CN115399242B - 橙色大白菜子叶为外植体诱导不定芽再生的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种橙色大白菜子叶为外植体诱导不定芽再生的组织培养方法，包括：橙色大白菜种子消毒后，在培养基上培养获得无菌苗；切下无菌苗的子叶，在子叶边缘制造伤口，将子叶接种到分化培养基上，子叶上表皮向上，进行不定芽及不定根的诱导，获得组培苗；组培苗移栽到装有基质的营养钵中进行炼苗驯化。本发明以橙色大白菜子叶块为外植体高效诱导不定芽的组培再生体系，能够降低成本、提高不定芽再生速率。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种橙色大白菜子叶为外植体诱导不定芽再生的组织培养方法。
背景技术
大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)原产于中国，是十字花科芸薹属一年生或两年生的耐寒性的叶用蔬菜，因其富含膳食纤维，具有改良肠道系统、预防肠道系统的癌变等功能而深受消费者的喜爱。橙色大白菜不仅具有上述的保健功能，还因富含类胡萝卜素、类黄酮等抗氧化物质而成为了大白菜家族的新秀。采用分子育种技术持续改良橙色大白菜，从而满足消费者持续增长的对品质的需求。橙色大白菜高效的再生体系是其分子育种的基础，并且深入研究橙色大白菜的品质形成相关分子机理也离不开高效再生体系的建立。
植物组织培养技术是分子育种的基础和前提，不仅可以高效获得外源基因，而且具有繁殖速度快等优势，采用无菌子叶切块作为外植体有利于农杆菌的侵染，不仅有利于外源基因的转入，而且具有繁殖系数高，是橙色大白菜分子育种的重要前提和基础。
文献“橙色大白菜离体再生体系的建立及原生质体的分离”(西北农林科技大学，2007年06月)以子叶为材料，研究了苗龄、外植体类型、不同激素种类对橙色大白菜不定芽再生的影响。
综上所述，获得高效的组培再生体系是橙色大白菜获得分子育种的基础和前提，对高品质橙色大白菜新品种的育成具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种橙色大白菜子叶为外植体诱导不定芽再生的组织培养方法，以橙色大白菜子叶块为外植体高效诱导不定芽的组培再生体系，能够降低成本、提高不定芽再生速率。
为达到上述目的，本发明使用的技术解决方案是：
橙色大白菜子叶为外植体诱导不定芽再生的组织培养方法，包括：
橙色大白菜种子消毒后，在培养基上培养获得无菌苗，培养基配方为：MS培养基+3％蔗糖+0.8％琼脂；
切下无菌苗的子叶，在子叶边缘制造伤口，将子叶接种到分化培养基上，子叶上表皮向上，进行不定芽及不定根的诱导，获得组培苗，分化培养基配方为：MS培养基+5.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+6.0mg/L AgNO3；
组培苗移栽到装有基质的营养钵中进行炼苗驯化。
进一步，挑选外观饱满、无虫眼、发育成熟的橙色大白菜种子适量，采用70％乙醇浸泡橙色大白菜种子30s，灭菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl2浸泡橙色大白菜种子8min，灭菌水冲洗8次，晾干后即获得消毒种子。
进一步，将消毒后的种子均匀播散在培养基表面，培养温度24℃，暗培养至种皮破裂露白，待全部种子均破裂露白后，培养条件改为温度25℃，光照时间16h/d，光照强度2800-3000lx，培养4-5天后即获得无菌苗。
进一步，不定芽及不定根的诱导的培养温度为25℃，光照时间为16h/d，培养时间为20-25天，光照强度为2800-3000lx。
进一步，组培苗移栽到装有基质的营养钵中，覆盖保湿5-7天后移栽到大田。
本发明技术效果包括：
本发明利用橙色大白菜子叶为外植体，通过不定芽分化获得组培苗，为橙色大白菜高效的再生体系的建立奠定基础。本发明是橙色大白菜分子育种的基础，在其品种改良方面应用前景广阔。
本发明材料易得、消毒方法简单、成本低、速度快、分化率高并能保证橙色大白菜品种的特征品质；具有成本低、再生速率快的优点。
本发明与文献《橙色大白菜离体再生体系的建立及原生质体分离》相比，当AgNO3用量是6mg/L时，本发明为68％，文献中的不定芽的诱导率为30％；本发明的培养基成分为6-BA(6-苄基腺嘌呤)和NAA(萘乙酸)，采用了更为廉价的6-BA代替了TDZ(苯基噻二羧基脲)，大大降低了成本，而文献中培养基成分为TDZ和NAA；不定芽再生速率方面，文献中用时15天，而本发明为7天。
附图说明
图1是本发明中橙色大白菜种子萌发形成的无菌苗图片；
图2是本发明中橙色大白菜不定芽诱导膨大时期图片；
图3是本发明中橙色大白菜不定芽生长时期图片；
图4是本发明中橙色大白菜不定根生长初期图片；
图5是本发明中橙色大白菜不定根生长后期图片；
图6是本发明中橙色大白菜不定芽生长时期图片。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
橙色大白菜子叶为外植体诱导不定芽再生的组织培养方法，包括如下步骤：
步骤1：橙色大白菜种子消毒后，在培养基上培养获得无菌苗；
挑选外观饱满、无虫眼、发育成熟的橙色大白菜种子适量，采用70％乙醇浸泡橙色大白菜种子30s，灭菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl2浸泡橙色大白菜种子8min，灭菌水冲洗8次，晾干后即获得消毒种子。
如图1所示，是本发明中橙色大白菜种子萌发形成的无菌苗图片。
将消毒后的种子均匀播散在培养基表面，培养温度24℃，暗培养至种皮破裂露白，待全部种子均破裂露白后，培养条件改为温度25℃，光照时间16h/d，光照强度2800-3000lx，培养4-5天后即获得无菌苗。
种子萌发、获得无菌苗的培养基配方为：MS培养基+3％蔗糖+0.8％琼脂。
步骤2：切下无菌苗的子叶，在子叶边缘制造伤口，将子叶接种到分化培养基上，子叶上表皮向上，进行不定芽及不定根的诱导，获得组培苗；
如图2所示，是本发明中橙色大白菜不定芽诱导膨大时期图片；如图3所示，是本发明中橙色大白菜不定芽生长时期图片；如图4所示，是本发明中橙色大白菜不定根生长初期图片；如图5所示，是本发明中橙色大白菜不定根生长后期图片；如图6所示，是本发明中橙色大白菜不定芽生长时期图片。
不定芽及不定根的诱导的培养温度25℃，光照时间16h/d，培养时间20-25天，光照强度2800-3000lx。
不定芽及不定根诱导的分化培养基配方为：MS培养基+5.5mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)+0.5mg/L NAA(萘乙酸)+6.0mg/L AgNO3。
步骤3：组培苗移栽到装有基质的营养钵中进行炼苗驯化。
组培苗移栽到装有基质的营养钵中，覆盖保湿5-7天，可移栽到大田，进行正常管理。
实施例1：
橙色大白菜子叶为外植体诱导不定芽再生的组织培养方法，包括如下步骤：
1、橙色大白菜种子的选择与消毒；
挑选外观饱满、无虫眼、发育成熟的橙色大白菜种子适量。超净工作台内用70％乙醇浸泡橙色大白菜种子30s，灭菌水冲洗3次。用0.1％HgCl2浸泡搅动橙色大白菜种子8min，灭菌水冲洗8次，晾干后即获得消毒种子81粒。
2、无菌苗获得；
将配置好的MS+3％蔗糖+0.8％琼脂固体培养基置于超净工作台台面，将种子均匀播种在培养基表面，每瓶9粒，封口。将种植橙色大白菜种子的三角瓶置于光照培养箱内，24℃下暗培养至种皮破裂露白，待全部种皮破裂露白后，培养条件改为温度25℃、光周期16h/d、光照强度2800-3000lx，培养时间4-5天。
3、不定芽诱导；
点燃酒精灯，将镊子和剪刀浸泡至75％的酒精溶液中。打开无菌苗瓶口，用酒精灯灼烧后冷却的镊子夹取橙色大白菜无菌苗，放入培养皿中，一手用镊子固定幼苗，一手用剪刀剪下子叶，并在子叶边缘制造伤口。将切好的子叶接种到MS培养基+5.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+6.0mg/LAgNO3培养基上，子叶上表皮向上。每瓶接种外植体3块，在酒精灯火焰边封口。培养温度25℃，光周期16h/d，光照强度2800-3000lx，培养时间20-25天。一周后开始出现不定芽，两周统计不定芽诱导率，不定芽诱导率达68％，生根率达81％。
4、炼苗驯化。
打开封口膜将生根后的不定芽组培苗与环境充分接触2-3天后，移栽到装有基质的营养钵中，覆盖保湿5-7天，之后进行正常管理。
本发明所用的术语是说明和示例性、而非限制性的术语。由于本发明能够以多种形式具体实施而不脱离技术方案的精神或实质，所以应当理解，上述实施例不限于任何前述的细节，而应在随附权利要求所限定的精神和范围内广泛地解释，因此落入权利要求或其等效范围内的全部变化和改型都应为随附权利要求所涵盖。
Claims (1)
1.一种橙色大白菜子叶为外植体诱导不定芽再生的组织培养方法，其特征在于，包括：
挑选外观饱满、无虫眼、发育成熟的橙色大白菜种子适量，采用70％乙醇浸泡橙色大白菜种子30s，灭菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl2浸泡橙色大白菜种子8min，灭菌水冲洗8次，晾干后即获得消毒种子；橙色大白菜种子消毒后，在培养基上培养获得无菌苗，培养基配方为：MS培养基+3％蔗糖+0.8％琼脂，将消毒后的种子均匀播散在培养基表面，将种植橙色大白菜种子的三角瓶置于光照培养箱内，培养温度24℃，暗培养至种皮破裂露白，待全部种子均破裂露白后，培养条件改为温度25℃，光照时间16h/d，光照强度2800-3000lx，培养4-5天后即获得无菌苗；
点燃酒精灯，将镊子和剪刀浸泡至75％的酒精溶液中，打开无菌苗瓶口，用酒精灯灼烧后冷却的镊子夹取橙色大白菜无菌苗，放入培养皿中，切下无菌苗的子叶，在子叶边缘制造伤口，将子叶接种到分化培养基上，子叶上表皮向上，进行不定芽及不定根的诱导，不定芽及不定根的诱导的培养温度为25℃，光照时间为16h/d，培养时间为20-25天，光照强度为2800-3000lx，获得组培苗，分化培养基配方为：MS培养基+5.5mg/L
6-BA+0.5mg/LNAA+6.0mg/LAgNO3；
打开封口膜将生根后的不定芽组培苗与环境充分接触2-3天后，组培苗移栽到装有基质的营养钵中进行炼苗驯化，覆盖保湿5-7天后移栽到大田。
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| 硝酸银在植物离体培养中的应用之研究进展;刘娟等;《中国农学通报》;20071005(第10期);全文 * |
| 芸薹属蔬菜再生体系研究进展;柏艾梅等;《中国细胞生物学学报》;20180531(第06期);全文 * |
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| CN115399242A (zh) | 2022-11-29 |
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