化合物群を示して
いる。これらの化合物は本明細書中で「ＭＤＲ阻害剤」
と呼び、例えば、カルシウムチャンネル遮断剤、抗不整
脈剤、抗高血圧剤、抗生物質、抗ヒスタミン剤、免疫抑
制剤、ステロイドホルモン、修飾ステロイド、脂肪親和
性カチオン、ジテルペン、洗剤、抗鬱剤、抗精神病薬を
含む（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ及びＰａｓｔａｎ，１９９
３，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ（生化学年鑑） ６２：３８５−４２
７）。癌の化学療法へのヒトＭＤＲ阻害剤の臨床応用
は、研究の焦点の集まる領域になってきている。
ジョウバエ ドロソフィラ メラノガスター(Ｄｒｏｓ
ｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ)、プラスモ
ジウムファルシパルム(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌ
ｃｉｐａｒｕｍ)、酵母 サッカロミセス セレビシエ
(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ)、カエノルハブディティス エレガンス(Ｃａｅｎｏ
ｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ)、レイシュマニ
ア ドノバニ(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎ
ｉｉ)、海綿、植物 アラビドプシス タリアナ(Ａｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、ホモ サピエン
ス(Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ)を含む多数の分岐した生
物において同定されている。広範囲の調査は多剤耐性ヒ
ト癌細胞系の表現型を逆転し、細胞毒性化合物の影響を
受けやすくさせることができる数種の化合物群を示して
いる。これらの化合物は本明細書中で「ＭＤＲ阻害剤」
と呼び、例えば、カルシウムチャンネル遮断剤、抗不整
脈剤、抗高血圧剤、抗生物質、抗ヒスタミン剤、免疫抑
制剤、ステロイドホルモン、修飾ステロイド、脂肪親和
性カチオン、ジテルペン、洗剤、抗鬱剤、抗精神病薬を
含む（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ及びＰａｓｔａｎ，１９９
３，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ（生化学年鑑） ６２：３８５−４２
７）。癌の化学療法へのヒトＭＤＲ阻害剤の臨床応用
は、研究の焦点の集まる領域になってきている。
【０００４】別の最先端分野では、特定の菌種に対する
抗菌化合物の発見及び開発もまた、ある程度の成功をみ
せてきている。カンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)種による菌
感染が大部分であり、新規抗菌化合物のためのスクリー
ンが抗カンディダ化合物の発見のために設計されてき
た。抗菌剤の開発を通じて、活性は通常Ｃ．アルビカン
ス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する活性，に基づいて
最大限に利用されてきた。結果として、これら抗カンデ
ィダ化合物はしばしば、他の菌種に対しては臨床的に有
意な活性を持たない。しかし、数種の抗カンディダ化合
物は、より高濃度で他の菌種を殺すことができることが
分かったことは興味深い。このことはこれら抗カンディ
ダ化合物の抗菌標的が、これら菌種にも同様に存在して
いることを示唆している。このような結果は数種の菌種
が、抗菌化合物の臨床的に適切な濃度における生存を可
能にする自然の耐性機構を持っていることを示してい
る。このような菌類における抗菌化合物に対する一般的
な耐性機構については、未だ記載がない。
抗菌化合物の発見及び開発もまた、ある程度の成功をみ
せてきている。カンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)種による菌
感染が大部分であり、新規抗菌化合物のためのスクリー
ンが抗カンディダ化合物の発見のために設計されてき
た。抗菌剤の開発を通じて、活性は通常Ｃ．アルビカン
ス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する活性，に基づいて
最大限に利用されてきた。結果として、これら抗カンデ
ィダ化合物はしばしば、他の菌種に対しては臨床的に有
意な活性を持たない。しかし、数種の抗カンディダ化合
物は、より高濃度で他の菌種を殺すことができることが
分かったことは興味深い。このことはこれら抗カンディ
ダ化合物の抗菌標的が、これら菌種にも同様に存在して
いることを示唆している。このような結果は数種の菌種
が、抗菌化合物の臨床的に適切な濃度における生存を可
能にする自然の耐性機構を持っていることを示してい
る。このような菌類における抗菌化合物に対する一般的
な耐性機構については、未だ記載がない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、菌類オーレ
オバシジウム プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕ
ｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）におけるＭＤＲ遺伝子の発見
について記述する。この遺伝子によってコードされるタ
ンパク、本明細書中以下の「ＡＰ−ＭＤＲ」はＭＤＲ表
現型を提供する。本発明はＡＰ−ＭＤＲをコードする単
離核酸配列を提供するものである。これらの核酸配列は
ＡＰ−ＭＤＲをコードする他の単離核酸化合物と同様、
天然ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）コード配列（配列表の
配列番号：１の一部分として示される）を含む。本発明
にはＡＰ−ＭＤＲをコードする核酸配列を含有するベク
ター及び宿主細胞が含まれる。本発明はさらに精製型の
ＡＰ−ＭＤＲを提供するものである。ＡＰ−ＭＤＲのア
ミノ酸配列は配列表中、配列番号：２として与えられ
る。
オバシジウム プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕ
ｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）におけるＭＤＲ遺伝子の発見
について記述する。この遺伝子によってコードされるタ
ンパク、本明細書中以下の「ＡＰ−ＭＤＲ」はＭＤＲ表
現型を提供する。本発明はＡＰ−ＭＤＲをコードする単
離核酸配列を提供するものである。これらの核酸配列は
ＡＰ−ＭＤＲをコードする他の単離核酸化合物と同様、
天然ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）コード配列（配列表の
配列番号：１の一部分として示される）を含む。本発明
にはＡＰ−ＭＤＲをコードする核酸配列を含有するベク
ター及び宿主細胞が含まれる。本発明はさらに精製型の
ＡＰ−ＭＤＲを提供するものである。ＡＰ−ＭＤＲのア
ミノ酸配列は配列表中、配列番号：２として与えられ
る。
【０００６】別の態様では、本発明は次の化合物の菌類
ＭＤＲ阻害活性の測定法を提供する： ａ）ＡＰ−ＭＤＲの発現をもたらすベクターで形質転換
された酵母細胞を（ｉ）非形質転換状態の酵母細胞は感
受性を示し、形質転換酵母細胞は耐性を示すような抗真
菌剤、及び（ｉｉ）真菌ＭＤＲ阻害活性を持つと考えら
れる化合物の存在下に培養し、 ｂ）該酵母細胞の成育を阻害する抗真菌剤の能力を測定
することによりこの化合物の真菌ＭＤＲ阻害活性を測定
する。
ＭＤＲ阻害活性の測定法を提供する： ａ）ＡＰ−ＭＤＲの発現をもたらすベクターで形質転換
された酵母細胞を（ｉ）非形質転換状態の酵母細胞は感
受性を示し、形質転換酵母細胞は耐性を示すような抗真
菌剤、及び（ｉｉ）真菌ＭＤＲ阻害活性を持つと考えら
れる化合物の存在下に培養し、 ｂ）該酵母細胞の成育を阻害する抗真菌剤の能力を測定
することによりこの化合物の真菌ＭＤＲ阻害活性を測定
する。
【０００７】図１に示す制限酵素の部位及びファンクシ
ョンマップ（機能地図）は、本明細書中で述べるプラス
ミドｐＰＳＲ３の概要を示すものである。制限酵素部位
の情報は完全ではない。ベクター上のこのタイプの制限
酵素部位は実際にマップに示したよりも多いこともあろ
う。
ョンマップ（機能地図）は、本明細書中で述べるプラス
ミドｐＰＳＲ３の概要を示すものである。制限酵素部位
の情報は完全ではない。ベクター上のこのタイプの制限
酵素部位は実際にマップに示したよりも多いこともあろ
う。
【０００８】本明細書中で使用している「ＡＰ−ＭＤ
Ｒ」なる用語は、オーレオバシジウムプルランスの多剤
耐性タンパクを意味する。「ベクター」なる用語は、自
律的に複製又は組み込みを行う物質を意味し、１又はそ
れ以上の付加ＤＮＡ分子を加えることのできるデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）分子を含むプラスミド、ウイルス
（ファージを含む）を含むが、これらに限定されない。
この定義に「発現ベクター」なる用語も含まれる。ベク
ターはＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの増
幅及び／又は発現か、あるいはＡＰ−ＭＤＲをコードす
るＤＮＡ又はＲＮＡと交雑するＤＮＡ又はＲＮＡの増幅
のどちらか一方のために用いられる。「発現ベクター」
なる用語は転写プロモーター（以下「プロモーター」）
及びＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡセグメントの発現
を操縦する位置にある他の調節配列を含むベクターを意
味する。本発明の発現ベクターは複製可能なＤＮＡ構成
であり、このＤＮＡ構成中においてＡＰ−ＭＤＲをコー
ドするＤＮＡ配列が適当な宿主中でＡＰ−ＭＤＲの発現
をもたらすことのできるような適当な制御配列に操作可
能に連結している。このような制御配列はプロモータ
ー、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適
当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及
び転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。ＤＮＡ領
域はお互いが機能的に関係しているときに操作可能に連
結する。例えばプロモーターはそれがＤＮＡコード配列
の転写を制御するとき、この配列に操作可能に連結して
おり、コード配列の翻訳を可能にするような位置にある
とき、リボソーム結合部位はコード配列に操作可能に結
合している。「ＭＤＲ阻害活性」なる用語は宿主細胞の
ＭＤＲ活性を阻害する化合物の能力を示し、それによっ
て前記の宿主細胞に対する抗菌化合物の抗菌活性が増加
する。
Ｒ」なる用語は、オーレオバシジウムプルランスの多剤
耐性タンパクを意味する。「ベクター」なる用語は、自
律的に複製又は組み込みを行う物質を意味し、１又はそ
れ以上の付加ＤＮＡ分子を加えることのできるデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）分子を含むプラスミド、ウイルス
（ファージを含む）を含むが、これらに限定されない。
この定義に「発現ベクター」なる用語も含まれる。ベク
ターはＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの増
幅及び／又は発現か、あるいはＡＰ−ＭＤＲをコードす
るＤＮＡ又はＲＮＡと交雑するＤＮＡ又はＲＮＡの増幅
のどちらか一方のために用いられる。「発現ベクター」
なる用語は転写プロモーター（以下「プロモーター」）
及びＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡセグメントの発現
を操縦する位置にある他の調節配列を含むベクターを意
味する。本発明の発現ベクターは複製可能なＤＮＡ構成
であり、このＤＮＡ構成中においてＡＰ−ＭＤＲをコー
ドするＤＮＡ配列が適当な宿主中でＡＰ−ＭＤＲの発現
をもたらすことのできるような適当な制御配列に操作可
能に連結している。このような制御配列はプロモータ
ー、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適
当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及
び転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。ＤＮＡ領
域はお互いが機能的に関係しているときに操作可能に連
結する。例えばプロモーターはそれがＤＮＡコード配列
の転写を制御するとき、この配列に操作可能に連結して
おり、コード配列の翻訳を可能にするような位置にある
とき、リボソーム結合部位はコード配列に操作可能に結
合している。「ＭＤＲ阻害活性」なる用語は宿主細胞の
ＭＤＲ活性を阻害する化合物の能力を示し、それによっ
て前記の宿主細胞に対する抗菌化合物の抗菌活性が増加
する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明においては、ＡＰ
−ＭＤＲをコードするＤＮＡの発現をもたらすベクター
で形質転換された宿主細胞によってＡＰ−ＭＤＲを合成
してもよい。ＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡは自然配
列又は合成配列又は両者の組み合わせ（「半合成配
列」）でもよい。これらの配列のインビトロ又はインビ
ボの転写及び翻訳は結果としてＡＰ−ＭＤＲを生産す
る。ＡＰ−ＭＤＲをコードする合成及び半合成配列は当
業者には公知の方法によって構築できる。Ｂｒｏｗｎ
ら，（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，
６８：１０９−１５１を参照する。ＡＰ−ＭＤＲコード
ＤＮＡ又はその一部はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ ３８０Ａ型又は３８０Ｂ型ＤＮＡシンセサイザ
ー（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，８５０Ｌｉｎｃ
ｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ
ｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４から商業的に入手可能）のよ
うな慣用のＤＮＡ合成装置を用いて合成できる。
−ＭＤＲをコードするＤＮＡの発現をもたらすベクター
で形質転換された宿主細胞によってＡＰ−ＭＤＲを合成
してもよい。ＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡは自然配
列又は合成配列又は両者の組み合わせ（「半合成配
列」）でもよい。これらの配列のインビトロ又はインビ
ボの転写及び翻訳は結果としてＡＰ−ＭＤＲを生産す
る。ＡＰ−ＭＤＲをコードする合成及び半合成配列は当
業者には公知の方法によって構築できる。Ｂｒｏｗｎ
ら，（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，
６８：１０９−１５１を参照する。ＡＰ−ＭＤＲコード
ＤＮＡ又はその一部はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ ３８０Ａ型又は３８０Ｂ型ＤＮＡシンセサイザ
ー（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，８５０Ｌｉｎｃ
ｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ
ｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４から商業的に入手可能）のよ
うな慣用のＤＮＡ合成装置を用いて合成できる。
【００１０】遺伝子コードの自然の縮重のために、かな
り多くではあるが明確な数のＡＰ−ＭＤＲをコードする
ＤＮＡ配列が構築され得ることは当業者には認められよ
う。このようなＤＮＡ配列はすべて本発明によって提供
される。ＡＰ−ＭＤＲをコードする好ましいＤＮＡコー
ド配列はオーレオバシジウム プルランスの自然配列
（配列番号：１）である。このＤＮＡ配列はプラスミド
ｐＰＳＲ３から得るのが好ましい。プラスミドｐＰＳＲ
３は宿主細胞エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＰＳＲ３から得
ることができ、このプラスミドはＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒ
ｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（ＮＲＲＬ），米国農務省，Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ １８１５，Ｐｅｏｒｉ
ａ，ＩＬ ６１６０４の永久培養コレクションに寄託
（寄託日１９９４年２月２３日）されているもので、受
託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２０２で入手可能である。ｐ
ＰＳＲ３の制限部位及びファンクションマップは図１に
示す。ＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡはプラスミドｐ
ＰＳＲ３から約４．０キロ塩基対のＳａｃＩ−ＳｐｈＩ
制限酵素フラグメント上に得ることができる。
り多くではあるが明確な数のＡＰ−ＭＤＲをコードする
ＤＮＡ配列が構築され得ることは当業者には認められよ
う。このようなＤＮＡ配列はすべて本発明によって提供
される。ＡＰ−ＭＤＲをコードする好ましいＤＮＡコー
ド配列はオーレオバシジウム プルランスの自然配列
（配列番号：１）である。このＤＮＡ配列はプラスミド
ｐＰＳＲ３から得るのが好ましい。プラスミドｐＰＳＲ
３は宿主細胞エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＰＳＲ３から得
ることができ、このプラスミドはＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒ
ｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（ＮＲＲＬ），米国農務省，Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ １８１５，Ｐｅｏｒｉ
ａ，ＩＬ ６１６０４の永久培養コレクションに寄託
（寄託日１９９４年２月２３日）されているもので、受
託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２０２で入手可能である。ｐ
ＰＳＲ３の制限部位及びファンクションマップは図１に
示す。ＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡはプラスミドｐ
ＰＳＲ３から約４．０キロ塩基対のＳａｃＩ−ＳｐｈＩ
制限酵素フラグメント上に得ることができる。
【００１１】ＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡの翻訳を
行うために、天然、合成または半合成ＡＰ−ＭＤＲをコ
ードするＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ及びＤ
ＮＡリガーゼを用いて多くの適当な発現ベクターの内の
いずれかに挿入する。これらベクターからの分離、及び
ベクターへの組み込みを促進する制限エンドヌクレアー
ゼ切断部位を持つように、合成及び半合成のＡＰ−ＭＤ
ＲをコードするＤＮＡ配列は設計することができ、天然
のＡＰ−ＭＤＲをコードする核酸は改良することができ
る。使用する特定の制限エンドヌクレアーゼは、用いる
発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンに
よって決められる。制限酵素部位はＡＰ−ＭＤＲ分子の
適切なフレーム内転写及び翻訳を達成するために、制御
配列とＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡとが適切に配向
するように選択される。ＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮ
ＡはＡＰ−ＭＤＲを発現する宿主細胞において機能する
発現ベクターのプロモーター及びリボソーム結合部位と
ともに適当な読み取りフレーム内に位置していなければ
ならない。
行うために、天然、合成または半合成ＡＰ−ＭＤＲをコ
ードするＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ及びＤ
ＮＡリガーゼを用いて多くの適当な発現ベクターの内の
いずれかに挿入する。これらベクターからの分離、及び
ベクターへの組み込みを促進する制限エンドヌクレアー
ゼ切断部位を持つように、合成及び半合成のＡＰ−ＭＤ
ＲをコードするＤＮＡ配列は設計することができ、天然
のＡＰ−ＭＤＲをコードする核酸は改良することができ
る。使用する特定の制限エンドヌクレアーゼは、用いる
発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンに
よって決められる。制限酵素部位はＡＰ−ＭＤＲ分子の
適切なフレーム内転写及び翻訳を達成するために、制御
配列とＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡとが適切に配向
するように選択される。ＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮ
ＡはＡＰ−ＭＤＲを発現する宿主細胞において機能する
発現ベクターのプロモーター及びリボソーム結合部位と
ともに適当な読み取りフレーム内に位置していなければ
ならない。
【００１２】サッカロミセス セレビシエなどの酵母細
胞におけるＡＰ−ＭＤＲの発現は好ましいものである。
酵母宿主とともに用いられる適当なプロモーター配列は
３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（プラスミドｐＡＰ１
２ＢＤ ＡＴＣＣ ５３２３１上に見いだされ、米国特
許４，９３５，３５０号（１９９０年６月１９日）に記
載がある）又はエノラーゼ（プラスミドｐＡＣ１ ＡＴ
ＣＣ ３９５３２上に見いだされる）などの他の糖分解
酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（プラスミドｐＨｃＧＡＰＣ１ ＡＴＣＣ ５７０９
０，５７０９１から誘導される）、ヘキソキナーゼ、ピ
ルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホ
グリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオー
スリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラー
ゼ、及びグルコキナーゼのためのプロモーターを含む。
誘導酵母プロモーターは転写が成育条件によって制御さ
れるというさらなる利点がある。このようなプロモータ
ーはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソサイトクロム
Ｃ、酸性ホスホターゼ、窒素代謝と関係がある分解酵
素、メタロチオネイン（プラスミドベクターｐＣＬ２８
ＸｈｏＬＨＢＰＶ ＡＴＣＣ ３９４７５に含まれ、米
国特許４，８４０，８９６号に記載）、グリセルアルデ
ヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びマルトースとガラ
クトースの消費に関与する酵素（プラスミドｐＲＹ１２
１ ＡＴＣＣ ３７６５８及びプラスミドｐＰＳＲ３上
にみられるＧＡＬ１）のためのプロモーター領域を含
む。酵母発現に使用される適当なベクター及びプロモー
ターはＲ．Ｈｉｔｚｅｍａｎらによって欧州特許公開
Ｎｏ．７３，６５７にさらに記載されている。サッカロ
ミセス セレビシエ由来のＵＡＳＧａｌエンハンサー
（プラスミドＹＥｐｓｅｃ−−ｈＩ１ｂｅｔａ，ＡＴＣ
Ｃ６７０２４上のＣＹＣ１プロモーターと連結してみら
れる）などの酵母エンハンサーもまた酵母プロモーター
とともに使用すると有利である。
胞におけるＡＰ−ＭＤＲの発現は好ましいものである。
酵母宿主とともに用いられる適当なプロモーター配列は
３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（プラスミドｐＡＰ１
２ＢＤ ＡＴＣＣ ５３２３１上に見いだされ、米国特
許４，９３５，３５０号（１９９０年６月１９日）に記
載がある）又はエノラーゼ（プラスミドｐＡＣ１ ＡＴ
ＣＣ ３９５３２上に見いだされる）などの他の糖分解
酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（プラスミドｐＨｃＧＡＰＣ１ ＡＴＣＣ ５７０９
０，５７０９１から誘導される）、ヘキソキナーゼ、ピ
ルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホ
グリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオー
スリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラー
ゼ、及びグルコキナーゼのためのプロモーターを含む。
誘導酵母プロモーターは転写が成育条件によって制御さ
れるというさらなる利点がある。このようなプロモータ
ーはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソサイトクロム
Ｃ、酸性ホスホターゼ、窒素代謝と関係がある分解酵
素、メタロチオネイン（プラスミドベクターｐＣＬ２８
ＸｈｏＬＨＢＰＶ ＡＴＣＣ ３９４７５に含まれ、米
国特許４，８４０，８９６号に記載）、グリセルアルデ
ヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びマルトースとガラ
クトースの消費に関与する酵素（プラスミドｐＲＹ１２
１ ＡＴＣＣ ３７６５８及びプラスミドｐＰＳＲ３上
にみられるＧＡＬ１）のためのプロモーター領域を含
む。酵母発現に使用される適当なベクター及びプロモー
ターはＲ．Ｈｉｔｚｅｍａｎらによって欧州特許公開
Ｎｏ．７３，６５７にさらに記載されている。サッカロ
ミセス セレビシエ由来のＵＡＳＧａｌエンハンサー
（プラスミドＹＥｐｓｅｃ−−ｈＩ１ｂｅｔａ，ＡＴＣ
Ｃ６７０２４上のＣＹＣ１プロモーターと連結してみら
れる）などの酵母エンハンサーもまた酵母プロモーター
とともに使用すると有利である。
【００１３】本発明において有用な様々な発現ベクター
が当業者によく知られている。サッカロミセスにおける
発現のために例えばプラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ ４
００５３，Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，１９７９，Ｎａｔ
ｕｒｅ ２８２：３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，１９７
９，Ｇｅｎｅ ７：１４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，１
９８０，Ｇｅｎｅ１０：１５７）はよく使用される。こ
のプラスミドはトリプトファン中での成育能力に欠ける
酵母変異株に対する選択マーカー、例えばＡＴＣＣ ４
４０７６又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，１９７７，Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２）を与えるｔｒｐ遺伝子を
含んでいる。
が当業者によく知られている。サッカロミセスにおける
発現のために例えばプラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ ４
００５３，Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，１９７９，Ｎａｔ
ｕｒｅ ２８２：３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，１９７
９，Ｇｅｎｅ ７：１４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，１
９８０，Ｇｅｎｅ１０：１５７）はよく使用される。こ
のプラスミドはトリプトファン中での成育能力に欠ける
酵母変異株に対する選択マーカー、例えばＡＴＣＣ ４
４０７６又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，１９７７，Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２）を与えるｔｒｐ遺伝子を
含んでいる。
【００１４】サッカロミセス セレビシエ宿主細胞にお
けるＡＰ−ＭＤＲの発現のために好ましいベクターはプ
ラスミドｐＰＳＲ３である。プラスミドｐＰＳＲ３はサ
ッカロミセス セレビシエ プラスミドｐＹＥＳ−２か
ら誘導され、サッカロミセスセレビシエ ＧＡＬＩプロ
モーター領域を含む。プラスミドｐＹＥＳ−２はＩｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｖａ
ｌｌｅｙ Ｂｌｖｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ ９
２１２１からカタログ番号８２５−２０で公然と入手で
きる。プラスミドｐＰＳＲ３は下記の方法で構築する。
オーレオバシジウム プルランスからゲノムＤＮＡを分
離し、次に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化する。部分
消化したＤＮＡはコスミドクローニングベクターＳｕｐ
ｅｒＣｏｓ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ
ＣＡ ９２０３７）へ連結する。コスミドクローンの
１つであるｃＲ１０６−２０Ａはヒトｍｄｒ−１遺伝子
と高い配列相同性を持つＤＮＡフラグメントを含む。コ
スミドｃＲ１０６−２０Ａは制限エンドヌクレアーゼＢ
ｓｔＸＩ及びＳｐｈＩで消化する。この消化はすべての
ＡＰ−ＭＤＲ読み取りフレームとＡＰ−ＭＤＲプロモー
ターを含む約４，５００塩基対のＤＮＡフラグメントを
脱離する。この約４，５００塩基対のＤＮＡフラグメン
トは標準的な方法を用いてゲル精製する。プラスミドｐ
ＹＥＳ−２もまたＢｓｔＸＩ及びＳｐｈＩで消化し、Ａ
Ｐ−ＭＤＲ遺伝子を含む約４，５００塩基対のＢｓｔＸ
Ｉ−ＳｐｈＩ ＤＮＡフラグメントをこのベクターに連
結し、中間体プラスミドを形成する。次いで中間体プラ
スミドをＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで消化し、オーレオバ
シジウム プルランス ＡＰ−ＭＤＲプロモーター領域
を除去する。ＡＰ−ＭＤＲ読み取りフレームを含む所望
のベクターフラグメントを制限エンドヌクレアーゼ消化
によって脱離したフラグメントからゲル精製する。欠失
領域をプラスミドｐＹＥＳ−２から生じた中間体プラス
ミドのサッカロミセス セレビシエ ＧＡＬ１プロモー
ターとＡＰ−ＭＤＲ読み取りフレームとを並置させた複
製連鎖反応（ＰＣＲ）ＤＮＡフラグメントで置換する。
けるＡＰ−ＭＤＲの発現のために好ましいベクターはプ
ラスミドｐＰＳＲ３である。プラスミドｐＰＳＲ３はサ
ッカロミセス セレビシエ プラスミドｐＹＥＳ−２か
ら誘導され、サッカロミセスセレビシエ ＧＡＬＩプロ
モーター領域を含む。プラスミドｐＹＥＳ−２はＩｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｖａ
ｌｌｅｙ Ｂｌｖｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ ９
２１２１からカタログ番号８２５−２０で公然と入手で
きる。プラスミドｐＰＳＲ３は下記の方法で構築する。
オーレオバシジウム プルランスからゲノムＤＮＡを分
離し、次に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化する。部分
消化したＤＮＡはコスミドクローニングベクターＳｕｐ
ｅｒＣｏｓ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ
ＣＡ ９２０３７）へ連結する。コスミドクローンの
１つであるｃＲ１０６−２０Ａはヒトｍｄｒ−１遺伝子
と高い配列相同性を持つＤＮＡフラグメントを含む。コ
スミドｃＲ１０６−２０Ａは制限エンドヌクレアーゼＢ
ｓｔＸＩ及びＳｐｈＩで消化する。この消化はすべての
ＡＰ−ＭＤＲ読み取りフレームとＡＰ−ＭＤＲプロモー
ターを含む約４，５００塩基対のＤＮＡフラグメントを
脱離する。この約４，５００塩基対のＤＮＡフラグメン
トは標準的な方法を用いてゲル精製する。プラスミドｐ
ＹＥＳ−２もまたＢｓｔＸＩ及びＳｐｈＩで消化し、Ａ
Ｐ−ＭＤＲ遺伝子を含む約４，５００塩基対のＢｓｔＸ
Ｉ−ＳｐｈＩ ＤＮＡフラグメントをこのベクターに連
結し、中間体プラスミドを形成する。次いで中間体プラ
スミドをＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで消化し、オーレオバ
シジウム プルランス ＡＰ−ＭＤＲプロモーター領域
を除去する。ＡＰ−ＭＤＲ読み取りフレームを含む所望
のベクターフラグメントを制限エンドヌクレアーゼ消化
によって脱離したフラグメントからゲル精製する。欠失
領域をプラスミドｐＹＥＳ−２から生じた中間体プラス
ミドのサッカロミセス セレビシエ ＧＡＬ１プロモー
ターとＡＰ−ＭＤＲ読み取りフレームとを並置させた複
製連鎖反応（ＰＣＲ）ＤＮＡフラグメントで置換する。
【００１５】ＰＣＲフラグメントは下記のプライマーと
ともに鋳型としてコスミドｃＲ１０６−２０Ａを用いて
生成する： ５’−ＡＣＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＣ
ＡＡＴＣＣＣＣＡＣＧＣＡＡＴＴＧＣ−３’（配列番
号：３）及び、 ５’−ＣＣＴＧＣＧＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡ
ＧＣＴＣＡＴＴＣＧＧＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＣ−
３’（配列番号：４）。 ＰＣＲフラグメントはＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩで消化し
ゲル精製する。次いでゲル精製したフラグメントを上記
のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ消化中間体プラスミドへ連結す
る。この工程によりＡＰ−ＭＤＲ読み取りフレームをサ
ッカロミセスセレビシエのＧＡＬ１プロモーターと適切
に１列に並べる。得られたプラスミドはｐＰＳＲ３と呼
ぶ。プラスミドｐＰＳＲ３はサッカロミセス セレビシ
エにおけるＡＰ−ＭＤＲの発現に有用である。
ともに鋳型としてコスミドｃＲ１０６−２０Ａを用いて
生成する： ５’−ＡＣＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＣ
ＡＡＴＣＣＣＣＡＣＧＣＡＡＴＴＧＣ−３’（配列番
号：３）及び、 ５’−ＣＣＴＧＣＧＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡ
ＧＣＴＣＡＴＴＣＧＧＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＣ−
３’（配列番号：４）。 ＰＣＲフラグメントはＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩで消化し
ゲル精製する。次いでゲル精製したフラグメントを上記
のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ消化中間体プラスミドへ連結す
る。この工程によりＡＰ−ＭＤＲ読み取りフレームをサ
ッカロミセスセレビシエのＧＡＬ１プロモーターと適切
に１列に並べる。得られたプラスミドはｐＰＳＲ３と呼
ぶ。プラスミドｐＰＳＲ３はサッカロミセス セレビシ
エにおけるＡＰ−ＭＤＲの発現に有用である。
【００１６】プラスミドｐＰＣＲ３を図１に示す。図に
示した通りこのプラスミドはサッカロミセス セレビシ
エ ＧＡＬ１プロモーター（Ｐｇａｌ１）に操作可能に
連結したＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡを含む。プラ
スミドｐＰＳＲ３はまたＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮ
Ａの３’位に位置する酵母転写ターミネーターｃｙｃ１
（Ｔ ｃｙｃ １）を含む。さらにプラスミドｐＰＳＲ３
はエシェリキア コリ宿主細胞における複製を可能にす
るＣｏｌＥ１複製起点（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）、及びア
ンピシリンの存在下で増殖した、プラスミドで形質転換
したエシェリキア コリ細胞の選択のためのアンピシリ
ン耐性遺伝子（Ａｍｐ）を含む。プラスミドｐＰＳＲ３
はさらに酵母宿主細胞における複製を可能にする酵母２
μ複製起点（２μ ｏｒｉ）、及びウラシル欠乏培地で
増殖した、プラスミドで形質転換したＳ．セレビシエ細
胞の選択のための酵母ＵＲＡ３遺伝子を含む。
示した通りこのプラスミドはサッカロミセス セレビシ
エ ＧＡＬ１プロモーター（Ｐｇａｌ１）に操作可能に
連結したＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮＡを含む。プラ
スミドｐＰＳＲ３はまたＡＰ−ＭＤＲをコードするＤＮ
Ａの３’位に位置する酵母転写ターミネーターｃｙｃ１
（Ｔ ｃｙｃ １）を含む。さらにプラスミドｐＰＳＲ３
はエシェリキア コリ宿主細胞における複製を可能にす
るＣｏｌＥ１複製起点（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）、及びア
ンピシリンの存在下で増殖した、プラスミドで形質転換
したエシェリキア コリ細胞の選択のためのアンピシリ
ン耐性遺伝子（Ａｍｐ）を含む。プラスミドｐＰＳＲ３
はさらに酵母宿主細胞における複製を可能にする酵母２
μ複製起点（２μ ｏｒｉ）、及びウラシル欠乏培地で
増殖した、プラスミドで形質転換したＳ．セレビシエ細
胞の選択のための酵母ＵＲＡ３遺伝子を含む。
【００１７】本発明はまたＡＰ−ＭＤＲを発現すること
が可能な組み換え宿主細胞を構築するための方法を含
み、この方法は宿主細胞を、ＡＰ−ＭＤＲをコードする
単離ＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡベクターで形質転
換することからなる。本発明はさらにＡＰ−ＭＤＲの発
現をもたらすことのできるベクターで形質転換した組み
換え宿主細胞においてＡＰ−ＭＤＲを発現させるための
方法を含むものであり、この方法は発現に適した条件の
もとで前記の形質転換宿主細胞を培養することからな
る。
が可能な組み換え宿主細胞を構築するための方法を含
み、この方法は宿主細胞を、ＡＰ−ＭＤＲをコードする
単離ＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡベクターで形質転
換することからなる。本発明はさらにＡＰ−ＭＤＲの発
現をもたらすことのできるベクターで形質転換した組み
換え宿主細胞においてＡＰ−ＭＤＲを発現させるための
方法を含むものであり、この方法は発現に適した条件の
もとで前記の形質転換宿主細胞を培養することからな
る。
【００１８】本発明の好ましい態様ではサッカロミセス
セレビシエ ＩＮＶＳｃ１又はＩＮＶＳｃ２細胞（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓｏｒｒｅｎｔｏ
Ｖａｌｌｅｙ Ｂｌｖｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ
９２１２１から入手可能）を宿主細胞として用いる
が、多くの他の細胞系も使用できる。形質転換された宿
主細胞は選択圧をかけた適当な培地（ウラシル欠乏最小
培地）に置く。次いでこの培地を使用する宿主細胞系に
適した時間と温度で培養する。
セレビシエ ＩＮＶＳｃ１又はＩＮＶＳｃ２細胞（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓｏｒｒｅｎｔｏ
Ｖａｌｌｅｙ Ｂｌｖｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ
９２１２１から入手可能）を宿主細胞として用いる
が、多くの他の細胞系も使用できる。形質転換された宿
主細胞は選択圧をかけた適当な培地（ウラシル欠乏最小
培地）に置く。次いでこの培地を使用する宿主細胞系に
適した時間と温度で培養する。
【００１９】サッカロミセス セレビシエ細胞などの酵
母細胞の形質転換にかかわる方法は当業者にはよく知ら
れているものであり、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における一般的なプロトコー
ル）（１９８９），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ及び補遺などの参考書にみ
ることができよう。形質転換した酵母細胞を培養する明
確な条件は、使用する宿主細胞系及びベクターの性質に
依存する。
母細胞の形質転換にかかわる方法は当業者にはよく知ら
れているものであり、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における一般的なプロトコー
ル）（１９８９），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ及び補遺などの参考書にみ
ることができよう。形質転換した酵母細胞を培養する明
確な条件は、使用する宿主細胞系及びベクターの性質に
依存する。
【００２０】ＡＰ−ＭＤＲは当業者によく知られてい
る、膜結合タンパクの単離及び精製の一般的な方法によ
って形質転換した宿主細胞から単離、精製する。単離し
たＡＰ−ＭＤＲは構造に基づく薬物設計の研究、インビ
トロ結合分析、ポリクローナル及びモノクローナル抗体
の生産において有用である。
る、膜結合タンパクの単離及び精製の一般的な方法によ
って形質転換した宿主細胞から単離、精製する。単離し
たＡＰ−ＭＤＲは構造に基づく薬物設計の研究、インビ
トロ結合分析、ポリクローナル及びモノクローナル抗体
の生産において有用である。
【００２１】ＡＰ−ＭＤＲを生産する組み換えＤＮＡの
別の合成法は固相ペプチド合成によるものである。この
方法は米国特許４．６１７，１４９号に記載されてお
り、ここで教示されている内容はすべて本明細書の一部
を構成する。ポリペプチドの固相化学的合成の原理は当
業者にはよく知られており、この領域での一般的な教科
書であるＤｕｇａｓ，Ｈ．及びＰｅｎｎｙ，Ｃ．，Ｂｉ
ｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（生物有機化
学）（１９８１），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５４〜９２頁などにみられよう。し
かし、組み換え法が好ましい。
別の合成法は固相ペプチド合成によるものである。この
方法は米国特許４．６１７，１４９号に記載されてお
り、ここで教示されている内容はすべて本明細書の一部
を構成する。ポリペプチドの固相化学的合成の原理は当
業者にはよく知られており、この領域での一般的な教科
書であるＤｕｇａｓ，Ｈ．及びＰｅｎｎｙ，Ｃ．，Ｂｉ
ｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（生物有機化
学）（１９８１），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５４〜９２頁などにみられよう。し
かし、組み換え法が好ましい。
【００２２】ＡＰ−ＭＤＲをコードするＲＮＡ又はＤＮ
Ａのいずれかの核酸、又はそれらの一部分はＡＰ−ＭＤ
Ｒ ｍＲＮＡ、ＡＰ−ＭＤＲ ｃＤＮＡ（相補的ＤＮ
Ａ）、又はゲノムＤＮＡの検出のための診断分析に有用
な核酸分子の生産において有用でもある。さらにＡＰ−
ＭＤＲをコードしないがＡＰ−ＭＤＲコードＤＮＡ又は
ＲＮＡとの交雑が可能なＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの
核酸もまた、このような診断分析には有用である。これ
らの核酸分子は蛍光基、放射性原子又は化学発光基など
の検出可能な部分で既知の方法により共有結合で標識で
きる。標識された核酸は次いで、サザン又はノーザン交
雑分析などの慣用の交雑分析又は複製連鎖反応分析（Ｐ
ＣＲ）に用い、交雑ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ分子
を同定する。ＰＣＲ分析は標識されてない核酸分子を用
いて行ってもよい。このような分析はＡＰ−ＭＤＲベク
ター及び形質転換細胞の同定、及び他の生物由来のＡＰ
−ＭＤＲ様ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを検
出するためのインビトロ診断に用いる。
Ａのいずれかの核酸、又はそれらの一部分はＡＰ−ＭＤ
Ｒ ｍＲＮＡ、ＡＰ−ＭＤＲ ｃＤＮＡ（相補的ＤＮ
Ａ）、又はゲノムＤＮＡの検出のための診断分析に有用
な核酸分子の生産において有用でもある。さらにＡＰ−
ＭＤＲをコードしないがＡＰ−ＭＤＲコードＤＮＡ又は
ＲＮＡとの交雑が可能なＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの
核酸もまた、このような診断分析には有用である。これ
らの核酸分子は蛍光基、放射性原子又は化学発光基など
の検出可能な部分で既知の方法により共有結合で標識で
きる。標識された核酸は次いで、サザン又はノーザン交
雑分析などの慣用の交雑分析又は複製連鎖反応分析（Ｐ
ＣＲ）に用い、交雑ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ分子
を同定する。ＰＣＲ分析は標識されてない核酸分子を用
いて行ってもよい。このような分析はＡＰ−ＭＤＲベク
ター及び形質転換細胞の同定、及び他の生物由来のＡＰ
−ＭＤＲ様ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを検
出するためのインビトロ診断に用いる。
【００２３】米国特許出願０８／１１１６８０号は真菌
感染を処置するために真菌ＭＤＲ阻害剤とともに、活性
スペクトルの明らかな抗真菌剤を含む併用治療の使用を
記載しており、この内容はすべて本明細書の一部を構成
する。この併用治療法は、それ以前に限られた臨床関連
抗真菌活性が証明されたに過ぎない抗真菌化合物の抗真
菌活性スペクトルを拡張するものである。同様に抗真菌
活性が証明された化合物もまた、これら化合物の抗真菌
活性がそれまでは耐性であった種に拡張せしめるような
真菌ＭＤＲ阻害剤によって強化される。併用治療などに
有用な化合物の同定のために本発明は、ＭＤＲ阻害活性
を有する化合物の同定のための分析法を提供する。ＡＰ
−ＭＤＲを発現する宿主細胞は真菌ＭＤＲ活性の阻害剤
として有用な化合物の同定のための優れた方法を提供す
る。
感染を処置するために真菌ＭＤＲ阻害剤とともに、活性
スペクトルの明らかな抗真菌剤を含む併用治療の使用を
記載しており、この内容はすべて本明細書の一部を構成
する。この併用治療法は、それ以前に限られた臨床関連
抗真菌活性が証明されたに過ぎない抗真菌化合物の抗真
菌活性スペクトルを拡張するものである。同様に抗真菌
活性が証明された化合物もまた、これら化合物の抗真菌
活性がそれまでは耐性であった種に拡張せしめるような
真菌ＭＤＲ阻害剤によって強化される。併用治療などに
有用な化合物の同定のために本発明は、ＭＤＲ阻害活性
を有する化合物の同定のための分析法を提供する。ＡＰ
−ＭＤＲを発現する宿主細胞は真菌ＭＤＲ活性の阻害剤
として有用な化合物の同定のための優れた方法を提供す
る。
【００２４】通常、分析はＡＰ−ＭＤＲを発現するベク
ターで形質転換された酵母細胞の培養を利用する。宿主
細胞によるＡＰ−ＭＤＲの発現により、酵母細胞が形質
転換されていない状態で感受性を示すような抗真菌化合
物の存在下での宿主細胞の成育が可能になる。このよう
に形質転換された培養酵母細胞は、（ｉ）非形質転換状
態の酵母細胞は感受性を示し、形質転換酵母細胞は耐性
を示すような抗真菌剤、及び （ｉｉ）真菌ＭＤＲ阻害
活性を持つと考えられる化合物の存在下に培養する。Ｍ
ＤＲ阻害剤であると考えられる化合物の効果は、形質転
換された酵母細胞の成育を阻害する抗真菌化合物の能力
を試験することにより測定する。このような阻害はＭＤ
Ｒ阻害剤であると考えられる化合物が、酵母細胞に抗真
菌化合物が作用するのを妨げるＡＰ−ＭＤＲの能力を阻
害すれば起こる。この分析の例を実施例３に示す。本発
明の操作をより充分に示すために、次の実施例を提供す
るが本発明の範囲を限定するものであると解釈してはな
らない。
ターで形質転換された酵母細胞の培養を利用する。宿主
細胞によるＡＰ−ＭＤＲの発現により、酵母細胞が形質
転換されていない状態で感受性を示すような抗真菌化合
物の存在下での宿主細胞の成育が可能になる。このよう
に形質転換された培養酵母細胞は、（ｉ）非形質転換状
態の酵母細胞は感受性を示し、形質転換酵母細胞は耐性
を示すような抗真菌剤、及び （ｉｉ）真菌ＭＤＲ阻害
活性を持つと考えられる化合物の存在下に培養する。Ｍ
ＤＲ阻害剤であると考えられる化合物の効果は、形質転
換された酵母細胞の成育を阻害する抗真菌化合物の能力
を試験することにより測定する。このような阻害はＭＤ
Ｒ阻害剤であると考えられる化合物が、酵母細胞に抗真
菌化合物が作用するのを妨げるＡＰ−ＭＤＲの能力を阻
害すれば起こる。この分析の例を実施例３に示す。本発
明の操作をより充分に示すために、次の実施例を提供す
るが本発明の範囲を限定するものであると解釈してはな
らない。
【００２５】
【実施例】オーレオバシジウム プルランスのＭＤＲをコードする
ＤＮＡ源 実施例１ プラスミドｐＰＳＲ３の単離 エシェリキア コリ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＰＳＲ３の
ライオフィルはＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ
Ｒｅｓｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＮＲＲ
Ｌ），Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４，
受託番号ＮＲＲＬＢ−２１２０２から得られる。プラス
ミドｐＰＳＲ３は当業者によく知られている方法を用い
て、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２０２から単離できる。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（モレキュラ
ー クローニング：実験室マニュアル）（１９８８），
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，ＮＹ、又はＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における一般的なプロトコ
ール）（１９８９），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ及び補遺を参照する。
ＤＮＡ源 実施例１ プラスミドｐＰＳＲ３の単離 エシェリキア コリ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＰＳＲ３の
ライオフィルはＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ
Ｒｅｓｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＮＲＲ
Ｌ），Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４，
受託番号ＮＲＲＬＢ−２１２０２から得られる。プラス
ミドｐＰＳＲ３は当業者によく知られている方法を用い
て、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２０２から単離できる。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（モレキュラ
ー クローニング：実験室マニュアル）（１９８８），
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，ＮＹ、又はＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における一般的なプロトコ
ール）（１９８９），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ及び補遺を参照する。
【００２６】実施例２ ＡＰ−ＭＤＲタンパクの発現 サッカロミセス セレビシエＩＮＶＳｃ１細胞（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃ
Ａ ９２１９１）をＪ．Ｄ．Ｂｅｇｇｓ，１９８８，Ｎ
ａｔｕｒｅ ２７５：１０４−１０９に記載の方法によ
りプラスミドｐＰＳＲ３で形質転換する。ＹＮＢ／ＣＳ
Ｍ−Ｕｒａ／ｒａｆ（４％ラフィノースを加えたＹＮＢ
／ＣＳＭ−Ｕｒａ［ＣＳＭ−ＵＲＡ（Ｂｉｏ １０１，
Ｉｎｃ．）を添加した酵母ニトロゲンベース（Ｄｉｆｃ
ｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍ
Ｉ）］）を含むブイヨン培地中、２８℃で飽和になるま
で振盪培養して形質転換細胞を増殖させる。ＡＰ−ＭＤ
Ｒの発現を誘導するために培養液の一部を単独の炭素源
としてラフィノースよりは、むしろ２％ガラクトースを
加えたＹＮＢ／ＣＳＭ−Ｕｒａ培地（ＹＮＢ／ＣＳＭ−
Ｕｒａ／ｇａｌ）を含むフラスコの接種に用いる。接種
したフラスコは２８℃で約１６時間培養する。
ｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃ
Ａ ９２１９１）をＪ．Ｄ．Ｂｅｇｇｓ，１９８８，Ｎ
ａｔｕｒｅ ２７５：１０４−１０９に記載の方法によ
りプラスミドｐＰＳＲ３で形質転換する。ＹＮＢ／ＣＳ
Ｍ−Ｕｒａ／ｒａｆ（４％ラフィノースを加えたＹＮＢ
／ＣＳＭ−Ｕｒａ［ＣＳＭ−ＵＲＡ（Ｂｉｏ １０１，
Ｉｎｃ．）を添加した酵母ニトロゲンベース（Ｄｉｆｃ
ｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍ
Ｉ）］）を含むブイヨン培地中、２８℃で飽和になるま
で振盪培養して形質転換細胞を増殖させる。ＡＰ−ＭＤ
Ｒの発現を誘導するために培養液の一部を単独の炭素源
としてラフィノースよりは、むしろ２％ガラクトースを
加えたＹＮＢ／ＣＳＭ−Ｕｒａ培地（ＹＮＢ／ＣＳＭ−
Ｕｒａ／ｇａｌ）を含むフラスコの接種に用いる。接種
したフラスコは２８℃で約１６時間培養する。
【００２７】実施例３ 抗真菌強化剤の分析 約１×１０6個のサッカロミセス セレビシエ ＩＮＶ
Ｓｃ１／ｐＰＳＲ３培養細胞をＹＮＢ／ＣＳＭ−Ｕｒａ
／ｇａｌを含む数枚の寒天平板にそれぞれ移す。寒天の
表面はバイオハザードフード中で乾燥させる。サッカロ
ミセス セレビシエ ＩＮＶＳｃ１／ｐＰＳＲ３細胞は
ＡＰ−ＭＤＲ活性を発現する。Ｒ１０６Ｉ（米国特許
５，０５７，４９３号、この内容は本明細書の一部を構
成する）などの非形質転換酵母細胞が典型的に感受性を
示す抗真菌化合物を１００％エタノール中に１又は７ｍ
ｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解する。１ｍｇ／ｍｌのこ
の溶液２０μｌを抗生物質感受性検定ディスク（Ｄｉｆ
ｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍ
Ｉ）に置く。抗真菌剤溶液を加えた後、このディスクを
バイオハザードフード中で風乾させる。乾燥の際、ディ
スクはサッカロミセス セレビシエ ＩＮＶＳｃ１／ｐ
ＰＳＲ３細胞を含むペトリ皿の表面に置く。ＡＰ−ＭＤ
Ｒ阻害の能力を検定する化合物をジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）中に溶解する。ＤＭＳＯに加える化合物の
量は検定する各化合物の溶解度に依存する。検定する化
合物を含む懸濁液２０μｌを抗生物質感受性検定ディス
ク（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒ
ｏｉｔ，ＭＩ）に加える。検定化合物を含むこのディス
クをバイオハザードフード中で風乾させる。次いでこの
ディスクを抗真菌化合物を含むディスクから約２ｃｍ離
してサッカロミセスセレビシエ ＩＮＶＳｃ１／ｐＰＳ
Ｒ３細胞を含む乾燥ペトリ皿の表面に置く。２枚のディ
スクを含むペトリ皿は２８℃で約１６時間インキュベー
トする。
Ｓｃ１／ｐＰＳＲ３培養細胞をＹＮＢ／ＣＳＭ−Ｕｒａ
／ｇａｌを含む数枚の寒天平板にそれぞれ移す。寒天の
表面はバイオハザードフード中で乾燥させる。サッカロ
ミセス セレビシエ ＩＮＶＳｃ１／ｐＰＳＲ３細胞は
ＡＰ−ＭＤＲ活性を発現する。Ｒ１０６Ｉ（米国特許
５，０５７，４９３号、この内容は本明細書の一部を構
成する）などの非形質転換酵母細胞が典型的に感受性を
示す抗真菌化合物を１００％エタノール中に１又は７ｍ
ｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解する。１ｍｇ／ｍｌのこ
の溶液２０μｌを抗生物質感受性検定ディスク（Ｄｉｆ
ｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍ
Ｉ）に置く。抗真菌剤溶液を加えた後、このディスクを
バイオハザードフード中で風乾させる。乾燥の際、ディ
スクはサッカロミセス セレビシエ ＩＮＶＳｃ１／ｐ
ＰＳＲ３細胞を含むペトリ皿の表面に置く。ＡＰ−ＭＤ
Ｒ阻害の能力を検定する化合物をジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）中に溶解する。ＤＭＳＯに加える化合物の
量は検定する各化合物の溶解度に依存する。検定する化
合物を含む懸濁液２０μｌを抗生物質感受性検定ディス
ク（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒ
ｏｉｔ，ＭＩ）に加える。検定化合物を含むこのディス
クをバイオハザードフード中で風乾させる。次いでこの
ディスクを抗真菌化合物を含むディスクから約２ｃｍ離
してサッカロミセスセレビシエ ＩＮＶＳｃ１／ｐＰＳ
Ｒ３細胞を含む乾燥ペトリ皿の表面に置く。２枚のディ
スクを含むペトリ皿は２８℃で約１６時間インキュベー
トする。
【００２８】培養に次いで、ディスク周囲の成育阻害の
ゾーンを調べる。検定プレート上の抗真菌ディスク付近
の成育阻害ゾーンはＭＤＲ阻害活性について検定される
化合物がＡＰ−ＭＤＲの活性を妨害し、抗真菌化合物に
宿主細胞の成育を阻害させていることを示している。こ
のような化合物はＭＤＲ阻害活性を持つと言える。成育
阻害ゾーンの小さい、もしくはない場合は検定化合物が
ＭＤＲ活性を妨害せず、従ってＡＰ−ＭＤＲが抗真菌化
合物に作用し宿主細胞のＭＤＲ阻害活性を妨害している
ことを示す。
ゾーンを調べる。検定プレート上の抗真菌ディスク付近
の成育阻害ゾーンはＭＤＲ阻害活性について検定される
化合物がＡＰ−ＭＤＲの活性を妨害し、抗真菌化合物に
宿主細胞の成育を阻害させていることを示している。こ
のような化合物はＭＤＲ阻害活性を持つと言える。成育
阻害ゾーンの小さい、もしくはない場合は検定化合物が
ＭＤＲ活性を妨害せず、従ってＡＰ−ＭＤＲが抗真菌化
合物に作用し宿主細胞のＭＤＲ阻害活性を妨害している
ことを示す。
【００２９】
【００３０】 配列番号：１ 配列の長さ：３９０９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【００３１】 配列番号：２ 配列の長さ：１３０２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク 配列
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【００３２】 配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列
【化１２】
【００３３】 配列番号：４ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:ＤＮＡ 配列
【化１３】
【図１】 プラスミドｐＰＳＲ３の制限酵素部位及びフ
ァンクションマップを示す模式図。
ァンクションマップを示す模式図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/18 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 ポール・ルーサー・スカートラッド アメリカ合衆国46143インディアナ州グリ ーンウッド、ウエスト・ステイト・ロード 144、5579番
Claims (3)
- 【請求項１】 オーレオバシジウム プルランス(Ａｕ
ｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ)ＭＤＲ
をコードする単離された核酸分子。 - 【請求項２】 配列番号：２によってコードされる精製
タンパク。 - 【請求項３】 ａ）ＡＰ−ＭＤＲの発現をもたらすベク
ターで形質転換された酵母細胞を（ｉ）非形質転換状態
の酵母細胞は感受性を示し、形質転換酵母細胞は耐性を
示すような抗真菌剤、及び（ｉｉ）真菌ＭＤＲ阻害活性
を持つと考えられる化合物の存在下に培養し、 ｂ）前記酵母細胞の成育を阻害する抗真菌剤の能力を測
定することにより前記化合物の真菌ＭＤＲ阻害活性を決
定することからなる化合物の真菌性ＭＤＲ阻害活性の測
定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/232,537 US5516655A (en) | 1994-04-20 | 1994-04-20 | Multiple drug resistance gene of Aureobasidium pullulans |
| US232537 | 1994-04-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07303489A true JPH07303489A (ja) | 1995-11-21 |
Family
ID=22873532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7093674A Pending JPH07303489A (ja) | 1994-04-20 | 1995-04-19 | オーレオバシジウム プルランスの多剤耐性遺伝子 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5516655A (ja) |
| EP (1) | EP0678578A3 (ja) |
| JP (1) | JPH07303489A (ja) |
| AU (1) | AU684142B2 (ja) |
| CA (1) | CA2147110A1 (ja) |
| HU (1) | HUT72842A (ja) |
| IL (1) | IL113405A0 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5773214A (en) * | 1995-02-27 | 1998-06-30 | Eli Lilly And Company | Multiple drug resistance gene of aspergillus flavus |
| US5705352A (en) * | 1995-02-27 | 1998-01-06 | Eli Lilly And Company | Multiple drug resistance gene of Aspergillus fumigatus |
| US5786463A (en) * | 1996-03-08 | 1998-07-28 | Eli Lilly And Company | Multiple drug resistance gene of Cryptococcus neoformans |
| US5914246A (en) * | 1996-03-08 | 1999-06-22 | Eli Lilly And Company | Multiple drug resistance gene of Aspergillus fumigatus |
| US5945324A (en) * | 1997-12-23 | 1999-08-31 | Eli Lilly And Company | Multiple drug resistance gene ATRC of aspergillus nidulans |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US492546A (en) * | 1893-02-28 | Combined copy-holder and folio-indicator for type-writers | ||
| US5057493A (en) * | 1988-07-19 | 1991-10-15 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Novel antibiotics r106 |
| AU665341B2 (en) * | 1990-12-18 | 1996-01-04 | Wellcome Foundation Limited, The | Agents for potentiating the effects of antitumor agents and combating multiple drug resistance |
-
1994
- 1994-04-20 US US08/232,537 patent/US5516655A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-04-13 CA CA002147110A patent/CA2147110A1/en not_active Abandoned
- 1995-04-17 IL IL11340595A patent/IL113405A0/xx unknown
- 1995-04-18 AU AU16506/95A patent/AU684142B2/en not_active Ceased
- 1995-04-18 EP EP95302542A patent/EP0678578A3/en not_active Withdrawn
- 1995-04-19 HU HU9501115A patent/HUT72842A/hu unknown
- 1995-04-19 JP JP7093674A patent/JPH07303489A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU684142B2 (en) | 1997-12-04 |
| US5516655A (en) | 1996-05-14 |
| CA2147110A1 (en) | 1995-10-21 |
| AU1650695A (en) | 1995-11-02 |
| IL113405A0 (en) | 1995-07-31 |
| EP0678578A2 (en) | 1995-10-25 |
| EP0678578A3 (en) | 1996-12-04 |
| HUT72842A (en) | 1996-05-28 |
| HU9501115D0 (en) | 1995-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nechaev et al. | Inhibition of Escherichia coli RNA polymerase by bacteriophage T7 gene 2 protein | |
| US5925516A (en) | Medicaments for the treatment of papillomavirus diseases | |
| US5846764A (en) | Materials and methods relating to proteins that interact with casein kinase I | |
| JPH07303489A (ja) | オーレオバシジウム プルランスの多剤耐性遺伝子 | |
| US6071715A (en) | Nucleic acids encoding novel proteins which bind to retinoblastoma protein | |
| US5773214A (en) | Multiple drug resistance gene of aspergillus flavus | |
| US5945324A (en) | Multiple drug resistance gene ATRC of aspergillus nidulans | |
| US6228615B1 (en) | Multiple drug resistance gene atrD of Aspergillus nidulans | |
| US5705352A (en) | Multiple drug resistance gene of Aspergillus fumigatus | |
| US5786463A (en) | Multiple drug resistance gene of Cryptococcus neoformans | |
| AU757920B2 (en) | Genes of the dead box protein family, their expression products and use | |
| EP0851912A4 (en) | INNOVATIVE FACTORS THAT CHANGE GENTRAL TRANSCRIPTION AND METHOD FOR APPLYING IT | |
| AU696986C (en) | Novel proteins which bind to retinoblastoma protein and their encoding DNA equences | |
| JP3335194B2 (ja) | 植物の病害抵抗性特異的リポキシゲナ−ゼ遺伝子 | |
| US5914246A (en) | Multiple drug resistance gene of Aspergillus fumigatus | |
| MXPA98008006A (en) | Novedoso transcription factor, tfiib, of candida albicans, sequence of nucleic acids that codify thereof, and methods of selective classification of growth inhibitors of candida albic | |
| JPH02215395A (ja) | チトクロームＰ―４５０ＨＦＬａ蛋白質、そのＤＮＡ配列およびその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041102 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050405 |