CN102676432B - 一种高效水体脱氮施氏假单胞菌db-33及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够用于养殖水体快速脱氮的施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）DB-33，其保藏号CGMCCNo.5993。本发明还公开该菌剂的开放培养方法：用25L的塑料桶作培养装置，装入DM液体培养基20L，接入液体菌种，接菌量为20%，温度在25℃以上，用气泵通气（45w），发酵时间24小时，发酵液有效活菌数达到16亿·mL^-1。本发明发现的施氏假单胞菌可快速降解水体中的硝酸盐，亚硝酸盐，氨氮，从而改善水体环境，减少含氮污染物对水体中生物的危害，极大地降低脱氮微生物制剂的生产成本，为广大养殖户提供一种高效、安全、实用的生物脱氮技术。

Description

一种高效水体脱氮施氏假单胞菌DB-33及其培养方法

技术领域

本发明属于生物菌制剂技术领域和环境微生物应用领域。涉及一种应用于养殖水体快速脱氮的施氏假单胞菌DB-33 及其开放培养方法。

背景技术

据国家环保总局 2010年中国环境状况公报, 我国主要湖泊氮、磷污染较重, 养殖水体由于养殖密度提高，饲料投放量过高，导致富营养化问题突出。高浓度的氨氮和（亚）硝酸盐氮不仅对许多水生动物有直接的毒害作用，还会降低其免疫力，导致水产病害频发，给水产养殖业带来巨大损失。因此，更快更好地解决水体富营养化问题已成为亟待解决的环境问题之一，也是目前研究的热点。

近年来，国内外对氮污染的治理日益重视，生物脱氮技术因其迅速安全而被广泛应用。在生物脱氮过程中，最重要的也是具有较大的优势的是好氧反硝化过程。而菌株的好氧反硝化特性决定了水体脱氮的效果。近年来越来越多的好氧反硝化菌被发现，已报道的有产碱杆菌属（Alcaligenes）、副球菌属（Paracoccus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽胞杆菌属（Bacillus）、红球菌属（Rhodococcus）、生丝微菌属（Hyphomicrobium）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、戴尔福特属（Delftia）等多个属存在好氧反硝化现象。但是目前国内市场尚无可有效进行水体脱氮的微生物制剂产品，其主要原因是没能开发出高效的反硝化菌种，而且在反硝化细菌的发酵培养中，需要较完善的发酵设备，投入较高的成本，导致养殖户的生产成本增加，制约了生物脱氮技术在生产上的大面积应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有污染水体生物脱氮技术的缺陷，旨在开发一种高效反硝化细菌及其简单实用的培养方法，极大地降低脱氮微生物制剂的生产成本，为广大养殖户提供一种高效、安全、实用的生物脱氮技术。

为实现上述目的，本发明人从自然环境中分离得到一株高效反硝化细菌DB-33，具有快速、高效脱氮功能；开发出DB-33的规模化培养方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DB-33，分离自天津市西青区水产养殖池中，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.5993。

本发明进一步公开了施氏假单胞菌DB-33保藏号CGMCC No.5993在制备养殖水体、污染水体快速脱氮菌剂方面的应用。其中的快速脱氮指的是能快速降解水体中的硝酸盐，在48h之内对含有138mg·L^-1硝酸盐的模拟废水中的硝酸盐降解率达94.58%；能快速降解水体中的亚硝酸盐，在24h之内对含有32mg·L^-1亚硝酸盐的模拟废水中的亚硝酸盐降解率达99.99%；能快速降解水体中的氨氮，在48h之内对含有18mg·L^-1氨氮的模拟废水中的氨氮降解率达51.52%。

本发明进一步公开了施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DB-33，保藏号CGMCC No.5993的开放培养方法，其特征在于该菌剂发酵流程是：斜面菌种→活化→液体菌种→塑料桶通气发酵→检验；其中

斜面菌种：将施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DB-33，保藏号CGMCC No.5993 接种在含有DM固体培养基的斜面试管中，30℃培养24h，4℃冰箱中保存的菌种。其中DM固体培养基为：柠檬酸钠5 g，KNO₃  2 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO4·7H₂O 0.2 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂粉12g，pH7.2。

活化：配置DM固体培养基，灭菌后倒入90mm 培养皿内，待冷却后，接入保存的DB-33斜面菌株，30℃培养24h。

液体菌种：配置DM液体培养基，分装与三角瓶中，灭菌，待冷却后，挑取培养皿中活化后的菌株接入，30℃培养24h；其中DM液体培养基为：柠檬酸钠5 g，KNO₃  2 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO4·7H₂O 0.2 g，蒸馏水1 000 mL， pH7.2。

塑料桶通气发酵：用25L的塑料桶作培养装置，旧桶用1%的次氯酸钠溶液消毒，然后用清水冲洗，新桶可用清水清洗过直接使用。装入DM液体培养基20L ，接入三角瓶中的液体菌种，接菌量为20%，温度在25℃以上，用气泵（45w）接入沙头（2%的次氯酸钠溶液浸泡）通气，发酵时间24小时。

本发明更加详细的技术内容如下：

（1）本申请人于2008年8月在天津西青区鱼虾养殖池中分离、筛选到一株高效的反硝化菌DB-33，在好氧条件下具有较强的水体脱氮能力。经过形态观察，生理生化试验和16S rDNA鉴定，属于施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）。申请人于2012年4月13日将该菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.5993。保藏日期：2012年4月13日；单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院。

（2）施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）菌株DB-33的细菌学特征及生理生化指标：

DB-33为革兰氏阴性菌，杆状，菌落淡黄色，边缘不整齐，表面粗糙，隆起形状不规则。接触酶阳性，氧化酶阳性，淀粉水解阳性，MP阴性，VP阴性，吲哚反应阴性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化阴性，产硫化氢阴性。

（3）施氏假单胞菌DB-33的对养殖水体的脱氮效果：

能快速降解水体中的硝酸盐，在48h之内对含有138mg·L^-1硝酸盐的模拟废水中的硝酸盐降解率达94.58%；能快速降解水体中的亚硝酸盐，在24h之内对含有32mg·L^-1亚硝酸盐的模拟废水中的亚硝酸盐降解率达99.99%；能快速降解水体中的氨氮，在48h之内对含有18mg·L^-1氨氮的模拟废水中的氨氮降解率达51.52%。

（4）菌株DB-33的发酵生产方法：

该菌剂发酵流程是：斜面菌种→活化→三角瓶液体菌种→塑料桶通气发酵→检验。

活化：配置DM固体培养基，灭菌后倒入90mm 培养皿内，待冷却后，接入保存的DB-33斜面菌株，30℃培养24h。其中DM固体培养基为：柠檬酸钠5 g，KNO₃  2 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO4·7H₂O 0.2 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂粉12g，pH7.2。

液体菌种：配置DM液体培养基，分装与三角瓶中，灭菌，待冷却后，挑取培养皿中活化后的菌株接入，30℃培养24h；其中DM液体培养基为：柠檬酸钠5 g，KNO₃  2 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO4·7H₂O 0.2 g，蒸馏水1 000 mL， pH7.2。

塑料桶通气发酵：用25L的塑料桶作培养装置，旧桶用1%的次氯酸钠溶液消毒，然后用清水冲洗，新桶可用清水清洗过直接使用。装入DM液体培养基20L ，接入三角瓶中的液体菌种，接菌量为20%，温度在25℃以上，用气泵（45w）接入沙头（2%的次氯酸钠溶液浸泡）通气，发酵时间24小时。

检验：发酵完成后通过稀释涂板法测定发发酵液中的菌数和杂菌数。测定菌数平均为16亿·mL^-1。在10^-7，10^-6两个稀释浓度下未发现杂菌。

DB-33的安全性评价

试验设对照、DB-33接种2个处理。每缸装水40 L，放养10条大小基本一致的鲫鱼（长约6～8 cm），平均每条鱼重10.75 g，投DB-33菌液1 L（菌液浓度为3×10⁸ cfu·mL^-1）。养鱼管理按日常管理，7 d投一次菌，试验周期30 d。

试验期间鱼苗进食正常，非常活跃，无浮头现象，所有处理未出现死亡现象。鱼的成活率均为100%，说明DB-33制剂对鱼苗是安全的。

本发明公开的高效的反硝化菌DB-33菌株所具有的有益效果在于：

（1）能够快速彻底的降解水体中的硝酸盐和亚硝酸盐，对氨氮也有较好的降解效果。

（2）由于其培养基的特殊性可以在非灭菌条件下生产，在增加其生产操作简便性的同时降低生产成本。

（3）对养殖生物无毒性，可以在环境污水处理，养殖池脱氮等多个领域使用。

附图说明： 

图1为DB-33对模拟养殖水中硝酸盐氮的降解效果；

图2为DB-33对模拟养殖水中亚硝酸盐氮的降解效果；

图3为DB-33对模拟养殖水中氨氮的降解效果；

图4为DB-33菌株的显微观察照片（1000×）。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。下面通过实例来进一步阐明高效水体脱氮施氏假单胞菌DB-33的制备方法。本发明所用到的试剂除特别指出外均有市售。

实施例1

菌株的分离，筛选和鉴定

（1）菌株分离：

样品采集：2007年10月采集天津市西青区鱼虾养殖池底泥样品。

样品富集：配置液体富集培养基:

DM培养基：柠檬酸钠5 g，KNO₃ 2 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO₄·7H2O  0.2 g，蒸馏水1 000 ml，pH7.2

将底泥样品取3-5g加入富集培养基中，30℃培养5d。

分离培养基

BTB(百里酚蓝)固体培养基：天冬酰胺1 g，KNO₃ 1 g，KH₂PO₄ 1 g，FeC1₂·6H₂O 0.5 g，CaC1₂-2H₂O 0.2 g，MgSO₄·7H₂O 1 g，琥珀酸钠8.5 g，琼脂15-18 g，l%溴百里酚兰（无水乙醇溶解）l mL，蒸馏水1 000 mL，pH 7～7.5

将富集后的菌液在分离培养基上进行划线分离，经过4-5次纯化后获得单菌株。

（2）优良菌株的筛选

筛选培养基

DM亚硝酸盐培养基：柠檬酸钠5 g，NaNO₂ 0.025 g（亚硝酸盐氮的含量为5 mg/L），KH₂PO₄ 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，去离子水1 000 mL，pH7.2

DM硝酸盐培养基：柠檬酸钠5 g，KNO₃ 0.721 8 g（硝酸盐氮的含量为100 mg/L），KH₂PO₄ 1 g，MgSO4·7H₂O 0.2 g，去离子水1 000 mL、pH7.2

DM氨氮培养基：柠檬酸钠5 g，(NH₄)₂SO₄  0.2g（氨氮的含量为20mg/L）KH₂PO₄ 1 g，MgSO4·7H₂O 0.2 g，去离子水1 000 mL、pH7.2

将多株单菌株接种到筛选培养基，定期测定其中的污染物含量，选择出降解能力强，降解速度快的菌株DB-33。

（3）菌株的鉴定：利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物16F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ 

16R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’ 做PCR扩增其16S rDNA并测序，将DB-33 16S rDNA序列到NCBI网站进行BLAST 序列比对，发现其与多株施氏假单胞菌的序列同源性达到99%，经鉴定，确定为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DB-33。

DB-33 16S rDNA序列：

TACCATGCAGTCGAGCGGATGAAGAGGGCTTGCTCTCTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTA

实施例2

DB-33菌株在模拟养殖废水中的脱氮效果

DB-33菌株对硝酸盐的降解效果

将玻璃容器中装2.5 L模拟养殖废水，调整硝态氮的初始浓度为138mg·L^-1，接入50 mL菌液后放置30 ℃培养箱中培养，以不加菌为对照，定时取样测水中硝酸盐的含量。结果如图1。

由图1可以看出，在水体中接入反硝化细菌，48 h内对硝酸盐浓度为138mg·L^-1模拟废水的降解率为94.58%，在72 h之内将亚硝酸盐完全降解，降解效果显著优于对照。

DB-33菌株对亚硝酸盐的降解效果

将玻璃容器中装2.5 L模拟养殖废水，调整亚硝态氮的初始浓度为32 mg·L^-1，接入50 mL菌液后放置30 ℃培养箱中培养，以不加菌为对照，定时取样测水中亚硝酸盐的含量。结果如图2。

由图2可以看出，在水体中接入反硝化细菌，24 h内对亚硝酸盐浓度为32 mg·L^-1模拟废水的降解率为99.9%，基本被完全降解，降解效果显著优于对照。

DB-33菌株对氨氮的降解效果

将玻璃容器中装2.5 L模拟养殖废水，调整氨氮的初始浓度为18 mg·L^-1，接入50 mL菌液后放置30 ℃培养箱中培养，以不加菌为对照，定时取样测水中亚硝酸盐的含量。结果如图3。

由图3可以看出，在水体中接入反硝化细菌，48 h内对氨氮浓度为18 mg·L^-1模拟废水的降解率为51.52%，降解效果显著优于对照。

实施例3 

DB-33菌株在开放条件下的发酵培养

活化：配置DM固体培养基，灭菌后倒入90mm 培养皿内，待冷却后，接入保存的DB-33斜面菌株，30℃培养24h。

制作液体菌种：配置DM液体培养基，分装与三角瓶中，灭菌，待冷却后，挑取培养皿中活化后的菌株接入，30℃培养24h。

塑料桶通气发酵：用25L的塑料桶作培养装置，旧桶用1%的次氯酸钠溶液消毒，然后用清水冲洗，新桶可用清水清洗过直接使用。装入DM液体培养基20L ，接入三角瓶中的液体菌种，接菌量为20%，温度在25℃以上，用气泵（45w）接入沙头（2%的次氯酸钠溶液浸泡）通气，发酵时间24小时。

检验：发酵完成后通过稀释涂板法测定发发酵液中的菌数和杂菌数。测定菌数平均为16亿·mL^-1。在10^-7，10^-6两个稀释浓度下未发现杂菌。

实施例4

DB-33的安全性评价

试验设对照、DB-33接种2个处理。每缸装水40 L，放养10条大小基本一致的鲫鱼（长约6～8 cm），平均每条鱼重10.75 g，投DB-33菌液1 L（菌液浓度为3*10⁸ cfu·mL^-1）。养鱼管理按日常管理，7 d投一次菌，试验周期30 d。

试验期间鱼苗进食正常，非常活跃，无浮头现象，所有处理未出现死亡现象。鱼的成活率均为100%，说明DB-33制剂对鱼苗是安全的。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  天津市农业生物技术研究中心

 

<120>  一种高效水体脱氮施氏假单胞菌DB-33及其培养方法

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1390

<212>  DNA

<213>  施氏假单胞菌

 

<400>  1

taccatgcag tcgagcggat gaagagggct tgctctctga ttcagcggcg gacgggtgag       60

 

taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg gacaacgttt cgaaaggaac gctaataccg       120

 

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agctagtcta                                                                          1390

 

 

Claims (1)

1.一种高效水体脱氮施氏假单胞菌DB-33的开放培养方法，其特征在于它包括斜面菌种、活化、液体菌种、塑料桶通气发酵、检验步骤；其中

斜面菌种：将施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DB-33，保藏号CGMCC No.5993 接种在含有DM固体培养基的斜面试管中，30℃培养24h，4℃冰箱中菌种保存，所述的DM固体培养基为：柠檬酸钠5g，KNO₃  2g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO4·7H₂O 0.2 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂粉12g，pH7.2；

活化：配置DM固体培养基，灭菌后倒入90mm 培养皿内，待冷却后，接入保存的DB-33斜面菌株，30℃培养24h； 

液体菌种：配置DM液体培养基，分装于三角瓶中，灭菌，待冷却后，挑取培养皿中活化后的菌株接入，30℃培养24h；所述的DM液体培养基为：柠檬酸钠5 g，KNO₃  2 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO4·7H₂O 0.2 g，蒸馏水1000 mL， pH7.2；

塑料桶通气发酵：用25L的塑料桶作培养装置，旧桶用1%的次氯酸钠溶液消毒，然后用清水冲洗，新桶可用清水清洗过直接使用；装入DM液体培养基20L ，接入三角瓶中的液体菌种，接菌量为20%，温度在25℃以上，用45w气泵接入2%的次氯酸钠溶液浸泡的沙头，通气，发酵时间24小时。

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