CN113265347B - 一株黄色杆菌t21及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株黄色杆菌T21及其应用。该菌于2021年1月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No:61462。本发明的黄色杆菌Xanthobactersp.T21是通过以TCEP为唯一碳源而富集获得，能高效降解TCEP，且具有较强的环境适应能力，在温度范围20℃‑40℃，pH范围4‑9条件下均表现出对TCEP的降解。在中性偏碱条件下，对50mg/L TCEP的降解效率30分钟内可达80‑98％本发明的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21对TCEP具有高效降解能力，应用于有机磷酸酯污染的生态修复潜力巨大。

Description

一株黄色杆菌T21及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株具有高效降解磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)功能的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21及其应用。
背景技术
有机磷酸酯作为溴系阻燃剂的替代品，近年来被广泛应用于建筑材料、电子器材、家庭装饰品中，产量逐年上升，使用范围大大增加。目前，各种环境介质中普遍检出有机磷酸酯污染，包括地表水、沉积物、及室内环境。有机磷酸酯及代谢产物在生物体内(鱼类、鸟类)和人体样品(尿液、母乳、血液)中也均有检出。近十年来，有机磷酸酯对公共健康和生态环境的影响在全球范围内受到广泛关注。毒理研究发现，含氯有机磷酸酯磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)具有神经毒性。与其他不含氯有机磷酸酯相比，TCEP更难通过生物和非生物过程发生降解，在城市污水处理系统中的去除率则非常低。大量有机磷酸酯残留通过污水处理系统的出水和活性污泥进入水环境和土壤环境，给公众健康和生态系统造成了潜在风险。2015年，欧盟已基本禁止TCEP的使用。2019年，美国有毒物质控制法(Toxic SubstancesControl Act，TSCA)提议TCEP为优控污染物(high priority chemicals)。
有机磷酸酯可通过碱催化、金属(氢)氧化物催化、光降解等途径发生降解转化。微生物降解是污染物进入环境后重要的消减途径之一，也是一类性价比较高且对环境友好的污染修复手段。有机磷酸酯可在微生物作用下发生水解，但TCEP由于其理化性质，较难被微生物降解。因此，非常有必要开展针对TCEP的生物降解和生物修复研究。本专利旨在通过分离获得高效TCEP降解菌，为TCEP污染场地的生物修复提供微生物资源。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有高效降解TCEP功能的黄色杆菌Xanthobactersp.T21及其应用。
其中，所述的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21于2021年1月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59楼5楼，保藏编号：GDMCC No:61462。
本发明的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21对TCEP具有高效降解作用。
通过液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)方法，对黄色杆菌T21的TCEP降解效率进行测定。结果显示黄色杆菌T21对TCEP的降解效率为100％。
因此，本发明的第二个目的是提供权所述的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21在降解有机磷酸酯中的应用。
所述的有机磷酸酯优选为磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)。
本发明的第三个目的是提供所述的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21在制备有机磷酸酯降解剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21在有机磷酸酯污染的生物修复治理中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21是通过以TCEP为唯一碳源而富集获得，能高效降解TCEP，且具有较强的环境适应能力，在温度范围20℃-40℃，pH范围4-9条件下均表现出对TCEP的降解。在中性偏碱条件下，对50mg/L TCEP的降解效率30分钟内可达80-98％本发明的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21对TCEP具有高效降解能力，应用于有机磷酸酯污染的生态修复潜力巨大。
附图说明
图1是黄色杆菌Xanthobacter sp.T21基于16S rRNA基因的系统进化发育树。
图2是黄色杆菌T21对TCEP的降解动力学曲线(n＝3)。
图3是温度对黄色杆菌T21降解TCEP的影响(n＝3)。
图4是pH对黄色杆菌T21降解TCEP的影响(n＝3)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、菌株T21的分离和纯化
用于分离微生物的底泥样品(即沉积物)来源于河北某有机磷酸酯阻燃剂生产厂家附近。
首先用无机盐培养基(MSM)对沉积物进行富集培养，具体步骤如下：取10g沉积物加入装有90mL无机盐培养基的250mL锥形瓶中，加入5mg/L TCEP为唯一碳源，放置摇床，25℃，120rpm培养。待TCEP降解完全后，加入TCEP至浓度为50mg/L继续培养。待TCEP降解完全后，按体积比1％比例转接至新的无机盐培养基中，转接后加入50mg/L TCEP为唯一碳源，放置摇床，25℃，120rpm培养。待TCEP降解完全后，加入50mg/L TCEP继续培养，重复培养、待TCEP降解完全后加入TCEP步骤多次，至pH降低至6.5。按体积比1％比例转接至新的无机盐培养基中，放置摇床，25℃，120rpm培养7d后再次重复上述转接、培养步骤5次，获得稳定的无泥TCEP降解混菌体系。无机盐培养基成分为：每升含有(NH4)2SO4 1g、K2HPO4 4.11g、KH2PO4 0.95g、MgSO4 0.2g、MnSO4·H2O 3mg、ZnSO4·7H2O 1mg、CoSO4·7H2O 1mg、(NH4)6Mo7O24·4H2O 1mg、FeSO4·7H2O 12mg和CaCl2·2H2O 0.1g，余量为蒸馏水，pH为7。
取1mL上述的无泥TCEP降解混菌体系，用无机盐培养基进行梯度稀释后，在涂抹了50mg/L TCEP的MSM平板上涂布，将涂布后的平板放置25℃培养。待菌落长出后，挑取单菌落，在涂抹了50mg/L TCEP的MSM平板上反复划线，挑取单菌落获得菌株T21。MSM平板即无机盐培养基加入15g/L琼脂倒平板制得。
2、菌株T21的分子生物学鉴定。
提取步骤1分离纯化的菌株T21的基因组DNA，以通用引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对其16S rRNA基因片段进行扩增。PCR反应体系如表1所示。将16S rRNA基因测序结果(如SEQ ID NO.1所示)与RDP数据库比对，其分类为黄色杆菌属，与该数据库中最相近的序列是黄色杆菌Xanthobacter sp.MN 45(AJ313028)，相似度99.93％，将菌株T21命名为黄色杆菌Xanthobacter sp.T21。黄色杆菌T21的16S rRNA基因系统进化发育树见图1。
表1、PCR反应体系
Figure BDA0003005909580000041
实施例2黄色杆菌T21降解TCEP的效率测定
将黄色杆菌T21接种至LB培养基，25℃，120rpm培养至OD600约为0.1，获得菌液，离心收集菌体，用无机盐培养基(同实施例1)清洗3遍后，重悬于两倍菌液体积的无机盐培养基(同实施例1)，加入50mg/L TCEP，25℃，120rpm培养。另设没有加入黄色杆菌T21的对照组。每个实验组包含三个重复样品。结果显示，50mg/L TCEP在120分钟内降解率为100％，半速率常数为22.4分钟。未加入菌株T21的对照组没有发生TCEP降解。降解动力学曲线如图2所示。
实施例3温度和pH对黄色杆菌T21降解率的影响
将黄色杆菌T21接种至LB培养基，25℃，120rpm培养至OD600约为0.1，获得菌液，离心收集菌体，用无机盐培养基(同实施例1)清洗3遍后，重悬于菌液等体积的无机盐培养基(同实施例1)，加入50mg/L TCEP，设置不同梯度培养温度(20℃，25℃，30℃，35℃，40℃)，120rpm震荡培养30分钟后取样测定剩余TCEP浓度。每个培养条件包含三个重复样品。
将黄色杆菌T21接种至LB培养基，25℃，120rpm培养至OD600约为0.1，获得菌液，离心收集菌体，用无机盐培养基(同实施例1)清洗3遍后，重悬于菌液等体积的无机盐培养基(同实施例1)，加入50mg/L TCEP，设置不同梯度pH(4，5，6，7，8，9)，25℃，120rpm震荡培养30分钟后取样测定剩余TCEP浓度。每个培养条件包含三个重复样品。
结果显示，TCEP降解率随温度升高而升高(图3)。20℃条件下培养30分钟后TCEP降解率为71.6％，40℃条件下培养30分钟后TCEP降解率为98.3％。由此可见黄色杆菌T21对温度的适应范围较广。
黄色杆菌T21对TCEP的降解率也随pH升高而升高(图4)。pH 4时，25℃条件下培养30分钟后TCEP降解率为29.0％；中性条件pH 7时，TCEP降解率为79.6％；碱性条件下(pH＝8，9)，TCEP降解率可达98％。由此可见，黄色杆菌T21喜好偏碱性条件，在酸性条件下TCEP降解能力降低。
综上所述，本发明的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21具有较强的环境适应能力。在20℃-40℃条件下均表现出较强的TCEP降解能力，且降解效率随温度升高而升高。在较广的pH范围内(pH 4-9)均表现出对TCEP的降解，在中性偏碱(pH 7-9)条件下降解能力更强。因此在TCEP的生物修复治理中具有巨大潜力。
序列表
<110> 中国科学院广州地球化学研究所
<120> 一株黄色杆菌T21及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1354
<212> DNA
<213> 黄色杆菌T21(Xanthobacter sp. T21)
<400> 3
tgcagtcgag cgcccagcaa tgggagcggc agacgggtga gtaacacgtg gggatctacc 60
caatggtacg gaataaccca gggaaacttg gattaatacc gtatgtgccc ttcgggggaa 120
agatttatcg ccattggatg aacccgcgtc ggattagcta gttggtgagg taaaggctca 180
ccaaggcgac gatccgtagc tggtctgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac 240
ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg caagcctgat 300
ccagccatgc cgcgtgagtg atgaaggcct tagggttgta aagctctttc gccggtgaag 360
ataatgacgg taaccggaga agaagccccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata 420
cgaagggggc tagcgttgct cggaatcact gggcgtaaag cgcacgtagg cggatcgtta 480
agtcaggggt gaaatcctgg agctcaactc cagaactgcc cttgatactg gcgatctcga 540
gttcgagaga ggttggtgga actccgagtg tagaggtgaa attcgtagat attcggaaga 600
acaccagtgg cgaaggcggc caactggctc gatactgacg ctgaggtgcg aaagcgtggg 660
gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatggatg ctagccggtt 720
gggggggttt acctctcagt ggcgcagcta acgccttaag catcccgcct gggggagtac 780
ggtcgcaaga ttaaaactca agggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 840
gtttaattcg aagcaacgcg cagaacctta ccagcctttg acatggcagg acgacttccg 900
gagacggatt tcttccagca atggacctgc acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 960
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgcctc tagttgccat 1020
cattcagttg ggcactctag agggactgcc ggtgataagc cgagaggaag gtggggatga 1080
cgtcaagtcc tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gcggtgacag 1140
tgggatgcga acccgcgagg gtaagcaaat ctccaaaagc cgtctcagtt cggattgcac 1200
tctgcaactc gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gtggatcagc atgccacggt 1260
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gctttacccg 1320
aaggcgctgc gctaacccgc aagggaggca gcga 1354

Claims (4)

1.黄色杆菌(Xanthobacter sp.)T21，其保藏编号为GDMCC No:61462。
2.权利要求1所述的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21在降解有机磷酸酯中的应用，所述的有机磷酸酯为磷酸三(2-氯乙基)酯。
3.权利要求1所述的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21在制备有机磷酸酯降解剂中的应用，所述的有机磷酸酯为磷酸三(2-氯乙基)酯。
4.权利要求1所述的黄色杆菌Xanthobacter sp.T21在有机磷酸酯污染的生物修复治理中的应用，所述的有机磷酸酯为磷酸三(2-氯乙基)酯。
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