WO2018235743A1 - 有機化合物の生分解処理方法 - Google Patents

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山本　哲史
斎藤　祐二
瀧　寛則
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大成建設株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for biodegradation treatment of an organic compound using a constitutive 1,4-dioxane decomposing bacterium strain N23.
  • 1,4-dioxane is a cyclic ether represented by the following formula (1).
  • 1,4-dioxane is excellent in compatibility with water and organic solvents, and is mainly used as a reaction solvent for organic synthesis.
  • the production and import quantity of 1,4-dioxane in Japan in fiscal 2010 is about 4500 t / year, and it is estimated that about 300 t / year was released into the environment. Since 1,4-dioxane is water soluble, it is widely diffused when released into the water environment. In addition, removal from water is difficult because of low volatility, adsorption to solids, photodegradability, hydrolyzability, and biodegradability. Since 1,4-dioxane has acute and chronic toxicity and carcinogenicity is also pointed out, contamination of the aquatic environment with 1,4-dioxane is feared to adversely affect humans and animals and plants. . Therefore, in Japan, regulation of 1,4-dioxane is made according to water quality standard (0.05 mg / L or less), environmental standard (0.05 mg / L or less) and drainage standard (0.5 mg / L or less). ing.
  • Non-Patent Document 1 industrial wastewater containing 1,4-dioxane contains cyclic ethers such as 1,3-dioxolane and 2-methyl-1,3-dioxolane in addition to 1,4-dioxane. Have been reported. In particular, toxicity such as acute toxicity has been confirmed for 1,3-dioxolane, and contaminated water and the like containing 1,3-dioxolane must be treated appropriately.
  • 1,4-dioxane can be treated by ozone treatment (O 3 / H 2 O 2 ) with the addition of hydrogen peroxide, ozone treatment under ultraviolet irradiation (O 3 / UV), radiation or ultrasonic irradiation.
  • O 3 / UV ultraviolet irradiation
  • the effectiveness of the treatment has been confirmed only in the accelerated oxidation method in which a plurality of physicochemical oxidation methods are used in combination, such as ozone treatment of
  • the accelerated oxidation method has not been widely used because of the high initial cost and running cost.
  • Non-Patent Document 2 reports that when organic substances other than 1,4-dioxane are present, the processing efficiency of 1,4-dioxane by the accelerated oxidation method decreases.
  • a 1,4-dioxane-degrading bacterium is a bacterium (assimilant bacterium) that degrades 1,4-dioxane as a single carbon source and a bacterium that can degrade 1,4-dioxane in the presence of a specific substrate such as tetrahydrofuran. It is divided roughly into two types of (co-metabolising bacteria). Therefore, in the case of treating 1,4-dioxane contained in groundwater or wastewater with 1,4-dioxane-degrading bacteria, it is more efficient to utilize assimilants that do not require the addition of a specific substrate.
  • Assimilation bacteria are further divided into inducible type and constitutive type according to the presence or absence of induction of 1,4-dioxane degrading enzyme.
  • the inducible 1,4-dioxane-degrading bacteria produce and secrete degradative enzymes in the presence of an inducer such as 1,4-dioxane, It needs to be conditioned before being used for 4-dioxane treatment.
  • constitutive 1,4-dioxane-degrading bacteria always produce degradative enzymes, and thus can be used immediately for 1,4-dioxane treatment without conditioning.
  • the 1,4-dioxane-degrading bacteria grow extremely slowly, and when it is contaminated with other microorganisms, the other microorganisms preferentially grow. Therefore, in order to culture the 1,4-dioxane degrading bacteria, it is necessary to sufficiently sterilize the culture apparatus and the medium in advance so that other microorganisms do not contaminate.
  • the sterilization treatment includes methods such as steam sterilization using an autoclave, dry heat sterilization heating in an oven or the like, radiation sterilization using a gamma ray, and chemical sterilization using an ethylene oxide gas.
  • there are too many facilities for sterilization too much energy cost, huge amount of chemicals used, and there are problems in cost and safety, etc. It is difficult.
  • Patent Document 2 a culture method of 1,4-dioxane-degrading bacteria which increases 1,4-dioxane-degrading bacteria using a medium containing diethylene glycol. Since 1,4-dioxane-degrading bacteria are superior in ability to utilize diethylene glycol as a carbon source as compared with other microorganisms, by using a medium containing diethylene glycol, other microorganisms are not subjected to sterilization treatment. It can preferentially grow even under conditions where it is inhabited.
  • Patent Document 3 the N23 strain which is a constitutive 1,4-dioxane degrading bacterium.
  • the N23 strain shows the highest 1,4-dioxane maximum specific decomposition rate among constitutive 1,4-dioxane-degrading bacteria that have been reported so far, and cyclic ethers such as 1,4-dioxane Very promising for biodegradation.
  • the N23 strain is superior in the ability to use 1,4-dioxane, ethylene glycol, diethylene glycol, 1,4-butanediol as a carbon source, as compared to a microorganism having no 1,4-dioxane degradation. Further, among organic substances in which the above-mentioned N23 strain is easily usable as a carbon source, it is reported that ethylene glycol is hardly biodegradable in an acidic environment of pH 5.0 or less (Non-patent Document 5).
  • Seiwa, Michihiko Ike Possibilities of biological treatment and purification of contaminated groundwater using 1,4-dioxane-degrading bacteria, water and wastewater, Vol. 53, No. 7, pp. 555-560, 2011. K. Sei, K. Miyagaki, T. Kakinoki, K. Fukugasako, D. Inoue and M. Ike: Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source, Biodegradation , 24, 5, pp. 665-674, 2012. Takao Imaeda, Takehiro Tokuhiro, Masana Hirai: Microbial degradation system of LLC, Toyota Central R & D Labs, Vol. 34, No. 3, pp. 23-30, 1999.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently treating an organic compound with a constitutive 1,4-dioxane-degrading bacterium strain N23.
  • the present invention is characterized in that the organic compound is biodegraded by N23 strain which is a constitutive 1,4-dioxane degrading bacterium deposited under Accession No. NITE BP-02032. Biodegradation treatment method. 2.
  • the organic compound comprises a cyclic ether.
  • the organic compound is characterized in that it contains any one or more of 1,4-dioxane, 1,3-dioxolane, 2-methyl-1,3-dioxolane, and tetrahydrofuran. Or 2.
  • At least one of ethylene glycol, diethylene glycol, 1,4-butanediol and 1,4-dioxane is added as a carbon source.
  • the organic compound is characterized in that it contains any one or more of ethylene glycol, diethylene glycol and 1,4-butanediol.
  • the biodegradation treatment method described in. 6. It is characterized by being a fed-batch process.
  • the biodegradation method as described in any of the above. 7. It is a continuous process.
  • the N23 strain is a constitutive 1,4-dioxane-degrading bacterium, and always produces degrading enzymes.
  • the N23 strain can decompose cyclic ethers without acclimation, induction and the like, and thus can efficiently process cyclic ethers.
  • the N23 strain can also be used for the biodegradation treatment of ethylene glycol, diethylene glycol and 1,4-butanediol.
  • the N23 strain can be activated in a wide acidic region of pH 3.0 or more and 5.5 or less, so there is no need to strictly adjust the pH during treatment, and management is easy.
  • the N23 strain can be subjected to biodegradation treatment by acting on the organic compound to be treated as a carbon source.
  • the cell concentration of strain N23 can be increased by adding any one or more of ethylene glycol, diethylene glycol, 1,4-butanediol and 1,4-dioxane as a carbon source. Since the amount can be maintained high, the biodegradation treatment of the organic compound can be efficiently performed.
  • the amount of N23 stock increases with each repetition of the process, so the time required for one process can be gradually shortened.
  • the fed-batch process has a high initial concentration of contaminants, and can maintain high degradation activity by the N23 strain, so that the contaminants can be degraded in a short time.
  • Contaminated water treatment can be carried out in a continuous process, and the existing purification equipment can be used as it is, so that the cost is low, and the biodegradation treatment process can be quickly and easily constructed.
  • FIG. 7 shows time-dependent changes in 1,4-dioxane concentration in Example 1 of Experiment 2 and Comparative Example 1. The figure which shows the relationship of the initial stage pH in different carbon sources in the experiment 3, and the amount increase of cell concentration.
  • strain N23 Constitutive type 1,4-dioxane-degrading bacterium strain N23 (hereinafter referred to as strain N23) used in the present invention is Accession No. NITE BP-02032. It has been internationally deposited on April 10, 2015 in Kazusa Tsuji 2-5-5 (Postal Code 292-0818), Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. The SEM image of the N23 strain is shown in FIG. The N23 strain is positive for gram stainability and positive for catalase reaction.
  • the N23 strain is a constitutive 1,4-dioxane-degrading bacterium, and always produces degrading enzymes.
  • constitutive 1,4-dioxane-degrading bacteria are known to exhibit lower 1,4-dioxane maximum specific degradation rates as compared to inducible 1,4-dioxane-degrading bacteria.
  • the specific degradation rate to the initial 1,4-dioxane concentration of the N23 strain is shown in FIG.
  • the N23 strain has the highest 1,4-dioxane maximum specific decomposition rate among constitutive 1,4-dioxane-degrading bacteria reported so far, and the value is an inducible 1,4-dioxane-degrading bacterium. Or more.
  • strain N23 can decompose 1,4-dioxane to an extremely low concentration of 0.017 mg / L or less, and can process 1,4-dioxane at a high concentration of about 5200 mg / L.
  • the N23 strain does not have to be conditioned in advance using 1,4-dioxane or the like.
  • strain N23 has high 1,4-dioxane maximum specific decomposition rate, can decompose 1,4-dioxane to very low concentrations, and can process high concentrations of 1,4-dioxane . Therefore, the N23 strain can be suitably used for the treatment of 1,4-dioxane.
  • the N23 strain can efficiently decompose not only 1,4-dioxane but also cyclic ethers such as 1,3-dioxolane, 2-methyl-1,3-dioxolane and tetrahydrofuran. Also, multiple cyclic ethers can be processed simultaneously. Furthermore, the N23 strain is also excellent in the degradability of ethylene glycol, diethylene glycol and 1,4-butanediol.
  • the N23 strain is used for the biodegradation treatment of 1,4-dioxane, 1,3-dioxolane, 2-methyl-1,3-dioxolane, cyclic ethers such as tetrahydrofuran, ethylene glycol, diethylene glycol, 1,4-butanediol It can be suitably used.
  • the N23 strain is hardly reduced in activity even in an acidic environment of pH 3.0 or more and 5.5 or less. That is, the N23 strain exhibits the highest 1,4-dioxane degradation activity at around pH 7.0, but 90% or more at pH 5.0 and 80% or more at pH 3.8 with respect to the degradation activity at pH 7.0. Maintain the decomposition activity. On the other hand, most microorganisms have an optimum pH of around 6.0 to 8.0 in a neutral environment.
  • ethylene glycol is an optimum pH for biodegradation under a neutral environment (pH 6 to 8), and an acidic environment of pH 5.0 or less Below, it is reported that it hardly biodegrades (nonpatent literature 5).
  • dioxane-degrading bacteria that exhibit high 1,4-dioxane-degrading activity in an acidic environment have not been reported so far, for example, strain D17, which is a constitutive 1,4-dioxane-degrading bacteria (Accession No. NITE) BP-01927) shows the highest decomposition activity at pH 8.0, and the decomposition activity at pH 5.0 is only about 50% of the decomposition activity at pH 8.0 (Non-patent Document 4).
  • Biodegradation treatment method The biodegradation treatment method of the present invention is characterized in that the organic compound is biodegraded with the N23 strain in an acidic environment of pH 3.0 or more and 5.5 or less.
  • Targets for biodegradation treatment include underground water containing organic compounds, polluted water such as factory drainage, polluted soil at an illegal disposal site, and the like. Contaminated water, contaminated soil, etc. inhabit a wide variety of microorganisms (hereinafter referred to as bacteria). As described above, since common bacteria have an optimum pH in a neutral environment, the activity of bacteria is suppressed in an acidic environment of pH 3.0 to 5.5.
  • the activity and growth of bacteria are suppressed, and the N23 strain preferentially acts, so that the biodegradation treatment of the organic compound by the N23 strain can be efficiently performed.
  • the biodegradation process of this invention in acidic environment, it is necessary to return to neutrality after a biodegradation process. Since soil neutralization work requires large-scale equipment, even when cleaning contaminated soil, the soil is washed in advance with water, and the organic compound to be treated is transferred to the aqueous phase and treated as contaminated water. Is preferred.
  • the biodegradation method of the organic compound in the contaminated water using the N23 strain is not particularly limited, but (1) the biodegradation treatment process of the contaminated water with the N23 strain, (2) precipitating activated sludge, carrier, etc. containing the N23 strain, Draining process to drain the supernatant after treatment, (3) Contaminated water input process to input new contaminated water, in this order: (1) ⁇ (2) ⁇ (3) ⁇ (1) ⁇ ... It can be performed by a so-called fed-batch process, a continuous process in which the input of the contaminated water in the upstream and the drainage of the treated water in the downstream are continuously performed with the same amount.
  • the fed-batch process can maintain a high biodegradation rate due to the high initial contaminant concentration in the aeration tank.
  • the N23 strain hardly flows out during drainage and the amount of N23 strain increases each time the process is repeated, the time required for one process can be gradually shortened.
  • the continuous process can use the existing wastewater treatment equipment as it is.
  • the organic compound to be subjected to the biodegradation treatment is not particularly limited as long as it can degrade the N23 strain, that is, it can be used as a carbon source.
  • examples thereof include 1,4-dioxane, 1,3-dioxolane, 2-methyl-1,3-dioxolane, cyclic ethers such as tetrahydrofuran, ethylene glycol, diethylene glycol, 1,4-butanediol and the like.
  • cyclic ethers in which the N23 strain constantly secretes degrading enzymes are particularly preferred.
  • the concentration of the organic compound to be treated (hereinafter referred to as a treated organic compound) contained in the contaminated water is high, the N23 strain uses the treated organic compound contained in the contaminated water as a carbon source to maintain the cell mass While being able to biodegrade efficiently.
  • the concentration of the treated organic compound in the contaminated water is low, the cell concentration of the N23 strain may be low, and the efficiency of the biodegradation treatment may be lowered. Therefore, when the concentration of the treated organic compound is low, it is preferable to add one or more of ethylene glycol, diethylene glycol, 1,4-butanediol and 1,4-dioxane as a carbon source to the contaminated water.
  • ethylene glycol is difficult to use by bacteria in an acidic environment and the growth of bacteria is suppressed, and it is rapidly biodegraded in a neutral environment even if it leaks to the outside. preferable.
  • the N23 strain can grow on ethylene glycol, diethylene glycol, 1,4-butanediol, 1,4-dioxane as a carbon source under acidic conditions. Therefore, even when the concentration of the treated organic compound is low, the bacterial cell concentration of the N23 strain can be maintained high by adding one or more of them as the carbon source to the contaminated water, and the treated organic compound with low concentration by the N23 strain Processing can be performed efficiently.
  • the concentration of the treated organic compound is about 400 mg / L or less.
  • the total concentration of the carbon source added to the contaminated water is preferably 10 mg / L to 100 g / L, more preferably 100 mg / L to 10 g / L, and still more preferably 200 mg / L to 5 g / L.
  • the N23 strain used for the biodegradation treatment is preferably cultured under an acidic environment of pH 3.0 or more and 5.5 or less. In an acidic environment of pH 3.0 or more and 5.5 or less, propagation of various bacteria can be suppressed, and therefore, N23 strain can be cultured efficiently.
  • the pH during culture is preferably lower, more preferably pH 4.9 or less, and still more preferably pH 4.5 or less.
  • liquid medium or solid medium can be mentioned.
  • the medium is not particularly limited as long as it can culture the N23 strain, and known media such as MGY medium and CGY medium can be used. It is preferable to use a liquid medium to culture the N23 strain in large quantities. It is further preferable to carry out continuous culture in which the culture solution containing the N23 strain in the same amount as the supply amount of the liquid medium is taken while supplying the liquid medium.
  • the N23 strain In an acidic environment, since the activity and growth of various germs are suppressed, the N23 strain can be cultured without completely sterilizing the culture. Moreover, since culture
  • N23 shares The N23 strain was cultured for 2 weeks using MGY medium (composition: 10 g / L Malt Extract, 4 g / L glucose, 4 g / L Yeast Extract, pH 7.3). The culture broth was centrifuged at 10000 ⁇ g at 4 ° C. for 3 minutes to collect bacteria, and mineral salt medium (medium composition: 1 g / L K 2 HPO 4 , 1 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 50 mg / L) Bacterial cells washed twice with L NaCl, 200 mg / L MgSO 4 ⁇ 7 H 2 O, 10 mg / L FeCl 3 , 50 mg / L CaCl 2 , pH: 7.3) were used.
  • MGY medium composition: 10 g / L Malt Extract, 4 g / L glucose, 4 g / L Yeast Extract, pH 7.3.
  • the culture broth was centrifuged at 10000 ⁇ g at 4 ° C. for 3
  • the sampling is performed 2.5 hours after culture start, 10 hours after and 12 hours after, and the 1,4-dioxane concentration in the solution is measured with a headspace gas chromatograph mass spectrometer (Shimadzu Corporation: GC / MS-QP2010 PLUS, TURBOMATRIX HS40 or less) , Head space GC / MS). It was confirmed that the rate of decrease of the 1,4-dioxane concentration was linear with each time, and the rate of 1,4-dioxane decomposition was calculated. Moreover, pH in the solution before and behind culture
  • the N23 strain showed the highest 1,4-dioxane degradation rate at pH 7.0. Also, it was confirmed that the N23 strain can biodegrade 1,4-dioxane at a concentration of 500 mg / L in an acidic environment. It was confirmed that the N23 strain maintained the decomposition activity at 90% or more at pH 5.9 and 5.0 and 80% or more at pH 3.8 with respect to the decomposition activity at pH 7.0. In addition, it was confirmed that the pH was lowered after the culture. It is believed that this is because the decomposition of 1,4-dioxane yielded the intermediate metabolite glyoxylic acid.
  • Example 2 Biodegradation treatment of cyclic ether by fed-batch process
  • a liquid tank with a capacity of 1.2 L 0.9 L of simulated wastewater containing 1,4-dioxane and a nutrient (final concentration of composition: 1 g / L K 2 HPO 4 , 1 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 200 mg / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 10 mg / L FeCl 3 , 50 mg / L CaCl 2 ) was added, and the N23 strain was added so that the cell concentration became 970 mg-cell / L, and the liquid volume was made 1 L.
  • the wastewater was adjusted to pH 5.0 using a pH controller and subjected to biodegradation treatment at 30 ° C. for 24 hours while performing aeration at 1 L / min. After 24 hours of biodegradation treatment, aeration was stopped to precipitate activated sludge containing N23 strain, and the supernatant was drained by 0.9 L. Thereafter, 0.9 L of simulated waste water and a nutrient were newly added, and a fed-batch process was repeated for 8 days, repeating the same biodegradation treatment.
  • Comparative Example 1 The fed-batch process was performed in the same manner as in Example 1 except that the pH was 7.0.
  • Example 1 and Comparative Example 1 the 1,4-dioxane concentration of water in the liquid tank was measured by head space GC / MS. The measurement results of the 1,4-dioxane concentration are shown in FIG. All of Example 1 and Comparative Example 1 were able to stably decompose 1,4-dioxane by the fed-batch process throughout the experimental period of 8 days. That is, it was confirmed that the N23 strain was able to biodegrade the cyclic ether 1,4-dioxane in an acidic environment of pH 5.0 as well as in a neutral environment of pH 7.0. Further, in each of Example 1 and Comparative Example 1, the amount of cells increased each time the process was performed, so that the processing capacity was improved.
  • N23 strain can grow in an acidic environment of pH 3.0 to 5.0 using ethylene glycol, diethylene glycol and 1,4-butanediol at a concentration of 4 g / L as a carbon source.
  • N23 strain is a constitutive type 1,4-dioxane-degrading bacterium and always produces degradative enzymes, so by using these as carbon sources, it is possible to biodegrade cyclic ether by N23 strain. It was confirmed.

Abstract

構成型１，４－ジオキサン分解菌Ｎ２３株による効率的な有機化合物の処理方法を提供することを課題とする。解決手段として、ｐＨ３．０以上５．５以下の条件下において、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０３２として寄託された構成型１，４－ジオキサン分解菌であるＮ２３株により、有機化合物を生分解処理する生分解処理方法を提供する。

Description

有機化合物の生分解処理方法
　本発明は、構成型１，４－ジオキサン分解菌Ｎ２３株を利用した有機化合物の生分解処理方法に関する。
　１，４－ジオキサンは、下記式（１）で表される環状エーテルである。１，４－ジオキサンは、水や有機溶媒との相溶性に優れており、主に有機合成の反応溶剤として使用されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　２０１０年度の日本国における１，４－ジオキサンの製造・輸入量は、約４５００ｔ／年であり、約３００ｔ／年が環境中へ放出されたと推測される。１，４－ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。また、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低いため、水中からの除去が困難である。１，４－ジオキサンは急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、１，４－ジオキサンによる水環境の汚染は、人や動植物に悪影響を及ぼすことが懸念されている。そのため、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）及び排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）により、１，４－ジオキサンの規制がなされている。
　また、非特許文献１には、１，４－ジオキサンを含む産業廃水には、１，４－ジオキサンの他に１，３－ジオキソラン及び２－メチル－１，３－ジオキソランといった環状エーテルが含まれていることが報告されている。特に１，３－ジオキソランは、急性毒性等の毒性が確認されており、１，３－ジオキソランを含む汚染水等は適切に処理しなければならない。
　従来の活性汚泥法や活性炭吸着法等の処理方法では、水中から１，４－ジオキサン等の環状エーテルを十分に除去することができない。例えば、１，４－ジオキサンは、過酸化水素を添加してのオゾン処理（Ｏ３／Ｈ２Ｏ２）、紫外線照射下でのオゾン処理（Ｏ３／ＵＶ）、放射線や超音波照射下でのオゾン処理等、複数の物理化学的な酸化方法を併用する促進酸化法においてのみ、処理の有効性が確認されている。しかし、促進酸化法はイニシャルコスト及びランニングコストが高いことから普及に至っていない。また、非特許文献２には、１，４－ジオキサン以外の有機物が存在すると、促進酸化法による１，４－ジオキサンの処理効率が低下することが報告されている。
　低コストかつ安定的に１，４－ジオキサン等の環状エーテルを含む水を処理する方法が求められており、特許文献１、非特許文献３では、１，４－ジオキサン分解菌による１，４－ジオキサン処理が提案されている。１，４－ジオキサン分解菌は、１，４－ジオキサンを単一炭素源として分解する菌（資化菌）と、テトラヒドロフラン等の特定の基質の存在下にて１，４－ジオキサンを分解できる菌（共代謝菌）の２種類に大別される。そのため、地下水や廃水等に含まれる１，４－ジオキサンを１，４－ジオキサン分解菌で処理する場合、特定の基質を添加する必要がない資化菌を活用する方が効率的である。
　資化菌は、さらに１，４－ジオキサン分解酵素の誘導の有無によって、誘導型と構成型に分けられる。非特許文献４に記載されているように、誘導型１，４－ジオキサン分解菌は、１，４－ジオキサンなどの誘導物質が存在することで分解酵素の生産・分泌がされるため、１，４－ジオキサン処理に用いる前に予め馴養する必要がある。一方、構成型１，４－ジオキサン分解菌は、常時、分解酵素を生産しているため、馴養することなく、直ちに１，４－ジオキサン処理に用いることができる。
　ここで、１，４－ジオキサン分解菌は増殖が極めて遅く、他の微生物が混入していると他の微生物が優先的に増殖してしまう。そのため、１，４－ジオキサン分解菌を培養するには、他の微生物が混入しないように、事前に培養装置や培地を十分に滅菌する必要がある。滅菌処理には、オートクレーブを用いる蒸気滅菌、オーブン等で加熱する乾熱滅菌、ガンマ線を用いる放射線滅菌、エチレンオキサイドガスを用いる化学滅菌等の方法がある。しかし、滅菌のための設備が大規模になりすぎる、エネルギーコストがかかりすぎる、使用する薬品量が膨大となりコスト・安全性の点で問題がある等、いずれの滅菌方法も、大規模スケールで行うことは困難である。
　本願発明者らは、特許文献２において、ジエチレングリコールを含む培地を用いて１，４－ジオキサン分解菌を増やす１，４－ジオキサン分解菌の培養方法を提案した。１，４－ジオキサン分解菌は、他の微生物と比較してジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れているため、ジエチレングリコールを含有する培地を用いることにより、滅菌処理を行うことなく、他の微生物が生息している条件下でも優先的に増殖することができる。
　さらに、本発明者らは、特許文献３において、構成型１，４－ジオキサン分解菌であるＮ２３株を報告している。Ｎ２３株は、これまでに報告されている構成型１，４－ジオキサン分解菌の中で、最も高い１，４－ジオキサン最大比分解速度を示し、１，４－ジオキサンを始めとする環状エーテルの生分解に非常に有望である。
　Ｎ２３株は、１，４－ジオキサン分解能を有さない微生物と比較して、１，４－ジオキサン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオールを炭素源として利用する能力に優れている。また、上記したＮ２３株が炭素源として利用しやすい有機物の中で、エチレングリコールは、ｐＨ５．０以下の酸性環境下においてほとんど生分解されないことが報告されている（非特許文献５）。
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　構成型１，４－ジオキサン分解菌Ｎ２３株による効率的な有機化合物の処理方法を提供することを課題とする。
１．ｐＨ３．０以上５．５以下の条件下において、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０３２として寄託された構成型１，４－ジオキサン分解菌であるＮ２３株により、有機化合物を生分解処理することを特徴とする生分解処理方法。
２．前記有機化合物が、環状エーテルを含むことを特徴とする１．に記載の生分解処理方法。
３．前記有機化合物が、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、２－メチル－１，３－ジオキソラン、テトラヒドロフランのいずれか１種以上を含むことを特徴とする１．または２．に記載の生分解処理方法。
４．エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオール、１，４－ジオキサンのいずれか１種以上を炭素源として加えることを特徴とする１．～３．のいずれかに記載の生分解処理方法。
５．前記有機化合物が、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオールのいずれか１種以上を含むことを特徴とする１．に記載の生分解処理方法。
６．フェッドバッチプロセスであることを特徴とする１．～５．のいずれかに記載の生分解処理方法。
７．連続プロセスであることを特徴とする１．～５．のいずれかに記載の生分解処理方法。
　ｐＨが３．０以上５．５以下の酸性環境下では、他の微生物の活動は抑制されるが、Ｎ２３株の活動性はほとんど低下しない。そのため、ｐＨが３．０以上５．５以下の酸性環境下では、Ｎ２３株による有機化合物の生分解処理を効率的に行うことができる。Ｎ２３株は、構成型１，４－ジオキサン分解菌であり、常時、分解酵素を生産している。Ｎ２３株は、馴化、誘導等することなく、環状エーテルを分解することができるため、効率的に環状エーテルの処理を行うことができる。また、Ｎ２３株は、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオールの生分解処理にも用いることができる。Ｎ２３株は、ｐＨ３．０以上５．５以下という広い酸性領域内で活動可能であるため、処理時のｐＨを厳密に調整する必要がなく、管理が容易である。
　高い濃度の有機化合物を処理する場合は、Ｎ２３株は、処理対象である有機化合物を炭素源として活動することにより、生分解処理を行うことができる。低い濃度の有機化合物を処理する場合は、炭素源として、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオール、１，４－ジオキサンのいずれか１種以上を加えることにより、Ｎ２３株の菌体濃度を高く維持することができるため、有機化合物の生分解処理を効率的に行うことができる。
　汚染水の処理を、フェッドバッチプロセスで行うと、プロセスを繰り返す毎にＮ２３株量が増加するため、１回のプロセスに必要な時間を徐々に短くすることができる。また、フェッドバッチプロセスは、汚染物の初期濃度が高く、Ｎ２３株による分解活性を高く維持することができるため、汚染物を短時間で分解することができる。汚染水の処理を、連続プロセスで行うと、既設の浄化設備をそのまま用いることができるため低コストであり、また、生分解処理プロセスを迅速、かつ容易に構築することができる。
Ｎ２３株のＳＥＭ画像。 Ｎ２３株の初期１，４－ジオキサン濃度に対する比分解速度を示す図。 実験１における初期ｐＨと環状エーテル分解速度との関係を示す図。 実験２の実施例１と比較例１における１，４－ジオキサン濃度の経時変化を示す図。 実験３における異なる炭素源での初期ｐＨと菌体濃度増加量との関係を示す図。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
「Ｎ２３株」
　本発明で使用する構成型１，４－ジオキサン分解菌Ｎ２３株（以下、Ｎ２３株という。）は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０３２として、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８））に、２０１５年４月１０日付で国際寄託されている。Ｎ２３株のＳＥＭ画像を図１に示す。Ｎ２３株は、グラム染色性が陽性、カタラーゼ反応が陽性である。
　Ｎ２３株は、構成型１，４－ジオキサン分解菌であり、常時、分解酵素を生産している。一般に、構成型１，４－ジオキサン分解菌は、誘導型１，４－ジオキサン分解菌と比較して低い１，４－ジオキサン最大比分解速度を示すことが知られている。Ｎ２３株の初期１，４－ジオキサン濃度に対する比分解速度を図２に示す。
　Ｎ２３株は、これまでに報告されている構成型１，４－ジオキサン分解菌の中で最も高い１，４－ジオキサン最大比分解速度を有し、その値は誘導型１，４－ジオキサン分解菌と同等以上である。また、Ｎ２３株は、１，４－ジオキサンを０．０１７ｍｇ／Ｌ以下の極低濃度まで分解することができ、約５２００ｍｇ／Ｌという高濃度の１，４－ジオキサンを処理することができる。
　Ｎ２３株は、１，４－ジオキサン等を用いて予め馴養する必要がない。また、Ｎ２３株は、高い１，４－ジオキサン最大比分解速度を有し、１，４－ジオキサンを極低濃度まで分解することができ、高濃度の１，４－ジオキサンを処理することができる。そのため、Ｎ２３株は、１，４－ジオキサンの処理に好適に利用することができる。
　Ｎ２３株は、１，４－ジオキサンだけでなく、１，３－ジオキソラン、２－メチル－１，３－ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテルを効率よく分解することができる。また、複数の環状エーテルを同時に処理することもできる。さらに、Ｎ２３株は、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオールの分解性にも優れている。そのため、Ｎ２３株は、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、２－メチル－１，３－ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオールの生分解処理に好適に利用することができる。
　Ｎ２３株は、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下であっても、ほとんど活動性が低下しない。すなわち、Ｎ２３株は、ｐＨ７．０付近で最も高い１，４－ジオキサン分解活性を示すが、ｐＨ７．０における分解活性に対して、ｐＨ５．０で９割以上、ｐＨ３．８で８割以上の分解活性を維持する。それに対し、多くの微生物は、ｐＨ６．０～８．０程度の中性環境下が至適ｐＨである。例えば、Ｎ２３株が炭素源として利用する能力に長けている有機物の中で、エチレングリコールは、中性環境下（ｐＨ６～８）が生分解の至適ｐＨであり、ｐＨ５．０以下の酸性環境下では、ほとんど生分解されないことが報告されている（非特許文献５）。また、酸性環境下において高い１，４－ジオキサン分解活性を発揮するジオキサン分解菌は、これまでに報告されておらず、例えば、構成型１，４－ジオキサン分解菌であるＤ１７株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９２７）は、ｐＨ８．０において最も高い分解活性を示し、ｐＨ５．０における分解活性はｐＨ８．０における分解活性の５割程度にすぎない（非特許文献４）。
「生分解処理方法」
　本発明の生分解処理方法は、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下において、Ｎ２３株により、有機化合物を生分解処理することを特徴とする。
　生分解処理対象としては、有機化合物を含む地下水、工場排水等の汚染水、不法廃棄サイトの汚染土壌等が挙げられる。汚染水、汚染土壌等には、多種多様な微生物（以下、雑菌という）が生息している。上記したように、一般的な雑菌は、中性環境下が至適ｐＨであるため、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下では、雑菌の活動は抑制される。ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下では雑菌の活動・増殖が抑えられ、Ｎ２３株が優先的に活動するため、Ｎ２３株による有機化合物の生分解処理を効率的に行うことができる。なお、本発明の生分解処理は、酸性環境下で行うため、生分解処理後に中性に戻す必要がある。土壌の中性化作業は大規模設備が必要であるため、汚染土壌を浄化する場合も、土壌を予め水で洗浄し、処理対象である有機化合物を水相に移行させて汚染水として処理することが好ましい。
　Ｎ２３株を用いた汚染水中の有機化合物の生分解方法は特に制限されないが、（１）汚染水のＮ２３株による生分解処理工程、（２）Ｎ２３株を含む活性汚泥や担体等を沈殿させ、処理後の上澄みを排水する排水工程、（３）新たな汚染水を投入する汚染水投入工程を、（１）→（２）→（３）→（１）→・・・と、この順で繰り返す、いわゆるフェッドバッチプロセス、上流での汚染水の投入と下流での処理水の排水とを同量で連続的に行う連続プロセス等により行うことができる。フェッドバッチプロセスは、曝気槽での初期汚染物濃度が高いため、生分解処理速度を高く保つことができる。また、排水時にＮ２３株はほとんど流出せず、プロセスを繰り返す毎にＮ２３株量が増加するため、１回のプロセスに必要な時間を徐々に短くすることができる。連続プロセスは、既設の排水処理設備をそのまま用いることができる。
　生分解処理する有機化合物としては、Ｎ２３株が分解できる、すなわち、炭素源として利用できるものであれば特に制限されない。例えば、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、２－メチル－１，３－ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオール等が挙げられる。これらの中で、Ｎ２３株が常時分解酵素を分泌している環状エーテルが特に好適である。
　以下、汚染水の場合を例にして説明する。
　汚染水中に含まれる処理対象である有機化合物（以下、処理有機化合物という。）の濃度が高い場合、Ｎ２３株は、汚染水に含まれる処理有機化合物を炭素源として利用し、菌体量を維持しながら、効率的に生分解処理することができる。
　汚染水中の処理有機化合物濃度が低い場合は、Ｎ２３株の菌体濃度が低くなり、生分解処理の効率が低下してしまう場合がある。そのため、処理有機化合物濃度が低い場合は、炭素源としてエチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオール、１，４－ジオキサンのいずれか１種以上を汚染水中に加えることが好ましい。これらは、単独、または混合して加えることができる。これらの中で、エチレングリコールが、酸性環境下では雑菌が利用しにくく雑菌の繁殖が抑制されること、および、仮に外部へ流出したとしても中性環境下では速やかに生分解されること等から好ましい。
　Ｎ２３株は、酸性条件下において、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオール、１，４－ジオキサンを炭素源として増殖することができる。そのため、処理有機化合物濃度が低い場合でも、汚染水中にこれらの１種以上を炭素源として加えることにより、Ｎ２３株の菌体濃度を高く維持することができ、Ｎ２３株による低濃度の処理有機化合物の処理を効率的に行うことができる。汚染水中に炭素源を加える目安としては、処理有機化合物濃度が４００ｍｇ／Ｌ以下程度である。また、汚染水に加える炭素源の総濃度は、１０ｍｇ／Ｌ以上１００ｇ／Ｌ以下が好ましく、１００ｍｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、２００ｍｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。
「培養方法」
　生分解処理に使用するＮ２３株は、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下で培養することが好ましい。ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下では、雑菌の繁殖が抑えられるため、Ｎ２３株を効率的に培養することができる。より確実に雑菌のコンタミネーションを防ぐために、培養時のｐＨは低いほうが好ましく、ｐＨ４．９以下がより好ましく、ｐＨ４．５以下がさらに好ましい。
　Ｎ２３株を培養する培地としては、液体培地、または固体培地が挙げられる。培地としては、Ｎ２３株を培養できるものであれば特に限定されず、ＭＧＹ培地やＣＧＹ培地等の公知の培地を使用することができる。Ｎ２３株を大量に培養するためには液体培地を使用することが好ましい。液体培地を供給しながら、液体培地の供給量と同量のＮ２３株を含む培養液を取り出す連続培養を行うことがさらに好ましい。
　酸性環境下では、雑菌の活動・増殖が抑制されるため、培養前に完全な滅菌処理を施さずとも、Ｎ２３株を培養することができる。また、酸性環境下でのＮ２３株の培養は、雑菌のコンタミネーションが起こりにくいため、隅々まで確実な滅菌処理を施すことが困難である大容量の培養装置を用いることができる。具体的には、酸性環境下において、Ｎ２３株を液体培地で培養する場合は、培養槽の容量を１０Ｌ以上１０００Ｌ以下とすることができる。
「Ｎ２３株」
　Ｎ２３株は、ＭＧＹ培地（組成：１０ｇ／Ｌ　Ｍａｌｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、４ｇ／Ｌ　グルコース、４ｇ／Ｌ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、ｐＨ７．３）を用いて２週間培養した。この培養液を、１００００×ｇ、４℃、３分間遠心分離して集菌し、無機塩培地（培地組成：１ｇ／Ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ　ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２、ｐＨ：７．３）を用いて二回洗浄した菌体を用いた。
「実験１」
ｐＨの環状エーテル分解活性への影響
　１００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに、液体培地（組成：５００ｍｇ／Ｌ　１，４－ジオキサン、１ｇ／Ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ　、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ　ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２）を１９ｍＬ添加し、Ｎ２３株の菌体濃縮液を１ｍＬ加え（菌体終濃度：２００ｍｇ－ｃｅｌｌ／Ｌ）、２８℃にて回転振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行った（ｎ＝３）。液体培地のｐＨは塩酸溶液及び水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ３．８、５．０、５．９、７．０、８．２に調整した。
　培養開始２．５時間後、１０時間後及び１２時間後にサンプリングを行い、溶液中の１，４－ジオキサン濃度をヘッドスペースガスクロマトグラフ質量分析計（島津製作所：ＧＣ／ＭＳ－ＱＰ２０１０　ＰＬＵＳ、ＴＵＲＢＯＭＡＴＲＩＸ　ＨＳ４０　以下、ヘッドスペースＧＣ／ＭＳという。）を用いて測定した。各時間ごとの１，４－ジオキサン濃度の減少速度に直線性があることを確認し、１，４－ジオキサン分解速度を算出した。また、培養前後における溶液中のｐＨを測定した。図３に初期ｐＨと分解速度の関係を、表１に培養前後のｐＨを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Ｎ２３株は、ｐＨ７．０で最も高い１，４－ジオキサン分解速度を示した。また、Ｎ２３株は、酸性環境下において、５００ｍｇ／Ｌ濃度の１，４－ジオキサンを生分解できることが確かめられた。Ｎ２３株は、ｐＨ７．０における分解活性に対して、ｐＨ５．９、５．０で９割以上、ｐＨ３．８で８割以上の分解活性を維持していることが確認できた。
　また、培養後にｐＨが低下していることが確認できた。これは、１，４－ジオキサンの分解により、中間代謝物であるグリオキシル酸が生じたためであると考えられる。
「実験２」
環状エーテルのフェッドバッチプロセスによる生分解処理
実施例１
　容量１．２Ｌの液槽に、１，４－ジオキサンを含む模擬廃水０．９Ｌと栄養剤（組成の終濃度：１ｇ／Ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、２００ｍｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ　ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２）を加え、Ｎ２３株を菌体濃度が９７０ｍｇ－ｃｅｌｌ／Ｌとなるように加え液量を１Ｌとした。
　この廃水を、ｐＨコントローラーを用いてｐＨ５．０とし、１Ｌ／ｍｉｎのエアレーションを行いながら２４時間、３０℃にて生分解処理を行った。２４時間の生分解処理後、エアレーションを停止して、Ｎ２３株を含む活性汚泥を沈殿させ、上澄みを０．９Ｌ排水した。その後、新たに模擬廃水０．９Ｌと栄養剤を加え、同様の生分解処理を繰り返すフェッドバッチプロセスを８日間行った。
比較例１
　ｐＨを７．０とした以外は、上記実施例１と同様にフェッドバッチプロセスを行った。
「環状エーテル濃度」
　実施例１、比較例１において、液槽中の水の１，４－ジオキサン濃度をヘッドスペースＧＣ／ＭＳにて測定した。１，４－ジオキサン濃度の測定結果を、図４に示す。
　実施例１、比較例１のいずれも、８日間の実験期間を通じて、フェッドバッチプロセスにより１，４－ジオキサンを安定的に分解することができた。すなわち、Ｎ２３株は、ｐＨ５．０の酸性環境下において、ｐＨ７．０の中性環境下と同様に、環状エーテルである１，４－ジオキサンの生分解処理が可能であることが確かめられた。また、実施例１、比較例１のいずれも、プロセスを経る毎に菌体量が増加したため、処理能力が向上した。
「実験３」
有機化合物の生分解処理
　３００ｍｌ容量のフラスコに、ｐＨ３．６～７．９に調整した栄養塩培地（組成：０．５ｇ／Ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４、５ｇ／Ｌ　酵母エキス）を加えた後、炭素源を４ｇ／Ｌになるように添加し、液量を１００ｍＬとした。その後、Ｎ２３株を７０ｍｇ－ｃｅｌｌ／Ｌになるように添加し、２８℃、１２０ｒｐｍにて、回転振盪培養を行った（ｎ＝１）。炭素源としては、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオールを用いた。図５に、７日間の培養により増加した菌体濃度を示す。
　Ｎ２３株が、４ｇ／Ｌ濃度のエチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオールを炭素源として、ｐＨ３．０～５．０の酸性環境下で増殖できることが確かめられた。そして、Ｎ２３株は、構成型１，４－ジオキサン分解菌であり、常時、分解酵素を生産しているため、これらを炭素源とすることにより、Ｎ２３株による環状エーテルの生分解処理ができることが確かめられた。

Claims (7)

  1. 　ｐＨ３．０以上５．５以下の条件下において、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０３２として寄託された構成型１，４－ジオキサン分解菌であるＮ２３株により、有機化合物を生分解処理することを特徴とする生分解処理方法。
  2. 　前記有機化合物が、環状エーテルを含むことを特徴とする請求項１に記載の生分解処理方法。
  3. 　前記有機化合物が、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、２－メチル－１，３－ジオキソラン、テトラヒドロフランのいずれか１種以上を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の生分解処理方法。
  4. 　エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオール、１，４－ジオキサンのいずれか１種以上を炭素源として加えることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の生分解処理方法。
  5. 　前記有機化合物が、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４－ブタンジオールのいずれか１種以上を含むことを特徴とする請求項１に記載の生分解処理方法。
  6. 　フェッドバッチプロセスであることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の生分解処理方法。
  7. 　連続プロセスであることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の生分解処理方法。
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