CN110283737A - 具有部分反硝化功能的嗜碱假单胞菌、其培养方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种具有部分反硝化功能的嗜碱假单胞菌、其筛选培养方法及应用,所述嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)的保藏号为CGMCC No.17246,所述嗜碱假单胞菌是由城镇污水处理厂筛选出来,可使用LB培养基进行富集。所述嗜碱假单胞菌在以葡萄糖或乙醇为碳源的条件下,可实现反硝化过程中硝酸盐到亚硝酸盐的快速稳定累积,在部分反硝化途径的研究领域有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及污水处理技术领域,特别是涉及一种具有部分反硝化功能的嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila,W-39)、其筛选培养方法及应用。
背景技术
以厌氧技术为核心的工艺路线中,COD通过厌氧工艺去除后,以厌氧氨氧化进行脱氮成为低能耗污水处理技术的可行途径。在厌氧氨氧化工艺 (anaerobic ammoniaoxidation,ANAMMOX)中,厌氧氨氧化菌以氨氮为电子供体、亚硝态氮为电子受体,将两者在厌氧条件下转化为氮气和少量硝态氮。获得比例相应的亚硝态氮和解决反应产生的硝酸盐累积是厌氧氨氧化技术工程应用的关键。传统上,通过好氧过程的曝气控制等方法实现部分亚硝化(partial nitritation,PN)来提供亚硝态氮,近年来,反硝化过程中亚硝酸盐累积的现象被发现,并且可以实现亚硝酸盐的稳定维持,这证明了部分反硝化(partialdenitrification,PD)途径能够实现,但是具体如何优化筛选/培养途径,满足不同场景对部分反硝化工艺的调控还需要深入探讨和研究。
发明内容
有鉴于此,本发明的主要目的在于提供一种具有部分反硝化功能的嗜碱假单胞菌,及其筛选和富集的方法和应用,以期至少部分地解决上述技术问题。
为了实现上述目的,作为本发明的第一个方面,提供了一种嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila),其特征在于,所述嗜碱假单胞菌的保藏编号为CGMCCNo.17246。
作为本发明的第二个方面,提供了一种嗜碱假单胞菌,其特征在于,所述嗜碱假单胞菌是从城镇污水处理厂活性污泥中筛选出来,筛选过程使用溴百里酚蓝BTB培养平板。
作为本发明的第三个方面,提供了一种嗜碱假单胞菌,其特征在于,所述嗜碱假单胞菌通过16SrDNA测序鉴定,所述嗜碱假单胞菌的16SrDNA 序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的第四个方面,提供了一种嗜碱假单胞菌的筛选培养方法,其特征在于,所述嗜碱假单胞菌由城镇污水处理厂活性污泥中筛选出菌种,筛选过程使用溴百里酚蓝BTB培养平板,筛选步骤包括:将活性污泥细菌悬液梯度稀释,涂布在BTB培养平板上,于30℃培养1~2d,挑取周围出现蓝色的单菌落,在BTB培养平板上划线纯化,使用LB培养基对筛选获得的纯化菌株进行富集培养,最终获得纯菌株。
作为本发明的第五个方面,提供了一种如上所述的嗜碱假单胞菌在污水处理领域的应用。
其中,所述嗜碱假单胞菌根据不同的硝酸盐转化场景选择碳源类型。
其中,在需要硝酸盐到亚硝酸盐的快速稳定累积时,选择以乙醇和/ 或葡萄糖为碳源的培养基;在需要生长和反硝化出现较长迟滞期,后期伴随硝酸盐浓度降低和亚硝酸盐浓度升高的场景时,选择以己酸钠和/或辛酸钠为碳源的培养基。
基于上述技术方案可知,本发明的嗜碱假单胞菌相对于现有技术至少具有如下有益效果之一:
(1)能够解决反硝化过程亚硝酸盐累积的现象;
(2)能够满足不同应用场景,通过培养过程碳源条件的不同,实现上述菌种反硝化过程中亚硝酸盐的累积。
附图说明
图1A~1C分别是本发明的菌株W-39利用不同常规碳源实现的反硝化效果曲线图,其中图1A碳源为甲醇、图1B碳源为乙醇、图1C碳源为葡萄糖;
图2A~2C分别是本发明的菌株W-39利用不同中长链脂肪酸碳源实现的反硝化效果曲线图,其中图2A碳源为己酸钠、图2B碳源为辛酸钠、图 2C碳源为壬二酸。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明。
本发明公开了一种嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila,W-39),用于解决反硝化过程亚硝酸盐累积的现象,以及在不同碳源条件下利用上述菌种解决反硝化过程中亚硝酸盐累积的现象。该嗜碱假单胞菌在设定碳源条件下具有部分反硝化功能,菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏登记入册的编号为CGMCC No.17246,保藏日期为2019年2月19日。
本发明还公开了一种嗜碱假单胞菌,其制备方法是由城镇污水处理厂活性污泥中筛选出菌种,筛选过程使用溴百里酚蓝(BTB)培养平板,其菌落在LB培养平板上呈淡黄色,边缘不整齐,表面光滑,通过16SrDNA 测序鉴定为嗜碱假单胞菌(Pseudomonasalcaliphila),16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还公开了一种如上所述的嗜碱假单胞菌在污水处理领域的应用,该嗜碱假单胞菌在碳源类型不同时会影响其对硝酸盐的转化效果。例如, W-39在甲醇和壬二酸为碳源的培养基中,菌密度OD600和硝酸盐浓度基本不发生变化;在以乙醇和葡萄糖为碳源的培养基中,可实现硝酸盐到亚硝酸盐的快速稳定累积;在以己酸钠和辛酸钠为碳源的培养基中,生长和反硝化出现较长的迟滞期,后期伴随硝酸盐浓度降低和亚硝酸盐浓度升高。
下面结合实施例,对本发明提供的具有部分反硝化功能的嗜碱假单胞菌,进行详细的说明。
实施例1具有反硝化功能的菌株的筛选和鉴定
筛选:自城镇污水处理厂采集活性污泥,并于4℃保存运输到实验室作为目标菌株的筛选材料,并按照如下方法分离筛选得到具有反硝化功能的细菌-嗜碱假单胞菌W-39。
①筛选过程使用的培养基如下:
反硝化液体培养基:以硝酸钾为唯一氮源,配制浓度为100mg·L-1(以N计),配制C/N=15(质量比),其组分为磷酸二氢钾0.27g,磷酸氢二钠 1.42g,氯化钠8g,氯化钾0.2g,六水丁二酸钠8.44g,硝酸钾0.724g,七水硫酸镁0.01g,一水硫酸锰0.01g,氯化钙0.004g,蒸馏水1000mL,调节pH值为7.1~7.2。
溴百里酚蓝(BTB)培养平板:每升反硝化液体培养基中加入20g琼脂粉和1mLBTB溶液(质量比1%溶于无水乙醇)。
LB培养基:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,蒸馏水1000mL,调节pH值为7.2~7.4。
LB培养平板:每升LB培养基中加入20g琼脂粉。
所有培养基配置好后于121℃高温灭菌15min。
②反硝化细菌的分离:取10mL活性污泥于装有90mL灭菌的反硝化液体培养基的150mL锥形瓶中,加入适量灭菌的玻璃珠,30℃恒温摇床上以160rpm培养1h,梯度稀释液涂布到BTB培养平板上,于30℃培养1~2d。用接种环挑取周围培养基出现蓝色的单菌落,多次经BTB培养平板划线纯化获得纯菌株,将所得菌株命名为W-39。
将分离纯化的W-39在LB培养平板上扩繁,30℃培养,观察菌落特征。
菌种鉴定:采用细菌通用引物对W-39菌株的16SrDNA进行PCR扩增(上海生工生物技术有限公司合成),正向引物27f (5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’),反向引物1492r (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。
PCR反应体系为:DNA模板0.2μL,2×Taq Master Mix 25μL,27f引物1μL,1492r引物1μL,ddH2O 22.8μL,共计50μL。
PCR反应程序为:95℃预变性10min,95℃变性45s,54.5℃退火30s, 72℃延伸1min,变性-退火-延伸循环30次,72℃延伸7min。
对PCR产物进行测序(北京博迈德基因技术有限公司),结果为测得长度为1410bp的序列,序列如SEQ ID NO.1所示,经上传至NCBI进行比对,与嗜碱假单胞菌(Pseudomonasalcaliphila)JCM 10630相似度最高,同源性为99.9%。
菌株W-39的生物学特征:其菌落在LB培养平板上呈淡黄色,边缘不整齐,表面光滑,扫描电镜下观察细胞为杆状,大小为(1.5~2.0)μm× (0.4~0.5)μm。
菌种保藏:筛选过程获得的具有降解硝酸盐功能的菌株命名为W-39,经鉴定为嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila),菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏登记入册的编号为CGMCC No.17246,保藏日期为2019年2月19日。
实施例2常规碳源对菌株W-39反硝化效果的影响
本实施例探究常规碳源对嗜碱假单胞菌W-39反硝化效果的影响,实验过程中分别用甲醇、乙醇和葡萄糖代替反硝化液体培养基中的六水丁二酸钠,反硝化液体培养基中的甲醇、乙醇和葡萄糖的初始浓度浓度分别为 4.01 g·L-1、2.88g·L-1和3.75g·L-1。
将菌种W-39接种至LB液体培养基中进行扩繁,按照体积比1%的量 (菌数在108cfu·mL-1数量级)将PBS清洗后的菌体接种于装有100mL灭菌的不同碳源反硝化液体中,反应容器为无菌透气封口膜封口的150mL玻璃锥形瓶,于恒温震荡培养箱中培养(30℃、50rpm),每组试验设置3个平行,1个空白对照。定时取样,每次取样4mL,用于测定72h内菌体生长情况、硝酸盐、亚硝酸盐、总氮和COD浓度变化,结果如图1所示。
图1为本发明的菌株W-39利用不同常规碳源的反硝化效果,其中图 1A碳源为甲醇,图1B碳源为乙醇,图1C碳源为葡萄糖。如图所示,本发明的嗜碱假单胞菌W-39在甲醇为碳源的培养基中,菌密度OD600和硝酸盐浓度基本不发生变化;在以乙醇和葡萄糖为碳源的培养基中,可实现硝酸盐到亚硝酸盐的快速稳定累积。
实施例3中长链脂肪酸碳源对菌株W-39反硝化效果的影响
本实施例探究中长链脂肪酸碳源对嗜碱假单胞菌W-39反硝化效果的影响,实验过程中分别用己酸钠、辛酸钠和壬二酸代替反硝化液体培养基中的六水丁二酸钠,反硝化液体培养基中的己酸钠、辛酸钠和壬二酸的初始浓度浓度分别为2.88g·L-1、2.60g·L-1和2.61g·L-1。
将菌种W-39接种至LB液体培养基中进行扩繁,按照体积比1%的量 (菌数在108cfu·mL-1数量级)将PBS清洗后的菌体接种于装有100mL灭菌的不同碳源反硝化液体中,反应容器为无菌透气封口膜封口的150mL玻璃锥形瓶,于恒温震荡培养箱中培养(30℃、50rpm),每组试验设置3个平行,1个空白对照。定时取样,每次取样4mL,用于测定72h内菌体生长情况、硝酸盐、亚硝酸盐、总氮和COD浓度变化,结果如图2所示。
图2为本发明的菌株W-39利用不同中长链脂肪酸碳源的反硝化效果,其中图2A碳源为己酸钠,图2B碳源为辛酸钠,图2C碳源为壬二酸。如图所示,本发明的嗜碱假单胞菌W-39在壬二酸为碳源的培养基中,菌密度OD600和硝酸盐浓度基本不发生变化;在以己酸钠和辛酸钠为碳源的培养基中,生长和反硝化出现较长的迟滞期,后期伴随硝酸盐浓度降低和亚硝酸盐浓度升高。
通过上述三个实施例可知,本发明的嗜碱假单胞菌W-39在以乙醇和葡萄糖为碳源的反硝化条件下,可以实现快速稳定的亚硝酸盐累积:以乙醇为碳源时,亚硝酸盐累积速率可达6.56mg·L-1·h-1,亚硝酸盐累积率为85.44%,亚硝酸盐浓度为82.14mg·L-1;以葡萄糖为碳源时,亚硝酸盐累积速率可达8.35mg·L-1·h-1,亚硝酸盐累积率为84.24%,亚硝酸盐浓度为 80.16mg·L-1。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila),其特征在于,所述嗜碱假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.17246。
2.一种嗜碱假单胞菌,其特征在于,所述嗜碱假单胞菌是从城镇污水处理厂活性污泥中筛选出来,筛选过程使用溴百里酚蓝BTB培养平板。
3.一种嗜碱假单胞菌,其特征在于,所述嗜碱假单胞菌通过16SrDNA测序鉴定,所述嗜碱假单胞菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种嗜碱假单胞菌的筛选培养方法,其特征在于,所述嗜碱假单胞菌由城镇污水处理厂活性污泥中筛选出菌种,筛选过程使用溴百里酚蓝BTB培养平板,筛选步骤包括:将活性污泥细菌悬液梯度稀释,涂布在BTB培养平板上,于30℃培养1~2d,挑取周围出现蓝色的单菌落,在BTB培养平板上划线纯化,使用LB培养基对筛选获得的纯化菌株进行富集培养,最终获得纯菌株。
5.一种如权利要求1~3任一项所述的嗜碱假单胞菌在污水处理领域的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述嗜碱假单胞菌根据不同的硝酸盐转化场景选择碳源类型。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:
在需要硝酸盐到亚硝酸盐的快速稳定累积时,选择以乙醇和/或葡萄糖为碳源的培养基;
在需要生长和反硝化出现较长迟滞期,后期伴随硝酸盐浓度降低和亚硝酸盐浓度升高的场景时,选择以己酸钠和/或辛酸钠为碳源的培养基。
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