CN116890028A - 一种稻蟹共作-微生物耦合及其修复稻田多环芳烃机制的分析方法 - Google Patents

一种稻蟹共作-微生物耦合及其修复稻田多环芳烃机制的分析方法 Download PDF

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CN116890028A CN202310937131.1A CN202310937131A CN116890028A CN 116890028 A CN116890028 A CN 116890028A CN 202310937131 A CN202310937131 A CN 202310937131A CN 116890028 A CN116890028 A CN 116890028A
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Abstract

本发明公开了一种稻蟹共作‑微生物耦合及其修复稻田多环芳烃机制的分析方法，属于农业水土环境修复领域。采用本发明的方法，有利于稻田多环芳烃的去除，在稻蟹共作耦合微生物模式中稻田土壤中多环芳烃(菲)去除率达到了88.92％，减少了水稻及螃蟹中菲的富集，增加了水稻根系分泌物的中多糖、有机酸、糖类等物质的分泌；促进了水稻的根系的生长、包括根尖、茎长、及根表面积的上升；促进了螃蟹的生长，包括体重、甲宽的增加；促进了土壤微生物群落丰度的增加及多样性，以及代谢功能的增强；促进了土壤酶活性的改善，土壤脲酶、脱氢酶、磷酸酶、以及蔗糖酶等活性提升、过氧化物酶及多份氧化物酶等应激酶活性恢复至常态。

Description

一种稻蟹共作-微生物耦合及其修复稻田多环芳烃机制的分 析方法
技术领域
本发明涉及一种稻蟹共作-微生物耦合及其修复稻田多环芳烃机制的分析方法，属于农业水土环境修复领域。
背景技术
多环芳烃是一种广泛存在于环境中的持久性有机污染物，具有致畸、致癌、致突变的性质。环境中大多数多环芳烃沉积于土壤中，损害了土壤健康，特别是在农业用地中，它们不仅会积累于农田作物中，威胁粮食作物安全，而且会通过食物链传播到更高的营养级水平，进而增加人类健康风险。
稻田作为农业用地的主要形式，覆盖了全球约1.6亿公顷的面积，无可避免的遭受着多环芳烃污染，并影响种植于其中的水稻健康安全。许多研究表明，水稻根部会吸收稻田中的多环芳烃，并将其输送到其他组织中，导致水稻植物的内部结构和器官受损，叶片变黄，甚至死亡，从而影响食品安全。因此，修复稻田中的多环芳烃污染并减少水稻植株中的多环芳烃积累，对于确保食品安全至关重要。
已经开发了许多手段如物理、化学和生物手段修复受多环芳烃污染的土壤。微生物修复法因其低风险和环境友好的特点，被广泛用于作物种植土壤污染的修复包括稻田、玉米田等。然而，外源微生物在修复农田土壤时会与作物竞争土壤养分，导致微生物代谢活动减少并且难以增殖。此外，大型土壤基质对污染物的物理保护限制了污染物的可及性和可用性，锁定与土壤中的多环芳烃难以解吸出来，导致微生物代谢过程相对缓慢以及PAHs不能被微生物完全降解，而稻田中由于上覆水存在导致的缺氧环境，进一步限制了微生物修复的效果。因此微生物在修复稻田田多环芳烃污染物方面仍然有一定的局限性需要克服。
许多学者研究了添加表面活性剂来促进土壤多环芳烃的解吸以增强微生物的修复效果，然而一些表面活性剂(如阳离子表面活性剂)的使用会对土壤造成损害，一些研究报告(和/>2010年，/>等人，2003年)活性剂的使用会增加生态学毒性的报告，不利于种植作物的生长。因此，迫切需要一种更安全、有效的方法来促进微生物对于受多环芳烃污染的稻田的修复。
最近的研究表明，具有生物扰动特征的稻蟹共作模式可能有助于克服上述问题。稻蟹共作作为水稻生产的重要组成部分已有2000多年的历史，对改善土壤质量和提高稻田生态有着积极的影响，其中的螃蟹充当生物扰动器能够有促进稻田土壤机制的流动并改善稻田的缺氧条件，展现出了一定改善土壤的潜力有利于有机污染物代谢的潜力。不仅如此，在稻蟹共作系统中，水稻、蟹类、微生物三者之间相互影响，形成了复杂的关系。一方面水稻与蟹类通过直接或间接的方式影响着土壤微生物群落，另一方面，微生物的生长带来的土壤功能的改善同样作用于水稻与蟹类的生长。稻蟹共作-微生物可能存在某种耦合关系，能够促进彼此生长。相较于传统稻田，螃蟹的生物扰动是稻蟹共作系统中的额外特征。螃蟹作为生物扰动器，被证明能有效改善稻田底泥理化性质并促进土壤颗粒迁移，并且具有促进污染物如重金属和多环芳烃从栖息地的释放的作用。
菲(phe)是最常见的低环多环芳烃污染物，具较高的有挥发性、水溶性和毒性，本研究以多环芳烃的典型污染物菲(phe)为研究对象，探究利用稻蟹共作微生物耦合效应是否能够有效修复稻田底泥多环芳烃，对于实现稻田边生产边治理，保护食品安全具有重要意义。
发明内容
本发明针对于稻田多环芳烃污染物理化学修复技术成本高、基础设施复杂、微生物修复技术修复缓慢、效果不好的痛点，提出了一种利用稻蟹共作-微生物耦合模式，该方法能有效地促进稻田系统生物生长、修复受污染的稻田土壤并且能够减少水稻多环芳烃的富集，保证粮食食品安全及人类健康安全。
稻蟹共作微生物耦合形成的植物-动物-微生物联合体在实现稻田土壤污染的可持续修复和水稻的安全生产极具潜力，在稻蟹共作系统微生物耦合系统中，水稻、蟹类、微生物三者之间相互影响，形成了复杂的关系。
一方面外源微生物可以直接作用于土著微生物，改变土著微生物群落结果，影响土壤功能，进而影响到稻田系统中生物的生长；另一方面，水稻与蟹类又影响稻田的水土环境质量，由此间接地影响了栖息于土壤中的微生物；同时，水稻根系分泌物又受到蟹类扰动的影响，即蟹类扰动也对微生物产生间接影响。
值得注意的是，微生物因能降解底泥多环芳烃，进而降低底泥毒性，改善和提升稻田水土环境，从而为水稻与蟹类的生长提供更适宜的水土环境。
综上，在稻蟹共作系统中，稻蟹共作-微生物可能存在某种耦合关系，探寻该耦合机制对于生物降解稻田底泥多环芳烃具有重要意义。此外，若使稻田底泥中多环芳烃被微生物降解，势必要求锁定在土壤颗粒中的多环芳烃被解吸出来，而在稻蟹共作系统中，蟹类生物扰动恰恰能促进底泥中多环芳烃的释放，但释放出来的多环芳烃能否被微生物高效地降解，这些问题尚不明确，亟待探求。
因此，探索稻蟹共生体促进稻田污染可持续修复的潜力和可能机制是必要的。因此需要进行如下研究：
本发明提供了一种稻蟹共作微生物耦合体系，所述体系中，水稻、蟹类与微生物关系复杂，不同角色间的相互影响调控，其中存在的耦合机制有待深入分析：
试验设置处理如下表1所示：
表1：试验设置
通过根系扫描仪分析水稻根系指标(如根表面积、根长、根直径等)、并分析水稻中过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性、衡量水稻生理状况。采用游标卡尺测量螃蟹体长、体宽、采用电子天平测定水稻重量(总重、根茎叶的重)及螃蟹重量。采用高通量测序(16sRNA)测定土壤微生物群落丰度以衡量稻蟹共作系统对于微生物群落多样性的影响。
以此分析稻蟹共作微生物耦合机制。
1)稻蟹共作微生物耦合体系中锁定于底泥颗粒中的多环芳烃释放动力学和释放机制有待研究；
试验设置处理如下表2所示：
表2：试验设置
通过HPLC测定水样品中提取出来的菲，通过计算菲释放通量及一级动力学模型定量分析对于稻蟹共作耦合体系中土壤菲的释放量以及土壤菲的解吸速率。使用激光粒度仪检测土壤粒径的变化，采用GC-MS对于低分子量有机酸含量进行测定。
3)稻蟹共作微生物耦合体系修复稻田多环芳烃污染的机制有待深入探讨
试验设置处理如下表3所示：
表3：试验设置
通过HPLC测定水样品中提取出来的菲，水稻从土壤中小心取出后，使用清水洗涤根部土壤，随后使用去离子水清洗两次，之后将其放置于装有200mL的玻璃容器中，收集12小时，在通过0.45um的滤膜过滤后，将其冷冻并存储于-20℃冰箱中等待使用，采用超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC-MS)测定滤液中的氨基酸含量、气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定滤液中的低分子量有机酸含量、液相色谱质谱联用仪(LC-MS)测定根系分泌物的糖类含量。将土壤过2mm筛，风干，称取2g土壤用于土壤脲酶测定；如上处理同样称取2g土壤，用TTC分光光度法测定土壤酶脱氢酶活性，使用3-5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活性。高通量测序法对沉积物中的微生物群落结构进行了测定，使用QIIME(1.8.0版)计算了土壤微生物群落Shannon指数以衡量微生物群落多样性。使用PICRUST软件预测了微生物群落功能代谢基因。
本发明还提供了一种稻蟹共作微生物耦合体系，在稻蟹共作系统中，水稻、蟹类与微生物关系复杂，存在一定的耦合效应，提出了稻蟹共作微生物耦合机制分析方法，并通过具体案例深入分析了稻蟹共作微生物耦合机制。
本发明还研究了稻蟹共作微生物耦合体系中锁定与底泥颗粒中的多环芳烃释放动力学和释放机制分析。
本发明还提出了稻蟹共作微生物耦合修复稻田多环芳烃的机制分析方法，并通过案例对于稻蟹共作微生物耦合修复稻田的多环芳烃的机制进行了分析。
本发明提供了一种修复稻蟹共作稻田底泥中多环芳烃污染的方法，所述方法为，在稻蟹共作稻田中添加假单胞菌微生物菌剂。所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：将假单胞菌ACCC 02173种子液经梯度降温培养后得到的；
所述梯度降温培养为，将假单胞菌ACCC 02173种子液依次在28℃～5℃温度范围内进行培养，梯度降温采用的温度降幅为1～3℃，每一轮温度梯度培养时间为：24～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：Pseudomonas mendocina购买于中国农业微生物保藏中心，保藏编号为ACCC 02173。我们进行了复苏初代培养孵育，并进行了传代培养。通过低温驯化，使其能适应5摄氏度的低温环境，并能正常增殖。通过分光光度法，我们估算了菌落的浓度，最终将其浓度调整至约为1.0×108CFU·g-1。当其活性较好时，我们按照0.5％，1％，3％，5％，的质量比将其接种于需要的土壤中。并确定最适宜的接种量。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：
将假单胞菌ACCC 02173种子液首先在28℃培养24h，然后在26℃，培养24h，再在24℃培养24h，再在22℃培养24h，再在20℃培养24h，再在18℃培养24h，再在16℃培养24h，再在14℃培养24h，再在12℃培养24h，再在10℃培养24h，再在8℃培养24h，再在6℃培养24h，最后在5℃培养24h；制备得到假单胞菌微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物菌剂的添加量至少为：0.5％。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌包括但不限于：Pseudomonasmendocina。
在本发明的一种实施方式中，所述稻蟹共作稻田为：在水稻分蘖期，加入螃蟹。
在本发明的一种实施方式中，所述稻蟹共作稻田中添加的蟹包括但不限于：中华绒螯蟹、梭子蟹、青蟹、花蟹。
本发明还提供了一种促进水稻生长的方法，所述方法为，在稻蟹共作稻田中添加假单胞菌微生物菌剂；所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：将假单胞菌ACCC 02173种子液经梯度降温培养后得到的；
所述梯度降温培养为，将假单胞菌ACCC 02173种子液依次在28℃～5℃温度范围内进行培养，梯度降温采用的温度降幅为1～3℃，每一轮温度梯度培养时间为：24～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物种子液的制备方法为：将假单胞菌(Pseudomonas mendocina)冻干粉，加入1mL葡萄糖营养琼脂液体培养基重悬管内的菌体，随后将菌悬液全部取出放入事先准备好的10mL葡萄糖营养琼脂液体培养基，培养48小时。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物菌剂的添加量至少为：水土质量比为0.5％的悬菌液比。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：
将假单胞菌ACCC 02173种子液首先在28℃培养24h，然后在26℃，培养24h，再在24℃培养24h，再在22℃培养24h，再在20℃培养24h，再在18℃培养24h，再在16℃培养24h，再在14℃培养24h，再在12℃培养24h，再在10℃培养24h，再在8℃培养24h，再在6℃℃培养24h，最后在5℃培养24h；制备得到假单胞菌微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌包括但不限于：Pseudomonasmendocina
在本发明的一种实施方式中，所述蟹包括但不限于：中华绒螯蟹、梭子蟹、青蟹、花蟹。
本发明还提供了一种促进水稻根部分泌低分子有机酸、氨基酸、及糖类物质的方法，所述方法为，在稻蟹共作稻田中添加假单胞菌微生物菌剂；所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：将假单胞菌ACCC 02173种子液经梯度降温培养后得到的；
所述梯度降温培养为，将假单胞菌ACCC 02173种子液依次在28℃～5℃温度范围内进行培养，梯度降温采用的温度降幅为1～3℃，每一轮温度梯度培养时间为：24～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：
将假单胞菌ACCC 02173种子液首先在28℃培养24h，然后在26℃，培养24h，再在24℃培养24h，再在22℃培养24h，再在20℃培养24h，再在18℃培养24h，再在16℃培养24h，再在14℃培养24h，再在12℃培养24h，再在10℃培养24h，再在8℃培养24h，再在6℃培养24h，最后在5℃培养24h；制备得到假单胞菌微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：葡萄糖营养液体培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物菌剂的添加量至少为：0.5％。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌包括但不限于：Pseudomonasmendocina。
在本发明的一种实施方式中，所述蟹包括但不限于：中华绒螯蟹、梭子蟹、青蟹、花蟹。
本发明还提供了假单胞菌微生物菌剂在修复稻蟹共作稻田底泥中多环芳烃污染，促进稻蟹共作稻田中水稻生长，在促进稻蟹共作稻田水稻根部分泌低分子有机酸、氨基酸、及糖类物质，和在降低多环芳烃污染的稻蟹共作稻田中水稻中的菲中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为，在稻蟹共作稻田中添加假单胞菌微生物菌剂；所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：将假单胞菌ACCC 02173种子液经梯度降温培养后得到的；
所述梯度降温培养为，将假单胞菌ACCC 02173种子液依次在28℃～5℃温度范围内进行培养，梯度降温采用的温度降幅为1～3℃，每一轮温度梯度培养时间为：24～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：
将假单胞菌ACCC 02173种子液首先在28℃培养24h，然后在26℃，培养24h，再在24℃培养24h，再在22℃培养24h，再在20℃培养24h，再在18℃培养24h，再在16℃培养24h，再在14℃培养24h，再在12℃培养24h，再在10℃培养24h，再在8℃培养24h，再在6℃培养24h，最后在5℃培养24h；制备得到假单胞菌微生物菌剂。
有益效果
(1)本发明的方法，有利于稻田多环芳烃的去除，在稻蟹共作耦合微生物模式中稻田土壤中多环芳烃(菲)去除率达到了88.92％，减少了水稻及螃蟹中菲的富集，增加了水稻根系分泌物中的多糖、有机酸、糖类等物质的分泌；富马酸(Fumaric acid)、琥珀酸(Succinic acid)、乳酸(Lactic acid)、柠檬酸(Citric acid)、果酸(Fruit acid)增加了3.54％～73.96％；促进了水稻的根系的生长、包括根尖、茎长、及根表面积的上升。促进了螃蟹的生长，包括体重、甲壳宽度(甲宽)的增加。促进了土壤微生物群落丰度的增加及多样性，以及代谢功能的增强。促进了土壤酶活性的改善，土壤脲酶、脱氢酶、磷酸酶、以及蔗糖酶等活性提升、过氧化物酶及多份氧化物酶等应激酶活性恢复至常态；促进了水稻植株抗逆性的增加，水稻中超氧化物酶、过氧化物酶、过氧化氢酶得到提升、丙二醛显著下降。改善了土壤粒度，提高了稻田土壤中细粒的占比、减少了土壤中的大颗粒。
(2)稻蟹共作微生物耦合模式利用生物间的协同效应修复多环芳烃污染，实现了绿色、安全、有效的修复稻田污染。并且克服了传统微生物修复土壤污染的局限性，如修复效果差、过程缓慢等局限性。该体系不仅修复了稻田土壤污染，而且由于螃蟹的加入附带了额外的经济价值，进一步减少了修复的投入，并可以支持更高效及多功能微生物菌剂的研究。此修复模式能够大规模使用，管理简单，附带的经济价值增强了其商业机会，具有可推广性。
(3)本研究在稻蟹共作微生物耦合体系中，分析稻蟹对于微生物群落变化的影响，并通过研究螃蟹与水稻的生长变化，了解微生物对于螃蟹与水稻的调控作用，从而探究体系内不同角色间的相互作用，阐明其耦合机制。
(4)本发明通过计算菲释放通量和一级动力学模型定量分析螃蟹的扰动对于锁定底泥的多环芳烃释放的影响。本发明通过研究耦合体系内稻田多环芳烃变化及生物(水稻、螃蟹)富集变化，结合土壤酶活性变化、水稻根系分泌物产物分析、及基因组学阐明稻蟹共作微生物耦合修复稻田多环芳烃机制。
附图说明
图1：代谢通路基因。
图2：不同处理下15、30、45、60、75和90天的土壤酶活性；其中，a为脱氢酶活性；b为素酶活性；c为蔗糖酶活性；d为磷酸酶活性；e为过氧化物酶活性；f为多酚氧化酶活性；不同的字母表示各处理间酶活性的显著差异(P<0.05)。
图3：菲降解基因预测。
具体实施方式
下述实施例中所采集的土壤来自黑龙江省哈尔滨市东北农业大学的农田。下述实施例中所涉及的螃蟹购自：辽宁盘锦螃蟹生产养殖基地的中华绒螯蟹。
下述实施例中所涉及的Pseudomonas mendocina ACCC 02173购买于中国农业微生物保藏中心，保藏编号为ACCC 02173。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
菲的含量的检测：
土壤中菲提取：在2克土壤中加入菲d10标准混合物，与10g无水硫酸钠混合，并加入二氯甲烷与丙酮混合物(体积比为1:1)，处理后的土壤经超声震荡萃取30min，将萃取后获得的溶液过滤，得到的滤液进入硅胶柱(10cm×6mm ID)，然后用正己烷与二氯甲烷混合物(体积比为1：1)洗脱，取5mL洗脱液经过旋转蒸发浓缩后，加入5mL甲醇溶解，取1mL溶解液待测。
水样中菲提取：水样取自稻蟹系统上覆水，水样经过滤膜(BKMAN、0.22μm孔径、0.47mm直径)过滤。取1mL滤液待测。
水稻中菲提取：将水稻放入陶瓷研钵，用研杵充分碾碎，称取2g重复土壤菲提取的步骤。
生物中菲提取：将螃蟹腹部软组织，包括肌肉和内脏取出，并对取出的部分进行均质化处理，称取2g重复土壤菲提取的步骤。
采用配有高纯度C18柱的高效液相色谱仪(U3000，Thermo Fisher，美国)测定土壤、上覆水及生物样品中提取出来的菲，使用甲醇-水(90：10)作为流动相，流速为1mL·min-1，在253nm波长下检测菲。配制不同浓度的菲的标准溶液，测定菲浓度，绘制菲浓度—峰面积图，R2>0.99。试验中菲d10的回收率在87％～104％之间。
水稻中氨基酸、有机酸、糖类，土壤酶脱氢酶活性、蔗糖酶活性、微生物群落结构、粒径的分析方法：
水稻从土壤中小心取出后，使用清水洗涤根部土壤，随后使用去离子水清洗两次，之后将其放置于装有200mL的玻璃容器中，收集12小时，在通过0.45um的滤膜过滤后，将滤液冷冻并存储于-20℃冰箱中待用，采用超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC-MS)测定滤液中的氨基酸含量、气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定滤液中的低分子量有机酸含量、液相色谱质谱联用仪(LC-MS)测定根系分泌物的糖类含量。
将土壤过2mm筛，风干，称取2g土壤，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)分光光度法测定土壤酶脱氢酶活性，采用3-5-二硝基水杨酸比色法测定土壤蔗糖酶活性。采用高通量测序法测定土壤微生物群落结构，采用QIIME(1.8.0版)计算了土壤微生物群落Shannon指数以衡量微生物群落多样性，采用PICRUST软件预测了微生物群落功能代谢基因。采用激光粒度仪检测土壤粒径的变化。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
葡萄糖营养肉汤培养基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0～20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2。
实施例1：微生物菌剂的制备
具体步骤如下：
(1)菌种复苏
使用无菌吸管吸取1mL葡萄糖营养肉汤培养基，将存放于冻干管中的Pseudomonasmendocina ACCC 02173菌粉溶解。将溶解后的悬菌液于30℃的条件下，转移至10mL的葡萄糖营养肉汤培养基中，培养5天复苏菌种。
(1)菌株的活化、种子液的制备
将复苏后的Pseudomonas mendocina ACCC 02173菌株，无菌环境下取5mL菌液，接种至葡萄糖营养肉汤斜面培养基中，在30℃条件下进行培养2天进行活化，得到活化后的菌液；将活化后的菌液接种至葡萄糖营养肉汤培养基中，在30℃条件下进行培养3天，制备得到种子液。
(2)菌株低温梯度培养
将制备得到的种子液，在转速为180r/min恒定不变的条件下进行温度梯度培养，具体如下：
首先在28℃培养24h，然后在26℃，培养24h，再在24℃培养24h，再在22℃培养24h，再在20℃培养24h，再在18℃培养24h，再在16℃培养24h，再在14℃培养24h，再在12℃培养24h，再在10℃培养24h，再在8℃培养24h，再在6℃培养24h，最后在5℃培养24h；制备得到微生物菌剂。
经检测，制备得到的微生物菌剂中，活菌数为：3.0×108CFU/mL。
实施例2：添加了微生物菌剂的稻蟹共作稻田制备
具体步骤如下：
(1)采集土壤后，经过风干并过2mm筛，去除土壤中的石块、木屑等杂物，留待使用；
(2)采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的过筛土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水；
(3)在需要种植水稻的处理组别中，种植体型相似的16穴水稻(水稻种子是从中国购买的龙粳系列种子)，并在需要放入螃蟹的处理中选择5只螃蟹体系相似，生长状况良好的螃蟹。
(4)在需要添加微生物菌剂的处理组别中以1％、3％、5％水土比(体积质量比)加入微生物悬菌液，在不需要接种微生物的处理中加入灭活的悬菌液作为对照。
具体实验分组如下：
R组：水稻组，具体为采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的没有菲污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水，并在每个装置中移植事先准备好的健康水稻植株，每个装置移栽12穴(每穴5株水稻)；
C组：仅添加螃蟹，不种植水稻，具体为采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的没有菲污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水，并在每个装置添加5只螃蟹，添加密度参考《黑龙江稻蟹共作技术规范》(DB23T 27602021)；
RC组：水稻+螃蟹，具体为，采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的没有菲污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水，并在每个装置中移植事先准备好的健康水稻植株，每个装置移栽12穴(每穴5株水稻)，随后添加5只螃蟹，添加密度参考《黑龙江稻蟹共作技术规范》(DB23T 27602021)；
RCM(1％)组：水稻+螃蟹+微生物，具体为，采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的没有菲污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水，并在每个装置中移植事先准备好的健康水稻植株，每个装置移栽12穴(每穴5株水稻)，随后添加5只螃蟹，添加密度参考《黑龙江稻蟹共作技术规范》(DB23T 27602021)；将实施例1制备得到的假单胞菌剂按1％的水土质量比接种于该组实验装置的土壤中；
RCM(3％)组：水稻+螃蟹+微生物，具体为，采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的没有菲污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水，并在每个装置中移植事先准备好的健康水稻植株，每个装置移栽12穴(每穴5株水稻)，随后添加5只螃蟹，添加密度参考《黑龙江稻蟹共作技术规范》(DB23T 27602021)；将实施例1制备得到的假单胞菌剂按3％的水土质量比接种于该组实验装置的土壤中；
RCM(5％)组：水稻+螃蟹+微生物，具体为，采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的没有菲污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水，并在每个装置中移植事先准备好的健康水稻植株，每个装置移栽12穴(每穴5株水稻)，随后添加5只螃蟹，添加密度参考《黑龙江稻蟹共作技术规范》(DB23T 27602021)；将实施例1制备得到的假单胞菌剂按5％的水土质量比接种于该组实验装置的土壤中。
实施例3：实验结果的分析
试验持续1个月，对实施例2的实验结果分析如下：
1、试验结束时分析稻蟹共作系统内水稻及螃蟹的生长变化，采用愈创木酚法分析水稻植株叶片中过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性，采用氮蓝四哗法分析超氧化物歧化酶(SOD)，采用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应测定丙二醛(MAD)的含量，衡量水稻生理状况和抗氧化能力，结果如表4、表5所示。
表4：水稻SOD、POD、MDA、CAT
表5：与R组相比，其他处理组的水稻SOD、POD、MDA、CAT增长率
表4-5所示，在螃蟹和假单胞菌的协同处理下，MDA含量有显著上升。与对照组相比，MDA含量降低，特别时在RCM(3％)处理下，下降了48.86％。不同浓度的微生物菌剂处理，对SOD、CAT活性的影响差异极显著。在稻蟹共作微生物处理下，RCM(1％)组SOD、CAT活性最低、RCM(5％)活性最高。与对照组R比较，微生物处理下POD活性有显著增加，不同微生物施加量的影响差异不明显。
2、稻蟹共作微生物耦合机制分析
(1)通过根系扫描仪，分析水稻根系指标(如根表面积、根长、根直径等)，采用电子天平测定水稻重量(总重、根、茎、叶的重)，结果如表6、表7所示。
表6：水稻生长总重、根、茎、叶重量变化
表7：水稻根系指标变化
如表6-7所示，就水稻而言，微生物的加入能够促进水稻的生长，包括水稻植株重量的增加与水稻根系的发育，但不同质量比的促进作用有所差异，3％质量比悬菌液加入的情况下，水稻总重达到16.13g，水稻根长为19.68cm、根面积为367.04cm2，根尖、跟直径等均有一定的增长；
(2)采用游标卡尺测量螃蟹体高、甲宽、采用电子天平测定螃蟹体重(表8)。
表8：螃蟹体高、甲宽、体重变化
如表8所示，就螃蟹而言，稻蟹共作有利于螃蟹的生长，得益于水稻为螃蟹提供了额外的营养来源，调节了食物链的营养流动。螃蟹体高、甲宽、体重的上升趋势在微生物的加入后得到进一步增强。在3％的微生物菌剂加入后，其促进效果最为显著。
(3)采用高通量测序(16sRNA)测定土壤微生物群落丰度以衡量稻蟹共作系统对于微生物群落多样性的影响。高通量测序表明稻蟹共作微生物耦合模式提高了微生物群落的多样性与丰度，不同处理下样品的测序覆盖值高于98％，表明测序深度足以覆盖样品整个微生物群落。多样性分析(Alpha多样性)结果如表9所示。
表9：微生物群多样性
表9结果显示，M处理中的chao1(1482.37)和observed_species(1014)可以反映微生物群落的丰度和多样性，相比之下CM处理下chao1(1254.02)和observed_species(779)有所下降，表明螃蟹的引入减少了土壤微生物群落的多样性与丰度，这可能是由于螃蟹对于土壤微生物的摄食作用不利于微生物群增殖，而RM组处理的chao1(1704.8)和observed_species(1233)有所升高，表明水稻有利于土壤微生物群群落的多样化。而RCM组处理的chao1指数(2042.74)和observed_species(1847)数值最高，表明RCM组样本中物种丰富度和物种数量最高。
推测水稻的加入为土壤微生物提供了碳氮来源，也为螃蟹提供了营养来源，进而减少了螃蟹对于土壤微生物的摄食作用。上述结果表明稻蟹共作体系能够减少体系内动物的不利影响，并将植物的促进作用进一步放大，有效促进土壤微生物群落的增殖与多样性。
(4)代谢功能基因检测
如图1所示，所有预测的功能基因主要与KEGG通路中七个部分的功能相关，结果表明，稻蟹共作微生物耦合模式能够有效提高碳水化合物代谢、脂质代谢途径、同型半胱氨酸脱氢酶途径、外源物质生物降解代谢途径、萜类和多酮类化合物代谢等代谢通路。表明稻蟹共作微生物耦合系统提高了土壤的代谢能力，促进了微生物对于体系内物质的代谢能力，特别是促进了外源物质生物降解代谢功能以及碳水化合物代谢功能的上调，能够有效促进稻田土壤内多环芳烃的代谢。
实施例4：稻蟹共作微生物耦合体系改善稻田质量减少多环芳烃污染风险效果
具体步骤如下：
1、菲污染土壤的制备：
(1)采集土壤后，经过风干并过2mm筛，去除土壤中的石块、木屑等杂物；
(2)将上述混合好的土壤样品保存于黑暗环境中，室温约为25℃，静置沉淀4周。向每千克土壤中加入使用丙酮溶解的50mg菲，然后放入搅拌器进行充分混匀。试验开始前，测定土壤中菲的初始浓度为42.17mg/kg。
水稻幼苗准备：
水稻种子是从中国购买的龙粳系列种子，将备用的稻种用盐水漂洗三遍去掉干瘪稻种，随后翻晒2～3天，采用双氧水浸泡种子5天左右，消毒，随后用30℃左右的温水催芽，将其置于温室内，带稻种发芽，选留壮芽，剔除小芽、弱芽随后进行播种。在培育至水稻幼苗期后移栽至实验装置。
螃蟹准备：
试验选用中华绒螯蟹作为试验蟹种。购买自辽宁盘锦。在试验开始前，挑选体型相似、活性较好的螃蟹，并对其进行环境适应性驯化。将其置于土壤中生活，定期投喂食物。试验开始后，将这些螃蟹加入需要的试验装置中。
CK-phe组：上覆水+土壤，具体为，采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水；
C-phe组：螃蟹+上覆水+土壤，具体为，采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水，随后添加5只螃蟹，添加密度参考《黑龙江稻蟹共作技术规范》(DB23T 27602021)。
R-phe组：水稻+上覆水+土壤，具体为，采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并在每个装置中移栽事先准备好的健康水稻植株，每个装置移栽12穴(每穴5株水稻)；并加入5～8cm厚的水层作为上覆水。
RC-phe组：水稻+螃蟹，具体为，采用长为50cm，宽度为38cm，高度为30cm的长方形玻璃容器作为实验装置，将事先准备好的污染土壤填充入每个实验装置中，填充后土层高度约18cm，并加入5～8cm厚的水层作为上覆水，并在每个装置中移栽事先准备好的健康水稻植株，每个装置移栽12穴(每穴5株水稻)，随后添加5只螃蟹，添加密度参考《黑龙江稻蟹共作技术规范》(DB23T 27602021)。
M-phe组：上覆水+土壤+微生物，具体为，在CK-phe组的处理的基础上，将实施例1制备得到的假单胞菌微生物菌剂按3％的质量比(菌剂质量/土壤重量)接种于需要接种的处理的土壤中；
CM-phe组：螃蟹+上覆水+土壤+微生物，具体为，在C-phe组的处理的基础上，将实施例1制备得到的假单胞菌微生物菌剂按3％的质量比(菌剂质量/土壤重量)接种于需要接种的处理的土壤中；
RM-phe组：水稻+水+土壤+微生物，具体为，在R-phe组的处理的基础上，将实施例1制备得到的假单胞菌微生物菌剂按3％的质量比(菌剂质量/土壤重量)接种于需要接种的处理的土壤中；
RCM-phe组：水稻+水+土壤+微生物+螃蟹，具体为，在RC处理的基础上，区别在于，将实施例1制备得到的假单胞菌微生物菌剂按3％的质量比(菌剂质量/土壤重量)接种于上述菲污染土壤中。
实施例5：实验结果分析
试验持续1个月，试验结束时分析不同处理下的土壤中菲浓度含量、水稻及螃蟹体内菲含量。
对实施例4的实验结果进行分析如下：
(1)上覆水菲含量(溶解态、颗粒态)，结果如下表10所示。
表10：上覆水菲的浓度
(2)底泥中菲含量如表11所示。
表11：底泥中菲的浓度
结果显示，如表11所示，底泥中菲的浓度在RCM处理下，显著降低，在实验结束时降解率为88.97％，表明稻蟹微生物耦合模式能够有效降低稻田菲含量。
(2)土壤粒度
土壤粒度测定和分级：土样预处理后，采用Mas tersizer 2000激光粒度分析仪进行粒度分析，测量范围0.02～2000um。根据美国土壤粒级分类标准对土壤粒度进行分类，其中粘粒(<0.002mm)、细粉粒(0.002～0.02mm)、粗粉粒(0.02～0.05mm)、极细砂(0.05～0.10mm)、细砂(0.10～0.25mm)。更大范围的粒级在实验中没有检测到。
试验结束时底泥粒度分析结果如下表12所示。
表12：底泥粒度分析
结果显示，在试验结束时，RCM处理下粗粉粒的占比为19.46％，RC处理下为22.07％。极细砂占比在RCM和RC处理下分别为5.96％和6.64％，而细砂的占比非常小，均在1％左右浮动。土壤细粒占比的提升表明螃蟹的扰动破坏了土壤大颗粒，降低了土壤结构对于菲的物理保护作用，有利于吸附于土壤颗粒内部的菲的释放。
(3)水稻根系分泌物的分析
水稻根系分泌物中低分子量有机酸能有效促进多环芳烃的降解转化，为了探究稻蟹共作微生物耦合体系内水稻根系分泌物的变化，对于水稻根系分泌物低分子量有机酸进行测定，结果如下表13所示。
表13：水稻根系分泌物低分子量有机酸的分析
结果显示，如表13所示，螃蟹的生物扰动显著促进了水稻根系分泌中低分子量有机酸中果酸、富马酸、柠檬酸及乳酸的分泌。果酸、柠檬酸及富马酸已被证明能有效促进土壤多环芳烃的解吸，因此推断水稻根系分泌物的增多与土壤粒径的改变是导致稻田底泥菲释放通量与释放速率增加的主要原因。
对水稻根系分泌物中的氨基酸成分进行分析，结果如表14所示。
表14：水稻根系分泌物氨基酸含量变化
结果显示，如表14所示，在RCM、RM、RC处理下氨基酸含量明显上升，表明微生物和螃蟹均能促进氨基酸分泌，这种促进作用现象在RCM处理下最为明显，在RCM处理下氨基酸最高超过了1200％。
实施例6：稻蟹共作微生物耦合体系对于稻田多环芳烃污染修复的机制分析
具体实施方式同实施例4，分别得到R-phe组(仅种植水稻)；RC-phe组(稻蟹共作)；RM-phe组(水稻+3％微生物悬菌液)；RCM-phe组(稻蟹共作+3％微生物悬菌液)。
2、试验结果：
(1)实验结束后，检测各组土壤菲的降解率，结果如表15所示：
表15：土壤中菲的降解率
如上表所示，试验结束时R-phe处理下底泥中菲的浓度为27.71mg/kg。RCM-phe处理的降解速率最快，90天时的菲的浓度最低，仅为4.70mg/kg。其次是RM-phe处理，90天时菲的浓度下降至14.70mg/kg。相对而言，RC-phe的下降速率较慢，90天时菲的浓度值仍然相对较高，22.99mg/kg。研究结果表明，RCM-phe处理表现出最显著的降解效果，说明其在短时间内的降解能力更强。试验结束时，降解率为88.92％，相较于R-phe处理其菲浓度下降了83.04％，表明稻蟹共作微生物耦合模式有效促进了底泥菲浓度的减少。
(2)实验结束后，检测各组上覆水菲的变化，结果如表16所示：
表16：上覆水菲的变化
就上覆水而言，如表16所示，试验结束时RCM处理下上覆水中菲浓度积累最少，表明RCM处理有效抑制了底泥中的菲向上覆水中的迁移转化。
(3)实验结束后，检测各组植株体内菲浓度，结果如表17所示：
表17：植株体内菲浓度
表17显示了不同处理下水稻及水稻各器官中菲浓度。在试验结束时，四种处理下水稻植株中均积累了菲，积累水平由高到低依次为RC(23.54mg/kg)>R(18.72mg/kg)>RM(14.37mg/kg)>RCM(8.56mg/kg)。
(2)土壤酶活性的检测
土壤酶是具有高度催化作用的蛋白质，不仅能够催化有机物顽固成分的降解并且也是衡量土壤健康的重要指标。
土壤中的脱氢酶活性是反应微生物代谢污染物应激反应的重要参数，随着时间的推移，脱氢酶活性呈现先上升后下降的趋势(图2中的a)，60天时各处理均达到峰值，分别为83.22mg/g/天(RCM-phe)、44.01mg/g/天(RM-phe)、34.38mg/g/天(RC-phe)、26.19mg/g/天(R-phe)。
脲酶与蔗糖酶活性变化可以表征微生物代谢土壤养分的活性的强弱，随着时间的推移，脲酶(图2中的b)活性随着时间轻微增加(RM除外)，试验结束其活性为48.11NH4 +-Nmg/g/天(R-phe)、50.78NH4 +-N mg/g/天(RC-phe)、52.13NH4 +-N mg/g/天(RM-phe)、59.86NH4 +-N mg/g/天(RCM-phe)。R-phe处理中蔗糖酶(图2中的c)活性变化不大，其余处理中蔗糖酶活性在60天时达到最大值，分别为10.52mg Glucose/g/天(RM-phe)、9.47mg Glucose/g/天(RC-phe)、13.92mg Glucose/g/天(RCM-phe)，随后略有下降至试验结束。
(3)代谢功能基因检测
土壤微生物群落结构与土壤微生物基因功能密切相关，为了解稻蟹共作对于土壤微生物基因功能的影响，借助PICRUST软件预测了土壤微生物群落功能基因。
如图3结果显示，随着菲浓度的降低，早期菲降解所需的基因k11943和k11944含量显著下降，而后期降解所需的基因占比则逐渐增大。试验结束时，R-phe、RC-phe和RCM-phe处理中，菲降解基因的总量均高于R-phe处理，这表明RC-phe、RM-phe和RCM-phe处理可以有效促进菲的降解和土壤微生物活性。
此外，在RCM-phe中，参与将菲转化为苯甲酸盐的后期降解基因K04100、K04101和K04102的含量远高于R-phe、RC-phe和RM-phe处理，而参与菲降解前中期阶段的功能基因相对较少，表明耦合模式下菲的降解已经趋近于结束。
土壤环境内多环芳烃的降解涉及多种微生物的共同代谢，单一的植物或微生物体系并不能完全降解多环芳烃。蟹类的生物扰动(摄食、筑穴、挖掘)改变了土壤粒度、增加了土壤的营养元素、水稻根系分泌物与土壤酶活性，促进了微生物群落的分化与群落结构的改变，对于系统菲污染的活化与降解具有积极作用，由上述可知，耦合系统菲污染风险的降低是由一系列复杂的物理化学过程驱动实现的。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种修复稻蟹共作稻田底泥中多环芳烃污染的方法，其特征在于，所述方法为，在稻蟹共作稻田中添加假单胞菌(Pseudomonas mendocina)微生物菌剂；所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：将假单胞菌ACCC 02173种子液经温度循环梯度培养后得到的；
所述温度循环梯度培养为，将假单胞菌ACCC 02173种子液依次在28℃～5℃温度范围内进行梯度降温培养，所述梯度降温培养采用的温度降幅为1～3℃，每一轮温度梯度培养时间为：24～72h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：
将假单胞菌ACCC 02173种子液首先在28℃培养24h，然后在26℃，培养24h，再在24℃培养24h，再在22℃培养24h，再在20℃培养24h，再在18℃培养24h，再在16℃培养24h，再在14℃培养24h，再在12℃培养24h，再在10℃培养24h，再在8℃培养24h，再在6℃培养24h，最后在5℃培养24h；制备得到假单胞菌微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述假单胞菌微生物菌剂在稻蟹共作稻田中的添加量至少按照质量体积比为：0.5％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稻蟹共作稻田中添加的蟹包括但不限于：中华绒螯蟹、梭子蟹、青蟹、花蟹。
5.一种促进稻蟹共作稻田中水稻生长的方法，其特征在于，所述方法为，在稻蟹共作稻田中添加假单胞菌微生物菌剂；所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：将假单胞菌ACCC02173种子液经梯度降温培养后得到的；
所述梯度降温培养为，将假单胞菌ACCC 02173种子液依次在28℃～5℃温度范围内进行培养，梯度降温采用的温度降幅为1～3℃，每一轮温度梯度培养时间为：24～72h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：
将假单胞菌ACCC 02173种子液首先在28℃培养24h，然后在26℃，培养24h，再在24℃培养24h，再在22℃培养24h，再在20℃培养24h，再在18℃培养24h，再在16℃培养24h，再在14℃培养24h，再在12℃培养24h，再在10℃培养24h，再在8℃培养24h，再在6℃培养24h，最后在5℃培养24h；制备得到假单胞菌微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述假单胞菌微生物菌剂在稻蟹共作稻田中的添加量至少按照质量体积比为：0.5％。
8.一种促进稻蟹共作稻田中水稻根部分泌低分子有机酸、氨基酸、及糖类物质的方法，其特征在于，所述方法为，在稻蟹共作稻田中添加假单胞菌微生物菌剂；所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：将假单胞菌ACCC 02173种子液经梯度降温培养后得到的；
所述梯度降温培养为，将假单胞菌ACCC 02173种子液依次在28℃～5℃温度范围内进行培养，梯度降温采用的温度降幅为1～3℃，每一轮温度梯度培养时间为：24～72h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：
将假单胞菌ACCC 02173种子液首先在28℃培养24h，然后在26℃，培养24h，再在24℃培养24h，再在22℃培养24h，再在20℃培养24h，再在18℃培养24h，再在16℃培养24h，再在14℃培养24h，再在12℃培养24h，再在10℃培养24h，再在8℃培养24h，再在6℃培养24h，最后在5℃培养24h；制备得到假单胞菌微生物菌剂。
10.假单胞菌微生物菌剂在修复稻蟹共作稻田底泥中多环芳烃污染，促进稻蟹共作稻田中水稻生长，在促进稻蟹共作稻田水稻根部分泌低分子有机酸、氨基酸、及糖类物质，和在降低稻蟹共作稻田中和水稻及螃蟹生物中菲污染的应用，其特征在于，所述应用为，在稻蟹共作稻田中添加假单胞菌微生物菌剂；所述假单胞菌微生物菌剂的制备方法为：将假单胞菌ACCC 02173种子液经梯度降温培养后得到的；
所述梯度降温培养为，将假单胞菌ACCC 02173种子液依次在28℃～5℃温度范围内进行培养，梯度降温采用的温度降幅为1～3℃，每一轮温度梯度培养时间为：24～72h。
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