CN107988100A - 无机解磷菌、微生物肥料及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无机解磷菌、微生物肥料及应用，该无机解磷菌为伯克霍尔德氏菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017585，保藏日期是2017年10月16日。上述无机解磷菌，可吸收土壤中的难溶态的无机磷并通过自身的新陈代谢将磷固定在体内，最后再排出体外形成可以被植物吸收利用的磷形态。上述无机解磷菌可有效的降解无机磷，减少磷肥的施用量，提高磷肥的利用率。

Description

无机解磷菌、微生物肥料及应用
技术领域
本发明涉及农业微生物领域，特别地，涉及一种无机解磷菌。此外，本发明还涉及一种包括上述无机解磷菌的微生物肥料及应用。
背景技术
磷是植物生长发育的重要物质基础，作物吸收磷量与其生物量(r＝0.97)和产量(r＝0.75)呈显著的正相关。然而由于磷固定的存在使得缺磷在范围内广泛存在，磷供给不足是世界农业生产中最重要的限制因素之一。从我国情况来看，全国有74％耕地土壤缺磷，高水溶性磷肥施入固磷强的石灰性土壤中上，作物的当季利用率一般只有5％～10％，加上作物的后效，也不超过25％。因此，大部分磷肥作为无效态(难溶态)在土壤中积累。据报道，至少有70％～90％的磷进入土壤而成为难以被作物吸收利用的固定形态。在这些土壤中，土壤有效磷含量很低而全磷含量较高。我国自20世纪50年代施用化肥以来，储存累积在土壤中的难溶性磷高达6000万t，超过目前全国磷肥10年消费量的总和。因此从土壤中筛选高效解磷微生物，研制成解磷菌剂拌种或直接施入土壤，将土壤中难溶性磷活化出来，对发展持续高效农业具有深远的战略意义。
发明内容
本发明提供了一种无机解磷菌、微生物肥料及应用，以解决土壤中难溶态磷肥累积的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种无机解磷菌，无机解磷菌为伯克霍尔德氏菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017585，保藏日期是2017年10月16日。
进一步地，伯克霍尔德氏菌为革兰氏阴性菌，菌落形态为边缘整齐，不透明，表面光滑，凸面。
本发明另一方面提供了一种微生物肥料，包括上述的无机解磷菌。
本发明还提供了一种上述无机解磷菌在降解无机磷中的应用。
本发明还提供了一种上述无机解磷菌在促进植物生长中的应用。
进一步地，无机解磷菌在促进小白菜或生菜生长中的应用。
进一步地，每颗小白菜或生菜的根部土壤中加入108～109个无机解磷菌。
本发明具有以下有益效果：上述无机解磷菌，可吸收土壤中的难溶态的无机磷并通过自身的新陈代谢将磷固定在体内，最后再排出体外形成可以被植物吸收利用的磷形态。上述无机解磷菌可有效的降解无机磷，减少磷肥的施用量，提高磷肥的利用率。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明的优选实施例提供了一种无机解磷菌，无机解磷菌为伯克霍尔德氏菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，其拉丁文名称为Burkholderia sp.YYBIO-003，保藏编号为CCTCC NO：M2017585，保藏日期是2017年10月16日。
本发明具有以下有益效果：上述无机解磷菌，可吸收土壤中的难溶态的无机磷并通过自身的新陈代谢将磷固定在体内，最后再排出体外形成可以被植物吸收利用的磷形态。上述无机解磷菌可有效的降解无机磷，减少磷肥的施用量，提高磷肥的利用率。
该无机解磷菌为伯克霍尔德氏菌，采集于湖南省浏阳市北盛镇及周边菜园植株根系土壤。
进一步地，伯克霍尔德氏菌为革兰氏阴性菌，菌落形态为边缘整齐，不透明，表面光滑，凸面。
本发明另一方面提供了一种微生物肥料，包括上述的无机解磷菌。
本发明还提供了一种上述无机解磷菌在降解无机磷中的应用。
本发明还提供了一种上述无机解磷菌在促进植物生长中的应用。
进一步地，无机解磷菌在促进小白菜或生菜生长中的应用。
进一步地，每颗小白菜或生菜的根部土壤中加入108～109个无机解磷菌。
实施例
1：土壤样品采集
采集湖南省浏阳市北盛镇及周边菜园植株根系土壤。
2：平板溶磷圈法初筛
将采集的土壤样品称取20g放入500ml三角烧瓶中，加入150～200ml蒸馏水，再滴入2滴吐温80，摇床振荡培养1小时后将混浊液用2层纱布过滤，滤液离心处理。将处理好的土壤悬液按10倍稀释法稀释，将10-3、10-4、10-5三个稀释浓度的土壤悬液各吸取0.1ml至磷酸钙培养基平板涂布，每个稀释度的土壤悬液做三个重复，置于30℃培养箱培养5天，根据溶磷圈的直径与菌落直径的大小比值来初步确定菌落的解磷能力，再用接种针挑取溶磷圈较大的菌落，在磷酸钙培养基平板上用连续划线的方法，进一步分离纯化，将纯化得到的菌株接种至胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA培养基)保存于4℃冰箱，同时挑取菌落制备成25％甘油管-80℃超低温冰箱冷冻保存。通过这种方法共得到了19个菌株进行下一轮液体解磷能力试验。
其中，磷酸钙平板培养基的配方及指标：葡萄糖10.00g、磷酸钙5.00g、氯化钾0.3g、七水硫酸镁0.3g、氯化钠0.3g、硫酸铵0.5g、七水硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、琼脂17g、蒸馏水1000ml、PH：7.0-7.50。
3：液体摇瓶法复筛
在平板培养基观察溶磷圈，只是一方面证明了菌株的解磷能力，具体解磷能力的大小还需通过定量测定加以说明，液体摇瓶培养则是测定解磷能力定量方法之一。本实验同时做了以磷酸钙为唯一无机磷来源、以磷酸镁为唯一无机磷来源、以磷酸铝为唯一无机磷来源测定菌株的解磷能力。
以磷酸钙为唯一无机磷来源测定菌株的解磷能力
将初筛保存于4℃冰箱中的P1～P18共18个菌株于磷酸钙培养基平板活化，将溶磷圈不再明显的P1～P4、P7～P14剔除，剩余7个菌株挑取菌苔接入到TSA培养基培养液中，培养24小时，制成含菌量约为108个/ml的菌悬液。
配制液体培养基，取1ml菌液，接入装有50ml已灭菌液体培养基的500ml有挡板的三角烧瓶中，同时做不接种菌的对照(装有50ml已灭菌液体培养基的500ml有挡板的三角烧瓶中接入1ml无菌水)。每个菌株做三个平行，摇床200r/min 30℃培养7d。
将培养后的培养液10000rpm离心10min，吸取上清液，用钼锑抗比色法测定有效磷含量。
钼锑抗比色法测定样品有效磷含量具体操作：
磷标准曲线绘制：吸取磷标准溶液[(P)＝5ug.mL-1 0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00ml于50ml容量瓶，加入二滴2，4-二硝基酚指示剂，再加入5ml钼锑抗显色剂，加无菌水定容。充分摇匀后室温(20～30℃)静置30min，用紫外可见分光光度计880nm波长及1cm比色杯测定吸光值，用系列溶液的零浓度调节仪器零点，绘制校准曲线或计算回归方程。
磷标准溶液：称0.143g磷酸二氢钾，溶于水，全部转移到100ml的容量瓶中，稀释刻度，摇匀。
吸取离心后的上清液1ml于50ml容量瓶，加入二滴2，4-二硝基酚指示剂，再加入5ml钼锑抗显色剂，加无菌水定容。充分摇匀后室温(20-30℃)静置30min，用紫外可见分光光度计880nm波长及1cm比色杯测定吸光值，同时进行空白试验，样品测定值减去空白测定值，即为样品溶液的实际测定值。
以磷酸镁为唯一无机磷来源、以磷酸铝为唯一无机磷来源测定菌株的解磷能力时，只将磷酸钙培养基中的磷酸钙相应换成磷酸镁、磷酸铝，其解磷能力的测定步骤相同。
实验结果见下表1-3：
表1以磷酸钙为唯一无机磷源的各菌株培养液中的有效磷含量
菌株编号 平行1(mg/Kg) 平行2(mg/Kg) 平行3(mg/Kg) 均值(mg/Kg)
ck 1.20 1.34 1.15 1.23±0.10d
P5 0.85 1.32 0.97 1.05±0.24d
P6 27.75 32.16 29.50 29.80±2.22b
P15 7.29 6.94 7.82 7.35±0.44c
P16 8.71 8.56 11.05 9.44±1.40c
P17 121.53 124.71 132.64 126.29±5.72a
P18 1.13 1.24 1.29 1.22±0.08d
小写字母表示处理间差异达显著性水平(p＜0.05)
表2以磷酸镁为唯一无机磷源的各菌株培养液中的有效磷含量
菌株编号 平行1(mg/Kg) 平行2(mg/Kg) 平行3(mg/Kg) 均值(mg/Kg)
ck 18.88 18.84 19.68 19.13±0.47c
P5 17.80 18.64 18.55 18.33±0.46c
P6 17.36 18.02 17.46 17.61±0.35c
P15 58.87 63.18 49.97 57.34±6.74b
P16 58.44 59.66 57.75 58.62±0.97b
P17 176.46 177.02 180.61 178.03±2.25a
P18 18.73 20.36 19.58 19.56±0.82c
表3以磷酸铝为唯一无机磷源的各菌株培养液中的有效磷含量
从三种磷酸盐液体解磷能力试验结果(见表1、表2、表3)可以得出，解磷能力最好是P17。
4:菌株鉴定
将P17，送往北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行鉴定。
鉴定过程为：提取P17菌体的基因组DNA，用细菌16SrDNA引物(27f:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，并用琼脂糖凝胶回收。将回收纯化后的PCR产物进行测序，进行blast比对。
根据blast结果，P17与Burkholderia sp.DOP-Ma3亲源关系最近。
SOURCE Burkholderia sp.DOP-Ma3
ORGANISM Burkholderia sp.DOP-Ma3
Bacteria；Proteobacteria；Betaproteobacteria；
Burkholderiales；
Burkholderiaceae；Burkholderia.
5：植物培养盆栽试验：
按照以下步骤进行试验：
(1)盆栽土壤处理：植物基肥+菜园土
(2)种子催芽：将小白菜和生菜种子用5％次氯酸钠消毒后用无菌水多次冲洗，撒播在铺有一层滤纸的培养皿中，加入少量无菌水使之保持湿润，置于30℃培养箱培养48-72小时，待种子发芽后移栽至组培盆内，每盆放种子3-4颗。待幼苗长出第一对子叶时，挑选长势较为一致的移栽至试验用盆内，每盆内种植一株。
(3)配制菌液并接种：取保存的解磷菌株P17，于TSA平板活化，30℃培养箱培养24-48小时，将长出的菌落刮入无菌水中，振荡打散后利用比浊法使菌液的含菌量达到109个/ml。吸取配1ml菌液沿着植物根部土壤加入，设10个重复，同时设不接菌对照。
(4)试验管理：本试验采用完全随机区组设计。
播种41天收获所有小白菜，并分别称量各组小白菜地上部分的鲜重，并计算平均鲜重与不接菌对照组进行比较。其中，对照组的小白菜鲜重为52.4g，10个添加解磷菌组的小白菜鲜重分别为65.5g、65.2g、64.8g、62.9g、63.4g、64.9g、65.1g、64.5g、65.3g、64.7g。解磷菌组的小白菜的平均鲜重为64.6g，相比对照组平均增重23％。
收获小白菜的同时，采集各盆内的土壤，采用Olsen法检测土壤中的有效磷含量，并与不接菌对照组比较。其中，对照组的土壤有效磷含量为130.68mg/kg，10个添加解磷菌组的土壤有效磷含量分别为156.79mg/kg、159.77mg/kg、155.37mg/kg、153.09mg/kg、165.09mg/kg、158.35mg/kg、159.82mg/kg、161.64mg/kg、158.76mg/kg、161.21mg/kg。解磷菌组的小白菜的土壤平均有效磷含量为158.99mg/kg，相比对照组有效磷含量增加21.66％。
播种53天收获所有生菜，并分别称量各组生菜地上部分的鲜重，并计算平均鲜重与不接菌对照组进行比较。其中，对照组的生菜鲜重为112.5g，10个添加解磷菌组的生菜鲜重分别为140.6g、143.1g、142.3g、142.7g、141.8g、142.5g、142.9g、141.5g、143.0g、142.6g。解磷菌组的生菜的平均鲜重为142.3g，相比对照组平均增重26.5％。
收获生菜的同时，采集各盆内的土壤，采用Olsen法检测土壤中的有效磷含量，并与不接菌对照组比较。其中，对照组的土壤有效磷含量为100.86mg/kg，10个添加解磷菌组的土壤有效磷含量分别为129.77mg/kg、125.37mg/kg、123.09mg/kg、135.69mg/kg、129.80mg/kg、128.33mg/kg、131.24mg/kg、128.84mg/kg、131.83mg/kg、115.57mg/kg。解磷菌组的生菜的土壤平均有效磷含量为127.95mg/kg，相比对照组有效磷含量增加26.86％。
综上所述，本发明的无机解磷菌不仅可以高效溶解无机磷，同时还能够促进植物生长，可应用于微生物肥料的制备。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种无机解磷菌，其特征在于，所述无机解磷菌为伯克霍尔德氏菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017585，保藏日期是2017年10月16日。
2.根据权利要求1所述的无机解磷菌，其特征在于，所述伯克霍尔德氏菌为革兰氏阴性菌，菌落形态为边缘整齐，不透明，表面光滑，凸面。
3.一种微生物肥料，其特征在于，包括权利要求1或2中任一项所述的无机解磷菌。
4.一种如权利要求1或2所述的无机解磷菌在降解无机磷中的应用。
5.一种如权利要求1或2所述的无机解磷菌在促进植物生长中的应用。
6.根据权利要求5所述的无机解磷菌在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述无机解磷菌在促进小白菜或生菜生长中的应用。
7.根据权利要求6所述的无机解磷菌在促进植物生长中的应用，其特征在于，每颗小白菜或生菜的根部土壤中加入108～109个所述无机解磷菌。
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