KR20020047289A - 인간 타이로신키나제 에이치씨케이에 결합하는 인간단백질 및 그것을 코드하는 유전자 - Google Patents

인간 타이로신키나제 에이치씨케이에 결합하는 인간단백질 및 그것을 코드하는 유전자 Download PDF

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Abstract

인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 신규한 단백질이 개시되어 있다. 본 발명의 단백질의 대표적인 예는, 서열목록 1 또는 12로 표시되는 아미노산 배열을 보유한다. 이들 단백질을 코드하는 핵산도 개시되어 있다. 본 발명의 단백질은 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 성질을 보유하고, 종양치사인자 자극에 의한 아포토시스를 촉진하는 기능을 보유한다.

Description

인간 타이로신키나제 에이치씨케이에 결합하는 인간 단백질 및 그것을 코드하는 유전자{HUMAN PROTEINS BINDING TO HUMAN TYROSINE KINASE Hck AND GENES ENCODING THE SAME}
세포외로부터의 다양한 시그널은 세포표면의 수용체를 통하여 세포내로 전달된다. 이들 정보는 다양한 시그널전달분자로 이루어지는 정보전달계에 의해서 핵내로 전달되어, 전사인자를 활성화하고, 그 결과, 일군의 유전자의 발현이 유도 또는 억제된다. 지금까지 세포내에 다수의 타이로신키나제가 발견되어 있고, 이들의 다수는 세포내의 시그널전달분자로서 작용하고 있는 것이 해명되어왔다. 타이로신키나제는 수용체형과 비수용체형의 타이로신키나제로 분류되고, 또한 비수용체형의 타이로신키나제는 막결합형과 세포질형으로 분류된다. Src패밀리의 타이로신키나제는 Src, Yes, Yrk, Fgr, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck의 합계 9종의 멤버가 알려져 있다. 이들은 약 500 아미노산으로 이루어지는 분자량 약 6만의 타이로신키나제로, 세포막을 관통하지 않고, 세포내막에 결합하는 막결합형 타이로신키나제이다. 이들 Src패밀리의 기본구조는 유사하여 있고, 모두 SH(Src homology)2 도메인과 SH3 도메인 및 프로테인키나제 도메인을 보유하고 있다. SH2 도메인과 SH3 도메인은 단백질 상호간의 결합여 관여하고 있고, SH2 도메인은 인산화된 타이로신잔기를 포함하는 배열을 인식하여, 특이적으로 결합한다. 한편, SH3 도메인은 프롤린이 풍부한 배열과 특이적으로 결합하고, 프로테인키나제 도메인에 의해서 타겟 단백질을 인산화한다고 생각되고 있다. 이 SH2 도메인과 SH3 도메인이 다양한 시그널 전달경로에서의 단백질-단백질 상호작용의 중개에 중요한 역활을 담당하고 있다고 생각되고 있다.
Hck는 Src패밀리의 타이로신키나제의 하나이고, 시그널전달을 담당하는 분자로 추측되고 있고(ZIEGLER, S.F. 등, Molecular and Cellular Biology, 7, 2276-2285(1987)), 태아성 간세포에 존재하는 LIF(leukaemia inhibitory factor)/IL-6(인터류킨6) 수용체의 서브유닛(gp130)에 Hck가 결합하여 그 시그널전달에 관여하고 있다(Emist M., ra 등, The EMBO Journal, 13, 1574-1584(1994))는 보고나, 단구성의 세포 THP-1의 FcγRⅡ에 Hck가 결합하여 그 시크널전달에 관여하고 있다(Ghazizadeh, s., 등, Journal of Biological Chemistry, 269, 8878-8884(1994))는 보고가 되어있다. 그러나, 이들을 포함하여 Hck의 시그널전달의 상세한 기능은 해명되어 있지 않다. 최근, 에이즈바이러스(HIV)의 nef단백질이 인간Hck의 SH3 도메인에 다른 Src형 타이로신키나제의 SH3 도메인에 비하여 10배 정도 강하게 결합하기 때문에(Lee C-H 등, EMBO Journal 14, 5006-5015(1995)) HIV감염에 있어서의 Hck의 역활이 주목되고 있다. 또한, 호중구의 분비과립에 존재하는 Hck는 과립구가 감염균을 탐식(phagocytosis)한 후의 시그널전달에 관여하고 있을 가능성이 있다(Welch, H., and Maridonneau-Parini, I., Journal of Biological Chemistry, 272, 102-109(1987)).
상기한 바와 같은 Hck가 관여하는 시그널전달의 연구나, HIV의 nef단백질의 거동의 해명연구 등을 위해서, 인간 세포내 타이로신 인산화 효소 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 단백질 및 이 단백질과 그것을 초래하는 유전자는 유용하다고 생각된다.
본 발명은 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 신규한 단백질 및 그것을 코드하는 핵산에 관한 것이다.
도1은 대장균으로 본 발명의 단백질의 일례인 HSB-1을 발현시킨 결과를 나타내는 전기영동패턴의 모식도이다.
레인1 : 분자량 마커
레인2 : IPTG 첨가전의 균체추출액
레인3 : IPTG 첨가 4시간후의 균체추출액
레인4 : 정제된 HSB-1
도2는 인간Hck와 HSB-1을 세포중에 공발현시켜, 인간Hck에 결합한 HSB-1이 인간Hck와, 함께 면역침강하는 것을 나타낸 전기영동패턴의 모식도이다.
레인1 : 분자량 마커
레인2 : 인간Hck를 면역침강시켜서 HSB-1을 검출하였다.
레인3 : 대조
도3은 인간Hck와 HSB-1 및 그 부분배열 HSB-1(1-131), HSB-1(70-404)를 각각 세포중에 공발현시켜, 인간Hck에 결합한 HSB-1 및 HSB-1(70-404)가 인간Hck와 함께 면역침강하고, HSB-1(1-131)이 인간Hck와 함께 면역침강하지 않는 것을 나타낸 전기영동패턴의 모식도이다. 상단은 항Xpress항체로 검출, 하단은 항FLAG항체로 검출한 상을 나타내었다.
레인1 : 컨트롤벡터 pcDNA4/HisMaxC와 Hck/pFLAG-CMV2로 형질전환한 세포추출액의 항인간Hck항체에 의한 면역침강물
레인2 : HSB-1와 인간Hck를 공발현한 세포추출액의 항인간Hck항체에 의한 면역침강물
레인3 : HSB-1(1-131)와 인간Hck를 공발현한 세포추출액의 항 인간Hck항체에 의한 면역침강물
레인4 : HSB-1(70-404)와 인간Hck를 공발현한 세포추출액의 항인간Hck항체에 의한 면역침강물
레인5 : 컨트롤벡터 pcDNA4/HisMaxC와 Hck/pFLAG-CMV2로 형질전환한 세포추출액
레인6 : HSB-1와 인간Hck를 공발현한 세포추출액
레인7 : HSB-1(1-131)와 인간Hck를 공발현한 세포추출액
레인8 : HSB-1(70-404)와 인간Hck를 공발현한 세포추출액
도4는 HSB-1을 발현한 CEM세포에 대한 TNF-α의 아포토시스 유도효과를 나타내는 도이다.
도5a∼5d는 서열목록 2에 있어서의 DNA에 해당하는 단백질 서열목록을 나타낸다.
도6a∼6d은 서열목록 13에 있어서의 DNA에 해당하는 단백질 서열목록을 나타낸다.
본 발명은, 세포내 타이로신 인산화 효소 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 단백질과 이것을 코드하는 핵산을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의검토를 거듭한 결과, 세포내 타이로신 인산화 효소 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 단백질을 코드하는 DNA를 단리하는 것으로 성공하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 제공한다.
(a) 서열목록 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질.
(b) 서열목록 1로 표시되는 아미노산 배열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 단백질.
또한, 본 발명은 서열목록 1로 표시되는 아미노산 배열 또는 그 한 영역과 80% 이상의 상동성을 보유하고, 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 본 발명의 단백질을 코드하는 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 본 발명의 핵산을 포함하고, 숙주세포중에서 상기 본 발명의 단백질을 발현할 수 있는 재배열 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 본 발명의 재배열 벡터로 형질전환되어, 상기 본 발명의 단백질을 생산하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 단백질은 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 기능을 보유하기 때문에, 인간Hck의 시그널전달 메카니즘의 해명이나, HIV감염에 있어서의 인간Hck의 역활해명에 유효하다. 또한, 인간Hck가 관여하는 병환이나 감염증의 치료약의 개발에 유효하다. 또한, 본 발명의 단백질은, 종양치사인자(TNF-α) 자극에 의한 아포토시스를 촉진하는 기능을 보유하므로, 종양치사인자와의 병용에 의해, 종양치사인자의 항종양활성촉진제로서 유용하다.
본 발명의 단백질은, 인간Src형 타이로신키나제 중, 인간 타이로신키나제 Hck라고 불리는 것(이하에서는 「인간Hck」라고 약칭하는 일이 있음)에 결합하는 단백질분자로, 그 대표예는 하기 실시예에서 얻어진 HSB-1이다. 한편, 본 발명의 핵산은 상기 본 발명의 단백질을 코드하는 핵산이고, 인간태반 등의 조직으로부터 조제된 cDNA 라이브러리로부터, 소위 효모 2-하이브리드시스템(Yeast two-hybrid system)을 사용한 스크리닝 등에 의해 창제된 것으로, 그 대표예는 하기 실시예에서 얻어진 HSB-1을 코드하는 것이다(이하, 「HSB-1 DNA」라고 함). 본 발명의 핵산은 하기와 같이하여 클로닝된 것이다.
또한, 본 발명의 핵산은 이하의 방법으로 창제된 것이지만, 본 발명에 의해, 그 염기배열이 결정되므로, 본 발명의 지견에 기초하여, 인간태반 cDNA 라이브러리를 주형으로 한 RT-PCR 등에 의해 용이하게 제작할 수 있다.
1. HSB-1 DNA의 클로닝
(1) cDNA 라이브러리의 획득
mRNA의 공급원으로는 인간태반 등의 조직이 열거된다. 또한 이들 조직유래의독립된 세포주를 공급원으로 하여도 좋다. mRNA의 조제는 통상 행해지는 수법으로 행할 수 있다. 예컨대, 상기 조직 또는 세포를 구아니딘시약을 사용하여 처리함으로써 전체 RNA를 얻고, 계속하여 올리고dT-셀룰로오스나, 폴리U-세팔로스 등을 사용한 친화성 컬럼법, 또는 배치법에 의해 폴리(A+)RAN(mRAN)를 얻는다. 또한, 수크로스밀도 구배원심법 등에 의해 폴리(A+)RNA를 더욱 분화할 수도 있다.
이와같이 하여 얻어진 mRNA를 주형으로 하여 일중쇄 cDNA를 합성한 후, 이 일중쇄 cDNA로부터 이중쇄 cDNA를 합성하고, 적당한 백터 DNA와의 재배열 플라스미드를 제작한다. 이것을 사용하여 대장균 등을 형질전환함으로써, cDNA의 라이브러리를 얻는다. 또는 cDNA의 라이브러리로서 시판된 것(CLONTECH사 등)을 사용해도 좋다.
(2) 베이트 플라스미드 pAS2-1의 구축
상기 1과 같이하여 얻어진 cDNA 라이브러리로부터, 목적의 클론을 스크리닝하기 위한 플라스미드를 다음과 같이 조제한다.
플라스미드는, 예컨대 인간Hck 전체를 코드하는 DNA를 GAL4의 DNA결합 도메인을 코드하는 DNA에 연결함으로써 키메라 DNA를 제작하고, 이 키메라 DNA를 베이트 플라스미드(bait plasmid) pAS2-1에 연결하여 조립하여도 좋지만, 시그널전달계로에서의 단백질-단백질 상호작용에 중요한 역활을 완수하고 있다고 생각되고 있고, SH2 도메인과 SH3 도메인을 코드하는 DNA를 함께 또는 각각 개별로 GAL4의 DNA결합 도메인을 코드하는 DNA에 연결함으로써 키메라DNA를 제작하고, 이 키메라DNA를 베이트 플라스미드 pAS2-1에 연결함으써도 얻을 수 있다.
(3) 스크리닝
계속하여 상기 플리스미드를 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 스크리닝에는 효모 2-하이브리드시스템(yeast two-hybrid system)을 사용할 수 있다. 효모 2-하이브리드시스템은 단백질간 상호작용을 효모균체내에서 검출할 수 있는 실험계이고, 목적의 단백질(베이트)에 상호작용하는 단백질의 cDNA를 라이브러리로 스크리닝할 수 있다. 베이트 플라스미드에 의한 형질전환체는 트립신(-)의 배지에서 선별할 수 있다. 또한 GAL4 전사활성화 도메인과의 융합 단백질로서 발현할 수 있는 cDNA 라이브러리로 형질전환하면, 형질전환체는 트립토판(-), 로이신(-)의 배제에서의 생육이 가능하게 된다. 또한, 베이트 플라스미드유래의 융합 단백질과 라이브러리 유래의 융합 단백질이 결합하면, 리포터 유전자의 HIS3 유전자 및 LacZ 유전자가 전사되므로, 양성 클론은 트립토판(-), 로이신(-), 히스티딘(-)의 배지에서의 생육이 가능하게 되고, 또한 β-갈락토시다제 활성을 보유한다. 그래서, 양성 클론은 히스티딘, 트립토판 및 로이신을 함유하지 않은 선택배지에 있어서의 증식 및 β-갈락토시다제 활성을 지표로 하여 선택할 수 있다.
(4) 염기배열의 결정
얻어진 클론에 대해서 염기배열의 결정을 행한다. 염기배열의 결정은 맥산-길버트법(Maxam-Gilbert method), 디데옥시법 등의 공지된 수법으로 행할 수 있지만, 통상은 자동 염기배열 결정장치를 사용하여 배열결정이 행해진다. 상기에 의해서 얻어진 염기배열로부터, 또한 5'-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)법, 3'-RACE법, 올리고캡법 등의 공지된 수법에 의해서, 완전한 길이의 cDNA 염기배열을 얻을 수 있다. 이와같이 하여 결정된 본 발명의 HSB-1 DNA의 염기배열로서, 예컨대 서열목록 2로 표시되는 것이 열거되고, 서열목록 1로 본 발명의 HSB-1의 아미노산 배열이 예시된다. 이 아미노산 배열로 이루어지는 단백질이 인간Hck와 결합하는 활성을 보유하는 한, 그 아미노산 배열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산에 결실, 치환, 부가 등의 변이가 생겨도 좋다. 에컨대, 서열목록 12에 아미노산 배열의 1개(12번째의 프롤린이 로이신에)가 치환되어 있는 변이체가 예시된다.
2. 재배열 벡터 및 형질전환체의 제작
(1)재배열 벡터의 제작
본 발명의 재배열 벡터는 적당한 벡터로 본 발명의 HSB-1 DNA를 연결, 삽입함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 HSB-1 DNA를 연결, 삽입하기 위한 벡터는, 그 DNA가 숙주중에서 복제가능한 것이면 특별히 한정하지 않고, 예컨대 플라스미드 DNA, 파지DNA 등이 열거된다. 플라스미드 DNA는 대장균이나 아그로박테륨으로부터 알칼리추출법 등에 의해 조제할 수 있다. 또한, 시판된 플라스미드로서, 예컨대 클론테크사, 호우슈조우사, 아무샴파르마시아 바이오테크사 등으로부터 제공되는 것을 사용해도 좋다.
파지DNA로는, 예컨대 M13mp 18, λgt11 등이 열거된다. 벡터로 본 발명의 DNA를 삽입하는데는, 우선, 정제된 DNA를 적당한 벡터DNA의 제한효소부위 또는 멀티클로닝사이트에 삽입하여 벡터에 연결하는 방법 등이 채용된다.
본 발명의 DNA는 그 DNA의 기능이 발휘되도록 벡터에 조립되는 것이 필요하다. 그래서 본 발명의 벡터에는 프로모터 및 본 발명의 DNA외, 종결인자, 리보솜결합배열 등을 조립하여도 좋다. 더욱이, 이들을 구비한 발현벡터가 다수 시판되어 있으므로, 이들 발현벡터의 멀티클로닝사이트에 본 발명의 DNA단편을 삽입함으로써, 본 발명의 단백질을 발현하는 재배열 벡터를 용이하게 제작할 수 있다.
(2) 형질전환체(또는 형질전환세포)의 제작
본 발명의 형질전환체는, 본 발명의 유전자 발현을 위한 재배열 벡터를 목적 유전자가 발현하여 얻어지도록 숙주속에 도입함으로써 얻을 수 있다. 여기서 숙주로서는 본 발명의 DNA를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정하지 않는다. 예컨대, 대장균(Esherichia coli), 고초균(Bacillus subtilis) 등의 세균, 사카로마이시스ㆍ세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모, COS세포, CHO세포 등의 동물세포, 또는 곤충세포(Sf9) 등이 열거된다.
세균으로의 재배열 벡터의 도입방법으로는 세균에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정하지 않는다. 예컨대 칼슘이온을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션 등이 열거된다. 효모로의 재배열 벡터의 도입방법으로는, 예컨대 일렉트로포레이션법, 초산리튬법 등이 열거된다. 동물세포로의 재배열 벡터의 도입방법으로는, 예컨대 일렉트로포레이션법, 인산칼슘법 등이 열거된다.
3. HSB-1의 생산
본 발명의 재배열 단백질 HSB-1은 상기 형질전환체를 배지에서 배양하고, 그 배양물로부터 채취함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 각 수주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행해진다. 대장균이나 효모 등의 미생물을 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로는 미생물이자화하여 얻어지는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양이 효율적으로 행해지는 배지이면 천연배지, 합성배지 어느 것을 사용해도 좋다. 배양은, 통상 진탕배양 또는 통기교반배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 필요에 따라서 유도물질을 배지에 첨가하여도 좋다. 예컨대, Lac프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG) 등을 배지에 첨가하여도 좋다.
동물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640배지나 DMEM배지, 또는 이들 배지에 소의 태아혈청 등을 첨가한 배지 등이 사용된다. 배양은 통상 5% 산소가스의 존재하에서 행해진다.
배양후, 본 발명의 HSB-1이 균체내 또는 세포내에 생산되는 경우에는 균체 또는 세포의 파쇄 등에 의해 HSB-1을 추출한다. 또한, 본 발명의 HSB-1이 균체외 또는 세포외에 생산되는 경우에는, 배양액으로부터 균체 또는 세포를 제거한 후, 단백질의 단리정제에 사용되는 일반적인 방법을 단독 또는 적당히 조합하여 사용함으로써, 배양물 중으로부터 본 발명의 HSB-1을 단리정제할 수 있다.
상기에 개략 설명하고, 또한 하기 실시예에 있어서 구체적으로 기재하는 방법에 의해, 서열목록 1로 표시하는 아미노산 배열을 보유하는 단백질을 단리하였다. 일반적으로, 어떤 생리활성을 보유하는 단백질의 아미노산 배열 중, 소수의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 경우에 있어서도 그 단백질이 그 생리활성을 유지하는 경우가 있는 것은 당업자에 있어서 폭넓게 알려져 있다. 따라서, 서열목록 1로 표시되는 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 단백질로서, 아미노산 배열의 상동성이 80% 이상(이하, 편의적으로 「수식단백질」이라고 하는 일이 있음) 및 그 수식단백질을 코드하는 핵산(이하, 편의적으로「수식핵산」이라고 하는 일이 있음)도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 하기 실시예에서 명백해지듯이, 인간 타이로신키나제 Hck와 결합하는 HSB-1의 영역은 N말단으로부터 130번째∼404번째의 아미노산으로 이루어지는 영역이다. 따라서, 서열목록 1로 표시되는 아미노산 배열중, Hck와의 결합에 필요한 한 영역으로부터 이루어지는 단백질, 및 그 한 영역에서의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 단백질로서, 상기 한 영역과 아미노산 배열의 상동성이 80%이상의 것도 상기 수식단백질에 포함되고, 본 발명의 범위에 속한다. 이와 같은 수식단백질의 아미노산 배열은 서열목록 1로 표시되는 아미노산 배열 또는 그 한 영역과 80%이상의 상동성을 보유하고, 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95%이상, 더욱 바람직하게는 98%이상의 상동성을 보유한다. 또한, 상기 본 발명의 단백질(상기 수식단백질을 포함함)을 코드하는 핵산은 모두 본 발명에 범위에 속한다. 상기 수식핵산은 서열목록 2로 표시되는 염기배열 또는 그 한 영역과 70%이상, 보다 바람직하게는 85%이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 특히 바람직하게는 95%이상의 상동성을 보유하는 것이 바람직하다. 또한, 수식핵산은 서열목록 2 기재의 염기배열을 보유하는 핵산과,엄격조건하(즉, 5 ×Denhardt's reagent, 6 ×SSC, 0.5% SDS라고한 일반적인 하이브리드형성용액을 사용하여 60∼65℃에서 반응을 행함)에서 하이브리드화하여 얻은 것이 바람직하다. 더욱이, 아미노산 배열 및 염기배열의 상동성은 FASTA와 같은 주지의 컴퓨터소프트웨어를 사용하여 용이하게 산출할 수 있다.
4. HSB-1의 기능
(1) HSB-1의 구조와 Hck의 결합
HSB-1은 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 기능을 보유하고, Hck로부터의 시그널전달을 다음의 단백질에 전달하는 역활을 담당하고 있다고 생각된다. 아미노산 배열의 구조해석의 결과로부터 아미노말단측에 SH3 도메인을 보유하고 있다. 또한, 하기 실시예에 기재하였듯이, HSB-1은 서열목록 12로 표시되는 아미노산 배열의 130번째부터 404번째의 범위에서, Hck의 SH3 도메인에 결합한다고 생각된다.
(2) 종양치사인자(TNF-α) 자극에 의한 아포토시스를 촉진하는 기능
하기 실시예에 구체적으로 기재하듯이, HSB-1/pEF/V5-HisC에 의해서 형질전환된 CEM A301세포(이하, CEM세포라고 칭함)는 HSB-1을 정상적으로 과잉생산한다. 한편, 종양치사인자(TNF-α)는 그 자극에 의해, 세포에 아포토시스를 유도하는 것이 알려져 있다. HSB-1을 과잉생산하는 형질전환된 CEM세포는 야생주 CEM세포나 pEF/V5-HisC에 의해서 형질전환된 CEM세포와 비교하여, 1/5∼1/10 저농도의 TNF에 의한 자극으로 아포토시스가 유도된다. 즉, HSB-1은 TNF-ａ에 의해서 유도되고, 아포토시스에 이르는 시그널전달에 관여하고, 이것을 촉진시킨다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 HSB-1 DNA의 클로닝
(1) cDNA 라이브러리
본 발명에서는 cDNA로서 시판된 것(CLONTECH사)을 사용하였다.
(2) 플라스미드의 조제
인간Hck의 SH2 도메인과 SH3 도메인(인간Hck의 아미노산 배열(서열목록 11)의 제62∼217번째)을 코드하는 DNA의 PCR반응은 클론텍크사의 PCR키트(Advantage PCR Kits)를 사용하여, 프라이머로서 이하의 것을 사용하였다.
센스프라이머 : 서열목록3
안티센스프라이머 : 서열목록4
PCR은 우선 94℃에서 1분 반응을 행하고, 다음에 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 및 72℃에서 1분의 반응을 1사이클로 하여 30사이클 행하고, 최후에 72℃에서 10분 반응을 행하였다.
다음에, PCR산물을 TA Cloning Kits(Invitrogen사)를 사용하여 플라스미드 pCR2.1에 클로닝하고, 이것을 EcoRll/Sall로 절단하고, 인간Hck의 SH2 도메인과 SH3 도메인을 포함하는 약 500bp의 프라그먼트를 얻었다. 이 프라그먼트를 EcoRll/Sall로 절단한 pAS-2벡터로 결합시켰다(이 벡터를 「Hck(SH2+SH3)/pAS-2」라고 칭함). Hck(SH2+SH3)/pAS-2를 통상의 방법으로 대장균 MC1061rec-으로 형질전환하고, 이것으로부터 알칼리법, 계속하여 염화세슘/브롬화에티듐 밀도평형원심법으로 정제를 행하였다.
(3) 스크리닝
베이트로 되는 플라스미드 Hck(SH2+SH3)/pAS-2를 초산리튬법으로 효모 Y190주로 형질전환하였다. 형질전환은 CLONTHEH사의 MATCHMAKER Two-Hybrid System kit를 사용하여 행하였다. 형질전환체를 트립신(2)의 배지에서 선별하였다. 또한 GAL4전사활성화 도메인과의 융합 단백질으로서 발현이 가능한 cDNA 라이브러리(CLONTHEH사의 인간태반 MATCHMAKER cDNA 라이브러리)를 형질전환하였다. 형질전환체로부터의 양성 클론은 트립토판(-), 로이신(-), 히스티딘(-) 및 3-아미노트리아졸(25mM) 첨가의 배지에서 증식한 클론(150클론)을, 또한 β-갈락토시다제 활성에 의해 선발하였다(51클론). 양성 클론을 시클로헥시이미드(1㎍/ml) 첨가배지에서 배양하고, 증식하여 온 클론으로부터 플라스미드를 정제하고, (CLONTHEH사의 MATCHMAKER Two-Hybrid System kit를 사용하여 행하였음), 다음에 대장균으로 형질전환하고, 이것으로부터 플라스미드를 정제하였다. 얻어진 플라스미드의 cDNA 라이브러리부분의 염기배열은 파킨엘마사 제품의 DNA 서열(373A형)을 사용하여, 다이터미네이터법으로 결정하였다. 염기배열 해석용 프라이머로는 키트를 첨부한 것을 사용하였다. 얻어진 염기배열을 GENETYX의 데이터베이스를 이용하여 상동검색을 행하였다.
그 결과, 이미 보고되어 있는 유전자와 일치하지 않는 신규배열을 포함하는 클론(Hck-c-58/pACT2)을 발견하였다.
Hck-c-58/pACT2에 포함되는 신규배열은, HSB-1의 N말단배열을 일부 결손하고있으므로, 이하와 같이하여 전체 염기배열을 포함하는 HSB-1의 유전자를 인간태아 cDNAλgt11 라이브러리(CLONTHEH사 제품)로부터 얻었다. Hck-c-58/pACT2에 포함되는 신규배열을 EcoRl/Xhol으로 절단하여 정제하고, 이것을 토대로 랜덤프라이머법으로32P-CTP로 표식된 방사성 표식프로브를 제작하였다. 인간태반 cDNAλgt11 라이브러리를 대장균(Y1090r-)과 함께 LB한천배지상에 감고, 플라크를 제작하고, 이것을 니트로셀룰로오스막에 전사하고, UV-교차연계후, 상기 방사성 표식프로브를 사용하여 오토라디오그래피를 행하였다. 계속하여, 양성을 띄는 플라크를 베껴 쓰고, 희석하여 동일한 스크리닝을 반복하여, 양성을 나타내는 클론을 다수 얻었다. 얻어진 λgt11 파지로부터, cDNA 라이브러리 삽입을 PCR(센스프라이머:서열목록5, 안티센스프라이머:서열목록6, 반응조건은 94℃에서 1분, 계속하여 94℃에서 30초, 68℃에서 4분의 반응을 1사이클로 하고, 이 사이클을 30회 반복하고, 최후에 68℃에서 4분 반응시켰다.)에 의해서 증폭되고, HSB-1의 N말단배열을 포함하는 PCR산물을 상기 pCR2.1에 클로닝하고, 삽입부분의 염기배열을 다이터미베이터법으로 해석하고, Hck-c-58/pACT2의 배열에 연결하여 HSB-1의 전체 길이의 염기배열을 결정하였다. HSB-1의 염기배열을 서열목록 2로 표시하였다. 또한, 서열목록 2로 표시되는 염기배열에 의해 코드되는 아미노산 배열을 서열목록 1로 표시하였다.
또한, 양성을 띄는 λgt11 파지클론으로부터 가장 긴 PCR산물을 마찬가지로 TA Cloning Kits(Invitrogen사)를 사용하여 플라스미드 pCR2.1에 클로닝하고, 삽입부분의 염기배열을 다이터미네이터법으로 해석하였더니, 서열목록 2로 표시되는HSB-1의 염기배열과 1염기만 다른 염기배열을 얻었다(362번째의 시토신(C)이 티민(T)과 치환되어 있음). 이 염기배열을 서열목록 13으로 표시하였다. 또한, 서열목록 13으로 표시되는 염기배열에 의해 코드되는 아미노산 배열을 서열목록 12로 표시하였다(121번째의 클로닝이 로이신으로 치환).
실시예 2 재배열 벡터의 구축, 형질전환체의 제작, 및 HSB-1의 발현
HSB-1 DNA의 재배열 벡터를 제작하기 위해서, HSB-1을 코드하는 cDNA(서열목록 13)을 PCR법으로 합성하였다. 프라이머는 하기의 것을 사용하고, PCR반응액의 조성은 상기의 것과 동일하다.
센스프라이머 : 서열목록7
안티센스프라이머 : 서열목록8
PCR반응은, 94℃에서 30초, 계속하여 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 2분의 반응을 1사이클로 하고, 이 사이클을 30회 반복하고, 최후에 72℃에서 3분 반응시켰다. 다음에 PCR산물을 TA Cloning Kits(Invitogen사)를 사용하여 플라스미드 pCRⅡ에 클로닝하고, 이것을 EcoRl/BamHl으로 절단하고, 발현벡터 pGEX-6P-1(아마샤무 팔마시아 바이오텍크사 제품)에 삽입하였다. 또한, 이 발현벡터를 대장균 BL21-CodmPlus-R1L(스트라토진사 제품)으로 형질전환을 행하였다.
HSB-1의 발현은 이 형질전환한 대장균을 LB배지(암피실린 첨가)에서 배양함으로써 행하였다. 전 배양한 배양액 0.4ml를 10ml의 배지에 접종하고, 32℃에서 4시간 진탕배양하였다. 100mM 이소프로필-티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 0.1ml가하고, 4시간 더 배양하였다. IPTG 첨가직전의 배양액 1ml와, IPTG 첨가후 4시간배양한 배양액 1ml로부터 각각 균체를 수집하고, 균체중의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 해석하였다. 전기영동후의 단백질 염색도를 도1에 표시하였다. HSB-1과 GST의 융합 단백질이 분자량 7만정도로 발현하여 있다.
실시예 3 HSB-1과 인간Hck의 결합
HSB-1과 인간Hck의 결합을 이하의 방법으로 확인하였다.
실시예 2의 발현벡터 작성방법과 동일한 방법으로, HSB-1을 코드하는 cDNA(서열목록 13)을 발현벡터 pEF/V5-HisC(Invitrogen사 제품)에 삽입하였다(HSB-1/pEF/V5-HisC).
한편, 인간Hck 코드하는 cDNA를 PCR법으로 합성하였다. 프라이머는 하기의 것을 사용하고, PCR반응액의 조성은 상기 것과 동일하다.
센스프라이머 : 서열목록9
안티센스프라이머 : 서열목록 10
PCR반응은, 94℃에서 30초, 계속하여 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 3분의 반응을 1사이클로 하고, 이 사이클을 30회 반복하고, 최후에 72℃에서 3분 반응시켰다. 다음에 PCR산물을 TA Cloning Kits(Invitogen사)를 사용하여 플라스미드 pCRⅡ에 클로닝하고, 이것을 EcoRl/Xhol로 절단하고, EcoRl/Sall으로 절단한 발현벡터 pFLAG-CMV2(이스트만 코닥사 제품)에 삽입하였다(Hck/pFLAG-CMV2).
다음에, 293T세포에 인산칼슘법(프라임사 제품의 키트를 사용)으로, 2개의 플라스미드, HSB-1/pEF/V5-HisC와 Hck/pFLAG-CMV2를 동시에 형질전환하였다. 또한, 대조로 HSB-1/pEF/V5-HisC와 pFLAG-CMV2를 동시에 형질전환하였다. 2일간 배양후,세포를 수집하고, 세포내 용액을 조제하였다. 이것을 항인간Hck 항체에 면역침강하고, 침강물을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분리하고, 웨스턴블랏을 행하여, 항V5항체로 검출하였다. 검출결과를 도2에 표시하였다. 항V5항체로 HSB-1이 검출된 것으로부터, 인간Hck와 함께 발현한 HSB-1(V5로 표식되어 있음)이 인간Hck에 결합하여 인간Hck와 함께 면역침강하는 것이 확인되었다.
실시예 4 Hck의 HSB-1과의 결합위치의 추정
실시예 1 (2)와 동일한 방법으로 Hck의 SH2 도메인(인간Hck의 아미노산 배열(서열목록 11)의 제121∼217번째), 및 SH3 도메인(제62∼120번째)을 코드하는 DNA를 PCR법으로 얻었다.
SH2 도메인
센스프라이머: 서열목록 14
안티센스프라이머: 서열목록4
SH3 도메인
센스프라이머: 서열목록3
안티센스프라이머: 서열목록 15
이 PCR산물을, 또한 동일한 방법으로, pAS-2벡터로 각각 결합하고, Hck(SH2)/pAS-2, 및 Hck(SH3)/pAS-2를 얻었다.
이들을 실시예 1 (3)과 동일한 방법으로 효모 Y190주로 형질전환하고, 계속하여 Hck-c-58/pACT2 또는 pACT2를 각각 형질전환하였다. 형질전환체를 트립토판(-), 로이신(-)배지에서 증식시켜서 취득하고, 3종의 인간Hck 단편(SH2+SH3, SH2,SH3)과 HSB-1의 결합을 β-갈락토시다제 활성의 유무로 측정하였다. 그 결과를 표1에 나타내었다. Hck-c-58/pACT2와 Hck(SH2+SH3)/pAS-2로 형질전환한 효모는 β-갈락토시다제 활성이 양성이었지만, Hck-c-58/pACT2와 Hck(SH2)/pAS-2로 형질전환한 효모는 β-갈락토시다제 활성은 음성이었다. Hck(SH3)/pAS-2로 형질전환한 효모는 pACT2와의 형질전환으로 β-갈락토시다제 활성이 양성으로 되고, 인간Hck 단편과 HSB-1의 결합의 유무는 판정불능하였다. 이상의 결과로부터, HSB-1은 인간Hck의 SH2와는 결합하지 않고, SH3 도메인과 결합한다고 생각되었다.
실시예 5 HSB-1의 인간Hck와의 결합부위의 추정
실시예 2의 발현벡터 작성방법과 동일한 방법으로, HSB-1 및 그 부분배열(서열목록 12의 1∼131번째, 70∼404번째)을 발현하는 발현벡터를 조제하였다. 서열목록 12의 1∼131번째, 및 70∼404번째를 코드하는 cDNA를 각각 PCR법으로 조제하고, 각각 발현벡터 pcDNA4/HisMaxC(Invitrogen사 제품)에 삽입하였다(이하, 각각 HSB-1/HisMaxC, HSB-1(1-131)/HisMaxC, HSB-1(70-404)/HisMaxC라 칭함).
HSB-1(1-131)을 코드하는 cDNA를 조제하는 PCR프라이머
센스프라이머: 서열목록7
안티센스프라이머: 서열목록 16
HSB-1(70-404)을 코드하는 cDNA를 조제하는 PCR프라이머
센스프라이머: 서열목록 17
안티센스프라이머: 서열목록8
다음에, 293T세포에 인산칼슘법(프라임사 제품의 키트를 사용)으로, 2개의 플라스미드, Hck/pFLAG-CMV2와, HSB-1/HisMaxC, 또는 HSB-1(1-131)/HisMaxC, 또는 HSB-1(70-404)/HisMaxC를 동시에 형질전환하였다. 또한, 대조로 pcDNA4/HisMaxC와 Hck/pFLAG-CMV2를 동시에 형질전환하였다. 2일간 배양후, 세포를 수집하고, 세포내 용액을 조제하였다. 이것을 항인간Hck항체에 면역침강하고, 침강물을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분리하고, 웨스트블랏을 행하여, 항Xpress항체에서 검출하였다. 검출결과를 도3에 표시하였다. 항Xpress항체로 HSB-1과 HSB-1(70-404)가 검출되고, HSB-1(1-131)이 검출되지 않았으므로, 인간Hck와 함께 발현한 HSB-1 또는 HSB-1(70-404)(모두 Xpress로 표식되어 있음)이, 인간Hck에 결합하여 인간Hck와 함께 면역침강하고, HSB-1(1-131)은 인간Hck에 결합하지 않으므로 인간Hck와 함께 면역침강하지 않은 것이 확인되었다.
실시예 6 CEM세포의 HSB-1을 발현하는 항상적 형질전환체의 제작
실시예 3에서 제작한 HSB-1/pEF/V5-HisC를 일렉트로포레이션법으로 CEM세포에 도입하였다. 이것을 항생물질 G418 황산염(라이프텍크 오리엔탈로부터 구입)(1.2mg/ml)을 첨가한 배지에서 배양하고, 발육하여온 내성클론으로부터 HSB-1(V5로 표식되어 있음)을 발현하여 있는 클론을 선발하였다(CEM/HSB-1라고 칭함). 동일하게 하여 pEF/V5-HisC를 일렉트로포레이션법으로 CEM세포에 도입하고, 항생물질 G418황산염(1.2mg/ml)을 첨가한 배지에서 배양하고, 발육하여 온 내성클론을 선발하였다(CEM/pEF라고 칭함).
실시예 7 TNF-α유도 아포토시스의 측정
실시예 6에서 제작한 각각의 세포를 5000개씩 48공 마이크로플레이트로 감고, 이것에 각각 인간 재조합 TNF-α를 마침농도가 0, 0.3, 1, 3, 10ng/ml가 되도록 첨가하고, 37℃에서 3일간 배양하고, 세포수를 계측하였다. 계측한 세포수를 TNF-α미첨가군을 100%로 하는 상대치로 표시하였다. 그 결과를 도4에 표시하였다. CEM/HSB-1세포는 CEM세포나 CEM/pEF세포에 비해, 보다 저농도에서 세포사가 관찰되었므로, HSB-1은 CEM세포의 TNF에서 유도되는 아포토시스를 촉진시킨다고 생각되었다.

Claims (10)

  1. (a) 서열목록 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질, 또는
    (b) 서열목록 1로 표시되는 아미노산 배열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 활성을 보유하는 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 서열목록 1 또는 서열목록 12로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질.
  3. 서열목록 1로 표시되는 아미노산 배열 또는 그 한 영역과 80%이상의 상동성을 보유하고, 인간 타이로신키나제 Hck에 결합하는 활성으로 보유하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 코드하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 서열목록 2 또는 서열목록 13으로 표시되는 염기배열, 또는 이들 염기배열에 있어서 1 또는 수개의 누클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기배열을 보유하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 서열목록 2 또는 서열목록 13으로 표시되는 염기배열을 보유하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  7. 제4항에 있어서, 서열목록 2 또는 서열목록 13으로 표시되는 염기배열과 70%이상의 상동성을 보유하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  8. 제4항에 있어서, 서열목록 2 또는 서열목록 13으로 표시되는 염기배열을 보유하는 핵산과, 엄격조건하에서 하이브리드하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 함유하고, 숙주세포중에 서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 발현시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 재배열 벡터.
  10. 제9항에 기재된 재배열 벡터로 형질전환되어, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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EP1892248A1 (en) * 2006-08-21 2008-02-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Specific and high affinity binding proteins comprising modified SH3 domains of FYN kinase

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5641748A (en) * 1995-06-07 1997-06-24 Biogen, Inc. Caip-like gene family
US5656438A (en) * 1995-06-07 1997-08-12 Biogen, Inc. CAIP-like gene family
US5837844A (en) * 1995-06-07 1998-11-17 Biogen, Inc. CAIP-like gene family
WO1997049808A1 (en) * 1996-06-27 1997-12-31 Biogen, Inc. The caip-like gene family

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WO2001032869A1 (fr) 2001-05-10
EP1241253A4 (en) 2004-05-19
CA2389062A1 (en) 2001-05-10

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