CN103773723B

CN103773723B - 一种耐盐并具有低温生物脱氮功能的施氏假单胞菌

Info

Publication number: CN103773723B
Application number: CN201410022561.1A
Authority: CN
Inventors: 周长林; 贾源宾; 张宁
Original assignee: Nanjing Yaodong Energy-Saving Environment Protection Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Yaodong Energy-Saving Environment Protection Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: CN103773723A

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种具有低温脱硝生物学活性的细菌，其特征是：它是施氏假单胞菌DN-3，拉丁名：Pseudomonas？stutzeri。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC？No.8291，保藏时间：2013年10月08日。本发明还涉及培养该细菌的方法，以该菌为主要组成成分的生物脱硝剂的制备，及其在水体氮素降解中的应用。

Description

一种耐盐并具有低温生物脱氮功能的施氏假单胞菌

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种具有低温脱硝生物学活性的细菌，培养该细菌的方法，以该菌为主要组成成分的生物脱硝剂的制备，及其在水体氮素降解中的应用。

背景技术

近年来，随着氮肥的使用及高密度水产养殖的发展，带来巨大经济效益，但同时也造成了严重的环境问题。因氮磷元素含量过高而造成的富营养化情况在水产养殖中频繁出现，导致水质恶化及生物平衡遭到破坏外，其中的氨氮和亚硝态氮对养殖动物还具有较强毒性，特别是亚硝态氮，其在养殖条件下转化速率过低使得水体中的亚硝酸盐积累量过高，尤其是大雨过后，亚硝酸盐含量极其容易超标，由此造成的水产养殖动物病害甚至死亡现象已多见报道。如在对虾养殖中，亚硝酸盐含量超过0.1ppm达到0.3ppm以上时，很容易造成对虾中毒，且不易抢救。传统上采用活性污泥直接投入，后又采用固定化光合细菌进行脱氮处理。人们曾利用硝化菌群除氮，但是硝化作用的最终产物是硝酸盐，会破坏生物圈氮素的平衡且该产物能诱发人类的高铁血红蛋白症。由于在鱼虾养殖过程中必须充氧来保证水中的溶解氧量，那么厌氧反硝化细菌的脱氮作用也不能得到充分发挥。因此，人们将注意力转移到好氧反硝化细菌，因为其可以在有氧条件下进行反硝化将硝酸盐和亚硝酸盐转化成气态氮，与传统的生物脱氮工艺相比，好氧反硝化细菌的出现可以使生物脱氮在同一反应器中完成，实现真正意义上的同步硝化反硝化。目前关于利用好氧反硝化细菌实现的生物脱氮已经有成功应用的报道。利用好氧反硝化细菌发展好氧脱氮技术具有以下几个优点：第一﹑使硝化-反硝化反应在同一个反应器中进行，可以大大减少占地面积和建设资金；第二﹑使用好氧反硝化细菌可以减少处理过程中加入调节系统pH的化学物质，降低成本；第三﹑在处理过程中好氧反硝化细菌更容易控制。

目前已报道的好氧反硝化细菌大多存在亚硝态氮的脱除能力不强，温度对脱除效率影响大（25℃以下脱除效率不高），缺乏对高浓度的亚硝酸盐的耐受性，菌株在高盐度水体中脱氮活性低，处理时间过长，效率不高等问题。

发明内容

本发明公开了一株具有低温脱氮生物活性细菌，该细菌具有较高的反硝化活性和单株亚硝态氮脱除能力。这类菌株是好氧反硝化细菌，在低温条件下即能有效地将NO₂ ^--N直接转化成菌体的自身组成物质，也能将NO₂ ^--N通过反硝化作用转化为各种氮元素的气体形式如NO，N₂O和N₂等逸出。更具体地，这类细菌是施氏假单胞菌DN-3，分类命名：施氏假单胞菌，拉丁名：Pseudomonasstutzeri。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.8291，保藏时间：2013年10月08日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明以现有的常温脱硝菌施氏假单胞菌DN-2（保藏号：CGMCCNo.2917）为原始菌，经长期反复低温驯化﹑活性检验，获得了具有低温脱硝活性的菌株DN-3。具体地，对常温脱硝菌在18℃的温度下进行低温驯化，每一阶段驯化后的细菌都进行脱亚硝态氮活性的测定。

本发明的施氏假单胞菌DN-3可以在15～30℃、90～150r/min的摇瓶转速、pH7.0～10.0的条件下，在每升含0.5～4.0gNaNO₂，2～10gCH₃COONa，0.01～0.05gMgSO₄，0.01～0.05gMnSO₄，0.01～0.05gFeSO₄，0.5～1.0gK₂HPO₄，0.1～0.5gNaH₂PO₄的培养基中培养。

更优选的培养条件是：施氏假单胞菌DN-3在30℃、120r/min的摇瓶转速、pH8.5条件下，在每升含0.5gNaNO₂，5gCH₃COONa，0.03gMgSO₄，0.01gMnSO₄，0.01gFeSO₄，0.75gK₂HPO₄，0.25gNaH₂PO₄的培养基中培养。

本发明公开了一种大规模高密度培养施氏假单胞菌DN-3的方法：在30℃，80～120r/min的搅拌转速，0.04～0.06vvm的通气量，3～6%的接菌量，初始pH8.5的条件下发酵罐培养细菌。优选的方法为在30℃、100r/min的搅拌转速、0.05vvm的通气量、5%的接菌量，初始pH8.5的条件下发酵罐培养细菌。

本发明的施氏假单胞菌DN-3是具有出色的亚硝态氮脱除能力的细菌，在常规的生长条件下就可表现出反硝化活性，在合适的pH值、温度、唯一碳源、C/N比等组合培养条件下，施氏假单胞菌DN-3能体现更强的亚硝态氮脱除能力。

施氏假单胞菌DN-3的培养及亚硝态氮还原活性：

好氧反硝化细菌为异养菌，因此在培养过程中须添加有机碳源才能正常生长和进行反硝化作用。在反硝化培养基中，分别以5.0g/L乙酸钠、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖和可溶性淀粉为唯一碳源，0.5g/LNaNO₂为唯一氮源时，30℃，120rpm摇床培养12h后，萘乙二胺法定量测定残余NO₂ ^--N的浓度，考查其对还原活性的影响，见表1。

表1不同碳源培养时的NO₂ ^--N还原率（12h）

还原率为被脱除的亚硝酸盐的浓度与初始培养基中亚硝酸盐的浓度的比值。

从反硝化琼脂斜面上接两环菌苔装入有100ml反硝化培养基的250ml锥形瓶中，在30℃，120～130rpm摇床培养12h。按5%接种量接种，将5ml种子培养液转移至装有100ml反硝化培养基的250ml锥形瓶中。溶氧，即摇床转速分别为60、90、120、150、180rpm；培养基初始pH分别为6、7、7.5、8、8.5、9、10；通过改变乙酸钠浓度来改变C/N（摩尔比）分别为1、4、8、12、16、20；初始NaNO₂浓度分别为0.5、1、2、3、4、5g/L（以乙酸钠为唯一碳源，同时保持C/N为12）。设不接种对照组，每组实验均为三个重复。对于不同初始pH组和不同初始NaNO₂浓度组均每2h取样，其余均12h后取样，12,000g离心1min，萘乙二胺法定量测定残余NO₂ ^--N的浓度，并计算NO₂ ^--N的还原率。结果见表2，附图1，表3，附图2。

表2不同转速培养时的NO₂ ^--N还原率（12h）

表3不同C/N培养时的NO₂ ^--N还原率（12h）

好氧反硝化细菌为异养菌，须添加有机碳源才能正常生长和进行反硝化作用。实验表明，菌株以乙酸钠为碳源时，培养12h后NO₂ ^--N全部被还原，即最适碳源为乙酸钠。初始pH等因素都对菌体脱除亚硝态氮的作用有很大的影响。培养温度为30℃时，菌株适宜在偏碱性的条件下生长和进行反硝化作用，见图1。C/N不低于12时，培养12h后NO₂ ^--N全部被还原，菌体生长和反硝化作用不再受碳源限制。这与目前研究所表明的过剩的碳源基质有利于高活性的好氧反硝化相一致。

此外，菌株在初始NaNO₂浓度不高于4g/L时，对还原活性影响不大，初始NaNO₂浓度高于5g/L时，会抑制菌株的生长而影响其还原活性，见图2。

施氏假单胞菌DN-3菌株达到最佳的生长状态和最高亚硝态氮还原速率的条件为：初始pH8.5，以乙酸钠为唯一碳源，并维持C/N比（mol/mol）为12，初始NaNO₂浓度2.0g/L，摇瓶转速120rpm条件下培养细菌。由于初始NaNO₂浓度为2.0g/L时，还原全部亚硝态氮所需的时间为20h，而初始NaNO₂浓度0.5g/L时则只需10h左右，且已经能完全满足菌体的生长，因此后续实验中初始NaNO₂浓度定为0.5g/L。

对本发明施氏假单胞菌DN-3进行大规模高密度培养后，优选通过12,000g、4℃离心10min收获菌体，重悬于5～30%的脱脂牛奶，冻干成冻干粉使用。

本发明公开了一种对水体进行生物脱氮的方法，包括：将菌体冻干粉直接投入淡水养殖水体，使其终浓度为2×10⁶～5×10⁶CFU/m³。优选使其终浓度为2.6×10⁶CFU/m³。本发明的施氏假单胞菌DN-3在低温的生长条件下就可表现出脱硝活性。

本发明的施氏假单胞菌DN-3是一株好氧异养微生物，它能对富营养化水体，特别是含亚硝酸盐的水体进行氮素无害化生物处理，经施氏假单胞菌DN-3生物处理的淡水养殖水体达到对淡水鱼虾类相对安全的水平。施氏假单胞菌DN-3的水体无害化处理是在有氧条件下进行的，不需要特殊的设备和额外的处理条件，亚硝态氮被大量转化为菌体自身的组成物质以及对环境无害的氮气，细菌可以作为鱼类的食物从而循环进入食物链，从而在实现环境保护的同时，真正做到了能源和物质的无害、合理再循环。

本发明公开了一种对含亚硝态氮废水进行生物脱氮的方法，本发明中具有亚硝态氮脱除能力的施氏假单胞菌DN-3可加入到含亚硝态氮废水中，在自然环境15～20℃静止或搅拌状态下，2～3天后，可脱除水体亚硝态氮的90～95%。

附图说明

图1是初始pH对菌株亚硝酸盐还原活性的影响

图2是初始NaNO₂浓度对菌株亚硝酸盐还原活性的影响

图3是DN-3在不同温度下的亚硝酸盐脱除率

图4是每阶段驯化结束的菌株与原始菌株脱亚硝活性对比

图5是10L发酵罐培养时DN-3菌浓变化情况

图6是NaCl对菌株亚硝酸盐还原活性的影响

图7是金属离子Co²⁺/Cu²⁺对菌株亚硝酸盐还原活性的影响

图8是DN-3在实际养殖水体中的应用

具体实施方式

各实施例中培养基和试剂的配制：

驯化培养基：0.5g/LNaNO₂，5.0g/LCH₃COONa，0.03g/LMgSO₄，0.01g/LMnSO₄，0.01g/LFeSO₄，0.75g/LK₂HPO₄，0.25g/LNaH₂PO₄，pH8.5，121℃灭菌20min。

N-（1-萘基）-乙二胺光度法试剂：于500ml烧杯内，加入250ml水和50ml磷酸，加入20.0g对氨基苯磺酰胺，再将1.00gN-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐溶于上述溶液中，转移至500ml容量瓶中，用水稀释至标线，混匀，贮存于棕色瓶中，保存在2～5℃，稳定一个月。

反硝化培养基：0.5g/LNaNO₂，5.0g/LCH₃COONa，0.03g/LMgSO₄，0.01g/LMnSO₄，0.01g/LFeSO₄，0.75g/LK₂HPO₄，0.25g/LNaH₂PO₄，12g/L琼脂粉，pH8.5，121℃灭菌20min。

种子培养基：0.5g/LNaNO₂，5.0g/LCH₃COONa，0.03g/LMgSO₄，0.01g/LMnSO₄，0.01g/LFeSO₄，0.75g/LK₂HPO₄，0.25g/LNaH₂PO₄，pH8.5，121℃灭菌20min。

实施例1

驯化获得具有低温脱硝功能的施氏假单胞菌DN-3

原始菌株来源：一株具有常温脱硝功能的施氏假单胞菌DN-2，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供，保藏号：CGMCCNo.2917。

低温驯化：按10%接种量将菌液10mL接种至装有90mL驯化培养基的500mL三角瓶中，18℃，120r/min振荡培养，并在三角瓶中装几粒玻璃珠，尽量减小厌氧微环境对试验结果的影响，培养周期为2天，每4个周期为1个阶段，每阶段结束后通过N-（1-萘基）-乙二胺光度法检测培养基内的亚硝酸盐浓度，直到获得亚硝酸盐脱除率能在95%及以上的细菌为止。结果：在18℃下，第九阶段的驯化结束后获得的菌株DN-3在培养周期内的亚硝酸盐脱除率能达到99%以上，见图4，命名施氏假单胞菌DN-3，分类命名：施氏假单胞菌，拉丁名：Pseudomonasstutzeri。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.8291，保藏时间：2013年10月08日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例2

施氏假单胞菌DN-3在不同温度下的脱亚硝态氮情况

施氏假单胞菌DN-3接种到反硝化培养基中于摇床培养24h，使菌体量达到10⁹CFU/mL以上（采用活菌计数法测定施氏假单胞菌菌浓）。菌体经离心生理盐水漂洗三次后，弃上清，加等体积的生理盐水悬浮菌体，将菌悬液以1%的接种量（体积比）接种至亚硝态氮浓度为330mg/L的反硝化培养基，将培养温度分别设为10﹑15﹑20、25、30℃，pH7.0、120r/min摇床培养；48h后测定亚硝态氮脱除率，结果见图3。由图3可以看出，DN-3在15～30℃的温度范围内的亚硝态氮脱除率都可以达到100%，在10℃的温度下的亚硝态氮脱除率也能维持在80%。

实施例3

施氏假单胞菌DN-3的发酵罐大规模培养

从反硝化琼脂斜面上接施氏假单胞菌DN-3两环菌苔装入有100ml反硝化培养基的500ml锥形瓶中，30℃，120rpm摇床培养12h。按5%接种量，将500ml种子培养基接种至装有9.5L发酵培养基的10L发酵罐中。根据摇瓶实验的研究结果，发酵罐的培养条件：30℃、搅拌转速100r/min、通气量0.05vvm、接菌量5%，发酵培养基组成：0.5g/LNaNO₂，5.0g/LCH₃COONa，0.03g/LMgSO₄，0.01g/LMnSO₄，0.01g/LFeSO₄，0.75g/LK₂HPO₄，0.25g/LNaH₂PO₄，初始pH调节至8.5。培养24h后，经活菌技术法测定菌浓，其浓度达到最大值1.2×10¹¹CFU/mL，见图5，随后菌株生长进入平台期。

实施例4

冻干粉制备

按照实施例3，将发酵罐培养24小时的施氏假单胞菌DN-3菌体通过12,000g，在4℃下离心15min收集，接着悬浮于含有15%脱脂奶粉的400mL发酵液，最后冻干。冻干程序设置为第一段：-30℃，240min（4h）；第二段：-10℃，600min（10h）；第三段：0℃，960min（16h）；第四段：4℃，360min（6h）。

发酵罐制备出的菌体冻干粉制剂活菌浓度为1.0×10⁹CFU/g，总重约64g。

实施例5

施氏假单胞菌DN-3在水体中的脱氮

1、不同浓度的NaCl下，施氏假单胞菌DN-3在水体中的脱氮效果：

从反硝化琼脂斜面上接两环菌苔装入有100ml反硝化培养基的500ml锥形瓶中，在30℃，120rpm摇床培养12h。按5%接种量接种，将5ml种子培养液转移至装有100ml反硝化培养基的500ml锥形瓶中。反硝化培养基中NaCl浓度分别为0，1，2，3，4%，施氏假单胞菌DN-3在水体中的脱氮效果见图6。

结果表明，NaCl浓度对菌株的还原活性没有明显影响；水产养殖的水体中存在一定的盐浓度，淡水盐浓度一般不超过0.5%，海水平均盐浓度为3.5%。综上，菌株可以适应海水的高盐浓度，可快速去除水体中的亚硝酸盐。

2、一定浓度的重金属离子下，施氏假单胞菌DN-3在水体中的脱氮效果：

从反硝化琼脂斜面上接两环菌苔装入有100ml反硝化培养基的500ml锥形瓶中，在30℃，120rpm摇床培养12h。按5%接种量接种，将5ml种子培养液转移至装有100ml反硝化培养基的500ml锥形瓶中。培养8h时，分别加入经膜过滤除菌的2.5mM的Co²⁺和Cu²⁺溶液，施氏假单胞菌DN-3在水体中的脱氮效果见图7。

结果表明，2.5mM的Co²⁺和Cu²⁺能明显抑制菌株对亚硝态氮的还原。因此，当水体中存在高浓度的重金属离子时，应先对水体进行处理除去过高的重金属离子，再使用施氏假单胞菌DN-3脱氮。

实施例6

施氏假单胞菌DN-3在实际养殖水体中的亚硝态氮脱除能力

将按照实施例4方法制备的菌体冻干粉(1.0×10⁹CFU/g)直接投入海水养殖池塘，菌体的投入量5×10⁵CFU/m³，每天以乙二胺光度法测定池塘水体的亚硝态氮含量。

结果表明，在水温16℃、pH7.8的水体环境下，水中NO₂ ^--N从菌体投放后的第2天开始下降，到第4天时已由0.38mg/L下降至0.08mg/L，见图8，施氏假单胞菌降解亚硝态氮的效果非常明显，能在不采取其他方法的情况下，较快地将水体亚硝态氮降解至对鱼虾相对安全的水平。在整个观察过程中，pH在7.6～7.9的范围间波动，这个范围适合施氏假单胞菌的生长。

Claims

1.一种施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)菌株，其保藏号为：CGMCCNo.8291。

2.一种培养权利要求1的施氏假单胞菌的方法，包括：在15～30℃，90～150rpm的摇瓶转速，pH7.0～10.0条件下，在每升含0.5～4.0gNaNO₂、2～10gCH₃COONa、0.01～0.05gMgSO₄、0.01～0.05gMnSO₄、0.01～0.05gFeSO₄、0.5～1.0gK₂HPO₄和0.1～0.5gNaH₂PO₄的培养基中进行培养。

3.权利要求2的方法，包括：在30℃，120rpm的摇瓶转速，pH8.5的条件下，在每升含0.5gNaNO₂、5gCH₃COONa、0.03gMgSO₄、0.01gMnSO₄、0.01gFeSO₄、0.75gK₂HPO₄和0.25gNaH₂PO₄的培养基中培养。

4.一种规模化培养权利要求1的施氏假单胞菌的方法，包括：在30℃，80～120r/min的搅拌转速，0.04～0.06vvm的通气量，3～6％的接菌量，初始pH8.5的条件下，发酵罐培养细菌，所述百分比为重量百分比。

5.权利要求4的方法，包括：在30℃ 、100r/min的搅拌转速、0.05vvm的通气量、5％的接菌量、初始pH8.5的条件下发酵罐培养细菌。

6.权利要求1的施氏假单胞菌在脱除水体中的亚硝态氮中的应用。

7.一种脱除水体中的亚硝态氮的方法，包括：将权利要求1的施氏假单胞菌培养后，悬浮于脱脂牛奶并冻干，将冻干粉直接投入水体，在自然环境pH7～9，培养3～4天后，即可脱除水体的亚硝态氮。

8.权利要求7的方法：包括将权利要求1的施氏假单胞菌培养后，悬浮于脱脂牛奶并冻干，将冻干粉直接投入水体，菌体的投入量为10⁵～10⁶CFU/m³，在自然环境pH7～9，温度15～20℃，培养3～4天后，即可脱除水体中的亚硝态氮。