JP4288198B2 - 汚染土壌の浄化方法 - Google Patents
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- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
Description
(1)洗浄法;
(2)加熱処理法(揮発・脱離)・熱分解法・溶融法;
(3)吸着法;
(4)化学分解法;
(5)生物分解法(バイオレメディエーション)。
(2)栄養剤添加(肥料等);
(3)乾燥防止(定期的な水分の添加);
(4)土壌のpH調整(石灰等の添加により中性に維持)。
(2)微生物反応槽(リアクター又はラグーン);
(3)濃縮槽(沈澱池);
(4)脱水機;
(5)脱水機等から発生する排水の処理設備。
(1)物質の分解に要する時間が長く、数百日にもおよぶこともある。
(2)処理性能が不安定である。
(3)浄化性状の適切なリアルタイムのモニタリング指標がない。
〔5〕前記脱窒菌の内の1種又は2種以上が、前記配列番号1に示す塩基配列を有するチオバシルス・ディニトリフィカンス(Thiobacillus denitrificans)近縁の脱窒菌、前記配列番号3に示す塩基配列を有するステロリバクテリウム・ディニトリフィカンス(Sterolibacterium denitrificans)近縁の脱窒菌、前記配列番号5に示す塩基配列を有するステノトロフォモナス・ナイトライティリデュウセンス(Stenotrophomonas nitritireducens)近縁の脱窒菌、及び、前記配列番号7に示す塩基配列を有するディアフォロバクター・ニトロリデュウセンス(Diaphorobacter nitroreducens)近縁の脱窒菌であることを特徴とする前記〔1〕〜〔3〕のいずれかの汚染土壌の浄化方法。
NH4 + +2H2O → NO2 - +8H+ + 6e− (1)
NO2 - + H2O → NO3 - +2H+ + 2e− (2)
2NO2 - + 6(H) → N2 + 2H2O + 2OH- (3)
2NO3 - + 10(H) → N2 + 4H2O + 2OH- (4)
(上式中の(H)は、水素供与体由来の水素を表す。)
汚染物質を除去しようとする土壌又は地下水中の嫌気環境下で棲息する脱窒菌が自生して存在する場合は、その菌を利用することが可能である。自生する脱窒菌が利用できない場合は、汚染土壌、あるいは地下水環境で棲息できる脱窒菌を含む土壌、あるいは、脱窒菌を含む水あるいは培養液を添加することが望ましい。土壌を掘り返したり、スラリー状にしたりして、脱窒菌を可能な限り均一に添加することも可能である。
まず、本発明者は脱窒反応を用いた土壌の汚染物質、あるいは地下水中の亜硝酸性窒素又は硝酸性窒素の分解除去をになう脱窒菌を、その16S rRNA遺伝子のDNAの塩基配列の、大腸菌の同遺伝子で506番目の塩基から907番目の塩基の領域(506f〜907rと略す)に相当するDNAの塩基配列を特定することに成功した。すなわち、これら脱窒菌として以下の表1に示す既知の脱窒菌と近縁な新規な塩基配列を有する脱窒菌を特定した。さらにこれらの新規な塩基配列を用いて浄化を行う脱窒菌のモニタリングを可能にした。
コールタールで汚染されたガス精製工場跡地の土壌に本方法を適用した。汚染土壌は当初、油分汚染がノルマル・ヘキサン抽出物質含有量として7000mg/kg−乾燥重量土壌であり、また、米国環境保全局(EPA)に指定された16種類の多環芳香族炭化水素類(PAHs)の含有量の和(Total−PAHs)が1040mg/kg−乾燥重量土壌(溶媒抽出−GCMS(ガスクロマトグラフ質量分析計)法で測定)とPAHsにも汚染された土壌であった。この汚染土壌1kgに海水と淡水を等体積で混合した水(海水:淡水の体積比1:1)に硝酸イオンを硝酸性窒素濃度として100mg/L溶かした水をpH8に調整したものを200mL添加し、撹拌後20℃で静置した。一日に一回、土壌を撹拌し、水の蒸発による土壌含水率の低下をふせぐため、蒸発した水の相当量の蒸留水を補充するとともに、酸性化する傾向があるため水酸化ナトリウムの溶液を用いてpHを8に維持するようにした。脱窒菌の至適pHが8前後のため、酸性化すると脱窒菌の活性が低下するためである。土壌中の酸化還元電位は−100mV(飽和塩化カリウム 銀/塩化銀電極基準、以下同じ)以上−20mV以下に維持されており還元的な環境になっていることを確認した。
解析は以下のようにおこなった。浄化処理工程において、土壌を経時的に採取した。土壌試料20gを緩衝液(100mM Tris−HCl(pH9.0)、40mM EDTA)に懸濁してホモジナイザーにより分散した。次いで、塩化ベンジル法によりDNAを抽出した。抽出したDNAはエタノール沈澱で濃縮回収した。回収したDNAについて GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham) を用いてDNAを精製して土壌からの夾雑物を除いた。精製したDNAを鋳型としてPCR法によりDNAの検出感度を上げるとともに、DGGE法によりわずかな塩基配列の違いでも検出できるようにした。使用したプライマーを以下の表2に示す。
石炭系油分で汚染されたガス精製工場跡地の土壌に本方法を適用した。汚染土壌は当初、油分汚染がノルマル・ヘキサン抽出物質含有量として7000mg/kg−乾燥重量土壌であり、また、米国環境保全局(EPA)に指定された16種類の多環芳香族炭化水素類(PAHs)の含有量の和(Total−PAHs)が1240mg/kg−乾燥重量土壌(溶媒抽出−GCMS(ガスクロマトグラフ質量分析計)法で測定)含んでおり、PAHsにも汚染されていた。この汚染土壌1kgに海水に亜硝酸イオンを亜硝酸性窒素濃度として100mg/L溶かした水をpH8に調整したものを200mL添加し、撹拌後20℃で静置した。一日に一回、土壌を撹拌し、水の蒸発による土壌含水率の低下をふせぐため、蒸発した水の相当量の上記添加液、ただし海水由来の塩分濃縮を防ぐために、淡水に溶解させた添加液を補充するとともに、酸性化する傾向があるため水酸化ナトリウムの溶液を用いてpHを8に維持するようにした。土壌中の酸化還元電位は−100mV(飽和塩化カリウム 銀/塩化銀電極基準、以下同じ)以上−20mV以下に維持されており還元的な環境になっていることを確認した。
解析は以下のようにおこなった。浄化処理工程において、土壌を経時的に採取した。土壌試料20gを緩衝液(100mM Tris−HCl(pH9.0)、40mM EDTA)に懸濁してホモジナイザーにより分散した。次いで、塩化ベンジル法によりDNAを抽出した。抽出したDNAはエタノール沈澱で濃縮回収した。回収したDNAについて GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham) を用いてDNAを精製して土壌からの夾雑物を除いた。精製したDNAを鋳型としてPCR法によりDNAの検出感度を上げるとともに、DGGE法によりわずかな塩基配列の違いでも検出できるようにした。PCRプライマーは先の表2に示したものを用いた。
硝酸性窒素濃度が43mg/Lと窒素汚染している地下水を採取して、0.2μmろ過により無菌化処理した。また、地下水採取位置近傍の土壌を採取して、オートクレーブ処理にて無菌化した土壌を用意した。無菌化した地下水1Lと、無菌化した土壌1kgを混合して、図7に示すように密栓できる2Lの容器2本にそれぞれ等量ずつ入れた。一方には、配列番号1に示す塩基配列を有するチオバシルス・ディニトリフィカンス(Thiobacillus denitrificans)近縁の脱窒菌の培養液(菌体濃度 1×108個/mL)を1mL添加して混合したものとした。培養液の組成は、Na2HPO4 1.2g/L、KH2PO4 1.8g/L、MgSO4・7H2O 0.1g/L、(NH 4 )2SO4 0.1g/L、CaCl2 0.03g/L、FeCl3 0.02g/L、MnSO4 0.02g/L、Na2S2O3 10g/L、NaHCO3 0.5g/L、KNO3 5g/Lである。
配列番号1〜7の塩基配列をその16S rRNA遺伝子の一部に有する7種類の微生物を含む土壌と近接した位置に存在している土壌の一部を採取して、そのDNAを塩化ベンジル法によりDNAを抽出した。抽出したDNAはエタノール沈澱で濃縮回収した。回収したDNAについて GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham) を用いてDNAを精製して夾雑物を除いた。精製したDNAを鋳型としてPCR法によりDNAの検出感度を上げるとともに、DGGE法によりわずかな塩基配列の違いでも検出できるようにした。PCRプライマーは先の表2に示したものを用いた。
2…地下水と土壌の混合物
3…容器
Claims (5)
- 土壌中の脱窒菌の塩基配列に基づく検出により、16SrRNA遺伝子中に配列番号1に示す塩基配列を有するチオバシルス・ディニトリフィカンス(Thiobacillus denitrificans)近縁の脱窒菌、又は、16SrRNA遺伝子中に配列番号2若しくは3に示す塩基配列を有するステロリバクテリウム・ディニトリフィカンス(Sterolibacterium denitrificans)近縁の脱窒菌、又は、16SrRNA遺伝子中に配列番号4若しくは5に示す塩基配列を有するステノトロフォモナス・ナイトライティリデュウセンス(Stenotrophomonas nitritireducens)近縁の脱窒菌、又は、16SrRNA遺伝子中に配列番号6若しくは7に示す塩基配列を有するディアフォロバクター・ニトロリデュウセンス(Diaphorobacter nitroreducens)近縁の脱窒菌の内の1種又は2種以上の存在が確認された土壌を、硝酸性窒素及び/又は亜硝酸性窒素を含む水と共に、汚染土壌に添加し、或いは、前記検出により前記脱窒菌の内の1種又は2種以上の存在が確認された汚染土壌に、硝酸性窒素及び/又は亜硝酸性窒素を含む水を添加し、嫌気条件下で、前記汚染土壌中の汚染物質を分解することを特徴とする汚染土壌の浄化方法。
- 前記汚染物質が、原油および原油から精製された石油製品に起因する油分、石炭製品に起因する油分、動植物油、ベンゼンを主体とする単環芳香族炭化水素、フェナントレン、フルオレン若しくはピレンを主体とする多環芳香族炭化水素、テトラクロロエチレン若しくはトリクロロエチレンを主体とする含ハロゲン炭化水素の内の1種又は2種以上を含有することを特徴とする、請求項1に記載の汚染土壌の浄化方法。
- 前記嫌気条件が、飽和塩化カリウム銀/塩化銀電極基準の酸化還元電位で、−100mV以上−20mV以下であることを特徴とする請求項1又は2に記載の汚染土壌の浄化方法。
- 前記脱窒菌の内の1種又は2種以上が、前記配列番号1に示す塩基配列を有するチオバシルス・ディニトリフィカンス(Thiobacillus denitrificans)近縁の脱窒菌、前記配列番号2に示す塩基配列を有するステロリバクテリウム・ディニトリフィカンス(Sterolibacterium denitrificans)近縁の脱窒菌、前記配列番号4に示す塩基配列を有するステノトロフォモナス・ナイトライティリデュウセンス(Stenotrophomonas nitritireducens)近縁の脱窒菌、及び、前記配列番号6に示す塩基配列を有するディアフォロバクター・ニトロリデュウセンス(Diaphorobacter nitroreducens)近縁の脱窒菌であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の汚染土壌の浄化方法。
- 前記脱窒菌の内の1種又は2種以上が、前記配列番号1に示す塩基配列を有するチオバシルス・ディニトリフィカンス(Thiobacillus denitrificans)近縁の脱窒菌、前記配列番号3に示す塩基配列を有するステロリバクテリウム・ディニトリフィカンス(Sterolibacterium denitrificans)近縁の脱窒菌、前記配列番号5に示す塩基配列を有するステノトロフォモナス・ナイトライティリデュウセンス(Stenotrophomonas nitritireducens)近縁の脱窒菌、及び、前記配列番号7に示す塩基配列を有するディアフォロバクター・ニトロリデュウセンス(Diaphorobacter nitroreducens)近縁の脱窒菌であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の汚染土壌の浄化方法。
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