JP2003250529A - 分解方法、浄化方法および分解菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生物難分解性化合物を分解する。 【解決手段】 汚染区域を滅菌し（Ｓ１１）、別に培養
したNocardioides属の一部の菌（Nocardioides sp. H-
1）（Ｓ１２）を添加する（Ｓ１３）とともに、区域に
栄養源および酸素を供給し（Ｓ１４）、浄化する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般に生物分解性
が困難であるといわれている生物難分解性化合物を特定
の微生物を用いて分解する分解方法、その分解方法を利
用した物質の浄化方法、およびこれに利用される分解菌
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、土壌・地下水などの環境汚染につ
いて、より広範かつ詳細な調査が進むにつれて、様々な
物質による汚染が顕在化し、その対策が求められてい
る。

【０００３】このような汚染物質として、重油や掘削油
のような油類の他にダイオキシン類、ＰＣＢ、ハロゲン
化炭化水素、フェノール類などの有機化学物質があげら
れ、これら有機化学物質に汚染されている場合には、こ
れら有機化学物質を分離したり、分解して浄化する必要
がある。

【０００４】この浄化に用いられる手法は、物理化学的
手法と、生物化学的手法に大別することができる。物理
化学的手法としては酸化剤を添加して酸化処理する方
法、還元剤を添加して脱ハロゲン化反応等により毒性の
低減を図る方法、高温により熱分解する方法、洗浄液に
より汚染物質を抽出して分離する方法等がある。しか
し、このような物理化学的手法では、加熱や薬剤添加に
より汚染物質だけでなく浄化対象物質の性状を大きく変
えてしまうという問題があり、また一般的に薬剤や設備
費等のコストが高くなるという問題もある。

【０００５】一方、生物活動を適切に利用し環境の汚染
物質濃度の低減を図る方法は、バイオレミディエーショ
ンと呼ばれ、環境に与える負荷が小さいこと、通常微生
物および微生物の活性を高めるための栄養源を添加する
のみであるため低コストで浄化が可能であるというメリ
ットがある。

【０００６】ここで、この微生物を用いた環境浄化の手
法であるバイオレミディエーションとしては、汚染現場
に存在する微生物を酸素、栄養源等の添加により活性を
高めて浄化を促進するバイオスティミュレーションと、
汚染物質に対して優れた浄化能を有する微生物を外部か
ら添加して浄化を行うバイオオーギュメンテーションを
あげられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、環境汚
染の原因となる化学物質には多種多様のものがあり、中
には、微生物による分解が難しい物質もある。

【０００８】例えば、ジベンゾフラン等の芳香族化合物
は、一般に生物難分解性であり、これらの分解能を有す
る微生物の報告例は少ない。また、汚染物質としてよく
取り上げられるダイオキシンについても、白色不朽菌な
ど、菌体外酵素を生成してこれを分解する菌の報告もあ
るが、それ自体を資化し得る微生物の報告は希有であ
る。

【０００９】本発明は、上記課題に鑑みなされたもので
あり、生物難分解性化合物を特定の微生物を用いて効率
的に分解する方法を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ベンゼン
環を有する難分解性物質を分解する能力を有する微生物
を鋭意探索した結果、Nocardioides属の一部の菌にベン
ゼン環を有する生物難分解性化合物を資化し増殖し得る
微生物を発見し、これを用いることにより生物難分解性
化合物を分解し、これらに汚染された物質の浄化を効率
的に行うことができることを見出した。すなわち、Noca
rdioides属の微生物は、生物難分解性化合物によって汚
染された土壌、排水、地下水、底質、飛灰等の浄化に好
適に使用できる。

【００１１】本発明に係る分解方法は、生物難分解性有
機化合物を、Nocardioides属の微生物を用いて分解する
ことを特徴とする。

【００１２】また、本発明に係る分解方法は、生物難分
解性有機化合物に、別に培養したNocardioides属の微生
物を添加し、前記生物難分解性有機化合物を分解するこ
とを特徴とする。

【００１３】また、前記生物難分解性有機化合物が、芳
香族化合物であることが好適である。

【００１４】また、前記生物難分解性有機化合物が、ベ
ンゼン環を有する化合物であることが好適である。

【００１５】また、前記生物難分解性有機化合物が、有
機塩素化合物であることが好適である。

【００１６】また、前記Nocardioides属の微生物が、No
cardioides sp. H-1であることが好適である。

【００１７】また、本発明に係る浄化方法は、上記分解
方法によって、前記生物難分解性有機化合物によって汚
染された物質を浄化することを特徴とする。

【００１８】また、本発明は、ジベンゾフラン、ビフェ
ニル分解能を有するNocardioides sp. H-1で特定される
分解菌に関する。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施形態につい
て、詳細に説明する。

【００２０】まず、本発明者らは、ダイオキシン類で汚
染された神奈川県引地川および埼玉県綾瀬川および大阪
府能勢町の河川水、底泥および土壌を採取した。そし
て、採取した試料について、次のような培養を行った。

【００２１】水試料は、スクリューキャップ付きＬ字試
験管に試料５ｍＬおよびＲＭ２無機塩合成培地３ｍＬを
添加した。また、底泥および土壌についてはＲＭ２無機
塩合成培地を添加してよく混合した後に上澄み液をＬ字
試験管に８ｍＬ入れた。

【００２２】次に、これらに、難分解性有機化学物質の
代表として２％ジベンゾフランを含有したヘプタメチル
ノナン溶液０．５ｍＬを添加して３０℃、１２０ｒｐｍ
の条件下で３日間振とう培養を行った。

【００２３】これを３回植えつぎ、濁度（６６０ｎｍの
吸光度）の上昇および溶液に変色が見られたものを選択
し、これらの培地をＳＰ寒天培地、ポリミキシンＢ添加
ＳＰ寒天培地およびジベンゾフランを塗布したＲＭ２無
機塩合成寒天培地に塗布して３０℃で７日間培養した。

【００２４】これにより出現したコロニーを釣菌し、ジ
ベンゾフランを塗布したＲＭ２無機塩合成寒天培地に植
え継ぐことを２回繰り返すことによりクリーンアップを
行ってジベンゾフラン資化性を有する菌株を得た。

【００２５】ここで、培養に用いた各培地および添加溶
液の組成を以下に示す。

【００２６】表１は、ＲＭ２無機塩合成培地の組成を示
す。

【表１】

【００２７】表２は、ＲＭ２無機塩合成培地に用いる微
量元素溶液組成を示す。

【表２】

【００２８】表３は、ＲＭ２無機塩合成培地に用いるビ
タミン溶液組成を示す。

【表３】

【００２９】表４は、ＳＰ培地組成を示す。

【表４】

【００３０】以下に上述のようにして得られた菌株Noca
rdioides sp. H-1 ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４４（受託番
号）の性状を示す。

【００３１】＜形態上の性質＞分離菌は好気性でグラム
陽性、ＳＰ寒天培地上で薄い乳白色の滑らかなコロニー
を形成する。また光学顕微鏡による観察では約１〜２μ
ｍの桿菌で運動性はみられない。

【００３２】＜生理学的試験結果＞分離菌の生育ｐＨ範
囲はｐＨ５〜８で、至適ｐＨは７であった。Catalase試
験、Oxidase試験、炭水化物の資化、加水分解試験等の
生理活性試験結果を表５に示した。なお、比較のため、
近縁種と考えられるNocardioides simplexとN.nitrophe
nolicusについて報告されている性状を併記した。

【表５】

【００３３】なお、表５には示されていないが、Elasti
n、Sodium Citrate、Erythritol、D-Arabinose、L-Xylo
se、Adonitol、Galactose、L-Sorbose、Dulcitol、Inoc
itol、Solbitol、α-Methyl-D-Mannoside、α-Methyl-D
-Glucoside、N-Acetyl-Gulcosamine、Amygdaline、Lact
ose、Melibiose、Inuline、Melezitose、D-Raffinose、
Glycogene、Xylitol、β-Gentiobiose、D-Lyxose、D-Ta
gatose、D-Fucose、L-Fucose、D-Arabitol、L-Arabito
l、Gluconate、2-Keto-Gluconate、5-Keto-Gluconateの
資化・加水分解試験は全株で陰性を示した。

【００３４】このように、今回得られた菌株は、生理学
的にNocardioides simplexや、N.nitrophenolicusと
は、異なっていることが分かった。

【００３５】＜ＤＮＡ相同性の確認＞１６Ｓリボソーム
ＲＮＡ遺伝子塩基配列解析の結果によると、分離菌はN.
simplexともっとも近縁であると考えられたため、N.sim
plexおよびその近縁種のＤＮＡとのハイブリダイゼーシ
ョンを行った。その結果、N.simplexとは４８％の相同
性を示したが、他の４菌種とは３０％以下の低い値を示
した。また、N.nitrophenolicusとの相同性は５１％で
あった。

【００３６】これらの結果より、本発明により分離され
た菌株はN.simplexおよびN.nitrophenolicusに遺伝的に
比較的近い新種であることが分かった。

【００３７】＜浄化への適用＞実浄化にあたってはこの
菌株もしくは同属の近縁種で同等の分解性を有する菌が
汚染物質中に存在する場合には栄養塩および酸素等の供
給を行うことによってNocardioides属の活性を高め、浄
化を促進することができる。また、汚染物質にこの菌株
もしくは同属の近縁種で同等の分解性を有する菌が確認
できない場合には、本菌株を大量培養して汚染物質中に
添加することができる。その際の添加方法としては液体
培地に懸濁させた状態もしくは担体等に付着させた状態
のいずれの方法でもよいが、他の菌体との競合を避け、
Nocardioides属を優先的に生育させることが望ましい。
担体としては活性炭やポリウレタンフォーム等の一般的
な生物処理に使用される担体のほかにゲル中に固定化す
る方法なども好適である。さらに、汚染物質が排水の場
合には通常の生物処理装置の後段に本属を優先的に生育
させた反応器を配置する方法なども採用できる。

【００３８】汚染物質の種類によらず他の微生物が優先
的に生育し得る環境中では本属との接触前に汚染物質を
熱処理もしくは薬品処理、紫外線処理、オゾン処理、ろ
過（孔径１μｍ以下、より望ましくは０．４５μｍ以
下）などの方法によって汚染物質中の競合細菌濃度を低
下させておくことが望ましい。

【００３９】熱処理を行う場合の温度としては蛋白質の
変性が起こる６０℃以上（より望ましくは８０℃以上）
の加熱を行うことが望ましく、薬品による殺菌を行う場
合には３％以上の過酸化水素水溶液や６０％以上のエタ
ノール水溶液を用いることが適当である。またこれらの
殺菌方法を併用することもできる。

【００４０】栄養剤としては窒素源およびリン源の添加
が挙げられるが、汚染物質中にこれらの栄養源が十分に
存在する場合には添加の必要がない場合もある。

【００４１】窒素源としては硝酸アンモニウム、硝酸カ
リウム、硝酸ナトリウム、硝酸、硝酸カルシウム、リン
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など窒素元素
を含む化合物を幅広く使用することができる。また、汚
染物質が土壌のような固形物の場合には、徐々に分解
し、アンモニウムイオンを放出するような緩効性窒素源
を利用することもできる。これらの緩効性窒素源として
はイソブチルアルデヒド加工尿素、アセトアルデヒド加
工尿素、ホルムアルデヒド加工尿素、リン酸グアニル尿
素等が容易に入手できる。

【００４２】リン源としてはリン酸カリウム、リン酸ナ
トリウム、リン酸アンモニウム等のリン酸塩等、リン元
素を含む化合物を広く用いることができる。また汚染物
質中で徐々にリン酸を放出するような緩効性リン酸肥料
が容易に入手できるためこれらを用いることも有効であ
る。

【００４３】なお、初期に菌数を増加させ、処理効果を
持続させるという観点で言えば、即効性の栄養源と緩効
性栄養源を混合して用いることも有効である。また、窒
素およびリンの添加量は対象とする汚染有機物質の量に
よって決定され、菌体構成元素の理論式から求められる
割合であるＣ：Ｎ：Ｐ＝１００：５：１以上の割合で窒
素およびリンを添加することが望ましい。この状態で静
置することにより汚染物質の分解は促進されるが、菌体
の至適温度が３０℃付近であること、好気性の菌株であ
ることを考慮すると、冬場には保温を行い、酸素を供給
するため対象汚染物質が液体の場合にはエアーパージ、
固体の場合には混合操作等を行うことが望ましい。ま
た、酸素供給には過酸化水素含有薬剤や市販の固体酸素
供給剤等を添加することも有効である。

【００４４】汚染区域における浄化処理は、例えば図１
に示すように、まず汚染区域について、滅菌処理を行う
（Ｓ１１）。また、並行して、分解菌（Nocardioides s
p. H-1）を培養しておく（Ｓ１２）。そして、滅菌処理
を行った汚染区域に培養菌を添加する（Ｓ１３）ととも
に、栄養源、酸素を供給する（Ｓ１４）。これによっ
て、汚染区域（土壌、地下水等）において、分解菌が優
先的に増殖し、処理対象となっている生物難分解性化合
物が分解される。

【００４５】また、水系の汚染に対しては、通常の活性
汚泥処理などの処理を経た処理水について、活性炭など
を用いた吸着処理を行い難分解性化合物を濃縮し、これ
を上述の分解菌を用いて分解処理することも考えられ
る。

【００４６】

【実施例】（実施例１）Ｌ字型に作成したスクリューキ
ャップ付き試験管（容量約２０ｍＬ）にＲＭ２無機塩培
地約８ｍＬを加え、Nocardioides sp. H-1を接種した。
ここに２％ジベンゾフラン含有ヘプタメチルノナン０．
５ｍＬを添加し、１２０ｒｐｍ，３０℃の条件下で振と
う培養を行った。この時の溶液におけるＯＤ６００の変
化を測定することによりジベンゾフラン資化能の測定を
行った。

【表６】

【００４７】その結果、明らかな菌体の増殖が確認さ
れ、本菌株がジベンゾフラン資化、分解能を有すること
が確認された。

【００４８】（実施例２）実施例１と同様にジベンゾフ
ランをビフェニルに変えて同一条件下での測定を行っ
た。

【表７】

【００４９】その結果、本菌株は反応は遅いものの、ビ
フェニルも資化、分解可能であることが確認された。

【００５０】（実施例３）容量５００ｍＬの綿栓付き三
角フラスコにＳＰ培地約２００ｍＬを入れ、オートクレ
ーブで滅菌した後、Nocardioides sp. H-1を接種し、１
２０ｒｐｍ，３０℃の条件下で振とう培養を行った。十
分な菌体濃度の上昇が確認された後に３０００ｒｐｍの
遠心分離器で沈降させ、滅菌したＲＭ２無機塩培地で二
回洗浄を行い集積菌を得た。次に容量７００ｍＬのバイ
アル瓶に滅菌したＲＭ２培地２００ｍＬを加え、先に集
積した菌株を懸濁させた後にｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ
−１，３−ジクロロプロペンをそれぞれ１．５ｍｇ／Ｌ
となるように添加し、密栓して１００ｒｐｍ，３０℃の
条件下で３日間振とうを行った。その後溶液の一部を採
取してＧＣ−ＭＳによる定量を行った。また、比較とし
て同様にNocardioidessp. H-1で調整して１２０℃，１
５分の条件で滅菌したものにｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ
−１，３−ジクロロプロペンをそれぞれ１．５ｍｇ／Ｌ
となるように添加し、反応させたものについても測定を
行った。

【表８】

【００５１】その結果、塩素化された生物難分解性物質
であるジクロロプロペンの分解性も非常に良いことが確
認された。

【００５２】以上のように、本菌株は多環芳香族化合物
および塩素化された物質まで幅広い生物難分解性物質を
分解、資化し得ることが明らかとなった。この菌を用い
ることにより様々な生物難分解性処理できる。

【００５３】

【発明の効果】以上説明したように、Nocardioides属の
一部の菌を用いることにより生物難分解性化合物を効率
的に分解し、物質の浄化を効率的に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 処理の一例を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０２Ｆ 11/02 Ｂ０９Ｂ 3/00 ＺＡＢＥ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 江口 正浩 東京都江東区新砂１丁目２番８号 オルガ ノ株式会社内 (72)発明者 長谷部 吉昭 東京都江東区新砂１丁目２番８号 オルガ ノ株式会社内 (72)発明者 川原 一芳 東京都港区白金５丁目９番１号 社団法人 北里研究所内 (72)発明者 平石 明 愛知県豊橋市北山町字東浦２−１ 合同宿 舎５−302 Ｆターム(参考） 4B065 AA01X AC20 BB03 BB13 BC26 CA56 4D004 AA37 AA41 AB05 AB06 AB07 AC07 CA18 CC07 4D040 DD03 4D059 AA09 BA01 BA22

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物難分解性有機化合物を、Nocardioid
   es属の微生物を用いて分解することを特徴とする生物難
   分解性化合物の分解方法。
2. 【請求項２】 生物難分解性有機化合物に、別に培養し
   たNocardioides属の微生物を添加し、前記生物難分解性
   有機化合物を分解することを特徴とする生物難分解性有
   機化合物の分解方法。
3. 【請求項３】 前記生物難分解性有機化合物が、芳香族
   化合物であることを特徴とする請求項１または２に記載
   の分解方法。
4. 【請求項４】 前記生物難分解性有機化合物が、ベンゼ
   ン環を有する化合物であることを特徴とする請求項１ま
   たは２に記載の分解方法。
5. 【請求項５】 前記生物難分解性有機化合物が、有機塩
   素化合物であることを特徴とする請求項１または２に記
   載の分解方法。
6. 【請求項６】 前記Nocardioides属の微生物が、Nocard
   ioides sp. H-1であることを特徴とする請求項１〜５の
   いずれか１つに記載の分解方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１つに記載の分
   解方法によって、前記生物難分解性有機化合物によって
   汚染された物質を浄化することを特徴とする浄化方法。
8. 【請求項８】 ジベンゾフラン、ビフェニル分解能を有
   するNocardioides sp. H-1で特定される分解菌。