CN110938568B - 一株施氏假单胞菌菌株f2，其发酵液及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株F2，其保藏编号为CGMCC No.17258。本发明还提供含有所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵液的应用。本发明的F2菌株在18h能够将25mg/L的亚硝酸盐降解到0mg/L，具有优异的亚硝酸盐降解能力。将筛选到的施氏假单胞菌和腐殖酸配合使用，可以进一步显著提高水体中氨氮、亚硝酸盐的转化效率提升。本发明中施氏假单胞菌和腐殖酸都水产养殖中常用的非药品制剂，具有安全、生态的特点。

Description

一株施氏假单胞菌菌株F2，其发酵液及应用

技术领域

本发明涉及一株施氏假单胞菌及其应用。

背景技术

水产养殖过程由于高蛋白饲料和肥水产品的过渡使用，再加上水生动物以氨氮形式进行排泄，这几个方面造成了水体中氨氮、亚硝酸盐的含量过高，严重影响了水生动物的健康，给养殖造成很大的损失。氨氮、亚硝酸盐对水生动物的影响主要包含以下几个方面：降低水产动物机体内的供氧能力；干扰细胞内外的K⁺浓度使之失衡,从而破坏神经系统传输、骨骼肌收缩等功能，使水产动物活力下降；抑制免疫系统功能,降低水产动物对病原生物的抵抗力。氨氮、亚硝酸盐浓度超标严重降低了水产养殖的成功率。

目前去除水中的氨氮、亚硝酸常用的方法有物理法、化学法和生物法。

物理方法主要使用物理吸附，比如凹凸棒石、沸石粉等，物理方法仅是把水体中的氨氮、亚硝酸盐吸附在固体表面，并没有从根本上减少水体中氨氮、亚硝酸的总量，在温度、pH发生变化时，又会发生解吸附现象，水体中氨氮、亚硝酸盐的浓度又会重新升高。

化学方法去除氨氮、亚硝酸主要有离子交换、折点加氯等。离子交换需要将废水收集，通过离子交换树脂，将氨氮、亚硝酸离子进行置换，这种方法生产成本高、工艺复杂，仅适用于工业化养殖场所，使用推广范围有限。折点加氯需要使用到氯气，操作安全性上有很大风险，另外氯气在水体与水反应生产次氯酸对鱼虾等养殖动物危害性更大。因而化学方法在使用上存在成本高、范围小、安全性低等特点。

生物法主要是利用硝化细菌和反硝化细菌将氨氮、亚硝酸通过硝化和反硝化作用转化成氮气，因反应条件温和、又能减少水体中总氮含量，因而是最为安全有效的方法。目前生物法使用的硝化细菌和反硝化细菌存在生长速度慢、反应时间长、处理效率低的特点。因而，亟需筛选更加安全有效的微生物菌种来转化水体中氨氮、亚硝酸含量。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株F2，其保藏编号为CGMCC No.17258。

本发明的施氏假单胞菌F2菌株，分离自养殖水域的水样和泥样，具有显著的亚硝酸盐降解能力。

利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5’-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3’(SEQ ID No.2)和下游引物5’-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3’(SEQ ID No.3)扩增细菌16srRNA基因片段。经过测序得到该菌属于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，序列如SEQID No.1所示。

将筛选到的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)命名为F2，于2019年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.17258。

本发明还提供一种施氏假单胞菌菌株F2的发酵液。

其中，所述发酵液中，施氏假单胞菌菌株F2的活菌数为1.0×10⁸～10⁹cfu/mL。

在本发明一个优选的实施方案中，所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵液中添加腐殖酸和/或其盐，混合制成复合液体微生态制剂。

其中，所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵液与所述的腐殖酸和/或其盐的体积质量比(ml:g)为2:1-2。

本发明还提供所述的施氏假单胞菌菌株F2和/或所述的发酵液在降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐中的应用。

本发明还提供一种降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的方法，其为每亩使用所述的施氏假单胞菌菌株F2发酵液1000-2000mL，并配合使用500-1000g腐殖酸钠，每5-7天使用一次。

本发明还提供所述的施氏假单胞菌菌株F2的发酵方法，所用的液体发酵培养基组成为：蛋白胨8-15g/L，葡萄糖15-25g/L，乳糖0.1-0.5g/L，酵母粉1-5g/L，氯化钠1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，玉米浆粉0.1-0.5g/L；发酵条件：温度30-37℃，搅拌速率80-150rpm，通气比：1:0.2-0.5，培养时间20-24h，培养密度为1.0×10⁸～10⁹cfu/mL。

本发明的F2菌株在18h能够将25mg/L的亚硝酸盐降解到0mg/L，具有优异的亚硝酸盐降解能力。将筛选到的施氏假单胞菌和腐殖酸配合使用，可以进一步显著降低养殖水体中氨氮和亚硝酸的含量，并提高养殖动物的生长性能。本发明中施氏假单胞菌和腐殖酸都水产养殖中常用的非药品制剂，具有安全、生态的特点。

附图说明

图1所示为亚硝酸钠标准曲线图。

图2所示为不同菌株亚硝酸盐降解能力比较。

图3所示为施氏假单胞菌F2菌落照片。

图4所示为施氏假单胞菌F2显微镜下照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1亚硝酸盐的测定方法建立

(1)实验试剂：格利斯Ⅰ、格利斯Ⅱ、标准浓度的硝酸钠2.5mg/L。

A、格利斯溶液：

在加热下溶解0.5g对氨基苯磺酸于50mL 30％乙酸中，于暗处保存。将0.4g 1-萘酚与100mL水混合煮沸，在从蓝色渣滓中倾出的无色溶液中加入6mL 80％乙酸，放棕色瓶中保存。

B、标准浓度的NaNO₂配制：

Ⅰ、取0.10g NaNO₂溶解于蒸馏水中，定容，至1000mL，NaNO₂浓度为100mg/L。

Ⅱ、取(I)溶液5mL用蒸馏水稀释，定溶，至200mL，此时NaNO₂浓度为2.5mg/L。

(2)实验仪器：

酶标仪、96孔板、容量瓶，150mL三角瓶、量筒、移液枪

(3)实验原理

酸性条件下，亚硝酸盐与对-氨基苯磺酰胺反应，生成重氮盐，再与N-(1-萘基)-乙二胺偶联生成红色染料。在540nm波长处有最大吸收。

(4)测定方法：

A标准曲线制作：

向96孔板加入0μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL 2.5mg/L NaNO₂标准溶液，分别加入蒸馏水200μL、180μL、160μL、140μL、120μL、100μL，加入格利斯Ⅰ混匀，静止3min，加入格利斯Ⅱ混合均匀，在波长540nm处测吸光度，绘制标准曲线(见图1)

B样品测定：

水样中亚硝酸盐(按NO2^-计)浓度以mg/L表示，按下列计算

C＝M/V

式中：C-----------------水样中亚硝酸盐浓度mg/L

M----------------冲校准曲线上查得亚硝酸盐含量，μg

V-----------------取样体积

实施例2施氏假单胞菌F2的筛选

(1)LB培养基的配置：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g

(2)亚硝酸菌株的筛选：LB培养基中添加25mg/L的亚硝酸盐，将菌株接种到培养基中，培养24h，测定发酵液中剩余的亚硝酸盐的浓度，进而计算亚硝酸降解率。

降解率＝(25mg/L-发酵液中剩余亚硝酸浓度)/25mg/L*100％

(3)亚硝酸盐转化菌株能力的比较

采集了江苏、福建、河北地区养殖水域的水样和泥样，从30多个样品中分离到83株细菌，其中明显具有亚硝酸盐降解能力的有4株，分别为Hh01、1-1、F2和8#。

进一步比较了4株菌在48h内的亚硝酸盐转化能力。试验发现F2菌株在18h能够将25mg/L的亚硝酸盐降解到0mg/L，1-1和Hh01需要24h和48h，8#菌转化能力最弱。通过比较四株菌的降解能力，我们明确了将F2菌株作为亚硝盐降解菌株(见图2)。

F2菌株的菌落特征：菌落呈现淡黄色，中间有凸起，边缘有褶皱状，菌落表面较湿润(图3)。显微镜照片特征：菌体呈现短杆状，分布较为均匀，能被着色剂染色(图4)。

利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5’-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3’(SEQ ID No.2)和下游引物5’-ggt tacctt gtt acg act t-3’(SEQ ID No.3)扩增细菌16srRNA基因片段。经过测序得到F2菌株属于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，序列如SEQ ID No.1所示。

将筛选到的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)命名为F2，于2019年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.17258。

实施例3施氏假单胞菌F2与腐殖酸钠复合液体微生态制剂的制备

(1)发酵培养基：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，乳糖0.2g/L，酵母粉3g/L，氯化钠2.5g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，玉米浆粉0.2g/L，发酵条件：温度35℃，搅拌速率100r/min，通气比：1:0.35，培养时间20-24h。

(2)腐殖酸钠：含量≥70％～50％，水分含量≤10％，80目通过率≥85％。

(3)混合：F2培养液：腐殖酸＝1000mL:500g。将发酵液与腐殖酸钠混合均匀，制备成含水量40％左右的复合微生态制剂。

实施例4复合液体微生态制剂在水产养殖中降解亚硝酸的应用

试验塘水体面积3亩，平均水深1.5米，主养罗非鱼套养草鱼，共计放罗非鱼8000尾，草鱼400尾。对照塘水体面积3亩，平均水深1.5米，主养罗非鱼套样草鱼，放养密度同试验塘相当。两塘每天投喂量为1.5％，其他条件相当。试验塘共3口，再加对照塘1口，总共4口池塘，采用不同的试验处理。

表1试验塘和对照塘的处理方法

试验进行35天，每7天取水样，检测氨氮和亚硝酸含量，结果如表2所示。

表2试验塘和对照塘H₄N⁺和NO₂ ^-浓度(mg/L)

从表2中可以看出，试验塘1采用施氏假单胞菌F2和腐殖酸钠配合使用时，能够显著降低氨氮和亚硝酸盐含量，并且一直维持在较低水体。试验塘2和试验塘3单独使用施氏假单胞菌F2和腐殖酸钠时，降低效果都较试验塘1差，并且单独使用腐殖酸钠，对亚硝酸盐的降解效果不显著。跟试验塘4(市售宝来利来化毒丹)比较，试验塘1(复合微生态制剂)明显优于市场同类型产品。

表3试验塘和对照塘罗非鱼和草鱼生长性能(g/条)

从表3中可以看出，试验塘1中罗非鱼和草鱼的生长情况较对照塘和其他试验塘显著提高，试验结束时，两种鱼的体重最重。另外试验塘2、试验塘3和试验塘4较对照塘生长情况也有所改善，但是改善情况显著不如试验塘1明显。

从本次生长养殖试验中可以看出，(1)单独使用施氏假单胞菌F2发酵液和腐殖酸钠时，水体的氨氮的降解率较对照塘有所提高；F2对亚硝酸盐的降解也显著高于对照塘口，但是单独使用腐殖酸钠时亚硝酸盐的降解效率并未提高。(2)当施氏假单胞菌F2和腐殖酸钠配合使用时，亚硝酸盐和氨氮的降解率显著高于对照塘口，也优于两种产品单独使用时的效果。(3)施氏假单胞菌F2和腐殖酸钠配合使用时，罗非鱼和草鱼的生长情况优于两种产品单独使用和对照塘口。(4)跟市售产品(化毒丹)相比，试验1组(施氏假单胞菌和腐殖酸钠复合产品)罗非鱼和草鱼的生长性能显著优于试验组4，说明本发明提供的产品和使用方法具有显著的优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建大北农水产科技有限公司，北京大北农科技集团股份有限公司，天津昌农科技有限责任公司

<120> 一株施氏假单胞菌菌株F2_，其发酵液及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1429

<212> DNA

<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

<400> 1

atctcgtggt accgtcctcc cgaaggttag actagctact tctggagcaa cccactccca 60

tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgtgaca ttctgattca 120

cgattactag cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc ggactacgat 180

cggttttatg ggattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctttgtaccg accattgtag 240

cacgtgtgta gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc 300

ggtttgtcac cggcagtctc cttagagtgc ccaccatcac gtgctggtaa ctaaggacaa 360

gggttgcgct cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat 420

gcagcacctg tgtcagagtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tctctgcatg 480

tcaaggcctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 540

gcgggccccc gtcaattcat ttgagtttta accttgcggc cgtactcccc aggcggtcga 600

cttaatgcgt tagctgcgcc actaagatct caaggatccc aacggctagt cgacatcgtt 660

tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcacctcagt 720

gtcagtatta gcccaggtgg tcgccttcgc cactggtgtt ccttcctata tctacgcatt 780

tcaccgctac acaggaaatt ccaccaccct ctgccatact ctagcttgcc agttttggat 840

gcagttccca ggttgagccc ggggctttca catccaactt aacaaaccac ctacgcgcgc 900

tttacgccca gtaattccga ttaacgcttg cacccttcgt attaccgcgg ctgctggcac 960

gaagttagcc ggtgcttatt ctgtcggtaa cgtcaaaaca gcaaggtatt aacttactgc 1020

ccttcctccc aacttaaagt gctttacaat ccgaagacct tcttcacaca cgcggcatgg 1080

ctggatcagg ctttcgccca ttgtccaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg 1140

gaccgtgtct cagttccagt gtgactgatc atcctctcag accagttacg gatcgtcgcc 1200

ttggtgagcc attacctcac caactagcta atccgaccta ggctcatctg atagcgcaag 1260

gcccgaaggt cccctgcttt ctcccgtagg acgtatgcgg tattagcgtt cctttcgaaa 1320

cgttgtcccc cactaccagg cagattccta ggcattactc acccgtccgc cgctgaatca 1380

tggagcaagc tccactcatc cgctcgactg catgtgtagt ctgccgccc 1429

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (2)

1.一种用于降低养殖水体中亚硝酸盐的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂由施氏假单胞菌菌株的发酵液和腐殖酸盐制成；所述施氏假单胞菌菌株的保藏编号为CGMCCNo.17258；所述施氏假单胞菌菌株发酵液的活菌数为1.0×10⁸～10⁹cfu/mL；所述的施氏假单胞菌菌株的发酵液与所述的腐殖酸盐的体积质量比(ml:g)为2:（1-2），所述液体制剂的含水量为40％。

2.根据权利要求1所述的用于降低养殖水体中亚硝酸盐的液体制剂，其特征在于，所述施氏假单胞菌菌株的16s rRNA 基因序列如SEQ ID No.1所示。

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