CN114836355A - 一种假单胞菌dt04及其在污水脱氮的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境微生物学、污水生物脱氮处理技术领域，具体涉及一株假单胞菌DT04在污水脱氮中的应用。本发明所述的菌株DT04保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.22998。所述菌株DT04具有很强的中低温脱氮及降解COD的能力，可用于我国寒冷地区的中高浓度生活污水、畜禽养殖废水或工业有机废水等多种水处理过程。基于菌株DT04提升低温条件下的高无机氮污染的水体脱氮效果，且具有适用温度范围宽、环境友好等优点。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物学、污水生物脱氮处理技术领域，具体涉及一株假单胞菌DT04在污水脱氮中的应用。
背景技术
水体中氨态氮、硝态氮等无机氮污染物浓度超标对水环境质量及生态系统安全构成了威胁。如何有效去除污染水体中无机氮污染具有重要的现实意义。
以硝化细菌、反硝化细菌等为代表的微生物可以利用污水中的无机氮污染物，并最终将绝大部分污染物转化成无害的氮气从水体中脱除(简称生物脱氮技术)。与物理、化学处理技术相比，生物脱氮技术具有经济可行、环境友好等优势，是目前世界各国广泛采用的污水脱氮主流工艺方法。
温度是影响微生物脱氮效果的重要因素。绝大多数硝化细菌、反硝化细菌等脱氮微生物为中温菌，即这些微生物发挥脱氮活性的最佳温度范围为25-35℃。然而，当秋冬季温度降低时，这些脱氮微生物的活性降低、数量减少，进而导致污水系统的脱氮效率及效果明显下降，出水水质不稳定或不达标。
发掘能够耐受低温条件的脱氮菌株以提高低温季节污水的脱氮效果具有重要意义。围绕高效耐低温脱氮菌的筛选、提高低温脱氮工艺效果等内容，国内外的多个研发机构和企业单位开展了大量的积极探索。例如： CN110964663A公开了一株低温污水脱氮的异养硝化细菌及其应用，该耐低温菌株Acinetobacter johnsonii BC-15(CGMCC No.18736)属于不动杆菌属, 能够在10-30℃发挥脱氮性能；CN103773723A公开了一株施氏假单胞菌菌株(Pseudomonas stutzeri；CGMCC No.8291)DN-3在15-20℃脱除水体中亚硝态氮的应用。但是该菌株在温度低于15℃时脱氮效果明显降低； CN103275908A公开了一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens, CGMCC No.7476)WSW-1001在8℃条件下降解氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的能力，但菌株在37℃以上生长不佳。
我国北方大部分地区每年秋冬季的时间长(常持续5-6个月)，此期间水体温度大多低于15℃，而现有生物脱氮菌种资源绝大多为中温菌(25℃ -40℃温度范围内脱氮活性较好)，对15℃以下的低温条件适应性差，脱氮活性低。能够耐低温的脱氮菌种类少，具有较高脱氮活性的菌种资源仍十分缺乏，无法更好地满足寒冷季节污染水体高效脱氮处理的迫切需求。
发明内容
本发明的目的是针对污水低温季节生物脱氮效果差及低温脱氮菌种资源缺乏的现状，提供了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)DT04及其在宽温度范围去除水体高浓度无机氮污染的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一株假单胞菌，所述菌株为假单胞菌DT04，其已于2021年8月2日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株的保藏号为CGMCC No.22998，保藏登记分类名暂为Pseudomonas sp.。保藏地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号。
所述菌株在中低温条件下具有高效脱氮能力，耐受高盐度条件，生长迅速。
一种假单胞菌的应用，所述菌株Pseudomonas sp.DT04在污水脱氮中的应用。
所述菌株Pseudomonas sp.DT04在7-40℃条件下去除污染水体中无机氮的应用。
所述污染水体中无机氮形态为氨态氮、硝态氮和亚硝态氮；其中，氨态氮浓度范围为20-200mg/L，硝态氮浓度范围为10-500mg/L，亚硝态浓度范围为0.5-80mg/L。
所述污水盐度(以NaCl浓度计)为0.1-40g/L，污水的pH值为6.0-9.0。
一种在具有脱氮、耐盐度的菌剂，菌剂含所述的假单胞菌。
所述菌剂含有该菌株的培养物、菌悬液或发酵菌液。
所述菌剂为将菌株DT04采用液体培养基中以转速80-180rpm、 25-35℃、培养基初始pH为7.2-8.0，发酵12-24h，即得发酵菌液；所述菌株、菌株发酵菌液、发酵菌液经离心或过滤等技术所得菌体、固态菌体或其液体溶解物均为培养物。
所述液体培养基成分为：NaCl 0.5-12.0；蛋白胨0.4-12.0；酵母膏 0.2-6.0、蒸馏水1000mL，调节pH为7.2-8.0。
一种具有脱氮、耐盐度的菌剂的应用，所述菌剂在7-40℃条件下在作为污染水体的脱氮、耐盐的菌剂中的应用。
将所述菌剂按0.1-10wt％接种量接种至待处理的无机氮污染水体中，所述污染水体的初始pH为6.0-9.0、盐度(以NaCl浓度计)为0.1-40g/L、温度为7-40℃。
本发明的有益效果：
(1)本发明菌株环境适应性强，对于盐度耐受性好，且对较高浓度的无机氮具有去除能力；
(2)本发明所述脱氮菌株DT04能够很好地适应低温条件，能够在7℃有效去除水体中氨态氮、硝态氮及亚硝态氮；
(3)本发明菌株在7-40℃的宽温度范围下保持较高脱氮活性，可用于我国北方年均温差变化大的广大地理区域内的污水生物脱氮处理；
(4)本发明菌株在中低温条件下生长繁殖能力均较好，菌株扩培及种子液制备相对较容易，有利于工业化生产及后续应用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明内容不仅局限于以下实施例。
本发明菌株分离筛选自黑龙江某污水处理厂活性污泥池，经16S rRNA 基因序列比对分析，初步鉴定DT04属于假单胞菌属(Pseudomonas)内的一种，与Pseudomonassynxantha(DSM 18928)的16S rRNA基因序列相似性最高，该菌株在低温条件下对水体中无机氮具有明显降解去除作用。
下述实施例中所需材料：
1)活性污泥：采集自黑龙江省某污水处理厂活性污泥池。
2)培养基：
富集培养基：NaCl 10.0；蛋白胨10.0；酵母膏5.0。
脱氮培养基(g/L)：CH3COONa 8.2；NH4Cl 0.30、KNO3 0.58、NaNO2 0.24、KH2PO40.08；CaCl2·2H2O 0.1；MgSO4·7H2O 1.0；FeSO4·7H2O 0.006；微量元素液1mL；蒸馏水1L；pH 7.0～7.5；固体培养基添加2％的琼脂。
微量元素液(g/L)：EDTA 0.35；ZnSO4·7H2O 0.2；CuSO4·5H2O 0.1； MnSO4·7H2O0.1；Co(NO3)2·7H2O 0.09；H3BO3 0.1；Na2MoO4 0.1。
以上培养基均通过灭菌锅在103.4kPa、121℃条件下灭菌20min，放凉后使用。
3)实验仪器：
恒温培养箱、恒温震荡培养箱、超净工作台、立式压力蒸汽灭菌器、凝胶成像系统、微型紫外分光光度计、PCR仪、电泳仪、涡旋振荡器等。
实施例1
(一)菌株DT04筛选
取活性污泥20g，放入预装有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，然后在10℃、180rpm的恒温摇床上震荡培养48h；
48h后，取静置后的上层菌液并经10倍梯度稀释后涂布于脱氮培养基平板中；
待筛选培养基上菌落生长后，用无菌接种环挑取单菌菌落，采用平板划线分离法接种于脱氮固体培养基上，并置于10℃恒温培养箱中培养48h，待菌落长出后挑取单菌落，重复上述划线分离过程直至菌落形态单一，经脱氮效果测定，取硝态氮去除率最大的菌株，编号为DT04。
(二)菌株DT04鉴定与菌种保藏
提取菌株DT04的基因组DNA，并送往北京六合华大基因科技有限公司进行16SrRNA基因测序。经在EzBioCloud Database数据库中的序列比对(https://www.ezbiocloud.net/)，菌株DT04的16S rRNA基因与 Pseudomonas synxantha(DSM18928)的序列相似性最高(99.5％)。
菌株16S rRNA基因序列为：CCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGT GACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTC TGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGA CTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTCTGGGATTAGCTCCACCTCGCG GCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGG CCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTT GTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATTACGTGCTGGTAACTA AGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGA CACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAG GCACCAATCTATCTCTAGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAG GTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCG GGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCA GGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGCTCAAGGCTC CCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTA ATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCA CCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTCGTCA GTTTTGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCAACT TAACGAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGC TTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGC TTATTCTGTCGGTAACGTCAAAATTGCAGAGTATTAATCTACAACCCTT CCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACG CGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGC TGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGAT CATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCC CACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCG AAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCGT TTCCGAACGTTATCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCA CCCGTCCGCCGCTCTCAAGAGAAGCAAGCTTCTCTCTACCGCTCGACT TGCATGTGTTAGTCTG
菌株DT04保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.22998，菌株分类名(建议分类名)暂登记为Pseudomonas sp.。
(三)菌株DT04特异性
菌株DT04在15℃即可较快生长，在富集培养基中(250mL锥形瓶、 180rpm)振荡培养16h后，菌液OD600由初始的0.15增加至0.68，细胞数量增长约3个数量级。
菌株可以在7-40℃、0.1-40g/L条件下保持脱氮活性。
实施例2
取DT04菌种，接种至装有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、180rpm的恒温摇床上活化24h。24h后取菌液，按照1％接种比例接种至脱氮培养基中，然后在7℃、180rpm条件下恒温培养96h。另设接种等体积的经高温蒸汽灭菌(103.4kPa、121℃)的DT04菌液为对照组以消除菌株发酵液对脱氮效果可能的影响，其他培养条件与接种组相同。培养期结束后，取水样测定氨态氮、硝态氮及亚硝态氮浓度。结果见表1所示。
由表1测定结果可见，96h后，接种DT04菌株的处理组的氨态氮、硝态氮及亚硝态氮降解率分别为44.8％、49.1％、38.6％；接种灭菌DT04菌液的对照组水样中氨态氮、硝态氮及亚硝态氮降解率分别仅为0.17％、0.22％、 0.08％。该结果显示，7℃低温条件下，接种DT04的脱氮效果明显。
表1菌株DT04在7℃脱氮效果
| 水样编号 | 氨氮去除率(％) | 硝态氮去除率(％) | 亚硝态氮去除率(％) |
| 接种DT04 | 44.8 | 49.1 | 38.6 |
| 接种灭菌DT04 | 0.17 | 0.22 | 0.08 |
实施例3
取实施例2中活化好的DT04菌液，按照1％接种比例接种至脱氮培养基中，然后在10℃、180rpm条件下恒温培养96h。另设接种等体积的经高温蒸汽灭菌的DT04菌液为对照组，其他培养条件与接种组相同。培养期结束后，取水样测定氨态氮、硝态氮及亚硝态氮浓度。结果见表2所示。
由表2测定结果可见，96h后，接种DT04菌株的处理组的氨态氮、硝态氮及亚硝态氮降解率分别为58.3％、69.4％、57.6％；接种灭菌DT04菌液的对照组水样中氨态氮、硝态氮及亚硝态氮降解率分别仅为0.11％、0.13％、0.05％。该结果显示，10℃低温条件下，接种DT04的脱氮效果较7℃有所提升，脱氮效果明显。
表2菌株DT04在10℃脱氮效果
| 水样编号 | 氨氮去除率(％) | 硝态氮去除率(％) | 亚硝态氮去除率(％) |
| 接种DT04 | 58.3 | 69.4 | 57.6 |
| 接种灭菌DT04 | 0.11 | 0.13 | 0.05 |
实施例4
取实施例2中活化好的DT04菌液，按照1％接种比例接种至脱氮培养基中，然后在15℃、180rpm条件下恒温培养96h。另设接种等体积的经高温蒸汽灭菌的DT04菌液为对照组，其他培养条件与接种组相同。培养期结束后，取水样测定氨态氮、硝态氮及亚硝态氮浓度。结果见表3所示。
由表3测定结果可见，96h后，接种DT04菌株的处理组的氨态氮、硝态氮及亚硝态氮降解率分别为76.2％、89.9％、88.2％；接种灭菌DT04菌液的对照组水样中氨态氮、硝态氮及亚硝态氮降解率分别仅为0.19％、0.14％、0.02％。该结果显示，15℃低温条件下，接种DT04的脱氮效果进一步提升，脱氮效果明显。
表3菌株DT04在15℃脱氮效果
| 水样编号 | 氨氮去除率(％) | 硝态氮去除率(％) | 亚硝态氮去除率(％) |
| 接种DT04 | 76.2 | 89.9 | 88.2 |
| 接种灭菌DT04 | 0.19 | 0.14 | 0.02 |
实施例5
取实施例2中活化好的DT04菌液，按照1％接种比例接种至脱氮培养基中，然后在40℃、180rpm条件下恒温培养96h。另设接种等体积的经高温蒸汽灭菌的DT04菌液为对照组，其他培养条件与接种组相同。培养期结束后，取水样测定氨态氮、硝态氮及亚硝态氮浓度。结果见表4所示。
由表4测定结果可见，96h后，接种DT04菌株的处理组的氨态氮、硝态氮及亚硝态氮降解率分别为99.1％、99.5％、96.8％；接种灭菌DT04菌液的对照组水样中氨态氮、硝态氮及亚硝态氮降解率分别仅为0.21％、0.04％、0.02％。该结果显示，40℃条件下，接种DT04的脱氮效果显著。
表4菌株DT04在40℃脱氮效果
| 水样编号 | 氨氮去除率(％) | 硝态氮去除率(％) | 亚硝态氮去除率(％) |
| 接种DT04 | 99.1 | 99.5 | 96.8 |
| 接种灭菌DT04 | 0.21 | 0.04 | 0.02 |
实施例6
取实施例2中活化好的DT04菌液，按照1％接种比例接种至沈北新区某地表水(初始氨态氮浓度10.5mg/L,硝态氮浓度2.3mg/L)，然后在15℃、 180rpm条件下恒温培养5天。另设接种等体积的经高温蒸汽灭菌的DT04 菌液为对照组，其他培养条件与接种组相同。培养期结束后，取水样测定氨态氮、硝态氮浓度。结果见表5所示。
由表5测定结果可见，5后，接种DT04菌株的处理组的氨态氮、硝态氮降解率分别为94.1％、96.4％；接种灭菌DT04菌液的对照组水样中氨态氮、硝态氮及亚硝态氮降解率分别仅为0.01％、0.02％。该结果显示，15℃条件下，接种DT04去除真实环境中地表水中氨态氮和硝态氮的效果显著。
表5菌株DT04在15℃去除真实污水中无机氮效果
| 水样编号 | 氨氮去除率(％) | 硝态氮去除率(％) |
| 接种DT04 | 94.1 | 96.4 |
| 接种灭菌DT04 | 0.01 | 0.02 |
序列表
<110> 沈阳风景园林股份有限公司
<120> 一种假单胞菌DT04及其在污水脱氮的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccgaaggtt agactagcta cttctggtgc aacccactcc catggtgtga cgggcggtgt 60
gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcga cattctgatt cgcgattact agcgattccg 120
acttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccggactacg atcggttttc tgggattagc 180
tccacctcgc ggcttggcaa ccctctgtac cgaccattgt agcacgtgtg tagcccaggc 240
cgtaagggcc atgatgactt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc 300
tccttagagt gcccaccatt acgtgctggt aactaaggac aagggttgcg ctcgttacgg 360
gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtctcaatg 420
ttcccgaagg caccaatcta tctctagaaa gttcattgga tgtcaaggcc tggtaaggtt 480
cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 540
atttgagttt taaccttgcg gccgtactcc ccaggcggtc aacttaatgc gttagctgcg 600
ccactaagag ctcaaggctc ccaacggcta gttgacatcg tttacggcgt ggactaccag 660
ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctca gtgtcagtat cagtccaggt 720
ggtcgccttc gccactggtg ttccttccta tatctacgca tttcaccgct acacaggaaa 780
ttccaccacc ctctaccata ctctagctcg tcagttttga atgcagttcc caggttgagc 840
ccggggattt cacatccaac ttaacgaacc acctacgcgc gctttacgcc cagtaattcc 900
gattaacgct tgcaccctct gtattaccgc ggctgctggc acagagttag ccggtgctta 960
ttctgtcggt aacgtcaaaa ttgcagagta ttaatctaca acccttcctc ccaacttaaa 1020
gtgctttaca atccgaagac cttcttcaca cacgcggcat ggctggatca ggctttcgcc 1080
cattgtccaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc tggaccgtgt ctcagttcca 1140
gtgtgactga tcatcctctc agaccagtta cggatcgtcg ccttggtgag ccattacccc 1200
accaactagc taatccgacc taggctcatc tgatagcgca aggcccgaag gtcccctgct 1260
ttctcccgta ggacgtatgc ggtattagcg tccgtttccg aacgttatcc cccactacca 1320
ggcagattcc taggcattac tcacccgtcc gccgctctca agagaagcaa gcttctctct 1380
accgctcgac ttgcatgtgt tagtctg 1407
Claims (10)
1.一株假单胞菌，其特征在于：所述菌株为假单胞菌DT04，其已于2021年8月2日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株的保藏号为CGMCC No.22998，保藏登记分类名暂为Pseudomonas sp.。
2.一种权利要求1所述的假单胞菌的应用，其特征在于：所述菌株Pseudomonassp.DT04在污水脱氮中的应用。
3.按权利要求2所述的假单胞菌的应用，其特征在于，所述菌株Pseudomonas sp.DT04在7-40℃条件下去除污染水体中无机氮的应用。
4.按权利要求3所述的应用，其特征在于，所述污染水体中无机氮形态为氨态氮、硝态氮和亚硝态氮；其中，氨态氮浓度范围为20-200mg/L，硝态氮浓度范围为10-500mg/L，亚硝态浓度范围为0.5-80mg/L。
5.按权利要求3所述的应用，其特征在于，所述污水盐度(以NaCl浓度计)为0.1-40g/L，污水的pH值为6.0-9.0。
6.一种具有脱氮、耐盐度的菌剂，其特征在于：菌剂含权利要求1所述的假单胞菌。
7.按权利要求6所述的具有脱氮、耐盐度的菌剂，其特征在于：所述菌剂含有该菌株的培养物。
8.按权利要求7所述的具有脱氮、耐盐度的菌剂，其特征在于：所述菌剂为将菌株DT04接种于液体培养基中在转速80-180rpm、25-35℃、培养基初始pH为7.2-8.0条件下发酵12-24h，即得发酵菌液；所述菌株、菌株发酵菌液、发酵菌液经离心或过滤等技术所得菌体、固态菌体或其液体溶解物均为培养物。
9.一种权利要求6所述的具有脱氮、耐盐度的菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂在7-40℃条件下在作为污染水体的脱氮、耐盐的菌剂中的应用。
10.按权利要求9所述的应用，其特征在于：将所述菌剂按0.1-10wt％接种量接种至待处理的无机氮污染水体中，所述污染水体的初始pH为6.0-9.0、盐度(以NaCl浓度计)为0.1-40g/L、温度为7-40℃。
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