CN114717328B - 一种基于scar-pcr技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法 - Google Patents

一种基于scar-pcr技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114717328B
CN114717328B CN202210240033.8A CN202210240033A CN114717328B CN 114717328 B CN114717328 B CN 114717328B CN 202210240033 A CN202210240033 A CN 202210240033A CN 114717328 B CN114717328 B CN 114717328B
Authority
CN
China
Prior art keywords
scar
primer pair
pcr product
rice
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210240033.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114717328A (zh
Inventor
袁龙宇
雷浩霖
肖汉祥
李燕芳
张振飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences filed Critical Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202210240033.8A priority Critical patent/CN114717328B/zh
Publication of CN114717328A publication Critical patent/CN114717328A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114717328B publication Critical patent/CN114717328B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于SCAR‑PCR技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法，涉及分子生物学检测技术领域。本发明的方法包括以下步骤：S1：提取待测稻水象甲样品的基因组DNA；S2：利用SCAR引物对LH‑ycf4‑F/R、OS‑AGL‑F/R和PD‑ndhF‑F/R，分别对基因组DNA进行SCAR‑PCR反应；S3：将所述步骤S2中的SCAR‑PCR产物作为模板进行第二轮SCAR‑PCR反应，引物与所述步骤S2相同；S4：将所述步骤S3中的SCAR‑PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并分析电泳结果。该方法步骤简单，耗时短，准确性高，能定性评估稻水象甲的食性，极大地降低了对工作人员专业知识的要求。

Description

一种基于SCAR-PCR技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别涉及一种基于SCAR-PCR技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法。
背景技术
农业害虫主要指的是植食性昆虫以口器取食、口器传毒和产卵等方式伤害农作物，使农作物产量降低。所以研究植食性昆虫的取食行为至关重要，这不仅有助于分析植食性昆虫对农作物的损伤及植食性昆虫的群落动态，而且可以进一步研究植食性昆虫与农作物的互作关系。
植食性昆虫的取食行为会受到外部与内部信号的调控，施用农药、农作物受病害侵扰和植食性昆虫自身被天敌寄生等情况都会影响植食性昆虫的取食行为。目前对于取食行为的研究大都采用观察法，Sanford等(1998)将取食行为的观察指标分为撕咬、触诊、搜寻、其他这4个方面。王洪涛等(2011)在观察斜纹夜蛾低龄幼虫的取食行为时，采取Sanford了等人的方法，并记录幼虫开始取食时间，计算幼虫在这项行为上花费的时间。对于暴食期斜纹夜蛾，王洪涛(2011)和王元兰(2011)都采用记录每次取食的时间，取食的总次数来评价试虫取食行为。观察法研究昆虫的取食需要连续观察，工作量大，而且需要将昆虫带回实验室观察，不适用于研究检疫性昆虫。
因此，亟需提供一组便捷、快速、准确的植食性昆虫食性判断方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测稻水象甲食性的方法，包括LH-ycf4-F/R、OS-AGL-F/R和PD-ndhF-F/R，其中，LH-ycf4-F/R针对李氏禾具有较高的特异性，OS-AGL-F/R针对水稻具有较高的特异性，PD-ndhF-F/R对双穗雀稗具有较高的特异性。
本发明的第一个方面，提供一种检测稻水象甲食性的方法，包括以下步骤：
S1：提取待测稻水象甲样品的基因组DNA；
S2：利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的SCAR引物对LH-ycf4-F/R，核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的SCAR引物对OS-AGL-F/R，以及核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6引物对PD-ndhF-F/R分别对所述基因组DNA进行SCAR-PCR反应，分别得第一PCR产物、第二PCR产物和第三PCR产物；
S3：利用所述SCAR引物对LH-ycf4-F/R对所述第一PCR产物进行SCAR-PCR反应，利用所述SCAR引物对OS-AGL-F/R对所述第二PCR产物进行SCAR-PCR反应，利用所述SCAR引物对PD-ndhF-F/R对所述第三PCR产物进行SCAR-PCR反应，分别得第四PCR产物、第五PCR产物和第六PCR产物；
S4：取5μL步骤S3中的所述第四PCR产物、所述第五PCR产物和所述第六PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，并分析电泳结果，判断所述待测稻水象甲样品的食性。
在本发明的一些实施方式中，所述SCAR引物对LH-ycf4-F/R用于检测稻水象甲对李氏禾的食性。
在本发明的一些实施方式中，所述SCAR引物对OS-AGL-F/R用于检测稻水象甲对水稻的食性。
在本发明的一些实施方式中，所述SCAR引物对PD-ndhF-F/R用于检测稻水象甲对双穗雀稗的食性。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1中，所述待测稻水象甲样品为稻水象甲的中肠。
在本发明的一些实施方式中，所述稻水象甲的中肠的前处理方法为：保持在液氮环境中研磨所述中肠至无可视颗粒物。由此，使样品中的基因组DNA充分释放出来。
在本发明的一些实施方式中，所述稻水象甲的中肠的前处理方法为：用无菌水漂洗中肠后，保持在液氮环境中研磨所述中肠至无可视颗粒物。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1中，通过试剂盒或CTAB提取法提取所述待测稻水象甲样品的基因组DNA。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中，所述SCAR-PCR反应中，所述SCAR引物对LH-ycf4-F/R的反应体系为：
Figure BDA0003540851690000021
Figure BDA0003540851690000031
所述SCAR引物对OS-AGL-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000032
所述SCAR引物对PD-ndhF-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000033
在本发明的一些实施方式中，所述2×PCR mix为GenStar 2×HiFiTaq PCRStarMix。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中，所述SCAR-PCR反应的体系中的所述基因组DNA的浓度为10ng/μL以上。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中，所述SCAR-PCR反应中，所述SCAR引物对LH-ycf4-F/R的反应体系包括：
Figure BDA0003540851690000034
所述SCAR引物对OS-AGL-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000035
所述SCAR引物对PD-ndhF-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000041
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中，所述SCAR-PCR反应的扩增程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中，所述SCAR-PCR反应的扩增程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述琼脂糖凝胶的浓度为1-2％。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述琼脂糖凝胶的浓度为2％。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述电泳的电压为100-120V，所述电泳的时间为20-40min。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述电泳的电压为105-115V。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述电泳的电压为110V。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述电泳的时间为25-40min。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述电泳的时间为30min。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中，所述电泳结果的分析方法为：如果所述第四PCR产物的电泳结果显示有大小约为216bp的条带，则判断所述待测稻水象甲取食李氏禾；如果第五PCR产物的电泳结果显示有大小约为203bp的条带，则判断所述待测稻水象甲取食水稻；如果第六PCR产物的电泳结果显示有大小约为247bp的条带，则判断所述待测稻水象甲取食双穗雀稗。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的方法在检测稻水象甲食性中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测稻水象甲食性的方法，该方法中采用的SCAR引物对LH-ycf4-F/R、OS-AGL-F/R和PD-ndhF-F/R特异性强，其中，LH-ycf4-F/R只针对李氏禾基因组扩增出清晰、单一的特异性条带，而对其他物种无扩增效果；OS-AGL-F/R只针对水稻基因组扩增出清晰、单一的特异性条带，而对其他物种无扩增效果；PD-ndhF-F/R只针对双穗雀稗基因组扩增出清晰、单一的特异性条带，而对其他物种无扩增效果；且三组SCAR引物对在目标植物(李氏禾、水稻和双穗雀稗)DNA浓度低至0.1ng/μL时仍具有很好的检测效果，具有很好的灵敏度。该方法步骤简单，准确性高，能定性评估稻水象甲的食性，极大地降低了对工作人员专业知识的要求。通过设置两轮SCAR-PCR反应，能检测出稻水象甲肠道中残留的微量杂草或水稻。稻水象甲的取食行为受到外部与内部信号的调控，施用农药、作物受病害侵扰和被天敌寄生等情况都会影响其取食行为。通过对稻水象甲对水稻的食性进行检测，有利于对防治药物的药效进行评价，也有利于分析农作物的损失。李氏禾和双穗雀稗是常见的禾本科杂草，稻水象甲在越冬越夏期间会取食杂草以维持生命活动，通过对稻水象甲对李氏禾和双穗雀稗的食性进行判断，可以选择是否除去李氏禾或双穗雀稗，以减少越冬越夏虫源，减轻虫害，有利于防疫。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例提供的LH-ycf4-F/R对李氏禾的特异性验证结果(M为DNA标记(Marker))；
图2为本发明实施例提供的OS-AGL-F/R对水稻的特异性验证结果(M为DNA标记(Marker))；
图3为本发明实施例提供的PD-ndhF-F/R对双穗雀稗的特异性验证结果(M为DNA标记(Marker))；
图4为本发明实施例提供的LH-ycf4-F/R对实际样品的检测结果(M为DNA标记(Marker)，1-7分别指1-7号稻水象甲样本中肠的基因组DNA)；
图5为本发明实施例提供的OS-AGL-F/R对实际样品的检测结果(M为DNA标记(Marker)，1-7分别指1-7号稻水象甲样本中肠的基因组DNA)；
图6为本发明实施例提供的PD-ndhF-F/R对实际样品的检测结果(M为DNA标记(Marker)，1-7分别指1-7号稻水象甲样本中肠的基因组DNA)；
图7为本发明实施例提供的LH-ycf4-F/R的灵敏度检测结果(M为DNA标记(Marker)，1-5分别指浓度为10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL和0.1ng/μL的李氏禾基因组DNA)；
图8为本发明实施例提供的OS-AGL-F/R的灵敏度检测结果(M为DNA标记(Marker)，1-5分别指浓度为10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL和0.1ng/μL的水稻基因组DNA)；
图9为本发明实施例提供的PD-ndhF-F/R的灵敏度检测结果(M为DNA标记(Marker)，1-5分别指浓度为10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL和0.1ng/μL的双穗雀稗基因组DNA)。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
下列实施例中采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
下列实施例中采用的
Figure BDA0003540851690000061
Plant Genomic DNA Kit由北京全式金生物技术有限公司提供，
Figure BDA0003540851690000062
Marine Animal Genomic DNA Kit由北京全式金生物技术有限公司提供，6×DNA Loading Buffer由北京擎科生物有限公司提供，TS-Gelred核酸凝胶染料由北京擎科生物有限公司提供，GenStar 2×HiFiTaq PCR StarMix由北京康润诚业生物科技有限公司提供。
引物的设计和特异性检测
(1)引物的设计
在NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)上寻找特异性较好的李氏禾、水稻和双穗雀稗的基因序列，三个基因序列分别为李氏禾ycf4基因的序列(KF797362.1)、水稻AGL20基因的序列(AY332476.1)和双穗雀稗ndhF基因的序列(KF852892.1)，使用NCBI网站的BLAST工具设计引物，共筛选得到3对特异性SCAR引物(分别为针对李氏禾ycf4基因序列的SCAR引物对LH-ycf4-F/R、水稻AGL20序列的SCAR引物对OS-AGL-F/R和双穗雀稗ndhF序列的SCAR引物对PD-ndhF-F/R)。3对特异性SCAR引物均由广州艾基生物技术有限公司合成。
其中，LH-ycf4-F的核苷酸序列为：5’-TGCGCATACCAATGGAAGTCT-3’(SEQ IDNO.1)；
LH-ycf4-R的核苷酸序列为：5’-TCCCACTTGGACAAAGCAAAC-3’(SEQ ID NO.2)；
OS-AGL-F的核苷酸序列为：5’-AATCAGCCTCCCTTGTCTGC-3’(SEQ ID NO.3)；
OS-AGL-R的核苷酸序列为：5’-CCAGCTTATTCCTGGCCTGT-3’(SEQ ID NO.4)；
PD-ndhF-F的核苷酸序列为：5’-ACTTGATCGACCCCCTTACG-3’(SEQ ID NO.5)；
PD-ndhF-R的核苷酸序列为：5’-GGCCGTGTAAACCAAAAGCC-3’(SEQ ID NO.6)；
LH-ycf4-F/R扩增的序列(216bp)的核苷酸序列为：5’-TGCGCATACCAATGGAAGTCTTTTGAGTACCAATTGCATTTTTTTGCAATGAATTGAATGCAGAAGAATTGGAAGAAGAAAAGTTTTCTCAACACGGCACGGGGGAGAGTCCCTTCGAAATTGCATTATTGTAAGGGTATTTTGAGTATTTATCTAAAGGAAGGAACAAACGAGGATAAGAGAAAATTGCTTCTAGTTTGCTTTGTCCAAGTGGGA -3’(SEQ ID NO.7)；
OS-AGL-F/R扩增的序列(203bp)的核苷酸序列为：5’-AATCAGCCTCCCTTGTCTGCTCCTTTGACTGTCCGGGCCGAAGATGAGAACCCGGACCGTAACATCAACACCACCAACGACAACATGGATGTCGAAACTGAGCTATTCATAGGGCTGCCTGGCAGAAGTCGCTCCAGCGGCGGTGCTGCAGAAGATAGCCAAGCGATGCCCCATTCTTAAGTAACAGGCCAGGAATAAGCTGG-3’(SEQ ID NO.8)。
PD-ndhF-F/R扩增的序列(247bp)的核苷酸序列为：5’-ACTTGATCGACCCCCTTACGTCTATTATGTTAATACTAATTACTACTGTAGGAATCTTGGTTCTTATTTATAGTGACGATTATATGTCTCACGATGAAGGATATTTGAGATTTTTTGTTTATATAAGTTTTTTTAATACTTCCATGTTGGGATTGGTTACTAGTTCCAATTTGATACAAATTTATTTTTTTTGGGAACTTATCGGAATGTGTTCCTATTTATTGATAGGCTTTTGGTTTACACGGCC-3’(SEQ ID NO.9)。
(2)样品基因组的提取
从稻水象甲越冬场所采集李氏禾(Leersia Hexandra Swartz)、双穗雀稗(Paspalum distichum L.)、二歧蓼(Polygonim dichotomum Bl.)和水稻(Oryza sativaL.)的叶片，装入尼龙网兜中带回实验室，使用无菌水清洗2遍后放入1.5mL离心管中，加入液氮使用电动研磨棒研磨，采用
Figure BDA0003540851690000072
Plant Genomic DNA Kit分别提取李氏禾、双穗雀稗、二歧蓼和水稻的基因组DNA，具体步骤按照说明书进行。用1％琼脂糖凝胶检测提取到的基因组DNA的完整性。用酶标仪对基因组DNA的纯度及浓度进行检测，存储在-20℃备用。
将野外捕捉到的稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel)样本浸泡到无水乙醇中，带回实验室中，将单头虫体分出，使用无菌水浸洗2次，放入1.5mL离心管中，加入液氮使用电动研磨棒研磨，采用
Figure BDA0003540851690000071
Marine Animal Genomic DNA Kit提取稻水象甲的基因组DNA，具体步骤按照说明书进行。将5μL上述提取到的稻水象甲基因组DNA与1μL 6×DNA Loading Buffer混匀，进行1％琼脂糖凝胶电泳，110V恒压电泳30分钟，电泳结束后，将琼脂糖凝胶于稀释后的TS-Gelred核酸凝胶染料中浸泡30分钟。将染色后的琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察，用酶标仪对电泳结果显示有清晰条带的样品的DNA纯度及浓度进行检测，存储在-20℃备用。
(3)SCAR-PCR反应
将步骤(2)提取得到的李氏禾、双穗雀稗、二歧蓼、水稻和稻水象甲的基因组DNA作为检测对象，按下述反应体系和扩增程序进行SCAR-PCR反应。SCAR引物对LH-ycf4-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000081
SCAR引物对OS-AGL-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000082
SCAR引物对PD-ndhF-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000083
SCAR引物对LH-ycf4-F/R、SCAR引物对OS-AGL-F/R和SCAR引物对PD-ndhF-F/R的扩增程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
(4)特异性检测
取5μL步骤(2)中SCAR-PCR反应所得的反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，110V恒压，30min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶于稀释后的TS-Gelred核酸凝胶染料中浸泡30分钟，将染色后的琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察
LH-ycf4-F/R对李氏禾、双穗雀稗、二歧蓼、水稻和稻水象甲的基因组DNA的扩增产物的电泳结果如图1所示；OS-AGL-F/R对李氏禾、双穗雀稗、二歧蓼、水稻和稻水象甲的基因组DNA的扩增产物的电泳结果如图2所示；PD-ndhF-F/R对李氏禾、双穗雀稗、二歧蓼、水稻和稻水象甲的基因组DNA的扩增产物的电泳结果如图3所示。
由图1可知，仅李氏禾的基因组发生了特异性扩增，其对应的泳道在约216bp处有清晰、单一的特异性条带。这表明本实施例中提供的SCAR引物对LH-ycf4-F/R对李氏禾具有非常高的特异性。
由图2可知，仅水稻的基因组发生了特异性扩增，其对应的泳道在约203bp处有清晰、单一的特异性条带。这表明本实施例中提供的SCAR引物对OS-AGL-F/R对水稻具有非常高的特异性。
由图3可知，仅水稻的基因组发生了特异性扩增，其对应的泳道在约247bp处有清晰、单一的特异性条带。这表明本实施例中提供的SCAR引物对PD-ndhF-F/R对双穗雀稗具有非常高的特异性。
上述实施例中的检测方法的实际检测效果
(1)样品DNA提取
将野外捕捉到的7只稻水象甲样本浸泡到无水乙醇中，带回实验室中，将单头虫体分出，分别使用无菌水浸洗2次，然后使用解剖用镊子将虫体解剖，取出中肠，放入1.5mL离心管中，加入液氮使用电动研磨棒研磨，采用
Figure BDA0003540851690000092
Marine Animal Genomic DNA Kit提取中肠的基因组DNA(样品记为：1，2......6，7)，具体步骤按照说明书进行。
将5μL上述提取到的稻水象甲中肠基因组DNA与1μL 6×DNA Loading Buffer混匀，进行1％琼脂糖凝胶电泳，110V恒压电泳30分钟，电泳结束后，将琼脂糖凝胶于稀释后的TS-Gelred核酸凝胶染料中浸泡30分钟。将染色后的琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察，将电泳结果显示有清晰条带的样品于-20℃保存。
(2)SCAR-PCR反应
1)第一轮SCAR-PCR反应
以步骤(1)中提取得到的稻水象甲中肠的基因组DNA作为检测对象，按下述反应体系和扩增程序进行SCAR-PCR反应。设置阳性对照组，分别为上述实施例提取得到的李氏禾基因组DNA(记为：李氏禾)、水稻基因组DNA(记为：水稻)和双穗雀稗基因组DNA(记为：双穗雀稗)。
其中，SCAR引物对LH-ycf4-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000091
SCAR引物对OS-AGL-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000101
SCAR引物对PD-ndhF-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000102
SCAR引物对LH-ycf4-F/R、SCAR引物对OS-AGL-F/R和SCAR引物对PD-ndhF-F/R的扩增程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
经SCAR引物对LH-ycf4-F/R扩增得到LH-ycf4-F/R产物，经SCAR引物对OS-AGL-F/R扩增得到OS-AGL-F/R产物，经SCAR引物对PD-ndhF-F/R扩增得到PD-ndhF-F/R产物。
2)第二轮SCAR-PCR反应
以步骤1)中得到的LH-ycf4-F/R产物、OS-AGL-F/R产物和PD-ndhF-F/R产物作为模板，按下述反应体系和扩增程序进行SCAR-PCR反应。设置阳性对照组，分别为上述实施例提取得到的李氏禾基因组DNA(记为：李氏禾)、水稻基因组DNA(记为：水稻)和双穗雀稗基因组DNA(记为：双穗雀稗)。
其中，SCAR引物对LH-ycf4-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000103
SCAR引物对OS-AGL-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000104
Figure BDA0003540851690000111
SCAR引物对PD-ndhF-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000112
SCAR引物对LH-ycf4-F/R、SCAR引物对OS-AGL-F/R和SCAR引物PD-ndhF-F/R的扩增程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
(3)实际检测效果
将5μL步骤2)中SCAR-PCR反应所得的反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，110V恒压，30min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶于稀释后的TS-Gelred核酸凝胶染料中浸泡30分钟。将染色后的琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察。
由图4可知，2号和3号稻水象甲的基因组DNA发生了特异性扩增，其对应的泳道在约216bp处有单一的特异性条带，与阳性对照(李氏禾)相同，这表明2号和3号稻水象甲曾取食过李氏禾。
由图5可知，1号、2号、5号和7号稻水象甲的基因组DNA发生了特异性扩增，其对应的泳道在约203bp处有特异性条带，与阳性对照(水稻)相同，这表明1号、2号、5号和7号稻水象甲曾取食过水稻。
由图6可知，没有扩增出与阳性对照(双穗雀稗)相同的条带，这表明1-7号稻水象甲均未取食过双穗雀稗。
以上结果表明本实施例提供的检测方法能够有效用于实际样品的检测，用于判断稻水象甲的食性。
上述实施例中的检测方法的灵敏度检测
(1)样品DNA提取
从田间采集李氏禾(Leersia Hexandra Swartz)、水稻(Oryza sativa L.)和双穗雀稗(Paspalum distichum L.)的叶片，装入尼龙网兜中带回实验室，剪取鲜重100mg的叶片组织放入1.5mL离心管中，加入液氮使用电动研磨棒研磨，采用
Figure BDA0003540851690000113
PlantGenomic DNA Kit分别提取李氏禾、水稻和双穗雀稗的基因组DNA，具体步骤按照说明书进行。用1％琼脂糖凝胶检测提取到的基因组DNA的完整性。用酶标仪对基因组DNA的纯度及浓度进行检测，存储在-20℃备用。
(2)SCAR-PCR反应
1)第一轮SCAR-PCR反应
将李氏禾基因组DNA、水稻基因组DNA和双穗雀稗基因组DNA分别稀释至浓度约为10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL和0.1ng/μL。将上述稀释后的基因组DNA作为检测对象，按下述反应体系和扩增程序进行SCAR-PCR反应。
其中，SCAR引物对LH-ycf4-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000121
SCAR引物对OS-AGL-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000122
SCAR引物对PD-ndhF-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000123
SCAR引物对LH-ycf4-F/R、SCAR引物对OS-AGL-F/R和SCAR引物对PD-ndhF-F/R的扩增程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
经SCAR引物对LH-ycf4-F/R扩增得到LH-ycf4-F/R产物，经SCAR引物对OS-AGL-F/R扩增得到OS-AGL-F/R产物，经SCAR引物对PD-ndhF-F/R扩增得到PD-ndhF-F/R产物。
2)第二轮SCAR-PCR反应
以步骤1)中得到的LH-ycf4-F/R产物、OS-AGL-F/R产物和PD-ndhF-F/R产物作为模板，按下述反应体系和扩增程序进行SCAR-PCR反应。
其中，SCAR引物对LH-ycf4-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000131
SCAR引物对OS-AGL-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000132
SCAR引物对PD-ndhF-F/R的反应体系如下：
Figure BDA0003540851690000133
SCAR引物对LH-ycf4-F/R、SCAR引物对OS-AGL-F/R和SCAR引物PD-ndhF-F/R的扩增程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
(3)灵敏度检测
将步骤2)中第二轮SCAR-PCR反应所得的反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，110V恒压，30min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶于稀释后的TS-Gelred核酸凝胶染料中浸泡30分钟。将染色后的琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察。
LH-ycf4-F/R的扩增产物的电泳结果如图7所示；OS-AGL-F/R的扩增产物的电泳结果如图8所示；PD-ndhF-F/R的扩增产物的电泳结果如图9所示。
由图7可知，浓度为10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL和0.1ng/μL的样品均发生了特异性扩增，其对应的泳道在约216bp处有单一的特异性条带，这表明只要李氏禾被稻水象甲捕食后未被完全消化，即便提取得到的基因组DNA中仅含有0.1ng/μL的李氏禾基因组，其仍能被本实施例提供的方法检测到。
由图8可知，浓度为10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL和0.1ng/μL的样品均发生了特异性扩增，其对应的泳道在约203bp处有单一的特异性条带，这表明只要水稻被稻水象甲捕食后未被完全消化，即便提取得到的基因组DNA中仅含有0.1ng/μL的水稻基因组，其仍能被本实施例提供的方法检测到。
由图9可知，浓度为10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL和0.1ng/μL的样品均发生了特异性扩增，其对应的泳道在约247bp处有单一的特异性条带，这表明只要双穗雀稗被稻水象甲捕食后未被完全消化，即便提取得到的基因组DNA中仅含有0.1ng/μL的双穗雀稗基因组，其仍能被本实施例提供的方法检测到。
本实施例提供的检测方法具有很好的灵敏性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 广东省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种基于SCAR-PCR技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcgcatacc aatggaagtc t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcccacttgg acaaagcaaa c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcagcctc ccttgtctgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccagcttatt cctggcctgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acttgatcga cccccttacg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggccgtgtaa accaaaagcc 20
<210> 7
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcgcatacc aatggaagtc ttttgagtac caattgcatt tttttgcaat gaattgaatg 60
cagaagaatt ggaagaagaa aagttttctc aacacggcac gggggagagt cccttcgaaa 120
ttgcattatt gtaagggtat tttgagtatt tatctaaagg aaggaacaaa cgaggataag 180
agaaaattgc ttctagtttg ctttgtccaa gtggga 216
<210> 8
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatcagcctc ccttgtctgc tcctttgact gtccgggccg aagatgagaa cccggaccgt 60
aacatcaaca ccaccaacga caacatggat gtcgaaactg agctattcat agggctgcct 120
ggcagaagtc gctccagcgg cggtgctgca gaagatagcc aagcgatgcc ccattcttaa 180
gtaacaggcc aggaataagc tgg 203
<210> 9
<211> 247
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acttgatcga cccccttacg tctattatgt taatactaat tactactgta ggaatcttgg 60
ttcttattta tagtgacgat tatatgtctc acgatgaagg atatttgaga ttttttgttt 120
atataagttt ttttaatact tccatgttgg gattggttac tagttccaat ttgatacaaa 180
tttatttttt ttgggaactt atcggaatgt gttcctattt attgataggc ttttggttta 240
cacggcc 247

Claims (8)

1.一种检测稻水象甲食性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取待测稻水象甲样品的基因组DNA；
S2：利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的SCAR引物对LH-ycf4-F/R，核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的SCAR引物对OS-AGL-F/R，以及核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的SCAR引物对PD-ndhF-F/R，分别对所述基因组DNA进行SCAR-PCR反应，分别得第一PCR产物、第二PCR产物和第三PCR产物；
S3：利用所述SCAR引物对LH-ycf4-F/R对所述第一PCR产物进行SCAR-PCR反应，利用所述SCAR引物对OS-AGL-F/R对所述第二PCR产物进行SCAR-PCR反应，利用所述SCAR引物对PD-ndhF-F/R对所述第三PCR产物进行SCAR-PCR反应，分别得第四PCR产物、第五PCR产物和第六PCR产物；
S4：取5μL步骤S3中的所述第四PCR产物、所述第五PCR产物和所述第六PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，并分析电泳结果，判断所述待测稻水象甲样品的食性；
步骤S1中，所述待测稻水象甲样品为稻水象甲的中肠；
步骤S4中，所述电泳结果的分析方法为：如果所述第四PCR产物的电泳结果显示有大小约为216bp的条带，则判断所述待测稻水象甲取食李氏禾；如果第五PCR产物的电泳结果显示有大小约为203bp的条带，则判断所述待测稻水象甲取食水稻；如果第六PCR产物的电泳结果显示有大小约为247bp的条带，则判断所述待测稻水象甲取食双穗雀稗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稻水象甲的中肠的前处理方法为：保持在液氮环境中研磨所述中肠至无可视颗粒物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述SCAR-PCR反应中，所述SCAR引物对LH-ycf4-F/R的反应体系包括：
Figure FDA0003908887340000011
所述SCAR引物对OS-AGL-F/R的反应体系如下：
Figure FDA0003908887340000012
Figure FDA0003908887340000021
所述SCAR引物对PD-ndhF-F/R的反应体系如下：
Figure FDA0003908887340000022
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述SCAR-PCR反应的扩增程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述SCAR-PCR反应中，所述SCAR引物对LH-ycf4-F/R的反应体系包括：
Figure FDA0003908887340000023
所述SCAR引物对OS-AGL-F/R的反应体系如下：
Figure FDA0003908887340000024
所述SCAR引物对PD-ndhF-F/R的反应体系如下：
Figure FDA0003908887340000025
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述琼脂糖凝胶的浓度为1-2％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述电泳的电压为100-120V，所述电泳的时间为20-40min。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在检测稻水象甲食性中的应用。
CN202210240033.8A 2022-03-10 2022-03-10 一种基于scar-pcr技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法 Active CN114717328B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210240033.8A CN114717328B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 一种基于scar-pcr技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210240033.8A CN114717328B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 一种基于scar-pcr技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114717328A CN114717328A (zh) 2022-07-08
CN114717328B true CN114717328B (zh) 2022-12-27

Family

ID=82237030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210240033.8A Active CN114717328B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 一种基于scar-pcr技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114717328B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117327808B (zh) * 2023-12-01 2024-03-08 浙江大学海南研究院 扩增稻水象甲线粒体coi基因序列的特异性引物组及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101365796A (zh) * 2005-09-16 2009-02-11 德福根有限公司 使用RNAi控制有害生物的方法
CN107406849A (zh) * 2015-02-27 2017-11-28 先锋国际良种公司 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101365796A (zh) * 2005-09-16 2009-02-11 德福根有限公司 使用RNAi控制有害生物的方法
CN107406849A (zh) * 2015-02-27 2017-11-28 先锋国际良种公司 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
中国入侵昆虫预防与控制研究进展;彭露等;《应用昆虫学报》;20200326(第02期);全文 *
我国入侵昆虫学研究进展;胥丹丹等;《应用昆虫学报》;20171126(第06期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114717328A (zh) 2022-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104610440B (zh) ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用
CN114717328B (zh) 一种基于scar-pcr技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法
Prosdocimi et al. Microbial ecology-based methods to characterize the bacterial communities of non-model insects
Zhang et al. Genome size reversely correlates with host plant range in Helicoverpa species
CN109776659B (zh) cry2Ah-vp基因在抗黏虫中的应用
CN112981000A (zh) 与棉花抗旱性相关的InDel分子标记及其应用
Wang et al. The effects of phytase transgenic maize on the community components and diversity of arthropods
CN111500754A (zh) 一种鉴别犬中四种布鲁氏菌的引物、试剂盒及其应用
Mukuma Morphological and molecular identification and characterization of dry bean fungal root rot pathogens in Zambia
CN114717327A (zh) 一种基于scar-pcr技术在天敌肠道检测入侵害虫稻水象甲的方法
Frediansyah The microbiome of cassava (Manihot esculanta)
CN110951730B (zh) 青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA及其人工饲料和应用
CN110144410B (zh) 一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用
Hameed et al. Biosafety assessment of locally developed transgenic sugarcane.
CN103146832B (zh) 检测或辅助检测高丹草国审品种方法
Natesan et al. DNA fingerprinting of foxtail millet (Setaria italica L.) variety ATL 1 using SSR and RAPD markers along with morphological descriptors
CN114990110B (zh) 一种野外蝴蝶监测无损伤取样方法
Marini et al. Screening of Ophidiomyces ophidiicolain the free-ranging snake community annually harvested for the popular ritual ofSan Domenico e dei Serpari (Cocullo, AQ, Italy)
EFSA Panel on Genetically Modified Organisms (GMOs) Scientific Opinion updating the risk assessment conclusions and risk management recommendations on the genetically modified insect resistant maize Bt11
CN113265455B (zh) 一种美国鹧鸪性别快速鉴定方法及引物组
Vinayan Genetic architecture of spotted stem borer resistance in sorghum as inferred from QTL mapping and synteny with the maize genome
Liu et al. An efficient integrated approach for nonlethal DNA sampling and genome-wide genotyping in bivalve molluscs
Olubode Detection of root borne pathogen causing pea root rot by using minion sequencing
Curticăpean et al. Detection of the genetically modified organisms from food products/Detecţia organismelor modificate genetic din produse alimentare
Shahjahan et al. Tissue specific esterase expression in indigenous chicken of Bangladesh

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant