CN106754534A - 一种耐酸性反硝化菌及其应用 - Google Patents

一种耐酸性反硝化菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐酸性反硝化菌，其分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)G16X‑D，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年10月13日，保藏编号为CGMCC NO.13108。本发明还公开了上述耐酸性反硝化菌在酸性水体中的应用。该菌株能够适应酸性环境，达到在酸性条件下硝酸盐氮的高效脱除，并且亚硝酸盐氮很少累积，无二次污染，具有很大的应用价值。

Description

一种耐酸性反硝化菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种反硝化菌，具体为一种耐酸性反硝化菌及其应用。
背景技术
原地浸出采铀技术已成为我国乃至世界疏松砂岩型铀矿床开采的主流。其中，酸法地浸采铀过程中，多使用硫酸为溶浸试剂，对地下水的生态环境有严重影响，主要表现在两个方面:一是将含矿层中的元素大量溶浸出来进入含矿层的地下水溶液中，造成了地下水含矿含水层放射性核素(铀、镭等)、酸以及其他重金属的污染；二是由于向含矿层中注入了溶浸试剂(硫酸)和淋洗剂(硝酸铵)，使含矿层地下水中的试剂组分(NO3-、SO4 2-)大大超标。
微生物脱氮即反硝化作用是在厌氧或缺氧的条件下，以硝酸盐作为电子受体，将硝酸盐或亚硝酸盐逐步还原为气态氮的过程。但反硝化菌适宜生长的pH条件一般为中性或弱碱性，严重限制了其使用范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种可在低pH环境中生长的硝酸盐还原菌，即耐酸性反硝化菌。
本发明的另一目的是耐酸性反硝化菌在酸性水体中的应用，如应用于矿山地下水、生产废水及其他类似酸性水体的脱氮。
为实现上述目的，以新疆某砂岩型铀矿地下水为样品，于反硝化培养基中富集分离并纯化获得了一株耐酸性反硝化菌。所获得的耐酸性反硝化菌株经鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)G16X-D。革兰氏阴性，菌体呈短杆状，菌落表面湿润，半透明。
所述的反硝化培养基组成为：NaNO31g·L-1；K2PO4·3H2O 0.654g·L-1；MgSO4·7H2O0.1g·L-1；FeSO4·7H2O 0.01g·L-1；Yeast Extract 0.5g·L-1；Glucose g·L-1。固体培养基中另加1.5-1.8％的琼脂。培养基于121℃、0.1MPa高温高压灭菌，其中，FeSO4·7H2O使用0.22um微孔滤膜过滤灭菌。
上述耐酸性反硝化菌通过ELx808BLG型Biolog微生物自动鉴定系统培养24h，其结果SIM＝0.75，大于0.5，DIST＝3.162，小于5，PROB＝0.962，结果可靠，说明本发明菌株属于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
上述耐酸性反硝化菌，其16SrDNA上有效长度约为1437bp的核苷酸序列，16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。将该序列输入GenBank，用Blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与Pseudomonas aeruginosa的16SrDNA序列的相似性达到99％。基于16SrDNA的系统发育分析结果以及生理生化特性，鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的一种新菌株。
本发明的耐酸性反硝化菌的适宜脱氮pH在4.5以上，最优脱氮pH为5.77～7.71。在初始硝酸盐浓度为160mg/L，以1％为接种量，pH为5.77～7.71情况下，本发明的反硝化菌32h可以将硝酸盐氮完全脱除。
本发明的耐酸性反硝化菌脱氮时，葡萄糖的COD值与硝酸盐N的浓度比为2.5～5，优选为3～4，最优选为3。在初始硝酸盐浓度为160mg/L，以1％为接种量，pH为4.5情况下，当C(葡萄糖)/N＝3时，硝酸盐去除率达到90％，且无亚氮积累。
本发明的耐酸性反硝化菌的脱氮温度为20℃～40℃，优选适宜的脱氮温度为35℃～40℃。在初始硝酸盐浓度为160mg/L，以1％为接种量，温度为35℃～40℃情况下，本发明的反硝化菌72h能将硝酸盐氮去除80％～90％。
本发明的耐酸性反硝化菌对高浓度NO3 ——N仍具有较强的反硝化能力，对初始硝酸盐的浓度没有特殊的限制。本发明实施例中，在初始硝酸盐浓度为420mg·L-1时，本发明的耐酸性反硝化菌仍具有反硝化能力。进一步优选初始硝酸盐浓度为50～280mg·L-1，更优选为70～200mg·L-1。
本发明的耐酸性反硝化菌在pH值为4.5条件下可以以硝酸盐为电子受体进行反硝化反应，在初始硝酸盐浓度为160mg·L-1的缺氧条件下，1％为接种量，35℃时，耐酸性反硝化菌Pseudomonas aeruginosa G16X-D可以在72h内降解90％的硝酸盐氮，达到酸性条件下硝酸盐氮的高效脱除，并且亚硝酸盐氮很少累积，无二次污染。
本发明采用自新疆某砂岩型铀矿地下水中分离筛选得到的耐酸性反硝化菌，该菌株能够适应较酸性的环境，达到在酸性条件下硝酸盐氮的高效脱除，并且亚硝酸盐氮很少累积，无二次污染。经扩大培养后，可以直接应用在酸性矿山地下水、生产废水及其他类似酸性水体中进行脱氮，在实际工程中具有很大的应用价值。
本申请的耐酸性反硝化菌将针对酸法地浸矿山退役后，采区含矿含水层水体pH低、硝酸盐含量高以及富含多种重金属等特点，在酸性或弱酸性环境条件下实现硝酸盐氮的去除，进而逐步提高水体pH值，使重金属逐步沉淀，实现该类水体的生物修复，不仅对以后该类水体污染以及类似环境问题的生态修复有着重要的应用前景，更具有重要的社会和环境意义。
生物保藏说明
本发明的耐酸反硝化菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，于2016年10月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.13108，其简称为G16X-d。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步说明。
图1为本发明菌株G16X-D的菌落纯化图；
图2为本发明菌株G16X-D的16S rDNA菌落PCR扩增后的结果图；
图3为本发明菌株G16X-D与其他菌株的亲缘关系图；
图4为本发明菌株G16X-D在不同COD(葡萄糖)/N条件下的反硝化能力；
图5为本发明菌株G16X-D在不同初始pH条件下的反硝化能力；
图6为本发明菌株G16X-D在不同温度条件下的反硝化能力；
图7为本发明菌株G16X-D在不同初始NO3 ——N浓度条件下的反硝化能力；
图8为本发明菌株G16X-D在pH值为4.5的条件下的反硝化作用；
图9为本发明菌株G16X-D在实际酸性矿山废水中的硝酸盐的去除率；
图10为本发明菌株G16X-D在实际酸性矿山废水处理过程中pH的变化。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：耐酸性反硝化菌(Pseudomonas aeruginosa)G16X-D的选育
本发明的耐酸性反硝化菌(Pseudomonas aeruginosa)G16X-D是自我国新疆某砂岩型铀矿地下水中分离纯化得到的。将地下水样品按20％接种到pH值为5.0～5.5的反硝化培养基中，在30～35℃条件下静置富集培养，每隔2天测定培养液中的硝酸根离子浓度，当硝酸根离子去除了90％以上后，将其按1％接种到第二批反硝化培养基中，继续测定培养液中的硝酸根离子，经过反复多批次驯化培养直到培养液中的硝酸根离子能在3～5天内降低90％以上，按照平皿夹层厌氧法在平板上稀释涂布进行分离，得到单菌落后，进行多次划线纯化，直到平板上菌落的形态特征基本相同，则视为纯菌，菌落纯化照片见图1。将反硝化培养基的pH值从5.5逐渐降低，纯菌接入其中进行驯化培养，直到pH值达到4.5时，纯菌能在5天内将初始浓度为140～160mg/L的硝酸盐降解85％以上，则得到高效耐酸性反硝化菌。
所用的分析测试方法为：培养体系的pH值采用990型pH计测定；硝酸盐浓度采用麝香草酚分光光度法测定；亚硝酸盐氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定；细菌密度以OD600为指标，采用UV-6100S型紫外分光光度计测定。
实施例2：耐酸性反硝化菌的鉴定
1、以Biolog微生物自动鉴定系统(ELx808BLG)鉴定
将获得的纯菌划线接种至Biolog配套的BUG固体平板培养基上，35℃培养48h。在无菌超净台中，先用空白浊度管将浊度调到100％，校正，再用一次性无菌棉签挑取已经培养好的菌落，接种到浊度管中，将微生物细胞浓度浊度调到98％T(T为Biolog浊度仪所测得的透光率)，最后将菌悬液倒入无菌V型槽中，用8通道电动移液枪将菌悬液加入到96孔细菌微孔板中，每孔100uL，35℃培养24h后使用读数仪读取结果，将结果与系统数据库进行比对得出鉴定结果。结果如表1所示：
表1 Biolog微生物自动鉴定系统(ELx808BLG)对耐酸性反硝化菌的鉴定结果
2、16S rDNA的鉴定
(1)纯菌落裂解
挑取单菌落至500uL的Tris-Cl(100mmol/L)中洗涤1～2次，至上清液pH大于7.5，将处理好的菌体悬浮于20uL溶菌液(0.05M NaOH/0.25％SDS)，充分分散菌体；加入溶菌液后迅速将体系置于PCR仪中，95℃热裂解15min，速降温至4℃，加入冰浴的无菌双蒸水180uL，放于-20℃过夜，3000rpm离心5min沉淀细胞残渣，上清液作为PCR模版。
(2)PCR反应
PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2uL；dNTP 1.6uL；DMSO(终浓度2％)0.4uL；27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)0.4uL；1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)0.4uL；ExTaq酶0.2uL；模版1uL；ddH2O定容至14uL。
PCR反应条件：95℃，5min；95℃，30s，55℃(每次循环降低0.5℃)，30s，72℃，90s，20个循环；95℃，30s，45℃，30s，72℃，90s，10个循环或12个循环；72℃，8min。
(3)PCR产物纯化
利用琼脂糖(1％)凝胶电泳验证菌落PCR结果，结果如图2所示，切胶后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行胶回收，将回收的DNA溶液送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
(4)序列比对与同源性分析
将测序结果提交至NCBI，通过Blast检索进行比对，搜索同源性序列，根据已有研究结果，采用MEGA5软件对其进行系统发育分析，以Neighbor-joining法构建系统发育树。菌株G16X-D与其他菌株的亲缘关系如图3所示。菌株G16X-D与Pseudomonas aeruginosa的同源性为99％，初步确定菌株G16X-D为Pseudomonas aeruginosa。
实施例3：菌株G16X-D在不同COD(葡萄糖)/N(硝酸盐氮)条件下的反硝化能力
将G16X-D接种到反硝化培养基中，按照1％接种量将对数生长期菌液接种到初始硝酸盐浓度为160mg/L的反硝化培养基中，调节COD(葡萄糖)/N分别调为1、2、3、4、5，每个梯度三个重复，初始pH为4.5，在35℃培养箱中静置培养，5天后测定培养体系中硝酸盐浓度、OD600和亚硝酸盐浓度，G16X-D在不同COD(葡萄糖)/N条件下的反应结果如图4所示。
从图4可以看出，在C(葡萄糖)/N为1时，菌液的OD600值非常低，硝酸盐去除率只有15.76％，这是由于碳源不足，不能提供足够的电子流供菌体生长和反硝化需要，但随着C(葡萄糖)/N的增大，OD600值和硝酸盐去除率也逐渐增大，当C(葡萄糖)/N＝3时，硝酸盐去除率达到90％，且无亚氮积累，并且随着C(葡萄糖)/N增大，硝酸盐的去除率并没有多大变化，基本不再受C(葡萄糖)/N影响，但OD600继续增大，这是由于G16X-D在硝酸盐氮消耗完后，以葡萄糖为电子供体，培养液中残余的氧为电子受体而继续生长。所以该菌株的最适宜C(葡萄糖)/N值为3。
实施例4：菌株G16X-D在不同初始pH条件下的反硝化能力
将G16X-D接种到反硝化培养基中，按1％接种量将对数生长期菌液接种到初始硝酸盐浓度为160mg/L的反硝化培养基中，调节COD(葡萄糖)/N＝3，初始pH分别为4.0、4.57、5.03、5.77、6.80、7.71和8.3(接种后实测值)7个梯度，在35℃培养箱中静置培养(每个梯度做三个重复)；以硝酸盐氮的去除率表示细菌的生长情况及反硝化能力，不定时检测培养体系中硝酸盐浓度，G16X-D在不同初始pH条件下的反应结果如图5所示。
从图5可以看出，菌株G16X-D的最适生长pH为5.77～7.71，在32h时，硝酸盐氮的去除率皆达到100％，随着培养时间的延长，在pH 4.5的条件下仍具有反硝化能力，在小于4.5的pH下不生长。
实施例5：菌株G16X-D在不同温度条件下的反硝化能力
将G16X-D接种到反硝化培养基中，按1％接种量将对数生长期菌液接种到初始硝酸盐浓度为160mg/L的反硝化培养基中，调节COD(葡萄糖)/N＝3，初始pH值为4.5，将其放入不同温度恒温培养箱中静置培养，温度分别设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃六个梯度(每个梯度三个重复)。以硝酸盐氮的去除率表示细菌的生长情况及反硝化能力，不定时检测培养体系中硝酸盐浓度，G16X-D在不同初始温度条件下的反应结果如图6所示。
从图6中可以看出，菌株G16X-D的最适生长温度范围为35～40℃，而在72h时，35℃条件下的去除率达到90％以上；在20-40℃均具有反硝化能力。
实施例6：菌株G16X-D在pH 4.5条件下的生长情况及反硝化能力
将G16X-D接种到反硝化培养基中，按1％接种量将对数生长期菌液接种到初始硝酸盐浓度为160mg/L的反硝化培养基中，调节COD(葡萄糖)/N＝3，将培养基的初始pH调为4.5，在35℃培养箱中静置培养(三个重复)；过程中检测培养体系中的OD600、硝酸盐浓度、亚硝酸盐浓度和pH，以时间为横坐标，OD600、硝酸盐浓度、亚硝酸盐浓度以及pH为纵坐标，结果如图8所示。
由图8可知，G16X-D菌株在24h后进入对数生长期，在96h时OD600值达到最大，随后进入衰亡期；在72h时，菌株G16X-D将硝酸盐氮从160mg/L降到11.62mg/L，去除率达到90％以上，且整个生长过程中亚氮积累很少，到第三天时已无亚氮积累；pH从4.5最后上升到7.06，整个培养体系pH达到中性。表明该菌株在pH 4.5的条件下具有很强的反硝化能力。
实施例7：耐酸性反硝化菌在实际酸性废水中的应用
以新疆某铀矿浸出液为试验水样，初始浸出液pH值为2.1～2.3，用NaOH调节浸出液pH值至4.5，作为酸性废水备用。加入NaN03、Glucose和微量Yeast Extract(0.5g·L-1)，设置初始硝酸盐浓度为86.52mg·L-1和163.52mg·L-1，调节COD(葡萄糖)/N＝3，将培养基中处于对数生长期的未经该废水驯化的菌株G16X-d按1％接种到上述废水中，于35℃静置培养，不定期测定水样中的硝酸盐氮和pH值，结果如图9、10所示。
从图9和图10可知，菌株G16X-D在pH值为4.5的酸性废水中，对初始浓度为86.52mg·L-1和163.52mg·L-1的硝酸盐在第8天时的去除率分别达到了64.4％和41.4％，pH值分别上升至7.87和7.44，这有利于酸性废水中重金属的沉淀，并且随着时间的延长，后期硝酸盐会被继续去除，说明该菌对酸性废水中的硝酸盐氮具有较好的去除效果。可见菌株G16X-d在酸性废水以及其他类似水体中具有很大的应用潜力。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 东华理工大学
<120> 一种耐酸性反硝化菌及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 1
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ttgctccaga agtagctagt ctaaccgcaa ggggacggta ccacgagatg atttgtc 1437

Claims (5)

1.一种耐酸性反硝化菌，其微生物保藏编号为CGMCC NO.13108。
2.权利要求1所述耐酸性反硝化菌在酸性水体中的应用，其特征在于，所述耐酸性反硝化菌在酸性水体中进行硝酸盐脱氮。
3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述酸性水体的pH值在4.5以上。
4.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述耐酸性反硝化菌进行硝酸脱氮的方法，具体包括以下步骤：
调节预处理水样的以下参数：pH在4.5以上，葡萄糖的COD值与N的浓度比为2.5～5；
将所述耐酸性反硝化菌接种到所述预处理后的水样中，在缺氧条件下于20～40℃培养，进行硝酸盐脱氮。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，接种的所述耐酸性反硝化菌处于对数生长期。
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