CN109022292B - 一株木霉及其在农业领域的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株木霉及其在农业领域的应用。一株木霉，分类命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15679，保藏日期为2018年5月21日。上述木霉用于抑制立枯丝核菌、炭疽菌、镰刀菌的生长。上述木霉用于土壤解磷。上述木霉用于制备微生物肥料。本发明公开的一株木霉及其在农业领域的应用具有以下有益效果：1、提供用于抑制立枯丝核菌、炭疽菌、镰刀菌的菌株，该菌株对上述植物有害病菌具有很好的抑制作用；2、该菌株还能用于制备微生物种子包衣剂，在不失去活性的情况下，对植物根系的促生长起到有益的作用。

Description

一株木霉及其在农业领域的应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一株木霉及其在农业领域的应用。
背景技术
在世界范围内，植物病害普遍地给农业生产造成严重的损失。生产上防治植物病虫害，往往以传统的化学防治为主，这对药剂的长期稳定性有着较高的要求，而化学药剂还会对环境造成严重污染。而农作物施用农药后，一旦残留，会极大影响农产品的品质，并且严重危害人体健康。随着人类环保意识的加强，发展绿色生态农业己经渐渐成为主流，尤其体现在以生物法替代传统的化学法进行植物土传病害的防治，该领域作为绿色农业的内容越来越受到人们的关注。
目前，植物病害的生防菌株大多是从土壤以及植物的根际或体表分离的真菌和细菌，其来源较为单一，易受外界自然环境的影响。如果环境有变化，易直接影响其定殖能力，在面对不同的有害病菌的时候效果起伏很大，对多数疫病难以起到防治作用，严重限制了其应用范围。因此，能够扩大对病菌的防治范围，同时对环境友好，既能促进植物生长又能改善土壤环境的菌株筛选，成为当前急需解决的技术难题。
发明内容
发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明的第一个目的在于公开了一株木霉。本发明的第二个目的在于公开一株木霉在农业领域的应用。
技术方案：一株木霉，分类命名为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15679，保藏日期为2018年5月21日。
上述的木霉在农业领域的应用。
上述的木霉用于抑制立枯丝核菌、炭疽菌、镰刀菌的生长。
上述的木霉用于土壤解磷。
上述的木霉用于制备微生物肥料，促进植物生长。
进一步地，将上述的木霉制成微生物种子包衣剂。
更进一步地，上述种子包衣剂的制备包括以下步骤：
(1)将木霉的原种接在PDA培养皿上活化，然后再接种于试管斜面上备用；
(2)将木霉孢子洗下形成木霉孢子液；
(3)将水溶成膜剂与黏着剂按照5：2的质量比混合，然后用水溶解，使水溶成膜剂的浓度达到0.05g/mL，使黏着剂的浓度达到0.02g/mL，得到种子包衣剂；
(4)测定木霉孢子液的浓度，当菌液的浓度达到108cfu/mL时，按照30:100的质量比将木霉孢子液拌入种子包衣剂中，然后用振荡仪振荡至物质溶解，即得到微生物种子包衣剂。
更进一步地，该微生物种子包衣剂中活菌的数量大于106cfu/mL。
更进一步地，水溶成膜剂是PVP-K30、海藻酸钠、聚乙烯酰胺、聚乙烯醇、壳聚糖中的一种。
更进一步地，黏着剂是聚乙二醇、黄原胶、羧基纤维素、硅酸铝镁、明胶、羧基纤维素钠、阿拉伯胶中的一种。
有益效果：本发明公开的一株木霉及其在农业领域的应用具有以下有益效果：
1、提供用于抑制立枯丝核菌、炭疽菌、镰刀菌的菌株，该菌株对上述植物有害病菌具有很好的抑制作用；
2、该菌株还能用于制备微生物种子包衣剂，在不失去活性的情况下，对植物根系的促生长起到有益的作用。通过低毒、高效、环境友好的特点，减少作物种植过程中的化肥及农药使用，进而实现高产。采用微生物种子包衣技术可使各种添加成分直接、高效且均匀地分布在种子周围，而不必的分散在苗床中，并且能使种子在储藏的过程中得到更多的保护，不容易丧失活力，特别对容易丧失活力的种子更具有重要作用。该菌株具有解磷功能，因此，由该菌株制成的种子包衣剂也具有的解磷功能也可以降低化肥的施用，减少土壤板结的风险与人力维护成本。
附图说明
图1为本发明所提供木霉的菌落形态示意图；
图2为本发明所提供木霉的系统进化树；
图3为各病原菌平板培养图；
图4为本发明所提供木霉对各病原菌的抑制效果图；
图5为立枯丝核菌平板培养基与普通PDA平板培养基对扣图；
图6为立枯丝核菌平板培养基与木霉平板培养基对扣图；
图7为玉米苗期第21d，实验组(MN12371)与对照组植株的生长情况对比示意图；
图8为苗期5d后，根系生长对比结果图；
图9为苗期8d后，根长对比结果示意图；
图10为玉米苗期第21d，实验组(MN12371)与对照组植株的平均株高、平均茎长的对比结果示意图；
图11为玉米苗期第21d，实验组(MN12371)与对照组植株的平均茎粗、平均鲜重的对比结果示意图；
图12为有效磷含量测定标准曲线的示意图。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
具体实施例1
一、哈茨木霉菌株的分离与筛选
样本来自海南省五指山里采集到的土壤样本。
秤取5g海南样本土壤，加入到灭过菌的45mL浓度为0.1％的吐温水中，震荡1分钟混匀并静置25分钟，取土壤液体梯度稀释至10-3、10-4浓度，然后分别涂布于PDA固体无机盐培养基中，于28℃恒温培养箱中倒置培养4d，4d后挑取任一单一真菌菌落，接种于PDA固体培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养5d，然后观察菌落型态，并用光学显微镜观察菌体型态(1000X)。菌落型态示意图如图1所示。该菌落圆形，放射状，气生菌丝分布不均匀表面白色至黄绿色絮状。
随后，对该菌株的ITS序列进行种属鉴定,测定结果见序列表SEQ ID NO.1，ITS序列(614bp,Genbank acession:NR_131264.1)提交至TrichOKEY，鉴定结果为Hypocrealixii/Trichoderma harzianum。
使用TEF序列(598bp,Genbank acession:AB646533)提交至NCBI数据库鉴定结果为Trichoderma aeroaquaticum；从GenBank数据库中获得了木霉菌属的序列，并结合NCBI数据库的标准模式菌序列，利用MEGA5.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joining method)，进行了聚类分析和系统进化树构建。构建的系统进化树详见图2。
至此判定该菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；菌株记为哈茨木霉MN12371。随后，将哈茨木霉MN12371送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.15679，保藏日期为2018年5月21日。
二、病原菌生防效果评估
1.对峙实验
供试病原菌：立枯丝核菌((Rhizoctonia solani)、草莓炭疽病(C.gloeosporioides)、西瓜镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cyc laminis)、草莓镰刀菌(Fusarium oxysporum)；其代号如表1所示。
表1实验用病原菌及其代号
病原菌 代号
立枯丝核菌 R.s
草莓炭疽菌 C.g
西瓜镰刀菌 F.o
草莓镰刀菌 F.s
实验方法：
CK空白对照:从活化3天的病原菌菌落边缘打取菌饼(直径5mm)，将其置于PDA平板一侧中央，对侧中央放置直径5mm PDA琼脂块，28℃恒温培养，平板5个重复。各病原菌的空白对照如图3所示。
平板对峙处理：从活化3天的病原菌菌落边缘打取菌饼(直径5mm)，将其置于PDA平板一侧中央，从活化3天的木霉MN12371菌落打取直径5mm菌饼，将其置于PDA平板另一侧中央，使病原菌和木霉的中心连线穿过平板中央，25℃恒温培养，每处理5重复。MN12371对各病原菌的抑制效果如图4所示。
数据采集：接种后，平板倒置培养，每隔24h测量一次病原菌直径，并根据以下公式计算抑菌率
抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径*100％
各组抑菌率结果如表2所示。
表2 MN12371对四种病原菌的抑菌率结果
Figure GDA0002829219080000071
2.对置实验
实验方法：
在木霉菌落边缘取直径为5mm的菌块接种于PDA平板上，待菌落直径为35mm时，将其与已培养2d的立枯丝核菌对扣培养(立枯丝核菌在上，木霉在下)，以不接种木霉的PDA平板(如图5所示)与接种同等条件的立枯丝核菌PDA平板(如图6所示)对口培养作为对照。每个处理重复3次，28℃恒温培养。
待对照立枯丝核菌菌落长满培养皿时，采用十字交叉法测量并记录立枯丝核菌的对照生长量(菌落直径)和处理生长量(菌落直径)，计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照生长量-实验生长量)/对照生长量*100％
实验结果如表3所示。
表3对置实验结果
CK空白对照 MN12371
平均菌落直径(cm) 85±0.00 62±1.96
抑制率(％) 27.06％
三、玉米种植实验
1.微生物种子包衣剂的制备
将木霉MN12371的原种接在PDA培养皿上活化，然后再接种于试管斜面上备用；
将木霉孢子洗下；
将水溶成膜剂与黏着剂按照5：2的质量比混合，然后用水溶解，使水溶成膜剂的浓度达到0.05g/mL，使黏着剂的浓度达到0.02g/mL，得到种子包衣剂；
使用血球计数板测定木霉孢子液的浓度，当菌液的浓度达到108cfu/mL时，按照30％的质量比将菌液拌入种子包衣剂中，然后用振荡仪振荡至物质溶解，即得到微生物种子包衣剂，经检测，该微生物种子包衣剂中活菌的数量大于106cfu/mL。
在本实施例中，水溶成膜剂使用的是PVP-K30。
在本实施例中，黏着剂使用的是聚乙二醇。
2.盆栽实验
玉米种子为郑单958。
土壤为碳土与珍珠岩按照2：1的体积比混合而成，灭菌，灭菌条件为121℃，60min。
选择大小相近的玉米种子，将这些玉米种子放入第一步制备得到的微生物种子包衣剂中，于振荡仪上振荡2～3min，使菌株均匀吸附于玉米种子上，然后再用纱布将玉米种子与种子包衣剂进行分离，晾干，得到包衣玉米种子，待用。
取10颗包衣玉米种子于装有10mL无菌水的离心管中，振荡2～3min，使玉米种子上的菌株脱落于无菌水中，然后再稀释至10-2、10-3，将稀释液在RBM平板上涂布计数，计算每颗种子的包衣菌数。
其中，
实验组：将包衣玉米种子植于32孔穴盘中，温室实验三次重复，采用随机区组排列，在玉米苗期第20d测定植株的平均根长、平均茎长、平均鲜重和平均干重；
对照组：将未包衣的玉米种子植于32孔穴盘中，温室实验三次重复，采用随机区组排列，在玉米苗期第20d测定植株的平均根长、平均茎长、平均鲜重和平均干重。
3.实验结果
玉米苗期第21d，实验组(MN12371)与对照组植株的生长情况见图7。
玉米苗期第21d，实验组(MN12371)与对照组植株的平均株高(cm)、平均茎长(cm)结果如图10所示；平均茎粗(cm)、平均鲜重(g)如图11所示。具体如下：
由图10和图11可知，玉米种子经过本发明的微生物种子包衣剂包衣后，无论是株高、茎长、茎粗，还是鲜重都明显优于对照组。
四、大豆种子包衣发芽势实验
1.微生物种子包衣的制备
实验大豆品种：早熟1号；
包衣剂：采购自诺普信大豆种子包衣剂，商品名叫“全程”
实验方法：
第一步：微生物以30％的剂量添加入全程大豆种衣剂中混和，制得微生物种子包衣剂；
第二步：以400g微生物种子包衣剂:100kg种子比例进行混合，包衣处理每处理50颗，进行4重复，共两百颗种子，以安科38号发芽纸进行卷纸处理，制得实验组；
第三步：以400g“全程”种子包衣剂：100kg种子比例进行混合，包衣处理每处理50颗，进行4重复，共两百颗种子，以安科38号发芽纸进行卷纸处理，制得Blank组；
第四步、称量200颗早熟1号大豆种子，按数量均匀分成4份，每份50颗，以安科38号发芽纸进行卷纸处理，作为CK组；
第五步、将制备好的纸卷置入密封袋中并放置于25℃光照培养室中；
第六步、5d后，测量三组种子的发芽率；
第七步、苗期5d后，记录根系生长对比图；
第八步、苗期8d后，测量三组种子的根长。
实验结果：
发芽率结果如表4所示，实验组的发芽率比其他两组要高，达到了100％。
表4三组种子的发芽率对比结果
Figure GDA0002829219080000111
苗期5d后，根系生长对比结果如图8所示，实验组的根系生长情况比其他两组要好，根毛较多。
苗期8d后，根长对比结果如图9所示，实验组的根系生长情况比其他两组要好，根系长度更长。
五、解磷实验
利用钼锑抗色法(NY/T 2421-2013标准)原理测定植物的有效磷含量。
仪器：紫外分光亮度计，移液枪，三角瓶，恒温摇床。
试剂：KH2PO4，浓硫酸，钼锑抗试剂，磷标准液，抗坏血酸，氢氧化钠，2，4-二硝基酚，0.5mol/L NaHCO3，0.5mol/L NaOH。
制备抗坏血酸试剂:1g分析纯抗坏血酸用10mL超纯水溶解。
制备磷标准储备液：称取105℃烘至恒重的磷酸二氢钾0.2195g，溶于约400mL水中，加入浓盐酸5mL，转入1L容量瓶，用超纯水定容。此储备溶液为50ug/mL的磷标准液。吸取10mL 50ug/mL磷标准储备液用水定容至100mL的容量瓶里。其浓度为5mg/L的磷溶液。
绘制标准曲线：吸取磷标准溶液[ρ(p)＝5μg/ml、0、2、4、6、8、10mL于150mL三角瓶中，加入0.5mol/L NaHCO3浸提剂10mL，加0.75mL的抗坏血酸试剂，100uL的2，4-二硝基酚指示剂，再准确加水至45mL，加入钼锑抗试剂5mL，摇匀，以室温高于20～30℃处放置30min后，用880nm或700nm波长进行比色。用系列溶液的零浓度调节仪器零点，测量吸光值，绘制校准曲线。标准曲线如图12所示。
本次回归方程为：y＝0.0363X-0.0339R2＝0.9915
配置NBRIP液体培养基：精确称量葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 2.5g，AlPO4 1g，FePO41.5g，MgCl25g，MgSO4.7H2O 0.25g，KCl 0.2g，硫酸铵1g，酵母浸膏0.5g；调节pH至7.0，加超纯水定容至1L。
理论上，NBRIP液体培养基中的磷为不溶性磷。
有效磷含量的测定：
第一步、从培养平板上用超纯水洗下哈茨木霉孢子，用血球计数板进行计数，并根据实际结果，将木霉孢子悬液用超纯水稀释至108，并以100μL体积接种至100mL之NBRIP培养基中，作为实验组；
第二步、以不加任何孢子的NBRIP液体培养基作为CK组；
第三步、将实验组与CK组按照30℃,150rpm条件进行培养
第四步、分别在培养进行到第2d、4d、7d时，进行采样测定有效磷含量，测量结果如表5所示：
表5不同天数的有效磷含量对比结果
Figure GDA0002829219080000121
Figure GDA0002829219080000131
实验结果表明，该木霉具有解磷功能，具有运用到农作物土壤解磷的应用上的可能。
具体实施例2
与具体实施例1大致相同，区别仅仅在于：
微生物种子包衣剂的制备过程中采用海藻酸钠作为水溶成膜剂、采用黄原胶作为黏着剂。
具体实施例3
与具体实施例1大致相同，区别仅仅在于：
微生物种子包衣剂的制备过程中采用聚乙烯酰胺作为水溶成膜剂、采用羧基纤维素或硅酸铝镁作为黏着剂。
具体实施例4
与具体实施例1大致相同，区别仅仅在于：
微生物种子包衣剂的制备过程中采用聚乙烯醇作为水溶成膜剂、采用明胶作为黏着剂。
具体实施例5
与具体实施例1大致相同，区别仅仅在于：
微生物种子包衣剂的制备过程中采用壳聚糖作为水溶成膜剂、采用羧基纤维素钠作为黏着剂。
具体实施例6
与具体实施例1大致相同，区别仅仅在于：
微生物种子包衣剂的制备过程中采用海藻酸钠作为水溶成膜剂、采用阿拉伯胶作为黏着剂。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
序列表
<110> 广州菌落生物科技有限公司
<120> 一株木霉及其在农业领域的应用
<130> 1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 614
<212> DNA
<213> 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)
<400> 1
taacaaggtc tccgttggtg aaccagcgga gggatcatta ccgagtttac aactcccaaa 60
cccaatgtga acgttaccaa actgttgcct cggcgggatc tctgccccgg gtgcgtcgca 120
gccccggacc aaggcgcccg ccggaggacc aaccaaaact cttattgtat accccctcgc 180
gggttttttt tataatctga gccttctcgg cgcctctcgt aggcgtttcg aaaatgaatc 240
aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga 300
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<211> 598
<212> DNA
<213> 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)
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caggccgatt gcgctatcct catcattgcc gccggtactg gtgagttcga ggctggta 598

Claims (9)

1.一株木霉在农业领域的应用，该一株木霉，分类命名为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15679，保藏日期为2018年5月21日。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于，用于抑制立枯丝核菌、炭疽菌、镰刀菌的生长。
3.权利要求1所述的应用，其特征在于，用于土壤解磷。
4.权利要求1所述的应用，其特征在于，用于制备微生物肥料。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，制成微生物种子包衣剂。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于，上述种子包衣剂的制备包括以下步骤：
(1)将木霉的原种接在PDA培养皿上活化，然后再接种于试管斜面上备用；
(2)将木霉孢子洗下形成木霉孢子液；
(3)将水溶成膜剂与黏着剂按照5：2的质量比混合，然后用水溶解，使水溶成膜剂的浓度达到0.05g/mL，使黏着剂的浓度达到0.02g/mL，得到种子包衣剂；
(4)测定木霉孢子液的浓度，当菌液的浓度达到108cfu/mL时，按照30:100的质量比将木霉孢子液拌入种子包衣剂中，然后用振荡仪振荡至物质溶解，即得到微生物种子包衣剂。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，该微生物种子包衣剂中活菌的数量大于106cfu/mL。
8.权利要求6所述的应用，其特征在于，水溶成膜剂是PVP-K30、海藻酸钠、聚乙烯酰胺、聚乙烯醇、壳聚糖中的一种。
9.权利要求6所述的应用，其特征在于，黏着剂是聚乙二醇、黄原胶、羧基纤维素、硅酸铝镁、明胶、羧基纤维素钠、阿拉伯胶中的一种。
CN201810933601.6A 2018-08-16 2018-08-16 一株木霉及其在农业领域的应用 Active CN109022292B (zh)

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