HUT72842A - Multiple drug resistance gene of aureobasidium pullulans - Google Patents

Description

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A jelen találmány rekombináns DNS technológiával kapcsolatos. A találmány különösen, az Aureobasidium pullulans többszörös gyógyszer rezisztencia proteinjét kódoló nukleinsav klónozásával kapcsolatos.

A humán mdr-1 gén termék által közvetített többszörös gyógyszer rezisztenciát (multiple drog resistance = MDR) kezdetben a rák kemoterápiában felhasználha-2 r tó eszközök fejlesztése során észlelték (Fajo és munkatársai, 1987 Journal of Clinical Qncoloqy 5:1922-1927). Egy többszörös gyógyszer rezisztencia rákos sejtvonal számos citotoxikus vegyület magas szintje ellen mutat rezisztenciát. Gyakran ezek a citotoxikus vegyületek nem rendelkeznek közös szerkezeti tulajdonságokkal, valamint nem hatnak egymásra a sejtben levő közös céllal. Az ezen citotoxikus anyagokkal szembeni rezisztenciát egy kifelé irányuló ATP-függő pumpa közvetíti, mely pumpát az mdr-1 gén kódolja. Ezen mechanizmus révén, a sejten belül nem akkumulálódhat egy bizonyos citotoxikus vegyületek toxikus szintje.

Az MDR-szerű géneket számos eltérő organizmusban azonosították, ideértve számos baktérium fajt, a gyümölcslégy Drosophila melanogaster-t, Plasmodium falciparum-ot az élesztőgomba Saccharomyces cerevisiae-t, a Caenorhabditid elegans-t, a Leishmania donovanii-t, a tengeri szivacsokat, a növény Arabidopsis thaliana-t valamint a Homo sapiens-t is. A kiterjedt kutatás vegyületek számos csoportjáról kiderítette, hogy képes megváltoztatni a többszörös gyógyszer rezisztencia humán rákos sejt vonalak MDR fenotípusát érzékennyé téve ezeket a citotoxikus vegyületek hatásával szemben. Ezek a vegyületek - melyekre a találmányban MDR inhibitorokként utalunk - például a következőket foglalják magukba: a kálcium csatorna blokkolókat, az anti-arrhytmia szereket, a vérnyomáscsökkentő szereket, az antibiotikumokat, az antihisztaminokat, a lipofil kationokat, a diterpéneket, a detergenseket, a depressziót csökkentő szereket, és az antipsyhotikumokat (Gottesman and Pastan, 1993, Annual Review of Biochemistry 62:385-427). A humán MDR inhibitorok rák kemoterápiában való klinikai alkalmazása a kutatások fókuszába került.

Másik területen, bizonyos gomba fajok elleni gombaellenes vegyületek felfedezésével és fejlesztésével, szintén sikereket értek el. A Candida fajok képviselik a gombás fertőzések többségét, és az új gombaellenes vegyületekhez szkrinelési módszereket terveztek, melyekkel Candida ellenes vegyületeket lehet felfedezni. A gombaellenes szerek fejlesztése során az aktivitást általában a C. albicans elleni aktivitást alapul véve optimalizálták. Ennek következtében ezek a Candida ellenes vegyületek gyakran nem rendelkeznek klinikai szempontból jelentős aktivitással más gomba fajokkal szemben. Azonban, érdekes megjegyezni, hogy magasabb koncentrációkban bizonyos Candida ellenes vegyületek képesek más gomba fajokat is elpusztítani. Ez azt sugallja, hogy ezen Candida elleni vegyületek gombaellenes célja(i) jelen van(nak) ezekben a gomba fajokban is. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy néhány gombafaj egy olyan természetes rezisztencia mechanizmussal rendelkezik, mely lehetővé teszi számukra, hogy gombaellenes vegyületek klinikailag alkalmazott koncentrációit is túléljék. A gombákban előforduló gombellenes vegyietekkel szembeni rezisztencia egy ilyen általános mechanizmusa még nem került leírásra.

A jelen találmányban leírásra kerül egy az Aureobasidium pullulans gombában levő MDR gén felfedezése. Az ezen gén által kódolt protein, melyet a találmány során AP-MDR-nek nevezünk, az MDR fenotípust biztosítja. A találmány biztosítja az AP-MDR-et kódoló izolált nukleinsav szekvenciát. Ezek a nukleinsav szekvenciák magukba foglalják a természetes DNS (dezoxiribonukleinsav) kódoló szekvenciát (a szekvencia listában szereplő 1. számú szekvencia részeként mutatjuk be), valamint bármely más izolált nukleinsav vegyületet, mely kódolja az AP-MDR-t. A találmány magába foglalja az AP-MDR-t kódoló nukleinsav szekvenciákat tartalmazó vektorokat és gazdasejteket. A jelen találmány továbbá az AP-MDR-t tisztított formában biztosítja. Az ΑΡ-MDR aminosav szekvenciáját a szekvencia lista 2. számú szekvenciájaként adjuk meg.

-4 A találmány egy másik megvalósulásában a találmány egy módszert biztosít a vegyület gomba MDR gátló aktivitásának meghatározására, mely a következőkkel jellemezhető:

a) egy élesztőgomba sejt tenyészetet szaporítunk, mely sejteket az AP-MDR expresszióját biztosító vektorral transzformáltuk (i) egy gombaellenes szer, mellyel szemben az említett élesztőgomba sejt rezisztens, de mellyel szemben az említett élesztőgomba sejt érzékeny ha nincs transzformált állapotban;

(ii) egy feltételezetten gomba MDR gátló aktivitással rendelkező vegyület jelenlétében; és

b) meghatározzuk az említett vegyület gomba MDR gátló aktivitását oly módon, hogy mérjük a gombaellenes szer említett élesztőgomba sejt növekedésére kifejtett gátló képességét.

A csatolt rajzon bemutatott restrikciós enzim hely és funkciós térkép egy megközelítő bemutatása a találmány során bemutatott pPSR3 plazmidnak, A restrikciós enzim hely információi nem teljesek. Egy adott típus több restrikciós enzim helye lehet a vektoron mint amennyit valójában bemutatunk a térképen.

1. ábra - A pPSR3 plazmid egy restrikziós enzim helye és funkciós térképe.

A találmány szerinti alkalmazásban az AP-MDR fogalma az Aureobasidium pullulans többszörös gyógyszer rezisztencia proteinjét jelenti.

A vektor kifejezés bármely némán replikálódó vagy integrálódó anyagot magába foglal, ideértve az ezekre való korlátozódás nélkül, a plazmidokat és a vírusokat (ideértve a fágokat is), melyek tartalmaznak egy olyan dezoxiribonukleinsav (DNS) molekulát, melyhez egy vagy több további DNS molekula adható. Ebbe a meghatározásba tartozik az expressziós vektor kifejezés is. A vektorokat vagy az «5 AP-MDR-t kódoló DNS vagy RNS amplifikálására és/vagy expresszálására használjuk vagy az AP-MDR-t kódoló DNS-sel vagy RNS-sel hibridizáló DNS vagy RNS amplifikálására.

Az expressziós vektor kifejezés olyan vektorokra utal, melyek tartalmaznak egy transzkripciós promotert (a későbbiekben promoter), valamint más egy az APMDR-t kódoló DNS szegment expressziójának irányítására pozícionált más szabályozó szekvenciát. A jelen találmány expressziós vektorai replikálható DNS szerkezetek, melyekben egy az AP-MDR-t kódoló DNS szekvencia működőképesen kapcsolódik megfelelő szabályozó szekvenciákhoz, melyek képesek az AP-MDR megfelelő gazdában való expressziójának befolyásolására. Ezek közé a megfelelő szabályozó szekvenciák közé tartoznak a promoterek, egy tetszés szerinti operátor szekvencia a transzkripció szabályozására, megfelelő mRNS riboszómális kötőhelyeket kódoló szekvencia és a transzkripció és transzláció terminációját szabályozó szekvenciák. A DNS régiók működőképesen kapcsolódnak amikor funkcionálisan kapcsolódnak egymáshoz. Például egy promoter működőképesen kapcsolódik egy DNS kódoló szekvenciához, ha szabályozza a szekvencia transzkripcióját, vagy egy riboszóma kötőhely működőképesen kapcsolódik egy kódoló szekvenciához ha úgy pozícionálták, hogy lehetővé tegye a transzlációt.

Az MDR gátló aktivitás kifejezés egy vegyület azon képességére utal, hogy egy gazdasejtben képes az MDR aktivitást gátolni, így megnövelheti a gombaellenes vegyület említett gazdasejt elleni gombaellenes aktivitását.

A jelen találmányban az AP-MDR szintetizálható az AP-MDR-t kódoló DNS expresszióját biztosító vektorokkal transzformált gazdasejtekkel. Az AP-MDR-t kódoló DNS lehet a természetes szekvencia, vegy lehet egy szintetikus szekvencia vagy lehet a kettő kombinációja (semi-szintetikus szekvencia). Ezen szekvenciák in vitro vagy in vivő transzkripciója és transzlációja eredményezi az AP-MDR termelését. Az

-6 AP-MDR-t kódoló szintetikus és szemi-szintetikus szekvenciák megszerkeszthetők a tudomány e területén jól ismert módszerekkel. Lásd Brown és munkatársai, (1979) Methods in Enzymoloqy, Academic Press, N.Y., 68:109-151. Az AP-MDR-t kódoló DNS vagy ennek részletei létrehozhatók egy hagyományos DNS szintetizáló készülék, mint amilyen az Applied Biosystems Model 380A vagy 380B DNS szintetizálok (a kereskedelemben beszerezhetők az Applied Biosystems, Inc.-tő, 850 Lincoln Center Drive, FosterCity, CA, 94404) segítségével.

A genetikai kód degeneráltságának köszönhetően a tudomány e területén jártas szakember felismeri, hogy számos, de meghatározott számú az AP-MDR-t kódoló DNS szekvencia szerkeszthető meg. Az összes ilyen DNS szekvenciát a jelen találmány biztosítja. Egy ilyen, az AP-MDR-t kódoló előnyben részesített DNS szekvencia az Aureobasidium pullulans természetes szekvenciája (1. számú szekvencia). Ezt a DNS szekvenciát előnyösen a pPSR3 plazmdiból nyerjük. A pPSR3 plazmid az Escherichia coli XL1-Blue/pPSR3 gazdasejtből nyerhető ki, melyet a Northern Régiónál Research Laboratory (NRRL) törzsgyűjteménynél deponáltak a United States Department of Agricultural Service-nél (1815 North University Street, Peoria, IL 61604) 1994 február 23-án és az NRRL B-21202 katalógusszámon szerezhető be. A pPSR3 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a csatolt rajzok közöt az 1. ábraként mutatjuk be. Az AP-MDR-t kódoló DNS-t a pPSR3 plazmidból egy megközelítően 4,0 bázispár hosszúságú Sacl-Sphl restrikciós enzim fragmentről lehet kinyerni.

Az AP-MDR-t kódoló DNS transzlációjának befolyásolásához a természetes, szintetikus, vagy szemi-szintetikus AP-MDR-t kódoló DNS szekvenciát inzertáljuk a nagyszámú, megfelelő expressziós vektorok bármelyikébe megfelelő restrikciós endonukleázok és DNS ligázok felhasználásával. A szintetikus és szemi-szintetikus AP-MDR-t kódoló DNS AP-MDR-ek megtervezhetők és a természetes AP- MDR-t

-7 kódoló nukleinsavak módosíthatók oly módon, hogy tartalmazzanak restrikciós endonukleáz hasítási helyeket az ezen vektorokból való izolálás és az ezen vektorokba való integrálás elősegítése céljából. Az adott, alkalmazott restrikciós endonukleázokat a felhasznált expressziós vektor restrikciós endonukleáz hasítási módja határozza meg (irányítja). A restrikciós enzim helyek úgy kerülnek kiválasztásra, hogy megfelelően orientálják az AP-MDR-t kódoló DNS-t a szabályozó szekvenciákkal az AP-MDR molekula megfelelő in-frame (kereten belüli) transzkripciójának és transzlációjának eléréséhez. Az AP-MDR-t kódoló DNS-t úgy kell pozícionálni, hogy megfelelő leolvasási keretben legyen az expressziós vektor promoterével és riboszóma kötő helyével, melyek mindegyike működőképes abban a gazdasejtben, amelyben az AP-MDR-t expresszálni kívánjuk.

Az AP-MDR élesztőgomba sejtekben, mint Saccharomyces cerevisiae sejtekben való expresszálását előnyben részesítjük. Az élesztőgomba gazdával való használathoz megfelelő promoter magába foglalja a 3-foszfoglicerát kináz promotereit (a pAP12DB ATCC 53231 plazmidon találták meg, és az 1990 junius 19én iktatott 4,935,350 számú US szabadalomban került leírásra) vagy más glikolitikus enzimeket, mint az enoláz (a pAC1 ATCC 39532 plazmidon találták meg), a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (a pHcGAPCI ATCC 57091 plazmidból származik), a hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvát kináz, triózfoszfát izomeráz, foszfoglükóz izomeráz és a glükokináz. Az indukálható élesztőgomba promoterek rendelkeznek azzal a további előnnyel, hogy a transzkripciót a szaporodás körülményei szabályozzák. Az ilyen promoterek közé tartoznak az alkohol dehidrogenáz 2, az izocitokróm C, a savas foszfatáz, a nitrogén metabolizmussal kapcsolatos lebontó enzimek a metallotionein ( a pCL28XhoLHBPV ATCC 39475 plazmid vektor tartalmazza, 4,840,896 számú US szabadalom) a gliceraldehid 3-foszfát dehidrogenáz és a mai

-8 - .......

tóz és galaktóz hasznosításért felelős enzimek (GAL1 a pRY121 ATCC 37658 és a pPSR3 plazmidokon találták meg) promoter régiói. Az élesztőgomba expresszióban való alkalmazáshoz megfelelő vektorokat és promotereket R. Hitzeman és munkatársai írták le a 73,657A számú Európai Szabadalmi Közleményben. Élesztőgomba enhancereket, mint amilyen a Saccharomyces cerevisiae-bő\ származó UAS Gál enhancer (a YEpsec-hHbeta, ATCC 67024, plazmidon a CYC1 promoterrel együtt találták meg) szintén előnyösen lehet alkalmazni az élesztőgomba promoterekkel együtt.

Számos a jelen találmányban használható expressziós vektor ismert a tudomány e területén. A Saccharomyces cerevisiae-ben való használathoz például az YRp7 plazmid (ATCC-40053, Stinchcomb és munkatársai, 1979, Natúré 282:39; Kingsman és munkatársai, 1979, Gene 7:141; Tschemper és munkatársai, 1980, Gene 10:157) általánosan alkalmazott. Ez a plazmid tartalmazza a trp gént, mely egy szelekciós markért biztosít a triptofán jelenlétében szaporodni nem képes mutáns élesztőgomba törzshöz, például az ATCC-44076 vagy a PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12).

Az AP-MDR egy Saccharomyces cerevisiae gazdasejtben való expresszálásához előnyben részesített vektor a pPSRr plazmid. A pPSR3 plazmid a pYES-2 S. cerevisiae plazmidból származik, mely tartalmazza a S. cerevisiae GAL1 promoter régiót. A pYES-2 plazmid beszerezhető az Invitrogen Corp.-tól (Sorrento Valley Blvd., San Diego CA 92121) a 825-20 katalógusszámon. A pPSR3 plazmidot a következők szerint szerkesztjük meg. Genom DNS-t izolálunk az Aureobasidium pulllulans-ból, majd részleges emésztésnek vetjük alá a Sau3AI restrikciós enzimmel. Ezt a részlegesen emésztett DNS-t ligáljuk a SuperCos 1 cozmid klónozó vektorba (Stratagene, LaJolla CA, 92037). A kozmid kiónok egyike, a cR106-20A, egy olyan DNS fragmentet tartalmazott, mely magas szekvencia homológiát mutat a hu-9 mán mdr-1 génnel. A cR106-20A kozmidot a BstXI és Sphl restrikciós endonukleázokkal emésztjük. Ez az emésztés felszabadít egy megközelítően 4500 bázispár hosszúságú DNS fragmentet, mely tartalmazza teljes AP-MDR nyílt leolvasási keretet és az AP-MDR promotert. Ezt a megközelítően 4500 bázispár hosszúságú DNS fragmentet géltisztításnak vetjük alá standard eljárásokat használva. A pYES-2 plazmidot is BstXi-gyel és Sphl-gyel emésztjük és a megközelítően 4500 bázispár hosszúságú BstXI-Sphl DNS fragmentet - mely tartalmazza az AP-MDR gént - ebbe a vektorba ligáljuk egy köztes plazmid létrehozása céljából. Ezután a köztes plazmidot emésztjük EcoRI-gyel és Sacl-gyel az Aureobasidium pullulans APMDR promoter régió eltávolítása céljából. Az AP-MDR nyílt leolvasási keretet tartalmazó kívánt vektor fragmentet a restrikciós endonukleáz emésztés által felszabadított fragmentektől géltisztítjuk. A kivágott régiót egy polimeráz lánc reakcióval (PCR) létrehozott DNS fragmenttel helyettesítjük, mely juxta pozícióba hozta az AP-MDR nyílt leolvasási keretet a pYES-2 plazmidból származó köztes plazmid Saccharomyces cerevisiae GAL1 promoterével.

A PCR fragmentet templátként a CR106-20A kozmidot felhasználva hozzuk létre a következő primereket használva:

5'-ACGCGAGATCTTCTCTCCAGTCAATCCCCACGCAATTGC-3' (3. számú szekvencia) és

5'-CCTGCGTCATCTTCAAGGGCGAGCTCATTCGGGTTCAAGAATCTTC-3' (4. számú szekvencia). A PCR fragmentet Sacl-gyel és EcoRI-gyel emésztjük és géltisztítjuk. A géltisztított fragmentet ezután A fenti EcoRI-Sacl-gyel emésztett köztes plazmidhoz ligáljuk. Ez az eljárás az AP-MDR nyílt leolvasási keretet megfelelő sorrendbe hozza a Saccharomyces cerevisiae GAL1 promoterével. A kapott plazmidot pPSR3 plazmidnak hívjuk. A pPSR3 plazmid hasznos az AP-MDR S. cerevisiae-ben való expressziójában.

-10A pPSR3 plazmid bemutatását az 1. ábrán adjuk meg. Ahogy fent említettük, ez a plazmid az AP-MDR-t kódoló DNS-t a Saccharomyces cerevisiae GAL1 promoterhez működőképesen kapcsolva tartalmazza (PgaH). A pPSR3 plazmid a cyc 1 élesztőgomba transzkripciós terminátort is tartalmazza az AP-MDR-t kódoló DNS 3' vége felé pozícionálva. A pPSR3 plazmid továbbá tartalmazza a ColE1 replikációs origót is (ColE1 őri), ami lehetővé teszi az Escherichia coli gazdasejtben való replikációt és az ampicillin rezisztencia gént (Amp) a plazmiddal transzformált és ampicillin jelenlétében szaporított E. coli sejtek szelektálását lehetővé téve. A pPSR3 plazmid továbbá tartalmazza az élesztőgomba 2μ replikációs origót (2μ őri) is, ami lehetővé teszi az élesztőgomba gazdasejtben való expressziót és az élesztőgomba URA3 gént az uracilt nem tartalmazó tápközegben szaporított a plazmidot tartalmazó S. cerevisiae szelekcióját lehetővé téve.

A jelen találmány tartalmaz egy olyan módszert is, mellyel egy az AP-MDR expresszálására képes rekombináns gazda sejtet lehet megszerkeszteni. Az említett módszer abból áll, hogy egy gazdasejtet egy az AP-MDR-t kódoló izolált DNS szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS vektorral transzformálunk A jelen találmány továbbá magába foglal egy olyan módszert is, mely révén az AP-MDR expresszálását biztosítani képes vektorral transzformált rekombináns gazdasejtben az AP-MDR-t expresszáljuk; az említett módszer magába foglalja az említett transzformált gazdasejtek az expressziónak megfelelő körülmények közötti tenyésztését.

A találmány egy előnyben részesített megvalósulásában Saccharomyces cerevisiae INVScl vagy INVSc2 sejteket (beszerezhetők az Invitrogen Corp.-től, Sorrento Valley Blvd., San Diego CA 92121) használunk gazdasejtekként, de számos más sejtvonal felhasználható erre a célra. A transzformált gazdasejteket egy megfelelő táptalajra szélesztjük szelekciós nyomás alatt (uracilt nem tartalmazó mi-

nimál táptalaj). A tenyészeteket ezután az alkalmazott gazdasejtvonal számára megfelelő ideig és hőmérsékleten inkubáljuk.

Az élesztőgomba sejtek, mint a Saccharomyces cerevisiae sejtek, transzformálására használt technikák jól ismertek a tudomány e területén és megtalálhatók az olyan általános művekben mint az Ausubel és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology (1989), John Wiley & Sons, Now York, N.Y. és kiegészítőiben. A transzformált élesztőgomba tenyésztéséhez használt pontos körülmények az élesztőgomba sejtvonal természetétől és az alkalmazott vektoroktól függnek.

Az AP-MDR a transzformált gazdasejtekből általános membrán kötött protein izolálási és tisztítási technikákkal izolálható és tisztítható, mely technikák jól ismertek a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára. Az izolált AP-MDR hasznos a szerkezet-alapú gyógyszer tervezési kísérletekben, az in vitro kötési vizsgálatokban és a poliklonális és monoklonális antitestek előállításában.

Az AP-MDR rekombináns DNS termelésének egy alternatívája a szilárd fázisú peptidszintézissel való szintézis. Ezt az eljárást a 4,617,149 számú US szabadalomban írták le, mely szabadalom a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. A polipeptidek szilárd fázisú kémiai szintézisének elvei jól ismertek a tudomány területén és megtalálhatók a tudomány általános irodalmában, pl. Dugas, H. and Penney, C., Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York p54-92. Azonban a rekombináns eljárások előnyben részesülnek.

Az AP-MDR-t kódoló nukleinsav, RNS vagy DNS, vagy ezek része szintén hasznos lehet az AP-MDR mRNS, AP-MDR cDNS (komplementer DNS) vagy genom DNS diagnosztikai vizsgálatában felhasználható nukleinsav molekulák előállításában. Továbbá, az AP-MDR-t nem kódoló RNS vagy DNS nukleinsav, mely azonban képes az AP-MDR-t kódoló DNS-hez vagy RNS-hez hibridizálódni szintén hasznos lehet az ilyen diagnoisztikai vizsgálatokban. Ezek a nukleinsav molekulák ismert

-12módszerekkel jelölhetők kovalensen egy detektálható egységgel, mint egy fluoreszcensz csoporttal, egy radioaktív atommal vagy egy kemilumineszcensz csoporttal. Ezután a jelölt nukleinsav felhasználható hagyományos hibridizációs vizsgálatokban, mint pl. a Southern vagy a Northern hibridizációs vizsgálatokban, vagy polimeráz láncreakciós vizsgálatokban (PCR) a hibridizáló DNS, cDNS vagy RNS molekulák azonosítására. A PCR vizsgálat elvégezhető jelöletlen nukleinsav molekulákkal is. Az ilyen vizsgálatok az AP-MDR vektorok és transzformán sok azonosítására használhatók, valamint in vitro diagnózisban más organizmusokból származó AP-MDR-szerű mRNS, cDNS vagy genom DNS detektálására.

A 08/111680 számú US Szabadalmi Alkalmazás (mely a hivatkozás révén teljes egészében része a találmánynak) leírja a kombinálási terápia alkalmazását, mely magába foglalja egy igazolt aktivitás spektrummal rendelkező gombellenes anyag egy gomba MDR inhibitorral együtt gombás fertőzés elleni alkalmazását. Ez a kombinációs terápiás megközelítés lehetővé teszi a korábban csak korlátozott klinikailag alkalmazható gombaellenes aktivitást mutató adott gombaellenes vegyület gombaellenes aktivitási spektumának kiszélesítését. Hasonlóképpen, a demonstráltan gombaellenes aktivitással rendelkező vegyületek hatásossá tehetők egy gomba MDR inhibitorral oly módon, hogy ezen vegyületek gombaellenes aktivitása kiterjed a korábban rezisztens fajokra is. Az ilyen kombinációs terápiában hasznos vegyületek azonosítására a jelen találmány egy vizsgálati módszert biztosít az MDR gátló aktivitással rendelkező vegyületek azonosítására. Az AP-MDR-t expresszáló gazdasejtek kiváló eszközt biztosítanak a gomba MDR aktivitás inhibitoraiként hasznos vegyületek azonosításában. Általában a vizsgálat olyan élesztőgomba sejt tenyészetet hasznosít, melyet az AP-MDR expresszióját biztosító vektorral transzformáltunk. A gazdasejt általi AP-MDR expresszió lehetővé teszi a gazdasejt számára, hogy a gombaellenes vegyület jelenlétében szaporodjon, mellyel szemben a nem transz-13-

formált állapotban levő sejtek azonban érzékenyek. így a transzformált élesztőgomba sejttenyészetet i) egy gombaellenes anyag - mellyel szemben a nem transzformált élesztőgomba sejt érzékeny, de mellyel szemben a transzformált gazdasejt rezisztens - és ii) egy vegyület - mely feltételezetten MDR inhibitor - jelenlétében szaporítjuk. A feltételezett MDR inhibitor hatását úgy mérjük, hogy teszteljük, hogy a gombaellenes vegyület képes-e gátolni a transzformált élesztőgomba sejt szaporodását. Ez a gátlás akkor fordul elő, ha a feltételezett MDR inhibitor gátolja az APMDR azon képességét, hogy megakadályozza a gombaellenes vegyület élesztőgomba sejtre való hatását. Egy ilyen vizsgálatra illusztratív példa a 3. példa.

A találmány működésének még teljesebb bemutatására a következő példákat mutatjuk be, melyekkel nem szándékoztunk a találmány oltalmi körét korlátozni.

1. Példa

Az Aureobasidium pullulans MDR-t kódoló DNS-ének forrása

A pPSR3 plazmid izolálása

Az Escherichia coli XL1-Blue/pPSR3 liofilezett formáját a Northern Régiónál REsearch Laboratories-tól (NRRL)(Peoria, Illinois 61604) szerezzük be az NRRL B-21202 katalógusszámon. A pPSR3 plazmid az NRRL B-21202-ből izolálható a tudomány e területén képzett szakembere számára jól ismert technikákat használva. Lásd Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY vagy Ausubel és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology (1989) John Wiley & Sons, New York, NY és a mellékletek.

• ·

2. példa

Az AP-MDR protein expresziója

Saccharomyces cerevisiae sejteket (Invitrogen Corp., San Diego CA 92191) a pPSR3 plazmiddal transzformáljuk a J.D. Beggs (1988, Natúré 275:104-109) által leírt technikát használva. A transzformált élesztőgomba sejteket YNB/CSM-Ura/raf (4 % raffinózzal kiegészített YNB/CSM-Ura [CSM-URA-val kiegészített (Bio 101, Inc) Yeast Nitrogéné Base (Difco Laboratories, Detroit, Ml)] táplevesben szaporítjuk 28 °C hőmérsékleten rázó inkubátorban, addig, míg a tápleves sejtekkel nem telítődik. Az AP-MDR expressziójának indukálásához a tenyészet egy részével szénforrásként raffinóz helyett inkább 2 % galaktózzal (YNB/CSM- Ura/gal) kiegészített YNB/CSM-Ura táplevest tartalmazó lombikot inokulálunk. Az inokulált lombikot 28 °C hőmérsékleten kb 16 órán keresztül inkubáljuk.

3. példa

Gombaellenesséqet kialakító vizsgálat

Megközelítően 1x10® Saccharomyces cerevisiae INVSc1/pPSR3 tenyészetet adunk az YNB/CSM-Ura/gal-t tartalmazó számos agarlemez mindegyikére. Az agar felszínét megszárítjuk egy bioprotektív burkolat alatt. A Saccharomyces cerevisiae INVSc1/pPSR3 sejtek expresszálják az AP-MDR aktivitást.

Egy olyan gombaellenes vegyületet, mellyel szemben a nem transzformált élesztőgomba sejt tipikusan érzékeny, mint pl. az R106I (5,057,493 számú US szabadalom, mely a hivatkozás révén része a találmánynak) 100 % etanolban feloldunk 1 vagy 7 mg/ml koncentrációban. Az 1 mg/ml koncentrációjú oldat 20 pl mennyiségét egy antibiotikum érzékeny teszt korongra helyezzük (Difco Laboratories, Detroit, Ml). A gombaellenes oldat hozzáadása után a korongot levegőn megszárítjuk egy » *· «*, ·♦*· · »» .· ··: .« : ' .· ···· ·» ; · ·

-15bioprotektív burkolat alatt. Ha a korong száraz egy Saccharomyces cerevisiae INVSc1/pPSR3 sejteket tartalmazó petri csésze felszínére helyezzük.

Az AP-MDR gátlásának képességére tesztelendő vegyületeket feloldjuk dimetil-szulfoxidban (DMSO). A DMSO-hoz adott vegyület mennyisége az egyes tesztelendő vegyület oldékonyságától függ. A tesztelendő vegyületet tartalmazó szuszpenzió 20 pl mennyiségét egy antibiotikum érzékenységi teszt lemezre (Difco Laboratories, Detroit, Ml) helyezzük. Az teszt vegyületet tartalmazó korongot levegőn bioprotektív burkolat alatt hagyjuk megszáradni. Ezután a korongot a Saccharomyces cerevisiae INVSc1/pPSR3 sejteket tartalmazó száraz petri lemezek felszínére helyezzük kb. 2 cm távolságra a gombaellenes anyagot tartalmazó korongtól. A kétféle korongot tartalmazó petri csészéket 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk kb. 16 órán keresztül.

Ezen inkubációs periódus után a petri csészéket megvizsgáljuk a korongok körüli szaporodás gátlási zóna jelenlétére. A szaporodás gátlási zóna a teszt lemezen a gombaellenes anyagot tartalmazó korong közelében azt jelzi, hogy az MDR gátló aktivitásra tesztelendő vegyület blokkolja az AP-MDR aktivitását és lehetővé teszi, hogy a gombaellenes vegyület gátolja az élesztőgomba gazdasejt szaporodását. Az ilyen vegyületekről azt mondjuk, hogy MDR gátló aktivitással rendelkeznek. A kis zóna, vagy a szaporodás gátlási zóna hiánya azt jelzi, hogy a teszt vegyület nem blokkolja az MDR aktivitást és így az AP-MDR számára lehetővé válik, hogy hatással legyen a gombaellenes vegyületre, megakadályozva annak a gazdasejtre kifejtett aktivitását.

• •••a

SZEKVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) FELTALÁLÓ: Perry, Róbert B.

Skatrud, Paul L.

(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Többszörös gyógyszerrezisztencia gén

Aureobasidium pullulansból (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 4 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: Éli Lilly and Company (B) UTCA: Lilly Corporate Center (C) VÁROS: Indianapolis (D) ÁLLAM: Indiana (E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 46285 (v) SZÁMÍTÓGÉPES OLVASÁSI FORMA:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: Floppy disk (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER:: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, #1.25 verzió (vi) A JELEN ALKALMAZÁS ADATAI:

(A) ALKALMAZÁSI SZÁM:

(B) IKTATÁSI DÁTUM:

(C) OSZTÁLYOZÁS:

(viii) ÜGYVÉDI/IRODA ADATOK:

(A) NÉV: Plánt, Thomas G.

(B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 35,784 (C) REFERENCIA/DOKUMENTUM SZÁM: X9212 (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:

(A) TELEFON: 317-276-2459 (B) TELEFAX: 317-276-1917 (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 3909 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATG Met 1

TCT Ser

TCT Ser

GCC Alá

GAC Asp 5

GGC Gly

AGA Arg

CGA Arg

ACA Thr

GTT Val 10

TCA Ser

TCT Ser

GAT Asp

TAT Tyr

GGC Gly 15

CAT His

48

CCA

CGA

CCT

TCA

ATG

GCC

AAC

GTC

GAA

GCG

GAT

CAC

AAC

TTT

GAG

ACG

96

Pro

Arg

Pro

Ser

Met

Alá

Asn

Val

Glu

Alá

Asp

His

Asn

Phe

Glu

Thr

20

25

30

ACG

ACT

TTG

AAT

TCT

GCT

CAA

CCG

CGA

TCA

TGG

CAC

ACT

GAG

TTT

GTC

144

Thr

Thr

Leu

Asn

Ser

Alá

Gin

Pro

Arg

Ser

Trp

His

Thr

Glu

Phe

Val

35

40

45

TTC

GTC

TCC

CGG

AAA

TTG

ATT

CAA

CAA

ATT

CTT

GGT

AAA

AAT

CCG

TTC

192

Phe

Val

Ser

Arg

Lys

Leu

Ile

Gin

Gin

Ile

Leu

Gly

Lys

Asn

Pro

Phe

50

55

60

AAG

AGT

TCA

TAT

CTG

GAT

TTG

TTC

AAG

CTT

GTC

AAC

GAT

GCG

AAG

TCG

240

Lys

Ser

Ser

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Leu

Val

Asn

Asp

Alá

Lys

Ser

65

70

75

80

AAG

GCC

GTT

CTT

TGG

GCT

GGC

ATA

CTG

TTG

GCA

ATA

GCT

GCT

GGT

TGT

288

Lys

Alá

Val

Leu

Trp

Alá

Gly

Ile

Leu

Leu

Alá

Ile

Alá

Alá

Gly

Cys

85

90

95

CCA

TTG

CCC

ATC

ATT

GGC

TAT

ATT

TTC

GGC

CAG

ATC

ATT

ACT

TCT

TTC

336

Pro

Leu

Pro

Ile

Ile

Gly

Tyr

Ile

Phe

Gly

Gin

Ile

11

Thr

Ser

Phe

100

105

110

CCG

CCT

CCG

GAA

GAT

GTT

CTG

CGA

GAT

AGA

CTG

TAT

CAG

CTT

GTT

GGT

384

Pro

Pro

Pro

Glu

Asp

Val

Leu

Arg

Asp

Arg

Leu

Tyr

Gin

Leu

Val

Gly

115

120

125

GTC

GCT

TGT

GGC

TAC

TTT

ATC

GTT

ACG

ACT

GGA

TAT

GCA

ATT

GCG

TGG

432

Val

Alá

Cys

Gly

Tyr

Phe

Ile

Val

Thr

Thr

Gly

Tyr

Alá

Ile

Alá

Trp

130

135

140

GGA

TTG

ACT

GGA

GAG

AAG

ATC

TCG

CGT

CGT

TTT

CGA

GAA

ACG

CTT

GTT

480

Gly

Leu

Thr

Gly

Glu

Lys

Ile

Ser

Arg

Arg

Phe

Arg

Glu

Thr

Leu

Val

145

150

155

160

GAG

CGC

CTG

CTT

GGT

CTT

GAG

CAG

GCA

TAC

TTC

GAC

ATC

AAA

GAT

CCA

528

Glu

Arg

Leu

Leu

Gly

Leu

Glu

Gin

Alá

Tyr

Phe

Asp

Ile

Lys

Asp

Pro

165

170

175

GAC

ATT

ACG

AAC

CTT

CTG

ACC

GAG

AAG

ATT

GAA

GCG

ATC

CAG

ATA

GGA

576

Asp

Ile

Thr

Asn

Leu

Leu

Thr

Glu

Lys

Ile

Glu

Alá

Ile

Gin

Ile

Gly

180

185

190

ACA

TCT

GAA

AAA

GTC

GGC

ATA

TTC

ATC

CAG

TCG

ATC

AGC

TAC

TTC

GTT

624

Thr

Ser

Glu

Lys

Val

Gly

Ile

Phe

Ile

Gin

Ser

Ile

Ser

Tyr

Phe

Val

195

200

205

GCT

GCC

TTT

ATT

GTT

GGG

TTC

ATC

TTG

AAC

GCC

AAA

CTC

ACC

GGT

ATT

672

Alá

Alá 210

Phe

Ile

Val

Gly

Phe 215

Ile

Leu

Asn

Alá

Lys 220

Leu

Thr

Gly

Ile

CTA

TTC

GCT

GCC

GTC

ATA

CCT

CTC

ATG

GCT

TTG

ATC

GTT

ACT

GTC

GGC

720

Leu

Phe

Alá

Alá

Val

Ile

Pro

Leu

Met

Alá

Leu

Ile

Val

Thr

Val

Gly

225

230

235

240

TCC

TCC

AGA

ATC

GCA

AAG

TAC

ACC

AAA

GCA

GCC

ACC

GAA

TAC

ACC

GAA

768

Ser

Ser

Arg

Ile

Alá

Lys

Tyr

Thr

Lys

Alá

Alá

Thr

Glu

Tyr

Thr

Glu

245

250

255

GCC

GCT

GGA

AGG

ATC

GCT

GAA

AGT

GCT

ATC

CAT

GCT

GTC

AAG

GTT

GTG

816

Alá

Alá

Gly

Arg

Ile

Alá

G1U

Ser

Alá

Ile

His

Alá

Val

Lys

Val

Val

250

265

270

CAG

GCT

TTT

GGC

ATG

GCC

GAA

AAT

CTC

AGC

AAA

GAA

CAC

TAC

CGT

CTG

864

Gin

Alá

Phe

Gly

Met

Alá

Glu

Asn

Leu

Ser

Lys

Glu

His

Tyr

Arg

Leu

275

280

285

CTC

AAA

CTG

TCT

GCA

AGA

TAC

GCC

ATC

CGG

AAG

TCA

GTT

TCT

GCT

GCG

912

Leu

Lys

Leu

Ser

Alá

Arg

Tyr

Alá

Ile

Arg

Lys

Ser

Val

Ser

Alá

Alá

290

295

300

TTC

ATG

CTT

GGC

TTG

GTC

TAT

TTT

ACT

GCT

TAC

AGT

GCC

AAT

GCG

CTT

960

Phe

Met

Leu

Gly

Leu

Val

Tyr

Phe

Thr

Alá

Tyr

Ser

Alá

Asn

Alá

Leu

305

310

315

320

GCC

rpmq-»

TGG

GAG

GGC

TCA

CGT

CTC

GCT

GCA

GAA

TCT

GGC

TCA

AAC

AAT

1008

Alá

?4;e

Trp

Glu

Gly

Ser

Arg

Leu

Alá

Alá

Glu

Ser

Gly

Ser

Asn

Asn

325

330

335

GCT

GGT

ACC

GTC

TAT

GCC

GTG

GTC

TTC

TTG

ATT

ATA

GAC

GCT

TCG

TTT

1056

Alá

Gly

Thr

Val

Tyr

Alá

Val

Val

Phe

Leu

Ile

Ile

Asp

Alá

Ser

Phe

340

345

350

GTT

GTC

GGC

CAA

TTT

GGA

CCA

TTC

CTT

GGT

AGC

TTC

GCC

ACC

GCT

GCA

1104

Val

Val

Gly

Gin

Phe

Gly

Pro

Phe

Leu

Gly

Ser

Phe

Alá

Thr

Alá

Alá

355

360

365

GCT

GCT

GGA

GAA

AGT

GTT

TAC

GAA

ATC

CTC

AAC

CAT

CCA

CAG

TCT

GAA

1152

Alá

Alá

Gly

Glu

Ser

Val

Tyr

Glu

Ile

Leu

Asn

His

Pro

Gin

Ser

Glu

370

375

380

ATC

AAC

GTC

TAC

TCG

GAG

GCT

GGG

CAA

GAA

GCC

ACA

GAG

AGC

GAC

ATG

1200

Ile

Asn

Val

Tyr

Ser

Glu

Alá

Gly

Gin

Glu

Alá

Thr

Glu

Ser

Asp

Met

385

390

395

400

AAA

GCT

GAT

TTG

GTC

TTT

CGC

AAT

GTC

ACA

TTT

GTT

TAT

CCC

GCG

AGG

1248

Lys

Alá

Asp

Leu

Val

Phe

Arg

Asn

Val

Thr

Phe

Val

Tyr

Pro

Alá

Arg

405

410

415

ACA

TCT

GCT

CGT

GCT

CTG

GAA

GAG

ATG

AGT

CTT

ATC

CTC

AAA

GCC

GGA

1296

Thr

Ser

Alá

Arg

Alá

Leu

Glu

Glu

Met

Ser

Leu

Ile

Leu

Lys

Alá

Gly

420

425

430

CAG

ATG

AAC

GCG

ATT

GTC

GGC

ACG

AGT

GGT

TGC

GGC

AAA

AGC

ACT

CTT

1344

Gin

Met

Asn

Alá

Ile

Val

Gly

Thr

Ser

Gly

Cys

Gly

Lys

Ser

Thr

Leu

435

440

445

GTG

TCT

CTG

CTC

TTG

AGG

CTG

TAC

GAC

ATA

TCC

TCT

GGT

CAA

TTG

ACA

1392

Val

Ser

Leu

Leu

Leu

Arg

Leu

Tyr

Asp

Ile

Ser

Ser

Gly

Gin

Leu

Thr

450

455

460

ΑΤΑ

GGA

AGC

CAT

GAT

ATC

AAG

GAC

TTC

AAC

GTA

AGG

AGT

TTG

AGA

AAA

1440

Ile

Gly

Ser

Hís

Asp

Ile

Lys

Asp

Phe

Asn

Val

Arg

Ser

Leu

Arg

Lvs

465

470

475

480

TAC

ACA

GCC

CTG

GTA

GAC

CAA

GAC

TCT

GTC

CTG

TTC

TCT

GGT

TCG

GTC

1488

Tyr

Thr

Alá

Leu

Val

Asp

Gin

Asp

Ser

Val

Leu

Phe

Ser

Gly

Ser

Val

485

490

495

CTT

GAA

AAC

ATC

AGT

TAT

GGA

CTT

GGT

GAA

CAT

TCA

TTA

TCA

GAC

GAT

1536

Leu

Glu

Asn

Ile

Ser

Tvr

Gly

Leu

Gly

Glu

Hís

Ser

Leu

Ser

Asp

Asp

500

505

510

GTT

GTC

TTG

GAG

AGG

TGT

ACT

GAG

GCT

GCG

AAA

GCT

GCC

AAC

CTG

GAC

1584

Val

Val

Leu

Glu

Arg

Cys

Thr

G1U

Alá

Alá

Lys

Alá

Alá

Asn

Leu

Asp

515

520

525

TTT

GTC

GAC

TTC

TTG

CCA

CAG

GGT

ATT

CAC

ACG

CGA

ATC

GGT

AAT

GGT

1632

Phe

Val

Asp

Phe

Leu

Pro

Gin

Gly

Ile

Hís

Thr

Arg

Ile

Gly

Asn

Gly

530

535

540

GGC

TAT

ACG

AGT

CTC

TCG

GGT

GGT

CAG

AAC

CAG

AGG

ATT

TGC

TTG

GCT

1680

Gly

Tyr

Thr

Ser

Leu

Ser

Gly

Gly

Gin

Asn

Gin

Arg

Ile

Cys

Leu

Alá

545

550

555

560

CGA

GCC

CTG

GTC

AAG

AAG

GCT

GCT

CTA

CTT

CTG

CTA

GAT

GAG

CCG

ACC

1728

Arg

Alá

Leu

Val

Lys

Lys

Pro

Alá

Leu

Leu

Leu

Leu

Asp

Glu

Pro

Thr

565

570

575

GCG

GCC

CTC

GAC

GCA

AAC

AGC

GAA

GGA

CTT

ATC

ATG

GAC

GCC

GTC

AAA

1776

Alá

Alá

Leu

Asp

Alá

Asn

Ser

Glu

Gly

Leu

Ile

Met

Asp

Alá

Val

Lys

580

585

590

AGC

GTG

GCT

GCC

ACA

GGC

ACA

ACA

GTG

GTC

ATG

GTA

GCG

CAC

CGA

CTC

1824

Ser

Val

Alá

Alá

Thr

Gly

Thr

Thr

Val

Val

Met

Val

Alá

Hís

Arg

Leu

595

600

605

TCC

ACT

GTG

TCA

GAC

TCG

CCC

AAC

ATC

GTG

CTC

ATG

GGT

GCA

GGC

AAG

1872

Ser

Thr

Val

Ser

Asp

Ser

Pro

Asn

Ile

Val

Leu

Met

Gly

Alá

Gly

Lys

610

615

620

GTC

ATT

GAG

CAA

GGA

AAC

CAT

GAT

GAA

CTC

ATG

CAG

TTG

GAA

GGC

GCC

1920

Val

Ile

Glu

Gin

Gly

Asn

Hís

Asp

Glu

Leu

Met

Gin

Leu

Glu

Gly

Alá

625

630

635

640

TAC

TTC

AAT

CTT

ATC

CAG

GCG

CAA

CAA

CTA

AAT

GAT

GCA

GAT

GAG

TCA

1968

Tyr

Phe

Asn

Leu

Ile

Gin

Alá

Gin

Gin

Leu

Asn

Asp

Alá

Asp

Glu

Ser

645

650

655

TCG

GCA

GAG

GTA

TCT

GCA

GCA

ACC

ACC

AGT

CAA

GTC

ACC

CCA

CAA

AAA

2016

Ser

Alá

G1U

Val

Ser

Alá

Alá

Thr

Thr

Ser

Gin

Val

Thr

Pro

Gin

Lys

660

665

670

GCA Alá

AGC Ser

AAG Lys 675

TCC Ser

GAA Glu

GAT Asp

TCG Ser

GCT Alá 680

GCT Alá

rp <-«/-· Ser

AGT Ser

GAC Asp

ACC Thr 685

GAG Glu

AGG

GTG Val

2064

CCT

CCA

CAG

GCG

AAG

AAG

GAA

GAC

AAG

CCA

GCC

AAA

AAG

GCT

CGA

TTC

2112

Pro

Pro

Gin

Alá

Lys

Lys

Glu

Asp

Lys

Pro

Alá

Lys

Lys

Alá

Gly

Phe

690

695

700

TGG

AAG

CTC

CTT

TTG

AGA

TGT

TTG

CGT

CTA

GCC

AAA

TCC

GAC

TCG

CCC

2160

Trp

Lys

Leu

Leu

Leu

Arg

Cys

Leu

Arg

Leu

Alá

Lys

Ser

Asp

Ser

Pro

705

710

715

720

ATC

ATC

GCT

CTG

GGT

CTC

GCT

GCC

TCA

ATC

GTA

TCG

GGT

GGC

ATC

ATT

2208

Ile

Ile

Alá

Leu

Gly

Leu

Alá

Alá

Ser

Ile

Val

Ser

Gly

Gly

Ile

Ile

725

730

735

CTC

GGC

GAA

GCC

ATC

GTC

TTC

GGC

AAC

CTC

ATC

TCG

GTG

CTG

AAC

GAT

2256

Leu

Gly

Glu

Alá

Ile

Val

Phe

Gly

Asn

Leu

Ile

Ser

Val

Leu

Asn

Asp

740

745

750

CTC

GAG

AGT

CCA

GAC

TTC

CGA

AGC

AGA

GCA

GAC

CTT

TTC

TCA

CTC

CTC

2304

Leu

Glu

Ser

Pro

Asp

Phe

Arg

Ser

Arg

Alá

Asp

Leu

Phe

Ser

Leu

Leu

755

760

765

TTC

TTC

ATA

CTG

GCA

CTC

ATT

GCG

CTC

TTC

TCA

TAC

GCC

GGC

AAT

GGA

2352

Phe

Phe

Ile

Leu

Alá

Leu

Ile

Alá

Leu

Phe

Ser

Tyr

Alá

Gly

Asn

Gly

770

775

780

TGC

TGT

TTC

GGT

ATC

GTC

TCT

TCA

CAT

TTT

GTC

GCC

AAA

ATT

CAA

CAT

2400

Cys

Cys

Phe

Gly

Ile

Val

Ser

Ser

His

Phe

Val

Alá

Lys

Ile

Gin

His

785

790

795

800

ATC

TCT

CTT

GCT

AGT

ATC

TTG

CGA

CAA

GAT

ATG

CAA

TGG

TTC

TCG

GGC

2448

Ile

Ser

Leu

Alá

Ser

Ile

Leu

Arg

Gin

Asp

Met

Gin

Trp

Phe

Ser

Gly

805

810

815

CAG

TCA

GTG

CCT

TCA

CTC

ATG

AGC

AGT

CTC

AGC

TCA

GAT

GCT

GGT

CAG

2496

Gin

Ser

Val

Pro

Ser

Leu

Met

Ser

Ser

Leu

Ser

Ser

Asp

Alá

Gly

Gin

820

825

830

CTT

GCT

TGC

TTG

TCC

GGA

GTG

GCT

ATT

GGC

ACC

ATA

TTC

ACG

GTG

TGT

2544

Leu

Alá

Cvs

Leu

Ser

Gly

Val

Alá

Ile

Gly

Thr

Ile

Phe

Thr

Val

Cys

835

840

845

GTC

TCC

ATC

ACT

GGT

GGT

ATC

ATC

CTT

GCC

CAC

GTG

GTG

GCT

TGG

AAA

2592

Val

Ser

Ile

Thr

Gly

Gly

Ile

Ile

Leu

Alá

HÍS

Val

Val

Alá

Trp

Lys

850

855

860

ATT

GCT

GTT

GTC

CTC

CTG

GCT

GCT

GTC

CCC

GTT

ATG

ATC

ACG

GCT

GGC

2640

Ile

Alá

Val

Val

Leu

Leu

Alá

Alá

Val

Pro

Val

Met

Ile

Thr

Alá

Gly

865

870

875

880

TAC

GTC

AGA

CTA

CGC

GTG

CTC

GCA

CTC

GCG

GAG

AGT

AGA

CAC

AGA

TCT

2688

Tyr

val

Arg

Leu

Arg

Val

Leu

Alá

Leu

Alá

Glu

Ser

Arg

His

Arg

Ser

885

890

895

GCT

TAC

AAT

GAT

GCT

GCT

TCT

ATC

GCC

GCC

GAG

GCT

TGT

AGA

GGC

ATC

2736

Alá

Tyr

Asn

Asp 900

Alá

Alá

Ser

Ile

Alá 905

Alá

Glu

Alá

Cys

Arg 910

Gly

Ile

CGC

ACC

ATT

GCT

TCT

CTC

GGC

AGA

GAG

CGT

GGA

GTG

TCT

AGA

GCA

TCC

2784

Arg

Thr

Ile

Alá

Ser

Leu

Gly

Arg

Glu

Arg

Gly

Val

Ser

Arg

Alá

Ser

915

920

925

AAC

GCA

GCG

GTC

AAA

GAG

CCA

TAC

GAC

AAG

GGC

ATC

CGA

TTC

ACC

TTG

2832

Asn

Alá

Alá

Val

Lys

Glu

Pro

Tyr

Asp

Lys

Gly

Ile

Arg

Phe

Thr

Leu

930

935

940

ATT

ACC

AAT

ACC

TTG

CTG

GCC

TTG

AGT

TTC

TCA

ATC

ACT

TAC

TTT

GTA

2880

Ile

Thr

Asn

Thr

Leu

Leu

Alá

Leu

Ser

Phe

Ser

Ile

Thr

Tyr

Phe

Val

945

950

955

960

TAT

GCC

CTT

GCC

TAC

TGG

TGG

GGA

GCC

AAG

CAA

GTC

AGA

AAT

GGA

ACA

2928

Tyr

Alá

Leu

Alá

Tyr

Trp

Trp

Gly

Alá

Lys

Gin

Val

Arg

Asn

Gly

Thr

965

970

975

TAC

AGT

CAA

TTG

GAC

TTT

TTC

ATT

GTT

CTT

CCT

GCT

CTT

CTG

TTC

TCT

2976

Tyr

Ser

Gin

Leu

Asp

Phe

Phe

Ile

Val

Leu

Pro

Alá

Leu

Leu

Phe

Ser

980

985

990

GCG

CAG

AGC

GCT

GGA

CAG

ATC

TTC

AGT

CTG

TCA

CCA

GAG

ATG

TCG

CGT

3024

Alá

Gin

Ser

Alá

Gly

Gin

Ile

Phe

Ser

Leu

Ser

Pro

Glu

Met

Ser

Arg

995

1000

1005

GCT

GGT

GTC

GCC

GCT

CGC

AAC

GTC

TTT

GGG

CTA

CAT

GAT

CAG

AAG

CCG

3072

A '·. a

Gly

Val

Alá

Alá

Arg

Asn

Val

Phe

Gly

Leu

His

Asp

Gin

Lys

Pro

1010

1015

1020

ACC

ATA

GTG

GAT

GTT

GAC

GCG

AAG

CAA

TCT

GGA

GCA

CTG

CCA

AGC

TCG

3120

Thr

Ile

Val

Asp

Val

Asp

Alá

Lys

Gin

Ser

Gly

Alá

Leu

Pro

Ser

Ser

1025

1030

1035

1040

ACC

TTG

TCT

ATT

CCT

ACT

CTA

GAG

GAC

AAG

GCA

AGT

CCA

TCA

TCT

GGA

3168

Thr

Leu

Ser

Ile

Pro

Thr

Leu

G1U

Asp

Lys

Alá

Ser

Pro

Ser

Ser

Gly

1045

1050

1055

GGC

TGG

ATT

GAG

TTC

AAG

AAC

GTC

AGT

CTA

TGC

TAT

CCG

TCC

AAA

CCT

3216

Gly

Trp

Ile

Glu

Phe

Lys

Asn

val

Ser

Leu

Cys

Tyr

Pro

Ser

Lys

Pro

1060

1065

1070

CAG

CAC

CCA

GCA

TTG

CAG

AAT

GTC

AAC

ATC

TCC

ATC

AGA

CCA

GGA

GAG

3264

Gin

His

Pro

Alá

Leu

Gin

Asn

Val

Asn

Ile

Ser

Ile

Arg

Pro

Gly

Glu

1075

1080

1085

TTC

ATT

GCA

CTT

GTC

GGC

CCT

AGC

GGA

GCA

GGC

AAG

TCG

ACC

ATT

CTC

3312

Phe

Ile

Alá

Leu

Val

Gly

Pro

Ser

Gly

Alá

Gly

Lys

Ser

Thr

Ile

Leu

1090

1095

1100

TCT

CTG

CTA

CAG

CGC

TTC

TAC

GAT

CCC

ACT

GCT

GGC

AGC

GTA

CAG

CTA

3360

Ser

Leu

Leu

Gin

Arg

Phe

Tyr

Asp

Pro

Thr

Alá

Gly

Ser

Val

Gin

Leu

1105

1110

1115

1120

GAT

GGG

CAG

GAC

ATC

CGC

GAG

GTT

GCT

GTA

CCA

CAA

CAC

AGA

GGT

CGA

3408

Asp

Gly

Gin

Asp

Ile

Arg

Glu

Val

Alá

Val

Pro

Gin

His

Arg

Gly

Arg

1125

1130

1135

TTG

GGG

CTG

GTA

CCT

CAA

GAG

CCA

GAC

CTC

TTC

CCT

GGC

TCG

ATC

TCC

3456

Leu

Gly

Leu

Val

Pro

Gin

Glu

Pro

Asp

Leu

Phe

Pro

Gly

Ser

He

Ser

1140

1145

1150

TAC

AAC

ATC

GGC

TTG

GGC

GCA

GCG

CCA

GGT

CAG

TTG

GTG

ACG

AGA

GAT

3504

Tyr

Asn

Ile

Gly

Leu

Gly

Alá

Alá

Pro

Gly

Gin

Leu

val

Thr

Arg

Asp

1155

1160

1165

GAT

ATC

GAG

AAG

ATT

TGC

GCA

AAG

TGT

GGC

ATT

CAC

GAG

TTC

ATC

ATG

3552

Asp

Ile

Glu

Lys

He

Cvs

Alá

Lys

Cys

Gly

He

His

Glu

Phe

Ile

Met

1170

1175

1180

AGT

CTG

CCC

GAA

GGC

TAC

AGC

ACA

GAG

TGC

GGC

ACC

AAT

GGT

TCG

AAA

3600

Ser

Leu

Pro

Glu

G1V

Tyr

Ser

Thr

Glu

Cys

Gly

Thr

Asn

Gly

Ser

Lys

1185

1190

1195

1200

CTC

TCC

GGA

GGT

CAG

AAG

CAA

CGT

ATT

GCT

GTC

GCC

AGA

GCA

TTG

ATC

3648

Leu

Ser

Gly

Gly

Gin

Lys

Gin

Arg

Ile

Alá

Val

Alá

Arg

Alá

Leu

He

1205

1210

1215

AGG

TCA

CCG

GAA

GTG

CTT

CTC

CTG

GAC

GAG

TAT

ACA

TCC

GCT

CTG

GAC

3696

Arg

Ser

Pro

Glu

Val

Leu

Leu

Leu

Asp

Glu

Tyr

Thr

Ser

Alá

Leu

Asp

1220

1225

1230

GCC

CAC

TCC

GAG

CAA

CAG

ATC

AAA

GAA

GCA

GTT

GAT

GGA

GCC

AGT

GTG

3744

Alá

His

Ser

Glu

Gin

Gin

He

Lys

Glu

Alá

Val

Asp

Gly

Alá

Ser

Val

1235

1240

1245

GAT

CGG

ACT

ACG

ATT

GTG

GTC

GCA

CAT

CGA

T ~ _ _ <J

TCC

ACG

GTG

CAG

AAC

3792

Asp

Arg

Thr

Thr

He

Val

Val

Alá

His

Arg

Leu

Ser

Thr

Val

Gin

Asn

1250

1255

1260

GCA

GAT

AGA

ATC

TTT

GTG

TTT

GAT

GAT

GGA

CGT

GTG

GTG

GAG

GTT

GGT

3840

Alá

Asp

Arg

Ile

Phe

Val

Phe

Asp

Asp

Gly

Arg

Val

Val

Glu

Val

Gly

1265

1270

1275

1280

AGC

CAT

GCT

GAG

CTT

GTT

GCT

CAA

GGG

GGT

TTG

TAT

GCA

GGC

ATG

GTT

3888

Ser

His

Alá

G1U

Leu

Val

Alá

Gin

Gly

Gly

Leu

Tyr

Alá

Gly

Met

Val

1285

1290

1295

CTG

GCG

CAG

ACA

CTC

ACA

TGA

3909

Leu

Alá

Gin

Thr 1300

Leu

Thr

(2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁGA 302 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;

Met 1

Ser

Ser

Alá

Asp 5

Gly

Arg

Arg

Thr

Val 10

Ser

Ser

Asp

Tyr

Gly 15

His

Pro

Arg

Pro

Ser

Met

Alá

Asn

Val

Glu

Alá

Asp

His

Asn

Phe

Glu

Thr

20

25

30

Thr

Thr

Leu

Asn

Ser

Alá

Gin

Pro

Arg

Ser

Trp

His

Thr

Glu

Phe

Val

35

40

45

Phe

Val

Ser

Arg

Lys

Leu

Ile

Gin

Gin

Ile

Leu

Gly

Lys

Asn

Pro

Phe

50

55

60

Lys

Ser

Ser

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Leu

Val

Asn

Asp

Alá

Lys

Ser

6 5

70

75

80

Lys

Alá

Val

Leu

Trp

Alá

Gly

Ile

Leu

Leu

Alá

Ile

Alá

Alá

Gly

Cys

85

90

9 5

Pro

Leu

Pro

Ile

Ile

Gly

Tyr

Ile

Phe

Gly

Gin

Ile

Ile

Thr

Ser

Phe

100

105

110

Pro

Pro

Pro

Glu

Asp

Val

Leu

Arg

Asp

Arg

Leu

Tyr

Gin

Leu

Val

Gly

115

120

125

Val

Alá

Cys

Gly

Tyr

Phe

Ile

Val

Thr

Thr

Gly

Tyr

Alá

Ile

Alá

Trp

130

135

140

Gly

Leu

Thr

Gly

Glu

Lvs

Ile

Ser

Arg

Arg

Phe

Arg

Glu

Thr

Leu

Val

145

50

155

160

Glu

Arg

Leu

Leu

Gly

_^U

Glu

Gin

Alá

Tyr

Phe

Asp

Ile

Lys

Asp

Pro

165

170

175

Asp

Ile

Thr

Asn

Leu

Leu

Thr

Glu

Lys

Ile

Glu

Alá

Ile

Gin

Ile

Gly

180

185

190

Thr

Ser

Glu

Lys

Val

Gly

Ile

Phe

Ile

Gin

Ser

Ile

Ser

Tyr

Phe

Val

195

200

205

Alá

Alá

Phe

Ile

Val

Gly

Phe

Ile

Leu

Asn

Alá

Lys

Leu

Thr

Gly

Ile

210

215

220

Leu

Phe

Alá

Alá

Val

Ile

Pro

Leu

Met

Alá

Leu

Ile

Val

Thr

Val

Gly

225

230

235

240

Ser

Ser

Arg

Ile

Alá

Lys

Tyr

Thr

Lys

Alá

Alá

Thr

Glu

Tyr

Thr

Glu

245

250

255

Alá

Alá

Gly

Arg

Ile

Alá

Glu

Ser

Alá

Ile

His

Alá

Val

Lys

Val

Val

260

265

270

Gin

Alá

Phe

Gly

Met

Alá

Glu

Asn

Leu

Ser

Lys

Glu

His

Tyr

Arg

Leu

275

280

285

Leu

Lys

Leu

Ser

Alá

Arg

Tyr

Alá

Ile

Arg

Lys

Ser

Val

Ser

Alá

Alá

290

295

300

•25Phe Met

305

Alá Phe

Alá Gly

Val Val

Alá Alá

370

Ile Asn

385

Lys Alá

Thr Ser

Gin Met

Val Ser

450

Ile Gly

465

Tyr Thr

Leu Glu

Val Val

Phe Val

530

Gly Tyr

545

Arg Alá

Alá Alá

Ser Val

Leu Gly

Trp Glu

Thr Val

340

Gly Gin

355

Gly Glu

Val Tyr

Asp Leu

Alá Arg

420

Asn Alá

435

Leu Leu

Ser His

Alá Leu

Asn Ile

500

Leu Glu 515

Asp Phe

Thr Ser

Leu Val

Leu Asp

580

Alá Alá

595

Leu Val

310

Gly Ser

325

Tyr Alá

Phe Gly

Ser Val

Ser Glu

390

Val Phe

405

Alá Leu

Ile Val

Leu Arg

Asp Ile

470

Val Asp

485

Ser Tyr

Arg Cvs

Leu Pro

Leu Ser

550

Lys Lys

565

Alá Asn

Thr Gly

Tyr Phe

Arg Leu

Val Val

Pro Phe

360

Tyr Glu

375

Alá Gly

Arg Asn

Glu Glu

Gly Thr

440

Leu Tyr

455

Lys Asp

Gin Asp

Gly Leu

Thr Glu

520

Gin Gly

535

Gly Gly

Pro Alá

Ser Glu

Thr Thr

600

Thr Alá

Alá Alá

330

Phe Leu

345

Leu Gly

Ile Leu

Gin Glu

Val Thr

410

Met Ser

425

Ser Gly Asp Ile Phe Asn

Ser Val

490

Gly Glu

505

Alá Alá

Ile His Gin Asn Leu Leu

570

Gly Leu

585

Val Val

Tyr Ser

315

Glu Ser

Ile Ile

Ser Phe

Asn His

380

Alá Thr

395

Phe Val

Leu Ile

Cys Gly

Ser Ser

460

Val Arg

475

Leu Phe

His Ser

Lys Alá

Thr Arg

540

Gin Arg

555

Leu Leu

Ile Met

Met Val

Alá Asn

Gly Ser

Asp Alá

350

Alá Thr

365

Pro Gin

Glu Ser

Tyr Pro

Leu Lys

430

Lys Ser

445

Gly Gin

Ser Leu

Ser Gly

Leu Ser

510

Alá Asn

525

Ile Gly

Ile Cys

Asp Glu

Asp Alá

5'90

Alá His

605 .“La Leu

320

Asn Asn

3 5

Ser Phe

Alá Alá

Ser Glu

Asp Met

400

Alá Arg

415

Alá Gly

Thr Leu

Leu Thr

Arg L/s

480

Ser Val

495

Asp Asp

Leu Asp

Asn Gly

Leu Alá

560

Pro Thr

575

Val Lys

Arg Leu

Ser

Thr 610

Val

Ser

Asp

Ser

Pro 615

Asn

Ile

Val

Leu

Met 620

Gly

Alá

Gly

Lys

Val

Ile

Glu

Gin

Gly

Asn

His

Asp

Glu

Leu

Met

C-ln

Leu

Glu

Gly

Alá

625

630

635

640

Tyr

Phe

Asn

Leu

Ile

Gin

Alá

Gin

Gin

Leu

Asn

Asp

Alá

Asp

Glu

Ser

645

650

655

Ser

Alá

Glu

Val

Ser

Alá

Alá

Thr

Thr

Ser

C-ln

Val

Thr

Pro

Gin

Lys

660

6 6 5

670

Alá

Ser

Lvs

Ser

Glu

Asp

Ser

Alá

Alá

Ser

Ser

Asp

Thr

Glu

Thr

Val

675

680

685

Pro

Pro

Gin

Alá

Lys

Lys

Glu

Asp

Lys

Pro

Alá

Lys

Lys

Alá

Gly

Phe

690

695

700

Trp

Lys

Leu

Leu

Leu

Arg

Cys

Leu

Arg

Leu

Alá

Lys

Ser

Asp

Ser

Pro

705

710

715

720

Ile

Ile

Alá

Leu

Gly

Leu

Alá

Alá

Ser

Ile

Val

Ser

Gly

Gly

Ile

Ile

725

730

735

Leu

Gly

Glu

Alá

Ile

Val

Phe

Gly

Asn

Leu

Ile

Ser

Val

Leu

Asn

Asp

740

745

750

Leu

Glu

Ser

Pro

Asp

Phe

Arg

Ser

Arg

Alá

Asp

Leu

Phe

Ser

Leu

Leu

755

760

765

Phe

Phe

Ile

Leu

Alá

Leu

Ile

Alá

Leu

Phe

Ser

Tyr

Alá

Gly

Asn

Gly

770

775

780

Cys

Cys

Phe

Gly

Ile

Val

Ser

Ser

His

Phe

Val

Alá

Lys

Ile

Gin

His

785

790

795

800

Ile

Ser

Leu

Alá

Ser

Ile

Leu

Arg

Gin

Asp

Met

Gin

Trp

Phe

Ser

Gly

805

810

815

Gin

Ser

Val

Pro

Ser

Leu

Met

Ser

Ser

Leu

Ser

Ser

Asp

Alá

Gly

Gin

820

825

830

Leu

Alá

Cys

Leu

Ser

Gly

Val

Alá

Ile

Gly

Thr

Ile

Phe

Thr

Val

Cys

835

840

845

Val

Ser

Ile

Thr

Gly

Gly

Ile

Ile

Leu

Alá

His

Val

Val

Alá

Trp

Lys

850

855

860

Ile

Alá

Val

Val

Leu

Leu

Alá

Alá

Val

Pro

Val

Met

Ile

Thr

Alá

Gly

865

870

875

880

Tyr

Val

Arg

Leu

Arg

Val

Leu

Alá

Leu

Alá

Glu

Ser

Arg

His

Arg

Ser

885

890

895

Alá

Tyr

Asn

Asp

Alá

Alá

Ser

Ile

Alá

Alá

Glu

Alá

Cys

Arg

Gly

Ile

900

905

910

Arg

Thr

Ile 915

Alá

Ser

Leu

Gly

Arg 920

Glu

Arg

Gly

Val

Ser 925

Arg

Al a

Ser

Asn

Alá

Alá

Val

Lys

Glu

Pro

Tyr

Asp

Lys

Gly

Ile

Arg

Phe

Thr

Leu

930

935

940

Ile

Thr

Asn

Thr

Leu

Leu

Alá

Leu

Ser

Phe

Ser

Ile

Thr

Tyr

Phe

Val

945

950

955

960

Tyr

Alá

Leu

Alá

Tyr

Trp

Trp

Gly

Alá

Lys

Gin

Val

Arg

Asn

Gly

Thr

965

970

975

Tyr

Ser

Gin

Leu

Asp

Phe

Phe

Ile

Val

Leu

Pro

Alá

Leu

Leu

Phe

Ser

980

985

990

Alá

Gin

Ser

Alá

Gly

Gin

Ile

Phe

Ser

Leu

Ser

Pro

Glu

Met

Ser

Arg

995

1000

1005

Alá

Gly

Val

Alá

Alá

Arg

Asn

Val

Phe

Gly

Leu

His

Asp

Gin

Lys

Pro

1010

1015

1020

Thr

Ile

Val

Asp

Val

Asp

Alá

Lys

Gin

Ser

Gly

Alá

Leu

Pro

Ser

Ser

1025

1030

1035

1040

Thr

Leu

Ser

Ile

Pro

Thr

Leu

Glu

Asp

Lys

Alá

Ser

Pro

Ser

Ser

Gly

1045

1050

1055

Gly

Trp

Ile

Glu

Phe

Lys

Asn

Val

Ser

Leu

Cys

Tyr

Pro

Ser

Lys

Pro

1060

106Ξ

1070

Gin

His

Pro

Alá

Leu

Gin

Asn

Val

Asr

Ile

Ser

Ile

Arg

Pro

Gly

Glu

1075

1080

1085

Phe

Ile

Alá

Leu

Val

Gly

Pro

Ser

Gly

Alá

Gly

Lys

Ser

Thr

Ile

Leu

1090

1095

1100

Ser

Leu

Leu

Gin

Arg

Phe

Tyr

Asp

Pro

Thr

Alá

Gly

Ser

Val

Gin

Leu

1105

1110

1115

1120

Asp

Gly

Gin

Asp

Ile

Arg

Glu

val

Alá

Val

Pro

Gin

His

Arg

Gly

Arg

1125

1130

1135

Leu

Gly

Leu

Val

Pro

Gin

Glu

Pro

Asp

Leu

Phe

Pro

Gly

Ser

Ile

Ser

1140

1145

1150

Tyr

Asn

Ile

Gly

Leu

Gly

Alá

Alá

Pro

Gly

Gin

Leu

Val

Thr

Arg

Asp

1155

1160

1165

Asp

Ile

Glu

Lys

Ile

Cys

Alá

Lys

Cys

Gly

Ile

His

Glu

Phe

Ile

Met

1170

1175

1180

Ser

Leu

Pro

Glu

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Cys

Gly

Thr

Asn

Gly

Ser

Lys

1185

1190

1195

1200

Leu

Ser

Gly

Gly

Gin

Lys

Gin

Arg

Ile

Alá

Val

Alá

Arg

Alá

Leu

Ile

1205

1210

1215

Arg

Ser

Pro

Glu

Val

Leu

Leu

Leu

Asp

Glu

Tvr

Thr

Ser Alá

Leu

Asp

1220

1225

1230

Alá

His

Ser

Glu

Gin

Gin

Ile

Lys

Glu

Alá

Val

Asp

Gly Alá

Ser

Val

1235

1240

1245

Asp

Arg

Thr

Thr

He

Val

Val

Alá

His

Arg

Leu

Ser

Thr Val

Gin

Asn

1250

1255

1260

Alá

Asp

Arg

He

Phe

Val

Phe

Asp

Asp

Gly

Arg

Val

Val Glu

Val

Gly

1265

1270

1275

1280

Ser

His

Alá

Glu

Leu

Val

Alá

Gin

Gly

Gly

Leu

Tyr

Alá Gly

Met

Val

1285 1290 1295

Leu Alá Gin Thr Leu Thr

1300 (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 39 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (ix) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACGCGAGATC TTCTCTCCAG TCAATCCCCA CGCAATTGC 39 (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 46 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (ix) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCTGCGTCAT CTTCAAGGGC GAGCTCATTC GGGTTCAAGA ATCTTC 46

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy izolált nukleinsav molekula, azzal jellemezve, hogy az Aureobasidium pullulans MDR-t kódolja.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav molekula, azzal jellemezve, hogy DNS-t jelent.
3. 3. A 2. igénypont szerinti nukleinsav molekula, azzal jellemezve, hogy az 1. számú szekvenciával rendelkezik.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav molekula vagy annak egy része, azzal jellemezve, hogy egy detektálható egységgel megjelöltük.
5. 5. A 4. igénypont szerinti nukleinsav molekula, azzal jellemezve, hogy a detektálható egységet egy fluoreszcensz jelölést, egy radioaktív atomot, és egy kemilumineszcensz jelölést magába foglaló csoportból szelektáljuk.
6. 6. Egy replikálható vektor, azzal jellemezve, hogy az 1., 2., vagy 3. igénypontok szerinti nukleinsavat tartalmazza.
7. 7. Egy gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
8. 8. Egy gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
9. 9. Egy tisztított formában levő protein, azzal jellemezve, hogy a 2. számú szekvencia kódolja.
10. 10. Eljárás egy vegyület gomba MDR gátló aktivitásának meghatározására, azzal jellemezve, hogy

    a) egy élesztőgomba sejt tenyészetet szaporítunk, mely sejteket az AP-MDR expresszióját biztosító vektorral transzformáltuk β· «ο ·--» » ·· * * V · ·♦·«♦ • ··· « ·♦»· ··* · v*e «« >· (i) egy gombaellenes szer, mellyel szemben az említett élesztőgomba sejt rezisztens, de mellyel szemben az említett élesztőgomba sejt érzékeny ha nincs transzformált állapotban;

    (ii) egy feltételezetten gomba MDR gátló aktivitással rendelkező vegyület jelenlétében; és

    b) meghatározzuk az említett vegyület gomba MDR gátló aktivitását oly módon, hogy a gombaellenes szer említett élesztőgomba sejt növekedésére kifejtett gátló képességét mérjük.