RU2608506C1 - Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина ttss hrcv burkholderia pseudomallei - Google Patents

Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина ttss hrcv burkholderia pseudomallei Download PDF

Info

Publication number
RU2608506C1
RU2608506C1 RU2016103419A RU2016103419A RU2608506C1 RU 2608506 C1 RU2608506 C1 RU 2608506C1 RU 2016103419 A RU2016103419 A RU 2016103419A RU 2016103419 A RU2016103419 A RU 2016103419A RU 2608506 C1 RU2608506 C1 RU 2608506C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ttss
hrcv
amplification
membrane protein
polymerase chain
Prior art date
Application number
RU2016103419A
Other languages
English (en)
Inventor
Дмитрий Викторович Викторов
Ирина Борисовна Захарова
Юлия Александровна Кузютина
Яна Анатольевна Лопастейская
Original Assignee
Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека filed Critical Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority to RU2016103419A priority Critical patent/RU2608506C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2608506C1 publication Critical patent/RU2608506C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Изобретение представляет собой набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина системы секреции III типа (TTSS) HrcV возбудителя мелиоидоза. Изобретение позволяет получить в высокой концентрации фрагмент ДНК, несущий полную последовательность гена, кодирующего высокоиммуногенный мембранный протеин TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза, что позволит в перспективе осуществить его клонирование в составе экспрессирующего вектора с целью накопления рекомбинантного антигена. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина системы секреции III типа (TTSS) HrcV возбудителя мелиоидоза. Изобретение может быть использовано в молекулярной биологии и биотехнологии для амплификации полной кодирующей нуклеотидной последовательности гена мембранного протеина TTSS HrcV В. pseudomallei.
Возбудитель особо опасной инфекции - мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia подкласса протеобактерий семейства Burkholderiaceae. В настоящее время род Burkholderia включает более 50 видов микроорганизмов и представляет собой довольно гетерогенную таксономическую группу, объединяющую сапрофиты, фитопатогены и патогены теплокровных животных.
Мелиоидоз эндемичен для влажных тропических и субтропических регионов Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, Западной Африки и Латинской Америки. В последнее время было отмечено довольно большое число спорадических случаев заболевания для ряда стран умеренного климатического пояса, связанных с заносом из эндемичных регионов.
В. pseudomallei относится к агентам II группы патогенности, все работы с которыми строго регламентированы СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
Важной диагностической задачей следует считать точную и быструю индикацию вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза и их дифференциацию от генетически и иммунологически близких непатогенных сапрофитных представителей рода, широко распространенных в естественных биоценозах.
Успешная реализация вышеуказанных задач зависит прежде всего от выбора и детальной технологической проработки стратегии поиска и выявления биополимеров В. pseudomallei, перспективных для использования в качестве специфичных диагностических мишеней при конструировании иммуно- и генодиагностических систем нового поколения.
На основании проведенного нами сравнительного in silico исследования последовательностей геномов В. pseudomallei был осуществлен выбор дифференцирующих групп кодирующих последовательностей поверхностных белков возбудителя мелиоидоза. В результате множественного выравнивания формально транслированных аминокислотных последовательностей были отобраны протеины, формировавшие наиболее гомогенные группы. Для каждого кластера белков исследованы потенциальные антигенные свойства и выделены линейные эпитопы. При этом большой интерес представлял мембранный протеин TTSS HrcV, обладающий высокой потенциальной иммуногенностью. Наличие генов TTSS является одним из известных механизмов, связанных с вирулентностью бактерий. TTSS обеспечивает инвазию, избегание микробами завершенного фагоцитоза, миграцию и размножение внутри фагоцита. Известно, что генный кластер TTSS3 В. pseudomallei или bsa необходим возбудителю для полной вирулентности на модели золотистых хомячков. По составу генов в кластере TTSS у представителей группы «pseudomallei» наблюдаются значительные вариации. Использование приложения BLAST-protein показало, что белок HrcV видоспецифичен для В. pseudomallei. Следовательно, исследуемый протеин и кодирующий его регион могут являться перспективными диагностическими мишенями.
Современной тенденцией в лабораторной диагностике мелиоидоза считают сочетанное применение двух методов: ПЦР и иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА на основе моноклональных антител может быть использован для аналитических исследований, связанных с идентификацией видовой принадлежности микроорганизмов и анализом топографии биологически активных и диагностически значимых компонентов бактериальной клетки.
ПЦР является прямым методом выявления ДНК и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Процесс амплификации нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий фрагментов ДНК, специфичных для конкретных определенных типов генетических последовательностей, например, генов мембранных протеинов микроорганизмов, в число которых входит и ген мембранного протеина TTSS HrcV.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для исследуемой генетической мишени. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах детектируемого фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК проходит только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор ДНК-мишени и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации.
Близкими аналогами можно считать олигонуклеотидные затравки, использованные в нескольких работах для амплификации и последующего клонирования гена основного порина внешней мембраны BpsOmp38 (38 кДа) [Siritapetawee J., Prinz Н. et al. Expression and refolding of Omp38 from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis, and its function as a diffusion porin // J. Biochem. - 2004. - P. 384] и гена цефалоспориназы (blaABPS) возбудителя мелиоидоза [Terence K.M. Cheung, P.L. Ho et al. Cloning and Expression of Class A β-Lactamase Gene blaABPS in Burkholderia pseudomallei // Antimicrob Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - P. 1132-1135]. В данных работах были использованы праймеры, фланкирующие полную кодирующую последовательность соответствующих генов, для их клонирования в гетерологичных системах и функциональной характеристики рекомбинантных биополимеров.
Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза для последующего клонирования.
Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина TTSS HrcV В. pseudomallei.
На основе геномных сиквенсов Burkholderia pseudomallei, представленных в общедоступных генетических базах данных (Genbank, EMBL, DDBJ), была подобрана пара праймеров, комплементарных фланкирующим последовательностям гена мембранного протеина TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза. Сконструированные олигонуклеотиды, структура которых указана в таблице 1, обладают активностью прямого (bps6155ricF) и обратного (bps6155ricR) праймеров в реакции амплификации. К специфической нуклеотидной последовательности обоих праймеров на 5'-конце добавлена фосфорилированная последовательность, позволяющая осуществить прямое клонирование амплифицированного фрагмента в дефосфорилированный экспрессирующий вектор RIC-ready pPAL7 без предварительной обработки рестриктазами с целью накопления рекомбинантного антигена.
Figure 00000001
Характеристика генетической мишени для данной пары праймеров и ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента ДНК приведены в таблице 2.
Figure 00000002
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности гена, кодирующего высокоиммуногенный мембранный протеин TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза, методом ПЦР.
На основе сравнительного анализа in silico последовательностей геномов микроорганизмов рода Burkholderia с использованием ресурса Pathema (http://pathema.jcvi.org/Pathema/) были выбраны дифференцирующие группы кодирующих последовательностей поверхностных белков возбудителя мелиоидоза. Использование приложения BLAST-protein (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) показало, что наиболее перспективной диагностической мишенью является видоспецифичный для В. pseudomallei белок HrcV.
Были выбраны специфические участки ДНК, являющиеся консервативными фрагментами нуклеотидных последовательностей гена мембранного протеина TTSS HrcV В. pseudomallei, к которым с помощью сервиса PrimerBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) были подобраны комплементарные олигонуклеотиды, формирующие пару праймеров. К специфической нуклеотидной последовательности прямого и обратного праймеров на 5'-конце добавлена фосфорилированная последовательность, позволяющая повысить эффективность клонирования амплифицированного фрагмента. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, составила 2118 п.н.
Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.
Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК возбудителя мелиоидоза с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров.
Для выделения ДНК использовался метод протеиназного лизиса [Higuchi R. Rapid, efficient DNA extraction for PCR from cells or blood // Amplifications: A Forum for PCR Users. Perkin-Elmer, Norwalk, CT. - 1989. - Issue 2] с модификациями: 200 мкл свежеприготовленной бактериальной взвеси в стерильной бидистиллированной воде плотностью 2×109 м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0.2 мг/мл желатина, 0.9% Nonidet Р-40, 0.9% Твин 20, 150 мкг/мл протеиназы К), инкубировали при 60°С 120 мин, прогревали при 99°С 30 мин для инактивации фермента.
Для постановки ПЦР использовался ДНК-амплификатор С1000 (Bio-Rad, США) с 96-луночным реакционным блоком. Программа амплификации состояла из этапов начального прогрева проб 95°С 3 мин, 40 реакционных циклов (денатурация 95°С 30 с, отжиг праймеров 64.3°С 30 с, удлинение цепи 72°С 2 мин 17 с) и финальной элонгации 72°С 10 мин.
Объем реакционной смеси на 1 пробу составлял 15 мкл. В состав реакционной смеси входили по 50 пМ прямого и обратного праймеров, 1.25 Ед. ДиаТак ДНК-полимеразы и 1×ПЦР-буфер с дНТФ и MgCl2 (ILS, Россия). Препараты геномной ДНК вносили в реакционную смесь в объеме 3 мкл.
Проводили электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 1,5% агарозном геле и визуализировали ампликоны окрашиванием бромистым этидием. Размер ампликона оценивали, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркерных фрагментов ДНК. Электрофоретический анализ реакции амплификации гена мембранного протеина TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза, результаты которого приводятся на рисунке 1, показал наличие расчетного ампликона размером 2118 п.н. с праймерами bps6155ricF/bps6155ricR.
Таким образом, сконструированные праймеры позволяют получить в высокой концентрации фрагмент ДНК, несущий полную последовательность гена, кодирующего высокоиммуногенный мембранный протеин TTSS HrcV возбудителя мелиоидоза, что позволит в перспективе осуществить клонирование в составе экспрессирующего вектора с целью накопления рекомбинантного антигена.

Claims (2)

  1. Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина TTSS HrcV Burkholderia pseudomallei, обладающих активностью прямого (bps6155ricF) и обратного (bps6155ricR) праймеров в реакции амплификации и имеющих следующую структуру:
  2. bps6155ricF 5'-(P)AAGCTTTGATGTTCAAATCGCTGAAACTG-3' bps6155ricR 5'-(P)AATTCTTATCAACCCTGGAGCGACAC-3'
RU2016103419A 2016-02-02 2016-02-02 Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина ttss hrcv burkholderia pseudomallei RU2608506C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016103419A RU2608506C1 (ru) 2016-02-02 2016-02-02 Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина ttss hrcv burkholderia pseudomallei

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016103419A RU2608506C1 (ru) 2016-02-02 2016-02-02 Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина ttss hrcv burkholderia pseudomallei

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2608506C1 true RU2608506C1 (ru) 2017-01-18

Family

ID=58456042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016103419A RU2608506C1 (ru) 2016-02-02 2016-02-02 Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина ttss hrcv burkholderia pseudomallei

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2608506C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988100A (zh) * 2017-12-05 2018-05-04 湖南豫园生物科技股份有限公司 无机解磷菌、微生物肥料及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009009484A2 (en) * 2007-07-06 2009-01-15 The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Northern Arizona University Burkholderia pseudomallei diagnostic genetic elements that predict mortality in melioidosis
CN102146478A (zh) * 2011-04-15 2011-08-10 中国人民解放军第三军医大学 一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的pcr试剂盒
RU2474614C1 (ru) * 2011-09-23 2013-02-10 Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ ГЕНОВ β-ЛАКТАМАЗ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ
RU2551208C1 (ru) * 2014-04-22 2015-05-20 Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei
US20150361435A1 (en) * 2010-12-17 2015-12-17 The Penn State Research Foundation Identification of inhibitors of a bacterial stress response

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009009484A2 (en) * 2007-07-06 2009-01-15 The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Northern Arizona University Burkholderia pseudomallei diagnostic genetic elements that predict mortality in melioidosis
US20150361435A1 (en) * 2010-12-17 2015-12-17 The Penn State Research Foundation Identification of inhibitors of a bacterial stress response
CN102146478A (zh) * 2011-04-15 2011-08-10 中国人民解放军第三军医大学 一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的pcr试剂盒
RU2474614C1 (ru) * 2011-09-23 2013-02-10 Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ ГЕНОВ β-ЛАКТАМАЗ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ
RU2551208C1 (ru) * 2014-04-22 2015-05-20 Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988100A (zh) * 2017-12-05 2018-05-04 湖南豫园生物科技股份有限公司 无机解磷菌、微生物肥料及应用
CN107988100B (zh) * 2017-12-05 2021-06-22 湖南豫园生物科技股份有限公司 无机解磷菌、微生物肥料及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mata et al. Multiplex PCR assay for detection of bacterial pathogens associated with warm-water streptococcosis in fish
García et al. Evaluation and comparison of various PCR methods for detection of Mycoplasma gallisepticum infection in chickens
Fournier et al. Suicide PCR on skin biopsy specimens for diagnosis of rickettsioses
Zhang et al. Multi-virulence-locus sequence typing of Listeria monocytogenes
Nilsson et al. Rickettsia helvetica in Ixodes ricinus ticks in Sweden
Govan et al. A PCR detection method for rapid identification of Paenibacillus larvae
Elbeaino et al. Multilocus sequence typing of Xylella fastidiosa isolated from olive affected by" olive quick decline syndrome" in Italy
Zweygarth et al. In vitro culture and structural differences in the major immunoreactive protein gp36 of geographically distant Ehrlichia canis isolates
Cheng et al. Molecular heterogeneity of Ehrlichia chaffeensis isolates determined by sequence analysis of the 28-kilodalton outer membrane protein genes and other regions of the genome
Peyraud et al. A specific PCR for the detection of Mycoplasma putrefaciens, one of the agents of the contagious agalactia syndrome of goats
Lange et al. Development and validation of a multiplex real-time PCR for detection of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum
Rossi et al. The oral microbiota of domestic cats harbors a wide variety of Staphylococcus species with zoonotic potential
Sasaki et al. Phylogenetic positions of Clostridium novyi and Clostridium haemolyticum based on 16S rDNA sequences.
Kanter et al. Analysis of 16S rRNA and 51-kilodalton antigen gene and transmission in mice of Ehrlichia risticii in virgulate trematodes from Elimia livescens snails in Ohio
Schurko et al. Development of a species-specific probe for Pythium insidiosum and the diagnosis of pythiosis
RU2608506C1 (ru) Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена мембранного протеина ttss hrcv burkholderia pseudomallei
Viana et al. Genotypic characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from rabbit lesions
Hercik et al. Molecular evidence of Bartonella DNA in ixodid ticks in Czechia
US20180057861A1 (en) Sequence, technique platform, and method for in vitro detecting clostridium difficile ribotype 027
Pilet et al. A new typing technique for the Rickettsiales Ehrlichia ruminantium: multiple-locus variable number tandem repeat analysis
Abdel-Tawab et al. Molecular detection of some virulence genes of S. aureus isolated from mastitic Cows by PCR
Zhang et al. Sensitive and rapid detection of Trueperella pyogenes using loop-mediated isothermal amplification method
Saraylu et al. Prevalence and evaluation of toxin genes among uropathogenic Escherichia coli clinical isolates by duplex PCR
RU2608505C1 (ru) Набор 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом полимеразной цепной реакции полной кодирующей последовательности гена омра/мотв burkholderia pseudomallei
Mamnoon et al. Quality control of widely used therapeutic recombinant proteins by a novel real-time PCR approach

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180203