BRPI0616181B1 - Construção de polinucleotídeo isolada, sequência de ribonucleotídeo de fita dupla, microrganismo transgênico, seu método de produção, e métodos para controle de infestação por coleóptero praga, para melhorar o rendimento e a tolerância a estiagem de um cultivo, e para produção de um produto comercial, alimento ou ração - Google Patents

Construção de polinucleotídeo isolada, sequência de ribonucleotídeo de fita dupla, microrganismo transgênico, seu método de produção, e métodos para controle de infestação por coleóptero praga, para melhorar o rendimento e a tolerância a estiagem de um cultivo, e para produção de um produto comercial, alimento ou ração Download PDF

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Claire A.Cajacob
Pascale Feldmann
Gregory R. Heck
Irene Nooren
Geert Plaetinck
Ty T. Vaughn
Wendy Maddelein
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Abstract

métodos para controle genético de infestações por insetos em plantas e composições dos mesmos. a presente invenção refere-se ao controle de infestação por pragas pela inibição de uma ou mais funções biológicas. a invenção provê métodos e composições para este controle, pela ingestão de uma ou mais das moléculas de rna de filamento duplo recombinante, providas pela invenção, à dieta alimentar da praga reduz a sua infestação pela supressão de expressão gênica. a invenção destina-se também a métodos para produção de plantas transgênicas que expressam as moléculas de rna de filamento duplo e a combinações especiais de agentes pesticidas transgênicos a serem utilizados na proteção de plantas contra infestação por pragas.

Description

Incorporação por referência da listagem de sequências, submetida em disco compacto
[001] A Listagem de Sequências é submetida em um disco compacto (Cópia 1), juntamente com uma duplicata do mesmo (Cópia 2), ambos criados em 15 de setembro de 2006 e contendo um arquivo de 669 kb, intitulado "MNDE002.APP.TXT". O material contido no disco compacto é especificamente aqui incorporado por referência neste pedido de patente.
Reivindicação de Prioridade
[002] Este pedido reivindica a prioridade da Patente Provisória Número de Série US 60/718,034, depositada em 16 de setembro de 2005, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.
Antecedentes da Invenção 1. Campo da Invenção
[003] A presente invenção se refere, de modo geral, ao controle genético de infestações por pragas. Mais especificamente, a presente invenção se refere a técnicas de DNA recombinante visando a repressão ou inibição de expressão pós-transcricional de sequências codificadoras, presentes na célula de uma praga, a fim de prover um efeito protetor contra a praga.
2. Descrição de Técnica Relacionada
[004] O ambiente no qual seres humanos vivem está repleto de infestação por pragas. A presença de pragas incluindo insetos, aracnídeos, crustáceos, fungos, bactérias, vírus, nematódeos, platelmintos, asquelmintos, oxiúros, áscaris, tênias, tripanossomos, esquisitossomas, moscas dermatobias, carrapatos, ácaros e piolhos e similares é disseminada no ambiente humano. Uma pluralidade de métodos tem sido utilizada para tentar contro-lar infestações por estas pragas. Composições para controle de infestações por pragas microscópicas, como bactérias, fungos e vírus, foram providas sob a forma de composições antibióticas, composições antivirais e composições antifúngicas. Composições para controle de infestações por pragas de mai-or tamanho, como nematódeos, platelmintos, asquelmintos, oxiúros, áscaris, tênias, tripanossomos,esquisitossomas e similares têm sido tipicamente sob a forma de composições químicas que podem ser aplicadas a superfícies sobre as quais as pragas estão presentes, ou administradas a animais infestados sob a forma de péletes, pós, comprimidos, pastas ou cápsulas e simi-lares. Há uma grande necessidade na técnica para melhorar estes métodos e, especialmente, para métodos que trariam benefícios ao meio ambiente, em comparação a técnicas anteriores.
[005] Cultivos comerciais são freqüentemente os alvos de ataque por insetos. Um avanço relevante tem ocorrido nas últimas décadas, direciona-do ao desenvolvimento de métodos e composições mais eficientes de con-trole de infestações em plantas. Pesticidas químicos têm sido muito eficien-tes na erradicação de infestações por pragas. No entanto, há várias desvan-tagens no uso de agentes pesticidas químicos. Agentes pesticidas químicos não são seletivos. Aplicações de pesticidas químicos, destinadas a controlar pragas invertebradas, como insetos coleópteros, incluindo espécies de lar-vas alfinete do milho, nocivas para vários tipos de cultivo e outras plantas, exercem também efeito não pretendido sobre a fauna, freqüentemente esterilizando eficientemente um campo por um período de tempo acima daquele dos agentes pesticidas que foram aplicados. A presença de agentes pestici-das químicos persiste no meio ambiente, os quais, geralmente, são de lenta metabolização, se porventura o forem. Estes agentes acumulam-se na ca-deia alimentar, especialmente nas espécies de predadores de maior tama-nho. Os acúmulos destes agentes pesticidas químicos levam ao desenvol-vimento de resistência aos agentes e em espécies de patamares evolutivos mais altos, podem atuar como mutagênicos e/ou carcinogênicos, provocan-do modificações genéticas irreversíveis e deletérias. Dessa forma, tem havi-do uma necessidade especial longamente sentida para métodos que não agridam o meio ambiente visando o controle ou erradicação de infestação por insetos sobre ou em plantas, ou seja, métodos seletivos, sem ação sobre meio ambiente, não persistentes e biodegradáveis e que se adaptem bem em esquemas de controle de resistência a pragas.
[006] Existem composições que incluem bactérias da espécie Bacillus thuringiensis (Bt) à disposição no mercado e estas têm sido utilizadas como inseticidas seguras para o meio ambiente e aceitáveis por mais de trinta anos. O efeito inseticida das bactérias Bt não persiste no meio ambiente, é altamente seletivo em relação às espécies afetadas às quais se destinam, sendo exercido somente quando estas são ingeridas por uma praga-alvo e, conforme demonstrado, não provocam danos a plantas e organismos aos quais não se destinam, incluindo seres humanos. Há disponíveis na técni-ca plantas transgênicas, contendo um ou mais genes que codificam a prote-ína inseticida da Bt, e estas são notadamente eficientes no controle de in-festação provocada por insetos-praga. Um resultado relevante do uso de plantas recombinantes que expressam a proteína inseticida da Bt é uma diminuição acentuada na quantidade de agentes pesticidas químicos, apli-cados ao meio ambiente para controle de infestação por pragas, em campos de cultivos nos quais estas plantas transgênicas são utilizadas. A diminui-ção em aplicação de agentes pesticidas químicos resultou em solos mais limpos e água mais limpa escoando dos solos nos riachos vizinhos, rios, lagoas e lagos. Além desses benefícios ao meio ambiente, houve um au-mento visível no número de insetos benéficos em campos de cultivos, nos quais plantas transgênicas resistentes a insetos são cultivadas, resultante do uso de agentes inseticidas químicos.
[007] Processos e composições antissenso têm sido expostos na técnica e acredita-se que exerçam os seus efeitos por intermédio da síntese de uma molécula de RNA de fita simples, a qual, em teoria, hibridiza-se in vivo para dar origem a uma molécula de RNA de fita senso, substancialmente complementar. O emprego da técnica antissenso tem sido difícil em muitos sistemas em decorrência de três motivos principais. Primeiramente, a sequência antissenso, expressa na célula transformada, é instável. Em segundo lugar, a instabilidade da sequência antissenso, expressa na célula transformada, torna difícil, concomitantemente, a liberação da sequência para um hospedeiro, tipo de célula ou sistema bio-lógico, distante da célula transgênica. Em terceiro lugar, as dificuldades en-contradas com a instabilidade e liberação da sequência antissenso difi-cultam a determinação de uma dose, dentro da célula recombinante, que expresse a sequência antissenso, capaz de modular efetivamente o nível de expressão da sequência senso de nucleotídeos pretendida.
[008] Houve alguns aperfeiçoamentos em técnicas para modulação do nível de expressão gênica dentro de uma célula, tecido ou organismo, porém, há especialmente, carência de técnicas desenvolvidas para o retar-do, repressão ou, de outra forma, a redução da expressão de genes especí-ficos, utilizando a técnica de DNA recombinante. Ademais, em conseqüên-cia de não ser possível prever os resultados dessas estratégias, não há mei-os comercialmente viáveis disponíveis para modulação do nível de expres-são de um gene específico em organismo eucariótico ou procariótico.
[009] A inibição de genes específicos, mediada por RNA de fita dupla, em várias pragas foi previamente demonstrada. Abordagens para controle genético, mediado por dsRNA, foram testadas na mosca de frutas Drosophila melanogaster (Kennerdell e Carthew, 1998; Kennerdell e Car-thew, 2000). Kennerdell e Carthew (1998) descreveram um método para li-beração do dsRNA envolvido na geração de insetos transgênicos que ex-pressam moléculas de RNA de fita dupla, ou injeções de soluções contendo dsRNA no corpo do inseto ou na ooteca, antes ou durante o de-senvolvimento embrionário.
[0010] Pesquisadores demonstraram previamente que a supressão gênica mediada por RNA de fita dupla pode ser obtida em nemató-deos, quer alimentando ou encharcando os nematódeos em soluções con-tendo moléculas de RNA de fita dupla ou moléculas de RNA peque-no interferente, e por injeção das moléculas de RNA. Rajagopal et. al. (2002) descreveram tentativas que falharam em suprimir um gene endógeno em larvas do inseto-praga Spodoptera litura pela alimentação ou submersão de larvas neonatas em soluções contendo dsRNA para o gene-alvo, porém ob-tiveram êxito, na supressão, depois que as larvas foram injetadas com dsR-NA na hemolinfa do 5° instar das larvas, utilizando um microaplicador. Re-centemente, Yadav et al. (2006) relataram que dsRNA, gerado por hospedei-ro e produzido em uma planta, pode proteger estas plantas de infecção por nematódeos. Da mesma forma, o Pedido de Patente Publ. U.S. N° 2003/0150017 expôs, profeticamente, um lócus preferido para inibição das larvas de lepidópteros Helicoverpa armigera, utilizando dsRNA liberado para as larvas por ingestão de uma planta transformada para produção do dsR-NA. A WO 2005/110068 expõe o fornecimento, na dieta de larvas alfinete de milho (CRW), de dsRNA específico da CRW, direcionado para genes fun-damentais da CRW. O dsRNA é fornecido na dieta do CRW, in vitro e in planta, resultando em atrofia ou morte de larvas de CRW, após serem ali-mentadas com a dieta, tendo esse efeito sido demonstrado para vários ge-nes diferentes.
[0011] Por conseguinte, há necessidade para identificação de seqüên-cias eficazes de nucleotídeos que possam ser utilizadas em métodos aper-feiçoados de modulação de expressão gênica, pela repressão, retardo ou, de outra forma, redução de expressão gênica, dentro de um coleóptero-praga em particular, visando o controle de infestação por praga ou a intro-dução de novos traços fenotípicos.
Sumário da Invenção
[0012] Em uma característica, a invenção provê um método de inibição de expressão de um gene-alvo em coleópteros-praga. Em certas concretiza-ções, o método compreende a modulação ou inibição da expressão de um ou mais genes-alvo em coleóptero-praga que faz com que este pare de se alimentar, crescer, desenvolver, reproduzir e/ou perca a sua capacidade de infectar e, eventualmente, resulta na morte do inseto. O método compreende introdução de RNA de fita dupla (dsRNA) estabilizado, parcial ou completo, incluindo suas formas modificadas, como sequências de pequeno RNA interferente (siRNA), nas células ou no ambiente extracelular, como o intestino médio no corpo de um coleóptero-praga, em que o RNA penetra as células e inibe a expressão de, pelo menos, um ou mais genes-alvo e, em que, a inibição exerce um efeito deletério sobre o coleóptero- praga. Os métodos e composições associadas podem ser utilizados para restringir ou eliminar infestação por coleóptero-praga em ou sobre qualquer hospedeiro ou simbionte da praga ou no ambiente no qual uma praga esteja presente, pelo fornecimento de uma ou mais composições, compostas pelas molécu-las de dsRNA, expostas neste pedido, na dieta da praga. O método trará be-nefícios especialmente à proteção de plantas contra-ataques por insetos. Em uma concretização, a praga é definida como compreendendo um pH do sistema digestivo incluído no intervalo de aproximadamente 4,5 a aproxima-damente 9,5, de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, de aproximada-mente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente pH 7,0.
[0013] Em outra característica, a presente invenção prove composições exemplares de ácidos nucléicos, homólogas a, pelo menos, uma parte de uma ou mais sequências nativas de ácidos nucléicos, em uma praga-alvo. Em certas concretizações, a praga é selecionada entre Diabrotica sp., inclu-indo larva alfinete do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera ou Diabroti-ca virgifera virgifera), Larva alfinete do milho do Sul (SCR, Diabrotica unde-cimpunctata howardi), Larva Alfinete do Milho do México (MCR, Diabrotica virgifera zea), Larva Alfinete do Milho do Brasil (BZR, Diabrotica balteata, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa), Larva Alfinete do Milho do Norte (NCR, Diabrotica barberi), Diabrotica undecimpunctata; bem como o Besou-ro da Batata do Colorado (CPB, Leptinotarsa decemlineata), Besouro-Vermelho de Farinha (RFB, Tribolium castaneum) e Besouro do Feijão Me-xicano (Epilachna varivestis). Em outras concretizações, a praga é selecio-nada entre insetos lepidópteros, incluindo Broca de Milho Europeu (ECB, Ostrinia nubilalis), Gafanhoto Preto (BCW, Agrotis ipsilon), Lagarta da Espi-ga de Milho (CEW, Helicoverpa zea), Lagarta-do-Cartucho (FAW, Spodopte-ra frugiperda), Bicudo-do-algodeiro (BWV, Anthonomus grandis), bichos da seda (Bombyx mori) e Manduca sexta, e de insetos dípteros, incluindo Dro-sophila melanogaster, Anopheles gambiae e Aedes aegypti. Exemplos es-pecíficos destes ácidos nucléicos, providos pela invenção, são fornecidos na listagem de sequências anexa, indicados pelas SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906.
[0014] Em ainda uma outra característica, a invenção provê um método para supressão de expressão gênica em um coleóptero-praga, como larva alfinete de milho ou espécie correlata, que compreende a etapa de forneci-mento na dieta da praga de uma quantidade supressora do gene, contando com pelo menos uma molécula de dsRNA, transcrita de uma sequência de nucleotídeos, conforme descrita neste pedido, que tenha pelo menos um fragmento complementar de uma sequência do mRNA no interior das célu-las da praga. O método pode compreender ainda a observação da morte, inibição, atrofia ou interrupção de alimentação da praga. Uma molécula de dsRNA, incluindo a sua forma modificada, alimentada à praga, de acordo com a invenção, pode ser, pelo menos, aproximadamente 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou aproximadamente 100% idêntica a uma molécula de RNA, transcrita de uma sequência de nu-cleotídeos, selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906. Em concretizações especiais, a sequência de nucleotídeos pode ser selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 697, SEQ ID NOs: 813-819, SEQ ID NO: 841 e SEQ ID NO: 874.
[0015] De acordo com o mesmo, em outra característica da presente invenção, é provido um conjunto de sequências de nucleotídeos, isoladas e purificadas, conforme indicadas na SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906. A presente invenção provê uma molécula de dsRNA estabilizada ou a expres-são de um ou mais miRNAs para inibição da expressão de um gene-alvo, em coleóptero-praga, expressado destas sequências e fragmentos das mesmas. O dsRNA estabilizado, o qual inclui uma molécula de miRNA ou de siRNA, pode compreender pelo menos duas sequências codificadoras, arranjadas em orientação sentido e antissenso, em relação a, pelo menos, um promotor, em que a sequência de nucleotídeos, compreendendo uma fita senso e uma fita antissenso, está unida ou ligada a uma sequência espaçadora, contando com, pelo menos, aproximadamente cinco a aproximadamente mil nucleotídeos, em que a fita senso e a fita antissenso podem ser de comprimento diferente, e em que as duas sequências codificadoras compartilham, pelo menos, 80% de identidade de sequência, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% de identidade de sequência, em relação a uma ou mais sequências de nu-cleotídeos, indicadas na SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906.
[0016] Ainda é provido pela invenção, um fragmento ou concatâmero de uma sequência de ácido nucléico, selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906. Em concretizações especiais, a seqüên-cia de nucleotídeos pode compreender um fragmento ou concatâmero de uma sequência selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 697, SEQ ID NOs: 813-819, SEQ ID NO: 841 e SEQ ID NO: 874.
[0017] O fragmento pode ser definido como causador da morte,inibi-ção, atrofia ou interrupção de alimentação de uma praga, quando expresso sob a forma de dsRNA e provido à praga. O fragmento pode compreender, por exemplo, pelo menos, aproximadamente 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer uma ou mais das seqüên-cias indicadas pela SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou um complemento destas. Um segmento de DNA proveitoso para uso na presente invenção contém, pelo menos, de aproximadamente 19 a aproximadamente 23, ou de aproximadamente 23 a aproximadamente 100 nucleotídeos até aproxima-damente 2000 nucleotídeos ou mais, em extensão. Serão especialmente proveitosas sequências de dsRNA incluindo de aproximadamente 23 a aproximadamente 300 nucleotídeos, homólogas da sequência de uma pra-ga-alvo. A invenção provê também um ácido ribonucléico expresso por qualquer uma destas sequências, incluindo um dsRNA. Uma sequência, cujo uso pode ser selecionado para expressão de um agente supressor do gene, pode ser construída a partir de uma única sequência, derivada de uma ou mais pragas-alvo, e cujo uso destina- se à expressão de um RNA que atue na supressão de um único gene ou família de genes em uma ou mais das pragas-alvo, ou que a sequência de DNA possa ser construída sob a forma de quimera, proveniente de uma pluralidade de sequências de DNA.
[0018] Em ainda outra característica, a invenção provê constructos de DNA recombinantes, compreendendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma molécula de dsRNA, descrita neste pedido. O dsRNA pode ser formado por transcrição de uma fita da molécula de dsRNA com sequência de nucleotídeos, aproximadamente 80% a aproximadamente 100% idêntica a uma sequência de nucleotídeos, selecionada do grupo constituí-do pela SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906. Estes constructos de DNA re-combinante podem ser definidos como produtores de moléculas de dsRNA, capazes de inibir a expressão de gene(s) endógeno(s) visado(s) em uma célula de praga, ao serem ingeridas. O constructo pode conter uma seqüên-cia de nucleotídeos da invenção, operacionalmente ligada a uma sequência de promotor que atue na célula do hospedeiro. Este promotor pode ser es-pecífico de tecidos e pode, por exemplo, ser específico para um tecido, obje-to de ataque da praga. No caso de larvas alfinete, por exemplo, pode-se de-sejar utilizar um promotor que se expresse de preferência em raízes.
[0019] Constructos de ácido nucléico de acordo com a invenção po-dem compreender pelo menos uma sequência de nucleotídeos que não ocorra naturalmente e que possa ser transcrita em RNA de fita simples, capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo por hibridização. Estas sequências de dsRNA montam-se sozinhas e podem ser fornecidas na dieta de um coleóptero-praga de forma a ser obtida a inibição desejada.
[0020] Um constructo de DNA recombinante pode compreender duas sequências diferentes que não ocorram naturalmente, as quais, quando expressas in vivo sob a forma de sequências de dsRNA e fornecidas na di-eta de um coleóptero-praga, inibem a expressão de, pelo menos, dois ge-nes-alvo diferentes na célula do coleóptero-alvo. Em certas concretizações, pelo menos 3, 4, 5, 6, 8, 10 ou mais dsRNA diferentes são produzidos em uma célula ou planta que compreenda a planta que possui efeito inibidor sobre a praga. Os dsRNAs podem ser expressos a partir de múltiplos cons-tructos, introduzidos em eventos diferentes de transformação, ou podem ser introduzidos em uma única molécula de ácido nucléico. Os dsRNAs podem ser expressos utilizando um único promotor ou promotores múltiplos. Em uma concretização da invenção, são produzidos dsRNAs simples compreendendo homólogos de ácidos nucléicos para locos múltiplos dentro de uma praga.
[0021] Em ainda outra característica, a invenção provê uma célula re-combinante do hospedeiro, contendo em seu genoma, pelo menos, uma sequência de DNA recombinante, a qual é transcrita para produzir, pelo menos, uma célula de dsRNA que atue quando ingerida por um coleóptero-praga, de forma a inibir a expressão de um gene- alvo na praga. A molécula de dsRNA pode ser codificada pelos ácidos nucléicos, descritos no presen-te, e conforme indicados na listagem de sequências. A presente invenção provê também uma célula vegetal transformada, contendo em seu genoma, pelo menos, uma sequência de DNA recombinante, descrita neste pedido. Plantas transgênicas compreendendo esta célula vegetal transformada são providas também, incluindo plantas de progênie de qualquer geração, sementes e produtos de plantas, todos compreendendo o DNA recombinante.
[0022] Os métodos e composições da presente invenção podem ser aplicados a qualquer planta monocotiledônea ou dicotiledônea, dependen-do do controle de coleóptero-praga desejado. Especificamente, as plantas pretendem incluir, entre outras, plantas de alfafa, endro, maçã, abricó, alca-chofra, rúcula, aspargo, abacate, banana, cevada, favas, beterraba, amora silvestre, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, melão canta-loupe, cenoura, mandioca, couve-flor, aipo, cereja, coentro, cítricos, tangeri-na, café, milho, algodão, pepino, pseudotsuga, berinjela, endívia, escarola, eucalipto, funcho, figo, cabaça, uva, toranja, melão "honey dew", batata me-xicana (jicama), kiwi, alface, alho-poró, limão, lima, pinheiro loblolly, manga, melão, cogumelo, noz, aveia, quiabo, cebola, laranja, planta ornamental, mamão papaia, salsa, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, pinheiro, abacaxi, plátano, ameixa, romã, álamo, batata, abóbora, marmelo, pinheiro radiata, chicória, rabanete, framboesa, arroz, centeio, sorgo, pinhei-ro do sul, soja, espinafre, abóbora "squash", morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, batata-doce, liquidambar, tangerina, chá, tabaco, tomate, grama, vinha, melancia, trigo, inhame e de abobrinha. Dessa forma, uma planta transformada com uma sequência de DNA recombinante, con-forme indicada na SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou concatâmero, fra-gmento ou complemento destas, transcrita para produzir, pelo menos, uma molécula de dsRNA que atue, quando ingerida por um coleóptero-praga, na inibição da expressão de um gene-alvo, é provida também pela invenção. Em concretizações especiais, a sequência de DNA recombinada pode ser selecionada do grupo constituído pela of SEQ ID NO: 697, SEQ ID NOs: 813-819, SEQ ID NO: 841 e SEQ ID NO: 874, ou fragmento, complemento ou concatâmero destas.
[0023] A invenção provê também combinações de métodos e composi-ções para controle de infestações por coleóptero-praga. Um dos meios pro-vidos se refere ao uso de dsRNA, conforme descrito neste pedido, para pro-teção de plantas contra infecção por insetos, juntamente com um ou mais agentes inseticidas com características diferentes daquelas exibidas pelos métodos com dsRNA e composições. Por exemplo, uma ou mais proteínas de Bt podem ser fornecidas na dieta de insetos-praga, em combinação com um ou mais dsRNAs, conforme expostos no presente. Uma composição formulada para aplicação tópica ou derivada, empregando uma abordagem transgênica que combine métodos com dsRNA e composições com Bt, pode ser utilizada de forma a conferir sinergias que não eram conhecidas previ-amente na técnica. Um dos efeitos sinérgicos resultantes é a redução no nível de expressão exigido para o(s) dsRNA(s) ou proteína(s) da Bt. Quando combinados, uma dose efetiva mais baixa de cada agente de controle da praga poderia ser utilizada. Acredita-se que as proteínas inseticidas da Bt criam poros que possibilitam a penetração das moléculas do dsRNA com mais eficiência em espaços remotos do intestino de insetos-praga, ou com mais eficiência nas células próximas a lesões criadas pelas proteínas da Bt, requerendo, dessa forma, menos quantidade de Bt ou do dsRNA para se obter o resultado inseticida desejado ou para a inibição ou supressão dese-jada de uma função biológica visada na praga à qual se destina.
[0024] A presente invenção provê, por conseguinte, uma composição que contém mais dois agentes pesticidas diferentes, todos tóxicos para a mesma praga ou espécie de inseto, pelo menos um destes compreendendo um dsRNA exposto neste pedido. Em certas concretizações, o segundo agente pode ser um agente selecionado do grupo constituído por uma pata-tina, uma proteína inseticida do Bacillus thuringiensis, uma proteína insetici-da do Xenorhabdus, uma proteína inseticida do Photorhabdus, uma proteína inseticida do Bacillus laterosporous, uma proteína inseticida do Bacillus sphaericus e uma lignina. Esta proteína inseticida do Bacillus thuringiensis pode ser qualquer uma entre algumas proteínas inseticidas, incluindo, entre outras, Cry1, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC1201,TIC407, TIC417, uma proteína inseticida binária CryET33 e CryET34, uma proteína inseticida binária CryET80 e CryET76, uma proteína inseticida binária TIC100 e TIC101, uma proteína inseticida binária PS149B1, uma proteína inseticida VIP, TIC900 ou proteína correlata, ou combinações das proteínas inseticidas ET29 ou ET37 com as proteínas inseticidas TIC810 ou TIC812, e quimeras inseticidas de qualquer uma das proteínas inseticidas preceden-tes.
[0025] Ácido ribonucléico presente em dieta pode ser fornecido em uma dieta artificial, formulada para atender a requisitos nutritivos especiais que mantenham uma praga nesta dieta. A dieta pode ser complementada com uma quantidade, que controle a praga, de RNA, purificado a partir de um sistema de expressão diferente para que possa ser determinada uma quantidade de controle de praga de uma composição de RNA ou para de-terminar a extensão da atividade supressora na ingestão da dieta comple-mentada pela praga. A dieta pode conter também uma célula transformada recombinante com sequência de DNA, construída para expressão do agen-te, de RNA ou do agente de supressão do gene. Na ingestão, pela praga, de uma ou mais destas células transformadas, é observado um resultado feno- típico desejado, indicando que o agente atuou na inibição da expressão de uma sequência visada de nucleotídeos, presente nas células da praga.
[0026] Um gene, cuja supressão é visada, pode codificar uma proteína essencial cuja função prevista é selecionada do grupo constituído por for-mação de músculos, formação de hormônio juvenil, regulação de hormônio juvenil, regulação e transporte de íons, síntese de enzima digestiva, manu-tenção de potencial de membrana celular, biossíntese de aminoácidos, de-gradação de aminoácidos, formação de esperma, síntese de feromônio, for-mação de antena, formação de asa, formação de perna, desenvolvimento e diferenciação, formação de ovo, maturação larval, formação de enzima di-gestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmis-são, divisão celular, metabolismo energético, função desconhecida e apop-tose.
[0027] Outra característica da presente invenção provê também méto-dos para melhorar o rendimento de uma cultura de um planta de cultivo, su-jeita à infestação por inseto-praga, o referido método compreendendo as etapas de (a) introdução de um polinucleotídeo contendo uma sequência selecionada entre a SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou um complemen-to, concatâmero ou fragmento destas na referida planta de cultivo; e (b) o cultivo desta planta de forma a permitir a expressão do referido polinucleotí-deo, em que a expressão do polinucleotídeo inibe a alimentação por inse-tos-praga e a perda de rendimento decorrente de infestação por praga.
[0028] Em certas concretizações, a expressão do polinucleotídeo pro-duz uma molécula de RNA que suprime, pelo menos, um primeiro gene-alvo, em inseto-praga que tenha ingerido uma porção da referida planta de cultivo, em que o gene-alvo atua em, pelo menos, uma função essencial selecionada do grupo constituído por alimentação pela praga, viabilidade da praga, apoptose celular da praga, diferenciação e desenvolvimento da praga ou de qualquer célula da praga, reprodução sexual pela praga, formação de músculo, movimentação muscular, contração muscular, formação e/ou re-dução de hormônio juvenil, regulação de hormônio juvenil, regulação e transporte de íons, manutenção de potencial da membrana celular, biossín-tese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, formação de esperma, síntese de feromônio, sensibilidade de feromônio, formação de antena, for-mação de asas, formação de perna, formação de ovo, maturação larval, for-mação de enzima digestiva, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolin-fa, neurotransmissão, transição de estágio larval, pupação, emergência de pupação, divisão celular, metabolismo energético, respiração e síntese e manutenção de estrutura citoesquelética, metabolismo de nucleotídeos, me-tabolismo de nitrogênio, uso de água, retenção hídrica e percepção sensori-al.
[0029] Em outras concretizações, o inseto-praga é uma praga de larva alfinete de milho, selecionada do grupo constituído por Diabrotica undecim-punctata howardi (larva alfinete do milho do Sul (SCR)), Diabrotica virgifera virgifera (larva alfinete do milho ocidental (WCR)), Diabrotica barberi (larva alfinete do milho do Norte (NCR)), Diabrotica virgifera zea (Mexican Corn Rootworm (MCR)), Diabrotica balteata (Brazilian Corn Rootworm (BZR)), Di-abrotica viridula (Brazilian Corn Rootworm (BZR)) e Diabrotica speciosa (Brazilian Corn Rootworm (BZR)).
[0030] São fornecidos também métodos para melhora de tolerância à estiagem de um cultivar, resultante de uma planta de cultivo sujeita à infes-tação por inseto-praga, o referido método compreendendo as etapas de (a) introdução de uma sequência de polinucleotídeo, selecionada entre a SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou fragmento da mesma, na referida planta de cultivo; e (b) cultura da planta de cultivo de forma a permitir a expressão do referido polinucleotídeo, em que a expressão deste inibe a alimentação pe-los insetos-praga e a perda da tolerância à estiagem decorrente da infesta-ção por praga.
[0031] Outra característica da invenção provê ainda produtos e/ou composições de matéria de valor agronômico e comercial, incluindo, entre outros, produtos e subprodutos cujo uso pretendido é alimento de consumo humano ou para uso em composições e produtos comerciáveis pretendidos para consumo humano, incluindo, entre outros, farinha de milho, alimento de milho, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, pipoca, bolos de milho, cereais e similares. Estas composições podem ser definidas como contendo quantidades detectáveis de uma sequência de nucleotídeos, ex-posta neste pedido, servindo também, dessa forma, para diagnóstico de qualquer evento transgênico contendo estas sequências de nucleotídeos. Estes produtos são úteis, no mínimo, por serem possivelmente derivados de plantas cultivadas com menos pesticidas e organofosfatos, graças à incor-poração dos nucleotídeos da presente invenção para controle de infestação de coleópteros-praga em plantas. Estes produtos e derivados comerciáveis podem ser produzidos a partir de semente proveniente de planta transgêni-ca, em que a planta transgênica expressa RNA de um ou mais nucleotídeos contíguos da presente invenção, ou nucleotídeos de um ou mais coleópte-ros-praga e os complementos destes. Estes produtos e derivados comerciá-veis podem ser úteis também no controle de coleópteros-praga, presentes nestes produtos e derivados comerciáveis, como, por exemplo, controle de gorgulhos de farinha, em virtude de haver, no produto ou derivado comerci-ável, o RNA supressor do gene, expresso a partir de uma sequência gênica, conforme descrita na presente invenção.
[0032] É provido também método de produção deste produto comerciá-vel, compreendendo a obtenção de uma planta transformada com um poli-nucleotídeo contendo uma sequência selecionada do grupo constituído pe-la SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou concatâmero, fragmento ou com-plemento desta, e o preparo de um produto comerciável da planta ou de par-te da mesma. Ademais, é ainda uma outra característica da invenção, um método de produção de comida ou alimento, compreendendo a obtenção de uma planta transformada com um polinucleotídeo contendo uma sequência selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou fragmento ou complemento desta, e o preparo de comida ou alimento a partir da referida planta ou de parte da mesma.
[0033] A invenção provê também um meio que pode ser lido por com-putador, contendo os registros de uma ou mais sequências de nucleotídeos, conforme indicadas na SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou complemen-tos destas, para uso em alguns aplicativos em computador, incluindo, entre outros, pesquisa de identidade e semelhança de DNA, caracterizações de perfis de transcrição, comparações entre genomas e análises de hibridiza-ção artificial.
Breve Descrição das Figuras
[0034] Figura 1: Bioensaio de eventos de planta de milho F1, transfor-mada com pMON98503 (SEQ ID NO: 820) e submetida a testes com Larva Alfinete Ocidental (larva alfinete do milho ocidental (WCR)).
[0035] Figura 2: Bioensaio de eventos de planta de milho F1, transfor-mada com pMON98504, contendo o concatâmero C1 (SEQ ID NO: 821) e submetida a testes com Larva Alfinete Ocidental (larva alfinete do milho oci-dental (WCR)).
[0036] Figura 3: Seleção de fragmentos Dv49 e Dv248 e desenho es-quemático do concatâmero C38 de Dv49-Dv248.
[0037] Figura 4: dsRNAs F1-F13, sintetizados com base no concatâme-ro C38.
[0038] Figura 5: Dose-resposta ao concatâmero 38 de DV49 DV248 (Fragmentos F1-F6).
[0039] Figura 6: Dose-resposta ao concatâmero 38 de DV49 DV248 (Fragmentos F7-F10).
[0040] Figura 7: Dose-resposta ao concatâmero 38 de DV49 DV248 (Fragmentos F11-F13).
Descrição Detalhada da Invenção
[0041] A seguir, é apresentada uma descrição detalhada da invenção, fornecida para auxiliar a sua prática por versados na técnica. Qualquer ver-sado na técnica pode modificar ou variar as concretizações aqui descritas, sem se distanciar do espírito ou escopo da presente invenção.
[0042] A presente invenção provê métodos e composições para contro-le genético de infestações por praga. Por exemplo, ela provê técnicas de DNA recombinante visando reprimir ou inibir a expressão pós-transcricional de uma sequência codificadora-alvo, na célula de uma praga, a fim de ser conferido efeito de proteção contra a praga, pela alimentação à mesma de uma ou mais moléculas de ácido ribonucléico (RNA) de fita dupla ou pequeno interferente, transcrito de toda ou de parte de uma sequência codi-ficadora-alvo e o controle, pelo mesmo, da infestação. Por conseguinte, a presente invenção se refere à inibição específica de sequência de expres-são de sequências codificadoras, empregando RNA de fita dupla (dsRNA), inclusive pequeno RNA interferente (siRNA), para serem atingidos os níveis pretendidos de controle.
[0043] São providas moléculas de ácido nucléico, isoladas e substan-cialmente purificadas, incluindo, porém sem restrição, sequências de nu-cleotídeos que não ocorrem naturalmente e constructos de DNA recombi-nante que suprimem ou inibem a expressão de uma sequência codificadora endógena na praga, quando introduzidas nesta. São providas também plan-tas transgênicas que (a) contêm sequências de nucleotídeos que codificam as moléculas de ácido nucléico, isoladas e substancialmente purificadas, e os constructos de DNA que não ocorrem naturalmente para transcrição das moléculas de dsRNA visando o controle de infestações de plantas por pra-gas, e que (b) exibem resistência e/ou tolerância intensificadas às infesta-ções por insetos. São descritas também composições contendo as seqüên-cias de nucleotídeos de dsRNA da presente invenção para uso em aplica-ções tópicas em plantas ou animais, ou no ambiente de um animal, visando eliminar ou reduzir infestação por praga.
[0044] Os inventores descobriram que, ao contrário dos ensinamentos na técnica anterior, a alimentação de uma composição contendo RNA de fita dupla, cuja molécula consiste em sequências com uma ou mais sequências expressas de nucleotídeos de uma espécie de coleóptero às espécies das quais as sequências de nucleotídeos foram obtidas, resulta na inibição de uma ou mais funções biológicas na espécie de coleóptero. Os inventores descobriram, especialmente, que a alimentação de moléculas de fita dupla, descritas neste pedido, a espécies de pragas de plantas de cultivo, como larvas alfinete de milho, resulta na morte ou inibição de de-senvolvimento e diferenciação de insetos-praga que ingeriram estas com-posições.
[0045] Os inventores identificaram que as sequências de nucleotídeos, aqui descritas, conferem efeitos protetores à planta contra espécies de co-leópteros-praga. Foram deduzidas sequências de aminoácidos, codificadas pelas sequências de cDNA, e estas foram comparadas a sequências de aminoácidos conhecidas. Prevê-se que muitas destas sequências codificam proteínas que possuem alguma informação anotada, associada às mesmas. A informação anotada, associada a uma sequência de nucleotídeo em par-ticular e sequência de proteína, codificada da mesma, tem como base homo-logia ou semelhança entre as sequências de aminoácidos, deduzidas atra-vés da tradução das sequências de codificação aqui descritas, conforme apresentadas, e sequências de aminoácidos, conhecidas na técnica e que podem ser encontradas em bancos de dados públicos.
[0046] Sequências de cDNA que codificam proteínas ou partes de pro-teínas, fundamentais para sobrevida, como sequências de aminoácidos, envolvidas em várias vias bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, reprodução, metabolismo energético, digestão, função neurológica e funções similares, foram selecionadas para serem utilizadas no preparo de moléculas de RNA de fita dupla, sendo estas fornecidas na dieta de coleópteros-praga. Conforme descrito neste pedido, ingestão, por uma praga-alvo, de composições contendo um ou mais dsRNAs, com pelo me-nos um segmento que corresponda a pelo menos um segmento substanci-almente idêntico do RNA produzido nas células da praga-alvo, resultou em morte, atrofia ou outro tipo de inibição da praga-alvo. Esses resultados indicaram que uma sequência de nucleotídeos de DNA ou RNA, derivada de um coleóptero-praga, pode ser utilizada para construir células de plantas resistentes à infestação pela praga. O hospedeiro da praga pode, por exem-plo, ser transformado de forma a conter uma ou mais das sequências de nucleotídeos, derivadas do coleóptero-praga. A sequência transformada de nucleotídeos no hospedeiro ou simbionte da praga pode codificar um ou mais RNAs que formam uma sequência de dsRNA nas células ou líquidos biológicos dentro do hospedeiro ou simbionte transformado, disponibilizan-do, dessa forma, os dsRNA na dieta da praga, se/quando a praga alimentar-se do hospedeiro ou simbionte transgênico, resultando na supressão da expressão de um ou mais genes, nas células da praga, e, em última instân-cia, na morte, atrofia ou outro tipo de inibição da praga.
[0047] A presente invenção se refere, de modo geral, ao controle gené-tico de infestações por coleópteros-praga em organismos hospedeiros. A presente invenção inclui, mais especialmente, os métodos de liberação de agentes de controle de pragas a um coleóptero-praga. Estes agentes de controle de pragas comprometem, quer direta ou indiretamente, a capacida-de da praga de manter-se, crescer ou, de outra forma, infestar um hospedei-ro ou simbionte visado. A presente invenção provê métodos para o emprego de moléculas estabilizadas de dsRNA na dieta da praga, como uma maneira para supressão de genes específicos na praga e, dessa forma, ser atingido o controle desejado de infestações por pragas em ou em torno do hospedei-ro ou simbionte visado pela praga.
[0048] Para atingir o precedente, a presente invenção provê um méto-do de inibição de expressão de um gene-alvo em coleóptero- praga, incluin-do, por exemplo, larvas alfinete de milho ou outras espécies de insetos co-leópteros, resultando na interrupção de alimentação, crescimento, desen-volvimento, reprodução, capacidade de infectar e podendo, eventualmente, resultar na morte da praga. O método compreende, em uma concretização, a introdução parcial ou completa de moléculas estabilizadas de nucleotídeos de RNA de dupla fita (dsRNA) em uma composição nutritiva na qual a praga baseia-se como fonte de alimento, e disponibilização da composição nutritiva para alimentação da praga. A ingestão da composição nutritiva, contendo as moléculas de RNA de dupla fita ou de siRNA, resulta na absorção das moléculas pelas células da praga, levando à inibição da expressão de, pelo menos, um gene-alvo em suas células. A inibição do gene-alvo exerce um efeito deletério sobre a praga.
[0049] Em certas concretizações, as moléculas de dsRNA, providas pela invenção, compreendem sequências de nucleotídeos complementares de uma sequência conforme indicada em qualquer uma entre a SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, cuja inibição, em organismo de praga, resulta na re-dução ou remoção do agente de uma proteína ou sequência de nucleotí-deos, essencial para o crescimento e desenvolvimento ou para outra função biológica das pragas. A sequência de nucleotídeos selecionada pode exibir de aproximadamente 80% a, pelo menos, aproximadamente 100% de iden-tidade de sequência em relação a uma das sequências de nucleotídeos, conforme indicadas na SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, de acordo com a listagem das sequências, incluindo o complemento das mesmas. Esta inibi-ção pode ser descrita como específica em que é escolhida uma sequência de nucleotídeos de uma parte do gene-alvo, do qual o dsRNA ou siRNA é transcrito. O método efetivamente inibe a expressão de, pelo menos, um ge-ne-alvo e pode ser utilizado para inibir muitos tipos diferentes de genes-alvo na praga. Em concretizações especiais, a sequência de nucleotídeos pode ser selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 697, SEQ ID NOs: 813-819, SEQ ID NO: 841 e SEQ ID NO: 874.
[0050] As sequências identificadas como tendo efeito protetor contra praga podem ser expressas de imediato como moléculas de dsRNA pela criação de constructos apropriados de expressão. Por exemplo, estas se-qüências podem ser expressas sob a forma de grampo e de alça, tomando-se um primeiro segmento, correspondente a uma sequência selecionada SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou um fragmento desta, ligando-se esta sequência a um segundo segmento de região espaçadora, o qual não é homólogo ou complementar ao primeiro segmento, e ligando-se este a um terceiro segmento que transcreve um RNA, em que pelo menos uma parte do terceiro segmento é substancialmente complementar do primeiro segmento. Este constructo forma uma estrutura em laço por hibridização do primeiro segmento com o terceiro segmento e formação de estrutura em alça compreendendo o segundo segmento (WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814A1 e US 2003/0018993A1).
A. Composições e construções de ácidos nucléicos
[0051] A invenção provê constructos de DNA recombinante para serem utilizados a fim de ser obtida transformação estável de hospedeiros ou sim-biontes de pragas, visados em particular. Os hospedeiros ou simbiontes transformados visados de pragas podem expressar níveis pesticidas efetivos de moléculas preferidas de dsRNA ou de siRNA, provenientes de construc-tos de DNA recombinante, e as moléculas fornecidas na dieta da praga. Pa-res de sequências de nucleotídeos, isoladas e purificadas, podem ser provi-das, provenientes de biblioteca de cDNA e/ou informação genômica de bibliotecas. Os pares de sequências de nucleotídeos podem ser derivados de qualquer coleóptero-praga preferido para uso como iniciadores de amplifi-cação térmica a fim de gerar cópias de DNA para o preparo de moléculas de dsRNA e de siRNA da presente invenção.
[0052] Conforme utilizado no presente, o termo "ácido nucléico" se refere a um polímero de fita simples ou dupla de bases de desoxirribonu-cleotídeos ou ribonucleotídeos, cuja leitura inicia na extremidade 5' até a extremidade 3'. O "ácido nucléico" pode conter também, opcionalmente, ba-ses de nucleotídeos que não ocorrem naturalmente ou alteradas que permi-tam a leitura correta por uma polimerase e que não reduzam a expressão de um polipeptídeo codificado por aquele ácido nucléico. O termo "sequência de nucleotídeos" ou "sequência de ácido nucléico" se refere a fitas em orientação sendo e antissenso de um ácido nucléico, sob a forma de fitas simples individualizadas ou na forma de dúplex. O termo "ácido ribonucléico" (RNA) inclui RNAi (RNA inibidor), dsRNA (RNA de fita dupla), siRNA (pequeno RNA interferente), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), tRNA (RNA de transferência, com carga ou sem carga com um aminoácido acilado correspondente) e cRNA (RNA complementar), e o termo "ácido desoxirribonucléico" (DNA) inclui cDNA e DNA genômico e híbridos DNA-RNA. As palavras "segmento de ácido nucléico", "segmento de sequência de nucleotídeos" ou, mais generalizada, "segmento" serão entendidas por aqueles na técnica como um termo funcional que inclui se-qüências genômicas, sequências de RNA ribossômico, sequências de RNA de transferência, sequências de RNA mensageiro, sequências de operon e sequências menores construídas de nucleotídeos que expressam, ou que podem ser adaptadas para expressar, proteínas, polipeptídeos ou peptídeos.
[0053] São providas, de acordo com a invenção, sequências de nu-cleotídeos, cuja expressão resulta em uma sequência de RNA que é subs-tancialmente homóloga a uma molécula de RNA de um gene- alvo em um inseto que contém uma sequência de RNA, codificada por uma sequência de nucleotídeos contida no genoma do inseto. Dessa forma, após ingestão da sequência estabilizada do RNA, pode ser obtida regulação negativa da sequência de nucleotídeos do gene-alvo nas células do inseto, resultando em efeito deletério sobre a manutenção, viabilidade, proliferação e infesta-ção do inseto.
[0054] Conforme utilizado no presente, o termo "substancialmente ho-mólogo" ou "homologia substancial", em referência a uma sequência de ácido nucléico, inclui uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas para a sequência codificadora, conforme indicada em qualquer uma entre as SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, conforme indica-das na listagem de sequências ou os complementos destas. Sequências que hibridizam sob condições de rigor para qualquer uma entre as SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, conforme indicadas na listagem de sequências, ou os complementos destas, são aquelas que permitem que um alinhamen-to em sentido contrário ao paralelo ocorra entre duas sequências, e as duas sequências são então capazes, sob condições de rigor, de formar pontes de hidrogênio com as bases correspondentes na fita oposta, formando uma molécula dúplex suficientemente estável, sob as condições de rigor, para ser detectável com métodos bem-conhecidos na técnica. Sequências substancialmente homólogas possuem, de preferência, de aproximadamen-te 70% a aproximadamente 80% de identidade de sequência, ou mais prefe-rencialmente, de aproximadamente 80% a aproximadamente 85% de identi-dade de sequência, ou, o mais preferível, de aproximadamente 90% a apro-ximadamente 95% a aproximadamente 99% de identidade de sequência, em relação a sequências de nucleotídeos de referência, conforme indicadas por qualquer uma entre as SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, conforme in-dicado nas listagens de sequências, ou os complementos destas.
[0055] Conforme utilizado no presente, o termo "identidade de seqüên-cia", "semelhança de sequência" ou "homologia" é utilizado para descrever relações de sequência entre uma ou mais sequências de nucleotídeos. O percentual de "identidade de sequência", entre duas sequências, é deter-minado pela comparação de duas sequências alinhadas da melhor forma sobre um intervalo de comparação, em que a parte da sequência, no inter-valo da comparação, pode compreender acréscimos ou exclusões (isto é, lacunas), quando comparada à sequência de referência (a qual não com-preende acréscimos ou exclusões), quanto ao alinhamento mais adequado das duas sequências. O percentual é calculado pela determinação do nú-mero de posições no qual uma base de ácido nucléico ou resíduo de ami-noácido ocorre em ambas sequências e que resulta no número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições no intervalo de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar origem ao percentual de identidade de sequência. Uma sequência idêntica em todas as posições, em comparação a uma sequência de refe-rência, é considerada como idêntica à sequência de referência e vice e ver-sa. Uma primeira sequência de nucleotídeos, quando observada na direção de 5' para 3', é considerada como "complemento" ou complementar de uma segunda sequência de nucleotídeos ou uma de referência, observada na direção de 3' para 5', se a primeira sequência de nucleotídeos exibe com-plementaridade completa com a segunda sequência ou a de referência. Conforme utilizadas no presente, moléculas de sequência de ácido nucléi-co são consideradas como exibindo "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das sequências, lida de 5' para 3', é complementar de cada nucleotídeo da outra sequência, quando lida de 3' para 5'. Uma se- qüência de nucleotídeos, complementar de uma sequência de nucleotídeos de referência exibirá uma sequência idêntica à sequência invertida de com-plementos da sequência de nucleotídeos de referência. Estes termos e des-crições são bem-definidos na técnica e podem ser entendidos com facilida-de por qualquer versado na técnica.
[0056] Conforme utilizado no presente, um "intervalo de comparação" se refere a um conceito de segmento contendo, pelo menos, seis posições contíguas, geralmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, mais geralmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, em que uma sequência é comparada a uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas, depois que duas sequências são alinhadas da melhor forma. O intervalo de comparação pode compreender acréscimos ou exclusões (isto é, lacunas) de aproximadamente 20% ou menos, em comparação com a sequência de referência (a qual não compreende acrés-cimos ou exclusões), para a melhor forma de alinhamento das duas se- qüências. Versados na técnica devem vide os métodos detalhados, utiliza-dos para alinhamento de sequências no pacote de programas Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA ou consultarem Ausubel et al. (1998), para uma discussão detalhada de análise de sequências.
[0057] A presente invenção provê sequências de DNA que podem ser expressas sob a forma de RNA em uma célula ou microorganismo para ini-bição da expressão de um gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de um inseto. As sequências compreendem uma molécula de DNA que codifica uma ou mais sequências diferentes de nucleotídeos, em que cada uma das sequências diferentes de nucleotídeos compreende uma sequência de sen-tido de nucleotídeos e uma sequência antissenso de nucleotídeos, liga-das por uma sequência espaçadora que codifica uma molécula de dsRNA da presente invenção. A sequência espaçadora constitui parte da seqüên-cia de sentido de nucleotídeos ou da sequência antissenso de nucleotí-deos e forma-se, dentro da molécula de RNA, entre a sequência senso e a sequência antissenso. A sequência senso de nucleotídeos e a sequência antissenso de nucleotídeos são substancialmente idênticas à sequência de nucleotídeos do gene-alvo, ou de um derivado do mesmo ou de uma sequência complementar do mesmo. A molécula de dsDNA pode ser operacionalmente colocada sob o controle de uma sequência de promo-tor que funcione na célula, tecido ou órgão do hospedeiro que expressa o dsDNA para produzir moléculas de dsRNA . Em uma concretização, a se-qüência de DNA pode ser derivada de uma sequência de nucleotídeos con-forme indicada na SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906 na listagem de se-qüências.
[0058] A invenção provê também uma sequência de DNA para expres-são em uma célula de uma planta que, na expressão do DNA para RNA e ingestão por uma praga visada, leva à supressão de um gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de um inseto-praga. O dsRNA compreende, pelo menos, uma ou múltiplas sequências estruturais do gene, em que a estrutu-ra de cada sequência do gene compreende uma sequência senso de nucleotídeos e uma sequência antissenso de nucleotídeos, ligados por uma sequência espaçadora que forma uma alça dentro das sequências complementar e antissenso. A sequência senso de nucleotídeos ou a sequência antissenso de nucleotídeos são substancialmente idênticas à sequência de nucleotídeos do gene-alvo, um derivado do mesmo ou se-qüência complementar do mesmo. A sequência ou mais sequências estru-turais do gene são colocadas operacionalmente sob o controle de uma ou mais sequências de promotor, sendo operável, pelo menos, uma destas na célula, tecido ou órgão de um organismo procariótico ou eucariótico, espe-cialmente de uma planta.
[0059] Uma sequência ou fragmento de gene para controle de praga, de acordo com invenção, pode ser clonado entre dois promotores específi-cos do tecido, como dois promotores específicos de raiz, que podem ser ope-rados em uma célula de planta transgênica e expressados na mesma para produzir mRNA, na célula da planta transgênica, que forma moléculas de dsRNA para o mesmo. As moléculas de dsRNA, contidas em tecidos da planta, são ingeridas por um inseto de forma que a supressão pretendida da expressão do gene-alvo é atingida.
[0060] Uma sequência de nucleotídeos, provida pela presente inven-ção, pode compreender uma repetição invertida, separada por uma "se-qüência espaçadora". A sequência espaçadora pode ser uma região com-preendendo qualquer sequência de nucleotídeos que facilite a formação de estrutura secundária entre cada repetição, quando esta for necessária. Em uma concretização da presente invenção, a sequência espaçadora é parte da sequência codificadora sentido ou antissenso do mRNA. A sequência espaçadora pode compreender, alternativamente, qualquer combinação de nucleotídeos ou homólogos dos mesmos, capazes de se ligarem covalen-temente a uma molécula de ácido nucléico. A sequência espaçadora pode compreender uma sequência de nucleotídeos de, pelo menos, aproxima-damente 10-100 nucleotídeos em extensão ou, alternativamente, de pelo menos aproximadamente 100-200 nucleotídeos em extensão, pelo menos aproximadamente 200-400 em extensão ou de, pelo menos, aproximada-mente 400-500 nucleotídeos em extensão.
[0061] As moléculas de ácido nucléico ou fragmentos das moléculas de ácido nucléico ou outras moléculas de ácido nucléico, na listagem de sequências, são capazes de se hibridizarem especificamente para outras moléculas de ácido nucléico, sob certas circunstâncias. Conforme utilizadas no presente, duas moléculas de ácido nucléico são consideradas como ca-pazes de se hibridizarem especificamente para uma outra, se as duas molé-culas forem capazes de formar uma estrutura antiparalela de duplo filamen-to de ácido nucléico. Uma molécula de ácido nucléico é considerada como sendo o complemento de outra molécula de ácido nucléico se exibirem complementaridade completa. Duas moléculas são consideradas como sendo "minimamente complementar" se puderem hibridizar para uma outra com estabilidade suficiente que permita que se mantenham aneladas a uma outra, sob condições convencionais de, pelo menos, "baixo rigor". Se-melhantemente, as moléculas são consideradas como sendo complementa-res se puderem hibridizar para uma outra com estabilidade suficiente que permita que se mantenham aneladas a uma outra sob condições convenci-onais de "alto rigor". Condições convencionais de rigor são descritas por Sambrook et al. (1989) e por Haymes et al. (1985).
[0062] Distanciamentos de complementaridade completa são, por con-seguinte, permitidos, desde que estes não impeçam completamente a capa-cidade das moléculas de formarem estrutura de dupla fita. Dessa forma, para que uma molécula de ácido nucléico ou fragmento da molécula de ácido nucléico sirva como iniciador ou sonda, ele precisa somente ser sufi-cientemente complementar, em sequência, para ser capaz de formar uma estrutura estável de dupla fita, sob o aglutinante e concentrações de sal, especificamente empregados.
[0063] Condições apropriadas de rigor que promovam hibridização de DNA são, por exemplo, 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), em aproximadamente 45°C, seguido por lavagem com 2,0 x SSC a 50°C, e co-nhecidas de versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology (1989). Por exemplo, a concentração do sal, na etapa de lavagem, pode ser selecionada entre baixo rigor de aproxima-damente 2,0 x SSC a 50°C a alto rigor de aproximadamente 0,2 x SSC a 50°C. Ademais, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada, de condições de baixo rigor em temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, para condições de alto rigor de aproximadamente 65°C. Tanto a temperatura como o sal pode variar ou a temperatura ou a concentração do sal pode ser mantida constante enquanto que a outra variável é modificada. Um ácido nucléico utilizado na presente invenção pode hibridizar especificadamente para uma ou mais moléculas de ácido nucléico de WCR, ou complementos deste, sob estas condições. De preferência, um ácido nucléico utilizado na presente invenção exibirá, pelo menos, aproximadamente 80%, pelo menos, aproximadamente 90%, pelo menos, aproximadamente 95%, pelo menos, aproximadamente 98% ou até mesmo aproximadamente 100% de identida-de de sequência com uma ou mais moléculas de ácido nucléico, conforme indicadas na SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, conforme indicadas na lis-tagem de sequências.
[0064] Ácidos nucléicos da presente invenção podem ser sintetizados também, completamente ou em parte, especialmente quando se desejar prover sequências preferidas de plantas, por métodos versados na técnica. Dessa forma, todos ou parte dos ácidos nucléicos da presente invenção po-dem ser sintetizados empregando códons preferidos por um hospedeiro se-lecionado. Codóns preferidos de espécies podem ser determinados, por exemplo, dos códons mais freqüentemente utilizados nas proteínas expres-sas em uma espécie particular de hospedeiros. Outras modificações das sequências de nucleotídeos podem resultar em mutantes com atividade li-geiramente alterada.
[0065] Sequências de nucleotídeos de dsRNA ou de siRNA compre-endem fitas duplas de ribonucleotídeos polimerizados e podem incluir modificações à cadeia principal de fosfato-açúcar ou aos nucleosídeos. Mo-dificações em estrutura de RNA podem ser adaptadas para permitir inibição genética específica. Em uma concretização, as moléculas de dsRNA podem ser modificadas por processo enzimático de forma que moléculas de siRNA possam ser geradas. O siRNA pode mediar eficientemente o efeito de regu-lação negativa de alguns genes-alvo em alguns insetos. Este processo en- zimático pode ser obtido, utilizando uma enzima RNAse III ou enzima DI-CER, presentes nas células de inseto, animal vertebrado, fungo ou planta na via eucariótica de RNAi (Elbashir et al., 2002; Hamilton e Baulcombe, 1999). Este processo pode utilizar também DICER ou RNAse III recombinan-te, introduzidas nas células de um inseto-alvo por meio de técnicas de DNA recombinante que são prontamente reconhecidas para os versados na téc-nica. As duas enzimas, DICER e RNAse III, naturalmente existentes em um inseto ou sintetizadas por técnicas de DNA recombinante, efetuam a cliva-gem de fitas maiores do dsRNA em oligonucleotídeos menores. As enzimas DICER cortam especificamente as moléculas do dsRNA em peda-ços de siRNA, cada uma das quais contando com aproximadamente 19-25 nucleotídeos, em extensão, enquanto que as enzimas RNAse III efetuam normalmente a clivagem das moléculas de dsRNA em siRNA contanto com 12-15 pares de base. As moléculas de siRNA, produzidas por qualquer uma destas enzimas, possuem 2 a 3 nucleotídeos em ressalto em 3' e fosfato em 5' e terminal hidroxila em 3'. As moléculas de siRNA, geradas pela enzima RNAse III, são iguais às produzidas pelas enzimas Dicer na via eucariótica do RNAi e são, por conseguinte, visadas e degradadas por um mecanismo celular inerente de degradação de RNA, depois que abertas e separadas em RNA de fita simples, e hibridizam com as sequências de RNA, transcritas pelo gene-alvo. Esse processo resulta na degradação ou remoção efe-tiva da sequência de RNA, codificada pela sequência de nucleotídeos do gene-alvo no inseto. O desfecho é o silenciamento de uma sequência es-pecialmente visada de nucleotídeos, dentro do inseto. Descrições detalha-das de processos enzimáticos podem ser encontradas em Hannon (2002).
[0066] Uma sequência de nucleotídeos da presente invenção pode ser registrada em um meio de leitura por computador. Conforme utilizado no presente, "meio de leitura por computador" se refere a qualquer meio de ex-pressão tangível que possa ser lido ou acessado diretamente por computa-dor. Estes meios incluem, entre outros: meio de armazenamento magnético, como disquetes, disco rígido, meio de armazenamento e filamento magnéti-ca; meio de armazenamento óptico, como CD-ROM; meio de armazenamen-to elétrico, como RAM e ROM; arquivos de computador, formatados para re-conhecimento de caracteres ópticos e híbridos dessas categorias, como meio de armazenamento magnético/óptico. Um versado pode apreciar de imediato que qualquer um dos meios de leitura por computador, conhecidos atualmente, pode utilizado para criar um produto compreendendo meio de leitura por computador contendo registros de sequência de nucleotídeos da presente invenção.
[0067] Conforme utilizado no presente, "registrado" se refere a um pro-cesso de armazenamento de informação em meio de leitura por computador. Um versado pode adotar imediatamente qualquer um dos métodos conheci-dos atualmente para registro de informação em meio de leitura por compu-tador para gerar meios que contenham informação sobre sequências de nucleotídeos da presente invenção. Há disponível uma variedade de estru-turas de armazenamento de dados, possibilitando que um versado crie um meio de leitura por computador contendo registros de sequências de nucle-otídeos da presente invenção. A escolha da estrutura de armazenamento de dados será, geralmente, baseada nos meios escolhidos para acesso à in-formação armazenada. Ademais, pode ser utilizada uma variedade de pro-gramas de processamento de dados e formatos para armazenar a informa-ção sobre sequências de nucleotídeos da presente invenção em meio de leitura por computador. A informação de sequências pode ser representada sob a forma de arquivo de processamento de texto, em programas formata-dos à disposição no mercado, como WordPerfect e Word da Microsoft, ou representados sob a forma de arquivo de texto ASCII, armazenado em apli-cativo de banco de dados, como DB2, Sybase, Oracle ou similar. O versado pode adaptar imediatamente qualquer número de formatos de estruturação de processamento de dados (por exemplo, arquivo de texto ou banco de da-dos) para obter um meio de leitura por computador contendo registros da informação de sequências de nucleotídeos da presente invenção.
[0068] Há programas de computador disponíveis publicamente que permitem um versado acessar informação de sequências, providas em um meio de leitura por computador. O programa que implanta o BLAST (Altschul et al., 1990) e BLAZE (Brutlag et al., 1993) e pesquisa algoritmos em um sis-tema Sybase pode ser utilizado para identificar estruturas de leitura aberta (ORFs), dentro de sequências, como os Unigenes e EST que são aqui pro-vidos e que contenham homologia em relação a ORFs ou proteínas de ou-tros organismos. Estas ORFs são fragmentos codificadores de proteínas, dentro das sequências da presente invenção, e são úteis para produção de proteínas de valor comercial, como enzimas utilizadas em biossíntese de aminoácidos, metabolismo, transcrição, tradução, processamento de RNA, degradação de ácido nucléico e de proteína, modificação de proteína e re-plicação, restrição, modificação, recombinação e reparo de DNA.
[0069] A presente invenção provê ainda sistemas, principalmente sis-temas baseados em computador, que contêm a informação de sequências, descritas neste pedido. Estes sistemas são criados para identificar fragmen-tos de valor comercial da molécula de ácido nucléico. Conforme utilizado no presente, "um sistema baseado em computador" se refere aos recursos refe-rentes a componentes rígidos, programas e de armazenamento de dados, utilizados para analisar a informação sobre sequências de nucleotídeos da presente invenção. Os recursos mínimos referentes a componentes rígidos dos sistemas baseados em computador da presente invenção compreendem unidade central de processamento (CPU), recursos de entrada de in-formação, recursos de saída de informação e recursos de armazenamento de dados. Um versado pode apreciar de imediato que qualquer um dos sis-temas baseados em computador, atualmente disponíveis, são adequados para uso na presente invenção.
[0070] Conforme utilizado no presente, "motivo visado em estrutura" ou "motivo visado," se refere a qualquer sequência ou combinação de seqüên-cias, racionalmente selecionadas, em que a sequência ou sequências é escolhida com base em configuração tridimensional, formada ao ser efetua-da a dobragem do motivo visado. Há uma variedade de motivos visados, co-nhecidos na técnica. Motivos que visam proteínas incluem, entre outros, sítios enzimáticos ativos e sequências de sinalização. Motivos que visam ácido nucléico incluem, entre outros, sequências de promotores, elementos cis, estruturas em grampo e elementos de indução de expressão (seqüên- cias de ligação protéica).
B. Vetores recombinantes e transformação de célula hospedeira
[0071] Um vetor de DNA recombinante pode ser, por exemplo, um plasmídeo linear ou circular fechado. O sistema do vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham, em conjunto, todo o DNA a ser introduzido no genoma do hospedeiro bacte-riano. Ademais, um vetor bacteriano pode ser um vetor de expressão. Molé-culas de ácido nucléico, conforme indicadas na SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou fragmentos ou complementos destas, podem ser, por exemplo, adequadamente inseridas em um vetor, sob controle de um promotor ade-quado que funcione em um ou mais hospedeiros microbianos a forma dire-cionar a expressão de uma sequência codificadora de ligação ou outra se- qüência de DNA. Há muitos vetores disponíveis para essa finalidade, e a seleção do vetor apropriado dependerá, principalmente, do tamanho do áci-do nucléico a ser inserido no vetor e da célula hospedeira em particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, de-pendendo de sua função (amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeira em particular com a qual é compatível. Os componentes do vetor, para transformação bacteriana, incluem geralmente, entre outros, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinalização, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores de seleção e um promotor de in-dução que permita a expressão do DNA exógeno.
[0072] Vetores de expressão e de clonagem contêm geralmente um gene de seleção, referido também como marcador seletivo. Este gene codifi-ca uma proteína necessária para a sobrevida ou crescimento das células hospedeiras transformadas em um meio de cultura seletivo. Genes de sele-ção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetra-ciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) suprem nutrien-tes fundamentais que não estão disponíveis no meio do complexo, por exemplo, o gene que codifica a D-alanina racemase do Bacilli. As células, transformadas com êxito com uma proteína heteróloga, ou fragmento desta, produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e, dessa forma, sobrevivem ao regime de seleção.
[0073] Um vetor de expressão, produtor de mRNA, pode conter também um promotor de indução que é reconhecido pelo organismo bacteriano hospedeiro e está operacionalmente ligado ao ácido nucléico que codifica, por exemplo, a molécula do ácido nucléico, codificadora do mRNA do D. v. virgifera ou fragmento deste de interesse. Promotores de indução, cujo uso é adequado com hospedeiros bacterianos incluem o promotor da β-lactamase, fago * de promotores PL e PR do E. coli e promotor da galactose do E. coli, promotor da arabinose, promotor da fosfatase alcalina, promotor do triptofano (trp) e o promotor operon da lactose e variações deste e promo-tores híbridos, como o promotor tac promoter. No entanto, outros promotores conhecidos de indução bacteriana são adequados.
[0074] O termo "ligado operacionalmente", conforme é utilizado em re-ferência a sequência reguladora e estrutura de sequência de nucleotídeos, significa que a sequência reguladora regula a expressão da sequência de nucleotídeos ligada à estrutura. "Sequências reguladoras" ou "elementos de controle" referem—se a sequências de nucleotídeos localizadas em sen-tido ascendente (sequências não codificadoras 5'), no interior, ou no senti-do descendente (sequências não traduzidas 3') da estrutura de uma se-qüência de nucleotídeos, e que influenciam o momento e nível ou quanti-dade de transcrição, processamento ou estabilidade do RNA ou a tradução da estrutura associada à sequência de nucleotídeos. Sequências regulado-ras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, introns, in- tensificadores estruturas em laço, sequências repressoras de ligação, se-qüências de reconhecimento de poliadenilação e similar.
[0075] Alternativamente, os constructos de expressão podem ser inte-gradas no genoma bacteriano com um vetor de integração. Vetores de inte-gração contêm tipicamente, pelo menos, uma sequência homóloga ao cromossomo da bactéria que permita a integração do vetor. As integrações parecem resultar de recombinações entre DNA homólogo no vetor e o cro-mossomo bacteriano. Por exemplo, vetores de integração construídos com DNA de várias cepas de Bacillus, integram-se em seu cromossomo (EP 0 127 328). Vetores de integração podem compreender também bacte- riófagos ou sequências transposon. Vetores suicidas são conhecidos tam-bém na técnica.
[0076] O constructo de vetores adequados, contendo um ou mais dos componentes listados acima, emprega técnicas convencionais de DNA re-combinante. Plasmídeos isolados ou fragmentos de DNA são clivados, ajus-tados e ligados mais uma vez na forma desejada para gerar os plasmídeos requeridos. Exemplos de vetores bacterianos disponíveis de expressão in-cluem, entre outros, os vetores de clonagem e expressão multifuncionais do E. coli, como o Bluescript® (Stratagene, La Jolla, CA), no qual, por exemplo, uma proteína do D. v. virgifera, ou fragmento desta, pode ser ligado ao vetor, na estrutura com sequências para o Met amino-terminal e os 7 resíduos subseqüentes da *-galactosidase de forma que uma proteína híbrida é pro-duzida; vetores pIN (Van Heeke e Schuster, 1989); e similar.
[0077] Um constructo recombinante de levedura pode incluir tipicamente um ou mais dos seguintes: sequência de promotor, sequência asso-ciada de fusão, sequência líder, sequência de término de transcrição e mar-cador de seleção. Esses elementos podem ser combinados em cartucho de expressão, o qual pode ser mantido em replicon, como um elemento extra-cromossômico (por exemplo, plasmídeos), capazes de manutenção estável em um hospedeiro, como levedura ou bactéria. O replicon pode conter dois sistemas de replicação, permitindo, dessa forma, a sua manutenção, por exemplo, em levedura para expressão, e em hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação. Exemplos destes vetores tipo ponte (shuttle) de levedura e bactéria incluem YEp24 (Botstein et al., 1979), pCl/1 (Brake et al., 1984) e YRp17 (Stinchcomb et al., 1982). Além disso, um replicon pode ser um plasmídeo com número alto ou baixo de cópias. Um plasmídeo de núme-ro alto de cópias pode conter um número de cópias que varia de aproxima-damente 5 a aproximadamente 200 e, tipicamente, de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Um hospedeiro contendo um plasmídeo com nú-mero alto de cópias terá, pelo menos, aproximadamente 10 e, mais prefe-rencialmente, pelo menos, aproximadamente 20.
[0078] Sequências úteis de promotor de levedura podem ser derivadas de genes que codificam enzimas presentes na via metabólica. Exemplos destes genes incluem álcool desidrogenase (ADH) (EP 0 284044), enolase, glicoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, gliceraldeído-3-fosfato-desidroge-nase (GAP ou GAPDH), hexoquinase, fosfofrutoquinase, 3-fosfoglicerato mutase e piruvato quinase (PyK) (EP 0 3215447). O gene PHO5 de levedu-ra,codificador da fosfatase ácida, fornece também sequências úteis de promotores (Myanohara et al., 1983). Ademais, promotores sintéticos que não ocorrem em natureza funcionam também como promotores de levedura. Exemplos destes promotores híbridos incluem a sequência reguladora da ADH, ligada à região de ativação da transcrição da GAP (Patentes U.S. N° 4 876 197 e 4 880 734). Exemplos de sequências terminadoras de transcrição e outras sequências de terminação, reconhecidas de leveduras, como aque-las que codificam enzimas glicolíticas, são conhecidas de versados na téc-nica.
[0079] Alternativamente, os constructos de expressão podem ser inte-grados no genoma da levedura com um vetor de integração. Vetores de in-tegração contêm tipicamente, pelo menos, uma sequência homóloga ao cromossomo de uma levedura que permita que o vetor seja integrado e, de preferência, contêm duas sequências homólogas, ladeando o constructo de expressão. Integrações parecem resultar de recombinações entre DNA ho-mólogo no vetor e no cromossomo da levedura (Orr-Weaver et al., 1983). Um vetor de integração pode ser direcionado a um loco específico, na levedura, pela seleção da sequência homóloga apropriada para inclusão no vetor. Vide Orr-Weaver et al., supra. Um ou mais constructos de expressão podem ser integrados, possivelmente afetando níveis da proteína recombinante produzida (Rine et al., 1983).
[0080] A presente invenção contempla também a transformação de uma sequência de nucleotídeos da presente invenção em uma planta de forma a serem atingidos níveis de uma ou mais moléculas de dsRNA que inibam a expressão da praga. Um vetor de transformação pode ser prepara-do de imediato empregando métodos disponíveis na técnica. O vetor de transformação compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos que é/são capazes de serem transcritas em uma molécula de RNA e que é/são substancialmente homólogas e/ou complementares de uma ou mais se-qüências de nucleotídeos, codificadas pelo genoma do inseto, de forma que na absorção do RNA, há regulação negativa de, pelo menos, uma das res-pectivas sequências de nucleotídeos do genoma do inseto.
[0081] O vetor de transformação pode ser denominado um constructo de dsDNA e pode ser definido também como uma molécula recombinante, um agente de controle de inseto, uma molécula genética ou um constructo genético quimérico. Um constructo genético quimérico da presente inven-ção pode compreender, por exemplo, sequências de nucleotídeos que codi-ficam um ou mais transcritos antissenso, um ou mais transcritos sentido, um ou mais de cada um dos supramencionados, em que todos ou parte de um transcrito, resultante do mesmo, são homólogos a toda ou parte de uma molécula de RNA, compreendendo uma sequência de RNA codificada por uma sequência de nucleotídeos, incluída no genoma do inseto.
[0082] Em uma concretização, o vetor de transformação da planta com-preende uma molécula de DNA, isolada e purificada, incluindo um promo-tor, ligado operacionalmente a uma ou mais sequências de nucleotídeos da presente invenção. A sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo constituído pela SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, conforme indicadas na listagem de sequências. A sequência de nucleotídeos inclui um segmento que codifica todo ou parte de um RNA, presente no transcrito do RNA de uma praga visada, e pode compreender repetições invertidas de todo ou par-te do RNA de uma praga visada. A molécula de DNA, compreendendo o vetor de expressão, pode conter ainda uma sequência de intron, posiciona-da no sentido ascendente da sequência codificadora, ou mesmo incluída na sequência codificadora, e pode conter também uma sequência líder não traduzida da extremidade cinco (5') (isto é, UTR ou 5'-UTR), posicionada en-tre o promotor e o ponto de início de tradução.
[0083] Um vetor de transformação de planta pode conter sequências de mais de um gene, permitindo, dessa forma, a produção de mais de um dsR-NA para inibição de dois ou mais genes em células de uma praga-alvo. Um versado na técnica apreciará prontamente que segmentos de DNA, cuja se-qüência corresponda àquela presente em genes diferentes, podem ser combinados em um único segmento composto de DNA para expressão em uma planta transgênica. Alternativamente, um plasmídeo da presente in-venção já contendo, pelo menos, um segmento de DNA, pode ser modifica-do pela inserção seriada de segmentos adicionais de DNA entre as se- qüências do realçada e promotor e do terminador. No antes de controle do inseto da presente invenção, criado para a inibição de múltiplos genes, os genes a serem inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de inseto, de forma a intensificar a efetividade do agente de controle do inseto. Em certas concretizações, os genes podem derivar de insetos diferentes para ampliar a faixa de insetos contra os quais o agente é efetivo. Quando múltiplos genes são direcionados para supressão ou combinação de expressão e supressão, um elemento policistrônico de DNA pode ser fabricado conforme ilus-trado e descrito em Fillati, Publicação do Pedido de Patente N° US 2004-0029283.
[0084] Promotores que funcionam em plantas de espécies diferentes são também bem-conhecidos na técnica. Promotores úteis para expressão de polipeptídeos em plantas incluem aqueles de indução, virais, sintéticos ou constitutivos, conforme descritos em Odell et al. (1985), e/ou promotores que são temporariamente regulados e espaço-temporariamente regulados. Promotores preferidos incluem os promotores aperfeiçoados CaMV35S e o promotor FMV35S. Para a finalidade da presente invenção, por exemplo, para melhor forma de controle de espécies que se alimentam de raízes, po-de ser preferível atingir os níveis mais altos de expressão daqueles genes no interior das raízes de plantas. Alguns promotores aperfeiçoados para raí-zes foram identificados e são conhecidos na técnica (Lu et al., 2000; Paten-tes U.S. N° 5 837 848 e 6 489 542).
[0085] Um vetor ou constructo de DNA recombinante da presente in-venção compreenderá, tipicamente, um marcador seletivo que confere um fenótipo seletivo a células de plantas. Marcadores seletivos podem ser utili-zados também para selecionar plantas ou células de plantas que conte-nham os ácidos nucléicos exógenos que codificam polipeptídeos ou proteí-nas da presente invenção. O marcador pode codificar resistência biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, bleomicina G418, higro-micina, etc.) ou resistência a herbicida (por exemplo, glifosato, etc.). Exem-plos de marcadores seletivos incluem, entre outros, neogene que codifica resistência à canamicina e que pode ser selecionado, empregando canami-cina, G418, etc., gene bar que codifica resistência a bialafos; gene mutante de EPSP sintase que codifica resistência a glifosato; gene de nitrilase que confere resistência bromoxinil; gene mutante de acetolactato sintase (ALS) que confere resistência a imidazolinona ou sulfoniluréia e gene DHFR re-sistente a metotrexato. Exemplos destes marcadores seletivos são ilustrados nas Patentes U.S. 5 550 318; 5 633 435; 5 780 708 e 6 118 047.
[0086] Um vetor ou constructo recombinante da presente invenção po-de incluir também um marcador capaz de ser examinado. Marcadores capaz de ser examinado podem ser utilizados para monitorar expressão. Exemplos de marcadores capaz de ser examinado incluem gene de *-glicuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromo-gênicos são conhecidos (Jefferson, 1987; Jefferson et al., 1987); genes de lócus R que codifica um produto que regula a produção de pigmentos da antocianina (cor vermelha), em tecidos vegetais (Dellaporta et al., 1988); ge-ne de *-lactamase (Sutcliffe et al., 1978), gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, cefalosporina cromogênica); gene de luciferase (Ow et al., 1986), gene xylE (Zukowsky et al., 1983) que codifica catecol desoxigenase que converte catecóis cromogênicos; gene de *-amilase (Ikatu et al., 1990); gene de tirosinase (Katz et al., 1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina para DOPA e dopaquinona, a qual por seu turno condensa e se transforma em melanina; α -galactosidase que cataliza um substrato cro-mogênico da α-galactose.
[0087] Vetores preferidos de transformação de plantas incluem aqueles derivados de plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, Pa-tentes U.S. N°s 4 536 475, 4 693 977, 4 886 937, 5 501 967 e EP 0 122 791). Plasmídeos de Agrobacterium rhizogenes (ou "Ri") são úteis também e co-nhecidos na técnica. Outros vetores preferidos de transformação de plantas incluem aqueles expostos, por exemplo, por Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) e EP 0 120 516.
[0088] Geralmente, é preferível introduzir um DNA recombinante funci-onal em um local não-específico no genoma de uma planta. Em casos es-peciais, pode ser útil inserir um constructo de DNA recombinante por inte-gração sítio-específico. Diversos sistemas de recombinação sítio-específico são conhecidos por operarem em implantes, incluindo cre-lox, conforme descrito na Patente U.S. 4 959 317, e FLP-FRT conforme descrito na Paten-te U.S. 5 527 695.
[0089] Métodos adequados de transformação de células hospedeiras que podem ser utilizados com a presente invenção, supostamente, incluem virtualmente qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula como, por liberação direta de DNA como transformação de protoplas-tos, mediada por PEG (Omirulleh et al., 1993), absorção de DNA mediada por dissecação/inibição (Potrykus et al., 1985), eletroporação (Patente U.S. N° 5 384 253), agitação com fibras de carboneto de silicone (Kaeppler et al., 1990; Patente U.S. N° 5 302 523 e Patente U.S. N° 5 464 765), transformação mediada por Agrobacterium (Patente U.S. N° 5 591 616 e Patente U.S. N° 5 563 055) e por aceleração de partículas revestidas com DNA (Patente U.S. N° 5 550 318; Patente U.S. N° 5 538 877 e Patente U.S. N° 5 538 880), etc. Por meio de aplicação de técnicas como estas, as células de virtualmen-te qualquer espécie podem ser estavelmente transformadas. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em organismos transgênicos.
[0090] Métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucléicos heterólogos, especialmente em plantas, são conhecidos e podem ser utilizados com os ácidos nucléicos providos neste pedido, para preparar plantas transgênicas que exibam susceptibilidade reduzida à ali-mentação por organismos da praga- alvo, como larvas alfinete de milho. Ve-tores de transformação de plantas podem ser preparados, por exemplo, pela inserção de ácidos nucléicos produtores do dsRNA, descrito no presente, nos vetores de transformação de plantas, e introdução destes nas plantas. Um sistema conhecido de vetor foi derivado pela modificação do sistema natural de transferência de genes do Agrobacterium tumefaciens. O sistema natural compreende plasmídeos grandes Ti (indutores de tumor), contendo um segmento grande conhecido como T-DNA, que é transferido para plan-tas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região vir, é respon-sável pela transferência do T-DNA. A região do T-DNA é limitada por termi-nais repetidos. Nos vetores binários modificados, os genes indutores de tu-mor foram deletados e as funções, da região vir, são utilizadas para transfe-rir DNA estrangeiro, limitado por sequências que ladeiam o T-DNA. A região T pode conter também um marcador seletivo para recuperação eficiente de plantas e células transgênicas, e um sítio múltiplo de clonagem para inser-ção de sequências para transferência, como de um ácido nucléico codificador de dsRNA.
[0091] Uma planta transgênica, formada empregando métodos de transformação com Agrobacterium, contém tipicamente uma única seqüên-cia simples de DNA recombinante, inserida em um cromossomo, e esta é referida como evento transgênico. Estas plantas transgênicas pode ser refe-ridas como sendo heterozigóticas em relação à sequência exógena inseri-da. Uma planta transgênica homozigótica, em relação a transgene, pode ser obtida separando uma planta transgênica segregada independente para produzir semente F1. Um quarto da semente F1 produzida será homozigóti-ca, em relação ao transgene. A germinação de semente F1 resulta em plan-tas que podem ser testadas quanto à heterozigozidade ou homozigozidade, empregando tipicamente um ensaio de SNP ou ensaio de amplificação tér-mica que permita a distinção entre heterozigóticas e homozigóticas (iosto é, um ensaio de zigozidade).
C. Expressão de ácido nucléico e supressão de gene-alvo
[0092] A presente invenção provê, como exemplo, um hospedeiro transformado ou organismo simbiótico da praga-alvo, células de plantas transformadas e plantas transformadas e suas progênies. As células de plantas transformadas e plantas transformadas podem ser construídas para expressarem um ou mais das sequências de dsRNA ou de siRNA, descritas neste pedido, a fim de fornecer efeito protetor contra pragas. Estas seqüên-cias podem ser utilizadas para supressão gênica em um organismo de pra-ga e redução, pelo mesmo, do dano causado pela praga em um hospedeiro ou organismo simbiótico transformado protegido. Conforme utilizado no pre-sente, o termo "supressão de gene" pretende referir-se a qualquer um dos métodos bem-conhecidos de redução dos níveis de transcrição do gene pa-ra mRNA e/ou tradução subseqüente do mRNA.
[0093] Supressão de gene pretende também significar a redução de expressão protéica de um gene ou de uma sequência codificadora, incluin-do supressão pós-transcricional do gene e supressão transcricional. A su-pressão transcricional do gene é mediada pela homologia entre todo ou par-te de um mRNA transcrito de um gene ou de uma sequência codificadora, direcionada para supressão, e o RNA de fita dupla correspondente, utilizado para supressão, referindo-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para ligação pelos ribosso-mos. O RNA transcrito pode estar em orientação sentido em relação ao efei-to, o que é denominado co- supressão, e na orientação antissenso em rela-ção ao efeito, o que é denominado supressão antissenso, ou em ambas as orientações, produzindo um dsRNA, em relação ao efeito, denominado RNA de interferência (RNAi).
[0094] A supressão transcricional é mediada pela presença na célula de um agente de supressão de gene do dsRNA, exibindo identidade de se-qüência substancial a uma sequência de promotor de DNA, ou o comple-mento da mesma, em relação ao feito, o que é referido como supressão trans promotor. A supressão do gene pode ser efetiva contra um gene nativo de planta, associado com um traço, por exemplo, fornecer plantas com ní-veis reduzidos de uma proteína, codificada pelo gene nativo, ou com níveis intensificados ou reduzidos de um metabólito afetado. A supressão de ge-nes pode ser efetiva também contra genes-alvo em pragas de plantas, os quais podem ingerir ou entrar em contato com material da planta que conte-nha agentes de supressão do gene, especificamente criados para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais sequências homólogas ou comple-mentares, nas células da praga. A supressão pós- transcricional de genes, por RNA em orientação sentido ou antissenso, para regular expressão ge-nética em células de plantas, é exposta nas Patentes U.S. N°s 5 107 065, 5 759 829, 5 283 184 e 5 231 020. O uso de dsRNA para suprimir genes em plantas é descrito em WO 99/53050, WO 99/49029, Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2003/0175965 e 2003/0061626, Pedido de Patente U.S. No.10/465 800 e Patentes U.S. N°s 6 506 559 e 6 326 193.
[0095] Um método benéfico de supressão pós-transcricional de genes, em plantas, emprega RNA transcrito em orientação sentido e antissenso, estabilizado, por exemplo, sob a forma de grampo e estrutura em laço. Um constructo preferido de DNA que suprima o gene depois de transcrição é aquela em que o primeiro segmento codifica um RNA em orientação antissenso, exibindo identidade substancial a um segmento de um gene visado para supressão, o qual é ligado a um segundo segmento, em orientação sentido, que codifica um RNA exibindo complementaridade substancial em relação ao primeiro segmento. Este constructo forma uma estrutura em laço, a partir das sequências de nucleotídeos que ligam os dois segmentos (vide WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814 e US 2003/0018993).
[0096] De acordo com uma concretização da presente invenção, é pro-vida uma sequência de nucleotídeos, cuja expressão in vitro resulta em transcrição de uma sequência estabilizada de RNA, substancialmente ho-móloga a uma molécula de RNA de um gene visado em um inseto que compreende uma sequência de RNA, codificada por uma sequência de nu-cleotídeos incluída no genoma do inseto. Dessa forma, depois que o inseto ingerir a sequência estabilizada de RNA, incorporada a uma dieta ou pulve-rizada sobre a superfície de uma planta, a regulação negativa da sequência de nucleotídeos, correspondente ao gene-alvo nas células de um inseto visado, é afetada.
[0097] A inibição de um gene-alvo, empregando a tecnologia de dsR-NA estabilizado da presente invenção é específica de sequências, em que sequências de nucleotídeos, correspondentes à região dúplex do RNA, são visadas para inibição genética. RNA que contenha sequências de nucleotí-deos, idênticas a uma parte do gene-alvo, é preferido para inibição. Foi constatado também que sequências de RNA com inserções, exclusões e mutações de ponto único, em relação à sequência-alvo, são efetivas quanto à inibição. Quando a presente invenção for executada, é preferível que o dsRNA inibidor e a parte do gene-alvo compartilhem, pelo menos, aproxi-madamente 80% de identidade de sequência, aproximadamente 90% de identidade de sequência, aproximadamente 95% de identidade de seqüên-cia, aproximadamente 99% de identidade de sequência ou mesmo aproxi-madamente 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região dúplex do RNA pode ser definida funcionalmente como uma sequência de nucleotídeos capaz de se hibridizar com uma parte do transcrito do gene-alvo. Uma sequência de extensão menor do que a completa, exibindo ho-mologia maior compensa uma sequência mais longa porém menos homólo-ga. A extensão das sequências idênticas de nucleotídeos pode conter, pelo menos, aproximadamente 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou, pelo menos, aproximadamente 1000 bases. Normalmente deve ser utilizada uma se-qüência contando com mais de 20-100, embora uma sequência contando com mais de aproximadamente 200-300 nucleotídeos seria preferível, e uma sequência contando com mais de aproximadamente 500-1000 nucleotídeos seria, especialmente preferida, dependendo do tamanho do gene-alvo. A invenção possui a vantagem de poder tolerar variações de sequências que poderiam ocorrer em decorrência de mutação genética, polimorfismo de ce-pas ou divergência evolutiva. A molécula de ácido nucléico introduzida não precisa ser de homologia absoluta, não precisa ser da extensão completa, em relação ao produto primário da transcrição, ou mRNA inteiramente pro-cessado do gene-alvo. Por conseguinte, aqueles vesados na técnica preci-sam perceber que, conforme descrita neste pedido, não é preciso 100% de identidade de sequência para a prática da presente invenção.
[0098] A inibição da expressão do gene-alvo pode ser quantificada pe-la medição do RNA endógeno visado ou a proteína produzida por tradução do RNA-alvo, e as consequências da inibição podem ser confirmadas por exame das propriedades visíveis da célula ou organismo. Técnicas para quantificação de RNA e de proteínas são bem-conhecidas de qualquer ver-sado na técnica. Há marcadores seletivos múltiplos disponíveis que confe-rem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higro-micina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espetinomicina, rifampicina, tetraciclina e similar.
[0099] Em certas concretizações, a expressão do gene é inibida em, pelo menos, 10%, preferencialmente em, pelo menos, 33%, mais preferen-cialmente em, pelo menos, 50% e ainda mais preferencialmente em, pelo menos, 80%. Em concretizações especialmente preferidas da invenção, a expressão do gene é inibida em, pelo menos, 80%, mais preferencialmente em, pelo menos, 90%, mais preferencialmente em, pelo menos, 95% ou em, pelo menos, 99%, no interior de células do inseto, de forma que ocorra uma inibição significativa. Inibição significativa pretende referir-se à inibição que resulte em fenótipo detectável (por exemplo, interrupção do crescimento lar-val, paralisia ou mortalidade, etc.) ou diminuição detectável em RNA e/ou proteína, correspondente ao gene-alvo que está sendo inibido. Embora em certas concretizações da invenção, a inibição ocorra em substancialmente todas as células do inseto, em outras concretizações preferidas, a inibição ocorre somente em um subconjunto de células que expressam o gene. Por exemplo, se o gene a ser inibido desempenha papel fundamental em célu-las no trato alimentar do inseto, a inibição do gene nestas células é sufici-ente para exercer um efeito deletério sobre o inseto.
[00100] As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. O dsRNA pode ser formado por uma fita simples autocomplementar do RNA ou por duas fitas complementares do RNA. RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição in vivo, ou RNA polimerase clonada pode ser utilizada para transcrição in vivo ou in vitro. A inibição po-de ser direcionada por transcrição específica em um órgão, tecido ou tipo de célula; estimulação de uma condição ambiental (por exemplo, infecção, es-tresse, temperatura, indutores químicos); e/ou transcrição construída em uma etapa de desenvolvimento ou idade. As fitas do RNA podem ser poliadeniladas ou não; as fita do RNA podem ser capazes ou não de ser traduzidas em um polipeptídeo por sistema de tradução de uma célula.
[00101] RNA, dsRNA, siRNA, ou miRNA da presente invenção podem ser produzidos química ou enzimaticamente por versados na técnica por reações manuais ou automáticas ou in vivo em outro organismo. O RNA pode ser produzido também por síntese orgânica parcial ou total; qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido por síntese enzimática in vitro ou orgânica. O RNA pode ser sintetizado por RNA polimerase celular ou RNA polimerase de bacteriófago (por exemplo, T3, T7, SP6). O uso e produção de um constructo de expressão são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, WO 97/32016; Patentes U.S. N°s 5 593 874, 5 698 425, 5 712 135, 5 789 214 e 5 804 693). Se sintetizado quimicamente ou por síntese enzimática in vitro, o RNA pode ser purificado antes de ser introduzido na célula. Por exemplo, o RNA pode ser purificado de uma mistura por extração com aglutinante ou reina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação destes. Alternativamente, o RNA pode ser utilizado sem ou pu-rificação mínima para evitar perdas decorrentes de processamento de amostras. O RNA pode ser secado para armazenamento ou dissolvido em solu-ção aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover anela-mento e/ou estabilização das fitas dúplex.
[00102] Para transcrição de um transgene in vivo ou construção de ex-pressão, uma região reguladora (por exemplo, promotor, intensificador, silenciador e poliadenilação) pode ser utilizada para transcrever a fita (ou fitas) do RNA. Por conseguinte, em uma concretização, as sequências de nucleotídeos, utilizadas na produção de moléculas de RNA, podem estar operacionalmente ligadas a uma ou mais sequências funcionais do promo-tor em um microorganismo, fungo ou célula hospedeira de planta. Idealmen-te, as sequências de nucleotídeos são postas sob controle de um promotor endógeno que reside normalmente no genoma do hospedeiro. A sequência de nucleotídeos da presente invenção, sob controle da sequência operaci-onalmente ligada do promotor, pode ser ainda flanqueada por sequências adicionais que afetam favoravelmente a sua transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Estas sequências são geralmente localizadas em direção ascendente do promotor ligado operacionalmente e/ou direção descendente da extremidade 3' do constructo de expressão, e podem ocor-rer tanto em direção ascendente do promotor e descendente da extremidade 3' do constructo de expressão, embora somente esta sequência ascendente seja também complementada.
[00103] Conforme utilizado no presente, o termo "agente de controle de inseto" ou "agente de supressão de gene" se refere a uma molécula especí-fica de RNA, compreendendo um primeiro segmento de RNA e um segundo segmento de RNA, em que a complementaridade entre o primeiro e segun-do segmentos de RNA resulta na capacidade dos dois segmentos de se hi-bridizarem in vivo e in vitro para formar uma molécula de fita dupla. Pode ser preferível, de modo geral, incluir um terceiro segmento de RNA que se liga e estabiliza a primeira e a segunda sequência de forma que toda a estrutura se torne do tipo em laço, ou até estruturas que se hibridizam mais fortemente que podem formar estrutura do tipo semicircular fechada. Alternativamente, uma estrutura simétrica em grampo poderia ser formada sem um terceiro segmento, em que não é criada alça, porém por motivos estéricos, um grampo criaria a sua própria alça quando a haste fosse longa suficiente para estabilizar-se. O primeiro e segundo segmento do RNA terão geralmente o comprimento da molécula do RNA e conterão repetições subs-tancialmente invertidas de cada um e serão reunidos pelo terceiro segmento de RNA. O primeiro e segundo segmento são invariavelmente correspon-dentes e não, respectivamente, a uma sequência senso e antissenso em relação ao RNA-alvo, transcrito do gene-alvo, no inseto-praga-alvo, que foi suprimido pela ingestão da molécula do dsRNA. O agente de controle do inseto pode ser também uma molécula purificada (ou isolada) de ácido nu-cléico e, mais especificamente, moléculas de ácido nucléico ou fragmento de ácido nucléico da mesma, proveniente de DNA genômico (gDNA) ou bi-blioteca de cDNA. Alternativamente, os fragmentos podem compreender oligonucleotídeos menores com aproximadamente 15 a aproximadamente 250 resíduos de nucleotídeos e, mais preferencialmente, com aproximada-mente 15 a aproximadamente 30 resíduos de nucleotídeos.
[00104] Conforme utilizado no presente, o termo "genoma", conforme se aplica a células de inseto ou de hospedeiro, abrange não só DNA cromos-sômico, encontrado no interior do núcleo, mas também DNA de organelas, encontrados no interior de componentes subcelulares da célula. Os DNA da presente invenção, introduzidos em células de plantas, podem, por conse-guinte, estar integrados em cromossomos ou localizados em organelas. O termo "genoma", conforme se aplica a bactérias, engloba o cromossomo e plasmídeos dentro de uma célula hospedeira bacteriana. Os DNA da pre-sente invenção, introduzidos em células hospedeiras bacterianas podem, por conseguinte, estar integrados em cromossomo ou localizados em plas- mídeos.
[00105] Conforme utilizado no presente, o termo "praga" se refere a in-setos, aracnídeos, crustáceos, fungos, bactérias, vírus, nematódeos, platel-mintos, asquelmintos, oxiúros, áscaris, tênias, tripanossomos, esquisitos-somas, moscas dermatobias, carrapatos, ácaros e piolhos e similares é dis-seminada no ambiente humano e que pode ingerir ou entrar em contato com uma ou mais células, tecidos ou líquidos produzidos por hospedeiro ou simbionte da praga, transformado para expressar ou ser revestido por agen-te de supressão de gene de fita dupla ou que pode ingerir material da planta, contendo o agente de supressão do gene. Conforme utilizado no presente, um traço de "resistência a praga" é uma característica de planta transgênica, animal transgênico, hospedeiro transgênico ou simbionte transgênico que faz com que a planta, animal, hospedeiro ou simbionte seja resistente ao ataque de uma praga, que tipicamente é capaz de infligir dano ou perda à planta, animal, hospedeiro ou simbionte. Esta resistente a praga pode ser decorrente de mutação natural ou, mais tipicamente, de incorpora-ção de DNA recombinante que confere resistência a praga. Para transmitir resistência a inseto para uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de RNA, dentro dos teci-dos ou líquidos da planta recombinante. A molécula de dsRNA é incluída em parte de um segmento de RNA, idêntico a um segmento correspondente de RNA codificado a partir de uma sequência de DNA dentro de um inseto-praga que prefere se alimentar da planta recombinante. A expressão do ge-ne no inseto-praga visado é suprimida pelo dsRNA, sendo que esta supres-são de expressão do gene no inseto-praga visado, faz com que a planta tor-ne-se resistente ao inseto. Fire et al. (Patente U.S. N° 6 506 599) descreve geralmente inibição de infestação por praga, fornecendo informação especí-fica somente sobre várias sequências de nucleotídeos que são efetivas para inibição de função genética na espécie de nematódeo Caenorhabditis ele-gans. Igualmente, Plaetinck et al. (US 2003/0061626) descreve o uso de dsRNA para inibir função genética em uma variedade de pragas da espécie nematódeo. Mesa et al. (US 2003/0150017) descreve o uso de sequências de dsDNA para transformar células hospedeiras para que expressem se-qüências de dsRNA correspondentes, substancialmente idênticas a se-qüências- alvo em patógenos específicos, descrevendo especialmente o constructo de plantas recombinantes que expressam sequências de dsRNA para ingestão por várias pragas de plantas, facilitando a regulação negativa de um gene, no genoma da praga, e melhorando a resistência da planta contra infestação pela praga.
[00106] A presente invenção provê inibição de expressão gênica de um ou mais genes múltiplos visados em uma praga-alvo, empregando métodos de dsRNA estabilizados. A invenção é especialmente útil na modulação de genes eucarióticos, em particular, a modulação de expressão de genes pre-sentes em pragas que exibem nível de pH em sistema digestivo que varia de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9,5, mais preferencialmente, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0 e, ainda mais preferencial-mente, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. Em relação a pra-gas de plantas com sistema digestivo que exibe níveis de pH não incluídos em esses intervalos, pode ser desejável que o uso não requeira ingestão de moléculas de dsRNA.
[00107] O efeito modulador do dsRNA pode ser aplicado a uma varieda-de de genes expressos nas pragas, incluindo, por exemplo, genes endóge-nos, responsáveis por metabolismo ou transformação celular, incluindo ge-nes de manutenção do metabolismo, fatores de transcrição e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular.
[00108] Conforme utilizada no presente, a frase "inibição de expressão gênica" ou "inibição de expressão de um gene-alvo na célula de um inseto" se refere à ausência (ou diminuição observável) no nível de proteína e/ou mRNA, cuja produção é resultante do gene- alvo. Especificidade se refere à capacidade de inibir o gene-alvo sem efeitos evidentes sobre outros genes da célula e sem quaisquer efeitos sobre qualquer gene dentro da célula que está produzindo a molécula do dsRNA. A inibição de expressão gênica do gene-alvo, no inseto- praga, pode resultar em novos traços fenotípicos no inseto-praga.
[00109] A presente invenção provê, em parte, um sistema para liberação dos agentes de controle de insetos pela exposição dos insetos a uma dieta contendo estes agentes de controle da presente invenção. De acordo com uma das concretizações, as moléculas estabilizadas de dsRNA ou de siR-NA podem ser incorporadas à dieta do inseto ou podem ser sobrepostas so-bre o topo da dieta para consumo por insetos. A presente invenção provê também, em parte, um sistema para liberação dos agentes de controle de insetos pela exposição dos insetos a um microorganismo ou hospedeiro, como uma planta contendo os agentes de controle de insetos da presente invenção, por ingestão do microorganismo ou células do hospedeiro ou o conteúdo das células. De acordo com outra concretização, a presente in-venção envolve a geração de uma célula transgênica de plantas ou de uma planta que contenha um constructo de DNA recombinante que transcreva as moléculas estabilizadas do dsRNA da presente invenção. Conforme uti-lizada no presente, a frase "geração de célula transgênica de planta ou de planta" se refere aos métodos que empregam tecnologias de DNA recombi-nante, prontamente disponíveis na técnica (por exemplo, por Sambrook et al., 1989) para construção de vetores de transformação de plantas que transcrevam as moléculas estabilizadas do dsRNA da presente invenção, visando transformar a célula da planta ou a planta e gerar a célula transgê-nica da planta ou a planta transgênica que contenha as moléculas estabilizadas do dsRNA.
[00110] Em ainda outra concretização, cepas não-patogênicas e atenu-adas de microorganismos podem ser utilizadas como veículo para os agen-tes de controle de insetos e, nessa ótica, os microorganismos que condu-zem estes agentes são referidos também como agentes de controle de inse-tos. Os microorganismos podem ser construídos para expressar uma se-qüência de nucleotídeos de um gene-alvo para que produza moléculas de RNA, compreendendo sequências de RNA, homólogas ou complementares das sequências de RNA tipicamente encontradas no interior das células de um inseto. A exposição dos insetos aos microorganismos pode resultar em ingestão dos microorganismos e regulação negativa de expressão de ge-nes-alvo, mediada, direta ou indiretamente, pelas moléculas do RNA ou fra-gmento ou derivados deste.
[00111] A presente invenção provê, alternativamente, exposição de um inseto aos agentes de controle de insetos da presente invenção, incorpora-dos em uma mistura pulverizada e aplicada à superfície de um hospedeiro, como um hospedeiro vegetal. Em uma concretização exemplar, a ingestão dos agentes de controle de insetos, por um inseto, libera estes agentes de controle em seu intestino e, subseqüentemente nas células no corpo do inseto. Em outra concretização, a infecção do inseto, pelos agentes de con-trole de insetos, por outros meios como por injeção ou outros métodos físi-cos, permite também a liberação dos agentes de controle de insetos. Em ainda outra concretização, as próprias moléculas do RNA estão encapsula-das em matriz sintética, como um polímero, e são aplicadas à superfície de um hospedeiro, como uma planta. A ingestão das células hospedeiras, por um inseto, permite a liberação dos agentes de controle ao inseto e resulta em regulação negativa de um gene-alvo no hospedeiro.
[00112] Prevê-se que as composições da presente invenção possam ser incorporadas nas sementes de espécie vegetal, quer como produto de ex-pressão de um gene recombinante, incorporado ao genoma das células de uma planta, quer incorporado em revestimento ou tratamento de semente, aplicado à semente antes de plantio. A célula da planta contendo um gene recombinante é considerada, neste pedido, um evento transgênico.
[00113] Acredita-se que um tratamento pesticida em semente possa pro-ver vantagens significativas quando combinado a evento transgênico que confira proteção contra infestação por coleóptero- praga, incluída no interva-lo preferido de efetividade contra uma praga- alvo. Ademais, acredita-se que há situações, bem-conhecidas daqueles versados na técnica, em que é vantajoso haver estes eventos transgênicos no intervalo preferido de efeti-vidade.
[00114] A presente invenção provê, em parte, um sistema para liberação de agentes de controle de insetos para insetos. As moléculas estabilizadas do dsRNA ou siRNA da presente invenção podem ser introduzidas direta-mente nas células de um inseto, ou introduzidas em cavidade extracelular, espaço intersticial, sistema de linfa, sistema digestivo, na circulação do inse-to através de ingestão oral ou por outros meios que técnicos no assunto po-derão empregar. Métodos de introdução oral podem incluir mistura direta do RNA com alimento do inseto, bem como abordagens de construção nas quais uma espécie, utilizada como comida, é construída para expressar o dsRNA ou siRNA, em seguida alimentada ao inseto a ser afetado. Em uma concretização, por exemplo, as moléculas do dsRNA ou siRNA podem ser incorporadas ou sobrepostas na dieta do inseto. Em outra concretização, o RNA pode ser pulverizado na superfície de uma planta. Em ainda outra concretização, o dsRNA ou siRNA pode ser expresso por microorganismos e estes podem ser aplicados sobre a superfície de uma planta ou introduzi-dos em raiz ou caule, por um meio físico como injeção. Em uma outra con-cretização ainda, uma planta pode ser geneticamente construída para ex-pressar o dsRNA ou siRNA , em quantidade suficiente que mate os insetos que sabidamente infectam a planta.
[00115] Especificamente, na prática da presente invenção em WCR, o dsRNA ou siRNA estabilizado pode ser introduzido no intestino médio, den-tro do inseto, e atingir a inibição desejada dos genes visados. As moléculas do dsRNA ou siRNA podem ser incorporadas a uma dieta ou ser sobrepos-tas sobre a dieta, conforme discutido acima, e podem ser ingeridas pelos insetos. Em qualquer caso, as moléculas do dsRNA da presente invenção são fornecidas na dieta da praga-alvo. A praga-alvo da presente invenção exibirá pH no trato digestivo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9,5, de aproximadamente 5 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,7 ou aproximadamente 7,0. O trato digestivo de uma praga-alvo é definido neste pedido como o local, no interior da praga, em que o alimento ingerido por este é descrito a um ambiente que favoreça a absorção das moléculas do dsRNA da presente invenção, sem serem submetidas a pH tão extremo que ocasione a dissociação das pontes de hidrogênio entre as fitas duplas do dsRNA, levando à formação de moléculas de fita simples.
[00116] Prevê-se também que as moléculas do dsRNA, produzidas por síntese química ou enzimática, possam ser formuladas de maneira compatí-vel com práticas comuns utilizadas em agricultura e ser utilizadas sob a for-ma de produtos pulverizados para controle de infestação por insetos. As fórmulas podem incluir os adesivos e umidificantes apropriados, requeridos para cobertura eficiente de folhas, bem como protetores que protejam o dsRNA contra dano causado por UV. Estes aditivos são comumente empre-gados na indústria de bioinseticidas e bem-conhecidos de versados na téc-nica. Essas aplicações poderiam ser combinadas a outras aplicações de inseticida pulverizada, com base biológica ou não, para intensificar a prote-ção da planta contra dano causado por alimentação de insetos.
[00117] Os presentes inventores contemplam que cepas bacterianas que produzem proteínas inseticidas podem ser utilizadas para produzir dsRNAs, visando controle de insetos. Estas cepas podem exibir proprieda-des melhoras de controle de insetos. Uma variedade de hospedeiros bacte-rianos diferentes pode ser utilizada para produzir dsRNAs de controle de insetos. Exemplos de bactérias podem incluir E. coli, B. thuringiensis, Pseu-domonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Serratia entomophila e Serratia sp. correlatas, B. sphaericus, B. cereus, B. laterosporus, B. popilliae, Clostridium bifermentans e outras espécies de Clostridium, ou outras bacté-rias gram-positivas, formadoras de esporo. Em certas concretizações, as bactérias podem ser construídas para controle de pragas como mosquitos.
[00118] A presente invenção se refere também aos constructos de DNA recombinante de expressão em microorganismos. Ácidos nucléicos exóge-nos, dos quais um RNA de interesse é transcrito, podem ser introduzidos em uma célula hospedeira microbiana, como célula bacteriana ou de fungo, empregando métodos conhecidos na técnica.
[00119] As sequências de nucleotídeos da presente invenção podem ser introduzidas em uma ampla variedade de microorganismos hospedeiros procarióticos e eucarióticos para produção de moléculas estabilizadas de dsRNA ou siRNA. O termo "microorganismo" inclui espécies microbianas procarióticas e eucarióticas como bactérias, fungos e algas. Fungos incluem leveduras e fungos filamentosos, entre outros. Exemplos de procarióticos, gram-negativo e gram-positivo, incluem Enterobacteriaceae, como Escheri-chia, Erwinia, Shigella, Salmonella e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, co-mo Rhizobium; Spirillaceae, como fotobactérias, Zymomonas, Serratia, Ae-romonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonada- ceae, como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraceae, Actinomyceta-les e Nitrobacteraceae. Entre eucariotes estão fungos, como Phycomycetes e Ascomycetes, os quais incluem levedura, como Saccharomyces e Schizo-saccharomyces; e Basidiomycetes, como Rhodotorula, Aureobasidium, Spo-robolomyces e similares.
[00120] Para finalidade de proteção de planta contra insetos, um grande número de microorganismos que, sabidamente, habitam o filoplano (a su-perfície das folhas de plantas) e/ou a rizoesfera (o solo que circunda raízes de plantas) de uma ampla variedade de cultivares importantes, pode ser também células desejáveis de hospedeiro para manipulação, propagação, armazenamento, liberação e/ou mutagênese dos constructos recombinan-tes descritos. Estes microorganismos incluem bactérias, algas e fungos. De particular interesse são microorganismos, como bactérias, por exemplo, do Bacillus (incluindo as espécies e subespécies B. thuringiensis kurstaki HD-1, B. thuringiensis kurstaki HD-73, B. thuringiensis sotto, B. thuringiensis ber-liner, B. thuringiensis thuringiensis, B. thuringiensis tolworthi, B. thuringiensis dendrolimus, B. thuringiensis alesti, B. thuringiensis galleriae, B. thuringien-sis aizawai, B. thuringiensis subtoxicus, B. thuringiensis entomocidus, B. thu-ringiensis tenebrionis e B. thuringiensis san diego); Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Zanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseu- domonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Ar-throbacter, Azotobacter, Leuconostoc e Alcaligenes; fungos, especialmente leveduras, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyve-romyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasidium. De particular inte-resse são as espécies de bactérias da fitosfera, como Pseudomonas syrin-gae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Xanthomonas cam-pestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes eutrophus e Azotobacter vinlandii; e espécies de levedura da fitosfera, como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Sac-charomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae e Aureobasidium pollulans.
D. Plantas transgênicas
[00121] A presente invenção provê sementes e plantas com um ou mais eventos transgênicos. Combinações de eventos são referidas como eventos transgênicos "sobrepostos". Estes eventos transgênicos sobrepostos podem ser direcionados à mesma praga-alvo ou podem ser direcionados a pragas-alvo diferentes. Em uma concretização, uma semente, contando com capa-cidade para expressar um ácido nucléico, conforme provido neste pedido, possui também a capacidade de expressar pelo menos um outro agente in-seticida, incluindo, entre outros, uma molécula de RNA, cuja sequência é derivada da sequência de um RNA expresso em uma praga-alvo e que for-ma estrutura de RNA de dupla fita ao ser expresso na semente ou células de uma planta derivada da semente, em que a ingestão de uma ou mais células da planta, pela praga-alvo, resulta na supressão de expressão do RNA nas células da praga-alvo.
[00122] Em certas concretizações, uma semente, contando com capaci-dade para expressar um dsRNA, cuja sequência é derivada de uma praga-alvo, possui também um evento transgênico que confere tolerância a herbi-cida. Um exemplo benéfico de gene de tolerância a herbicida é aquele que confere tolerância a glifosato, N- (fosfonometil) glicina, incluindo a forma de sal de isopropilamina deste herbicida.
[00123] No presente método, a combinação de expressão de uma quan-tidade inseticida de um dsRNA, no interior das células de uma semente transgênica ou de planta cultivada a partir da semente, acoplada com trata-mento da semente ou planta com certos produtos químicos ou proteínas pesticidas, pode ser utilizada para conferir vantagens sinergísticas inespe-radas, incluindo eficácia inesperadamente superior de proteção contra dano causado à planta transgênica resultante pela praga-alvo. Em concretizações especiais, o tratamento de uma semente transgênica, capaz de expressar certos constructos que formam moléculas de dsRNA, cuja sequência é derivada de uma ou mais sequências expressas em larva alfinete de milho, com aproximadamente 100 g a aproximadamente 400 g de pesticida por 100 kg de semente, confere proteção inesperadamente superior contra larva alfine-te de milho. Ademais, acredita-se que estas combinações são efetivas tam-bém para proteger as plantas emergentes contra dano causado por outras pragas. As sementes da presente invenção podem ser utilizadas também para diminuir o custo do uso de pesticidas, visto ser utilizado menos pestici-da para obter a quantidade requerida de proteção do que quando estes mé-todos não são empregados. Além disso, uma vez que menos pesticida é utilizada e aplicada antes de plantio e sem aplicação em campo separado, acredita-se que o método em questão é, por conseguinte, mais seguro para o operador e para o meio ambiente e, potencialmente, menos dispendioso do que métodos convencionais.
[00124] Por "sinergístico" pretende-se incluir os efeitos sinergísticos da combinação sobre a atividade pesticida (ou eficácia) da combinação do evento transgênico com o pesticida. No entanto, não se pretende que estes efeitos sinergísticos fiquem limitados à atividade pesticida, porém devem incluir também vantagens inesperadas como alcance aumentado da ativi-dade, perfil vantajoso de atividade, conforme relatado para tipo e quantidade de redução de danos, custo diminuído de pesticida e aplicação, distribuição diminuída no meio ambiente, exposição diminuída do pessoal que produz, manipula e planta sementes de milho e outras vantagens conhecidas de versados na técnica.
[00125] Pesticidas e inseticidas úteis em composições em combinação aos métodos e composições da presente invenção, incluindo tratamentos e revestimentos de sementes, bem como métodos de uso destas composi-ções, podem ser encontrados, por exemplo, na Patente U.S. 6 551 962, cujo conteúdo é aqui incorporado neste pedido por referência.
[00126] Embora se acredite que tratamentos de sementes possam ser aplicados a semente transgênica em qualquer estado fisiológico, pode ser preferível que a semente encontre-se em estado suficientemente durável que não incorra em danos durante o processo de tratamento. Tipicamente, a semente seria aquela colhida do campo, removida da planta transgênica e separada de qualquer outro material da planta que não fosse semente. A semente seria também, de preferência, biologicamente estável de forma que o tratamento não causasse dano biológico à mesma. Em uma concretiza-ção, por exemplo, o tratamento pode ser aplicado à semente de milho, colhi-da, limpa e desidratada até aproximadamente abaixo de 15% por peso de teor de umidade. Em uma concretização alternativa, esta pode ser uma se-mente que tenha sido desidratada e preparada com água e/ou outro material e, em seguida, reidratada antes ou durante o tratamento com o pesticida. Dentro das limitações descritas, acredita-se que o tratamento possa ser apli-cado à semente em qualquer ocasião entre a colheita e semeadura da se-mente. Conforme utilizado no presente, o termo "semente não semeada" pretende incluir semente em qualquer período entre a colheita e a semea-dura da semente no solo, visando germinação e crescimento da planta. Quando se diz que a semente não semeada é "tratada" com o pesticida, es-te tratamento não pretende incluir aquelas práticas nas quais o pesticida é aplicado ao solo, em vez de à semente. Por exemplo, estes tratamentos co-mo a aplicação do pesticida em faixas, faixas "em T" ou em sulco, ao mesmo tempo em que a semente é semeada, não são considerados incluídos na presente invenção.
[00127] O pesticida, ou combinação de pesticidas, pode ser aplicado "puro", ou seja, sem diluição ou componentes adicionais. No entanto, o pes-ticida é aplicado tipicamente às sementes na forma de pesticida formulado. Esta fórmula pode conter um ou mais componentes desejáveis, incluindo, entre outros, diluentes líquidos, aglutinantes para servir como matriz para o pesticida, espessantes para proteger as sementes durante condições de estresse e plastificantes para melhorar a flexibilidade, adesão e/ou capaci-dade de distribuir o revestimento.
[00128] Os pesticidas em questão podem ser aplicados a uma semente como componente de revestimento de uma semente. Os métodos e compo-sições para revestimento de sementes, conhecidos na técnica, são úteis quando são modificados pelo acréscimo de uma das combinações de pesti-cidas, concretizadas da presente invenção. Estes métodos de revestimento e equipamento para sua aplicação são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5 918 413, 5 891 246, 5 554 445, 5 389 399, 5 107 787, 5 080 925, 4 759 945 e 4 465 017. Composições de revestimento de sementes são descri-tas, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5 939 356, 5 882 713, 5 876 739, 5 849 320, 5 834 447, 5 791 084, 5 661 103, 5 622 003, 5 580 544, 5 328 942, 5 300 127, 4 735 015, 4 634 587, 4 383 391, 4 372 080, 4 339 456, 4 272 417 e 4 245 432, entre outras.
[00129] Os pesticidas úteis no revestimento são aqueles aqui descritos. A quantidade de pesticida, utilizada para tratamento da semente, variará dependendo do tipo de semente e do tipo de ingredientes ativos, porém o tratamento compreenderá o contato das sementes com uma quantidade da combinação de pesticidas com efeito pesticida. Quando a praga-alvo for in-setos, esta será uma quantidade do inseticida com efeito inseticida. Con-forme utilizada no presente, quantidade com efeito inseticida significa que aquela quantidade de inseticida eliminará insetos-praga em estado larval ou pupal de crescimento, ou reduzirá ou retardará consistentemente a quanti-dade de dano produzido por insetos-praga.
[00130] De modo geral, a quantidade de pesticida aplicada à semente no tratamento variará de aproximadamente 10 g a aproximadamente 2000 g do ingrediente ativo do pesticida por 100 kg do peso da semente. De prefe-rência, a quantidade de pesticida variará de aproximadamente 50 g a apro-ximadamente 1000 g de ingrediente ativo por 100 kg de semente, mais pre-ferencialmente, variará de aproximadamente 100 g a aproximadamente 600 g de ingrediente ativo por 100 kg de semente, e ainda mais preferencialmente, variará de aproximadamente 200 g a aproximadamente 500 g de in-grediente ativo por 100 kg de peso da semente. Alternativamente, foi consta-tado ser preferível que a quantidade do pesticida seja acima de aproxima-damente 60 g do ingrediente ativo do pesticida por 100 kg da semente e, mais preferivelmente, acima de aproximadamente 80 g por 100 kg de se-mente.
[00131] Os pesticidas utilizados no tratamento não precisam inibir a germinação da semente e devem ser eficazes em proteger a semente e/ou a planta no período de tempo, no ciclo de vida do inseto visado, no qual este causa lesão à semente ou a planta. De modo geral, o revestimento perma-necerá eficaz por aproximadamente 0 a 120 dias após a semeadura. Os pes-ticidas, objeto da invenção, podem ser aplicados à semente sob a forma de revestimento.
[00132] Benefícios providos pela presente invenção podem incluir, entre outros: a facilidade de introdução do dsRNA nas células de insetos, a baixa concentração do dsRNA que pode ser utilizada, a estabilidade do dsRNA e a efetividade da inibição. A possibilidade de usar baixa concentração de dsRNA estabilizado evita várias desvantagens de interferência de antissenso. A presente invenção não está limitada a uso in vitro ou para com-posições de sequências específicas, para um conjunto particular de genes-alvo, uma parte particular da sequência de nucleotídeos do gene-alvo ou transgene em particular, ou para um método de liberação especial, ao con-trário de algumas disponíveis conhecidas na técnica, como supressão antissenso ou co-supressão. Ademais, a manipulação genética é possibilitada em organismos que não modelos genéticos clássicos.
[00133] Na prática da presente invenção, podem ser conduzidas sele-ções para assegurar que a presença das sequências de nucleotídeos, transcritas a partir do constructo recombinante, não são seja nociva a célu-las que não pertencem a pragas. Isso pode ser obtido, visando-se genes que exibem um grau pequeno de identidade de sequência com genes cor-respondentes em uma planta ou animal vertebrado. De preferência, o grau da identidade de sequência é inferior a aproximadamente 80%. Mais prefe-rencialmente, o grau da identidade de sequência é inferior a aproximada-mente 70%. O mais preferível é que o grau da identidade de sequência seja inferior a aproximadamente 60%.
[00134] Além de transformação direta de uma planta com um constructo de DNA recombinante, plantas transgênicas podem ser preparadas pelo cruzamento de uma primeira planta, contendo um constructo de DNA re-combinante, com uma segunda planta desprovida do constructo. Por exem-plo, DNA recombinante para supressão gênica pode ser introduzido em uma primeira linhagem de planta, receptiva à transformação para produzir uma planta transgênica que possa ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para integração do DNA recombinante de supressão de gene na segunda linhagem de planta.
[00135] A presente invenção pode ser, em prática, combinada a outros traços de controle de insetos, em uma planta, para serem obtidos traços de-sejados de intensificação de controle de infestação por inseto. A combina-ção de traços de controle de insetos, empregando modos de ação distintos, pode conferir a plantas transgênicas protegidas contra insetos durabilidade superior sobre plantas que abrigam um único traço de controle de insetos, em decorrência de ser menor a probabilidade de que a resistência se desenvolva no campo.
[00136] O mecanismo de atividade inseticida de cristais protéicos do B. thuringiensis foi intensamente estudado na década passada. Foi demons-trado que os cristais protéicos são tóxicos para a forma larval do inseto, so-mente após ingestão da proteína. Na larva de lepidópteros, a presença de pH alcalino e enzimas proteolíticas no intestino médio do inseto solubiliza as proteínas, permitindo, pelo mesmo, a liberação de componentes que são tóxicos para o inseto. Estes componentes tóxicos desorganizam as células do intestino médio, fazem com que o inseto pare de se alimentar e, eventualmente, levam a sua morte. Por esse motivo, toxinas do B. thuringiensis comprovaram ser inseticidas efetivas e seguras para o meio ambiente, quando usadas para controlar vários insetos-praga. Insetos coleópteros e hemípteros, e possivelmente dípteros, do gênero lygus e outros insetos que picam e sugam exibem pH do intestino ligeiramente ácido e, dessa forma, as toxinas do Bt que são efetivas contra larvas lepidópteros não são efetivas contra estas pragas. Acredita-se também que o pH ligeiramente ácido do intestino destas pragas seja menos agressivo às composições da presente invenção, e sem pretender estar limitado a qualquer teoria em particular, é possível que o pH alcalino do intestino de larvas lepidópteras seja um moti-vo que contribua para que tentativas anteriores em exibir a eficácia do dsR-NA tenham falhado (Fire et al. Patente U.S. N° 6 506 559; Mesa et al. Publi-cação de Patente N° US2003/0150017; Rajagopal et al., 2002; Tabara et al., 1998). Acredita-se, por conseguinte, que os métodos do dsRNA, descritos neste pedido, devem ser preferencialmente utilizados em composições e em plantas para controle de insetos coleópteros, dípteros, hemípteros, do gêne-ro lygus e insetos que picam e sugam. Os métodos e composições descritos neste pedido são especialmente úteis quando se destinam a genes para supressão em insetos que exibem pH de intestino de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9,5, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,6 ou aproximadamente 7,0. No entanto, também se pretende que insetos e outras espécies de pragas que exibem pH de intestino de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 11,5, de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 11,0 ou de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 10,0, como larvas de insetos lepidópteros, sejam incluídos no escopo da presente invenção. Isso é particularmente verdadei-ro quando um dsRNA, específico para inibição de um gene em larvas lepi-dópteras é fornecido na dieta das larvas, juntamente com uma ou mais pro-teínas do Bt, as quais seriam comumente tóxicas para aquelas larvas lepi- dópteras quando providas em nível no limiar ou acima. A presença de uma ou mais toxinas do Bt, tóxicas para a mesma espécie de inseto, reduziria efetivamente o pH do intestino, propiciando um ambiente estável para as moléculas de RNA de fita dupla exercerem seus efeitos de supressão de um gene-alvo no inseto-praga.
[00137] Prevê-se que a combinação de certos constructos de dsRNA estabilizado, com um ou mais genes de proteínas de controle de insetos, resultará em sinergias que intensificarão o fenótipo de controle de insetos de uma planta transgênica. Bioensaios de insetos, empregando dieta artifi-cial ou inteiramente de tecidos de plantas, podem ser utilizados para definir dose-respostas, para mortalidade larval ou inibição de crescimento, usando tanto o dsRNA como proteínas de controle de insetos. Versados na técnica podem testar misturas de moléculas de dsRNA e proteínas de controle de inseto em bioensaio para identificar combinações de ingredientes ativos sinergísticos e desejáveis para emprego em plantas protegidas contra inse-tos (Tabashnik, 1992). A sinergia em eliminação de insetos-praga foi relata-da entre diferentes proteínas de controle de insetos (para revisão, vide Schnepf et al., 1998). Prevê-se que ocorrerá sinergia entre certos dsRNAs e entre certos dsRNAs e certas proteínas de controle de insetos.
[00138] A invenção se refere também a produtos comerciáveis, conten-do uma ou mais sequências da presente invenção, e produzidos a partir de uma planta ou semente recombinante, contendo uma ou mais das seqüên-cias de nucleotídeos da presente invenção, que são especificamente con-templados como concretizações da presente invenção. Produto comerciável contendo uma ou mais das sequências da presente invenção pretende in-cluir, entre outros, comidas, óleos, grãos moídos ou inteiros ou sementes de uma planta, ou qualquer produto alimentício compreendendo qualquer co-mida, óleo ou grão moído ou inteiro de uma planta ou semente recombinan- te, contendo uma ou mais sequências da presente invenção. A detecção de uma ou mais sequências da presente invenção, em um produto ou subpro-duto comerciável, contemplados neste pedido, é evidência de fato de que o produto ou subproduto comerciável é composto por uma planta transgênica, criada para expressar uma ou mais sequência de nucleotídeos da presente invenção, visando o controle de infestação por inseto, empregando métodos de supressão gênica mediada por dsRNA.
D. Obtenção de ácidos nucléicos
[00139] A presente invenção provê um método de obtenção de ácido nucléico, compreendendo uma sequência de nucleotídeos para produção de dsRNA ou siRNA. Em uma concretização, este método compreende: (a) sondagem de biblioteca de cDNA ou gDNA com sonda de hibridização, compreendendo toda ou parte de uma sequência de nucleotídeos, ou ho-móloga desta, proveniente de um inseto visado; (b) identificação de clone de DNA que se hibridize com a sonda de hibridização; (c) isolamento do clone de DNA, identificado na etapa (b); e (d) seqüenciamento do fragmento do cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (c), em que a molécula seqüenciada de ácido nucléico transcreve toda ou parte substan-cial da sequência de nucleotídeos do RNA, ou de homólogo desta.
[00140] Em outra concretização, um método da presente invenção de obtenção de fragmento de ácido nucléico, compreendendo uma sequência de nucleotídeos para produção de parte substancial de um dsRNA ou siR-NA compreende: (a) síntese de um primeiro e segundo iniciador de oligonu-cleotídeos, correspondentes a uma parte de uma das sequências de nucleo-tídeos de um inseto visado; e (b) amplificação da cópia do cDNA ou gDNA em um vetor de clonagem, empregando o primeiro e segundo iniciador de oligonucleotídeos da etapa (a), em que a molécula amplificada de ácido nu-cléico transcreve parte substancial de um dsRNA ou siRNA da presente in-venção.
[00141] Na prática da presente invenção, um gene-alvo pode ser deriva-do de uma larva alfinete de milho (CRW), como WCR ou SCR, ou de qual-quer espécie de inseto que cause danos às plantas de cultivo e perdas sub-seqüentes de rendimento. Contempla-se que vários critérios podem ser em-pregados na seleção de genes-alvo preferidos. Este é um gene cujo produto protéico possui uma taxa rápida de utilização, de forma que a inibição pelo dsRNA resultará em diminuição rápida em níveis protéicos. Em certas con-cretizações, é vantajoso selecionar um gene para o qual uma queda pe-quena, em nível de expressão, resulte em efeitos deletérios para o inseto. Se for desejado atingir uma ampla faixa de espécies de insetos, é selecionado um gene que é altamente preservado entre as espécies. Por outro la-do, para fins de conferir especificidade, em certas concretizações da inven-ção, é selecionado um gene que contenha regiões que são pouco preser-vadas entre espécies individualizadas de insetos, ou entre insetos e outros organismos. Em certas concretizações, pode ser desejável selecionar um gene que não possua homólogos conhecidos em outros organismos.
[00142] Conforme utilizado no presente, o termo "derivado de" se refere a uma sequência especificada de nucleotídeos que pode ser obtida de uma fonte especificada ou espécie em particular, embora não necessária e dire-tamente daquela fonte ou espécie especificada.
[00143] Em uma concretização, é selecionado um gene que se expressa no intestino do inseto. Genes visados que se expressam no intestino evitam que o dsRNA precise ser disseminado no inseto. Genes-alvo para uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que compartilham homologia substancial com as sequências de nucleotídeos de genes co-nhecidos que se expressam no intestino e que codificam componentes pro-téicos da V-ATPase protônica de vacúolos e da membrana plasmática (Dow et al., 1997; Dow, 1999). Esse complexo protéico é a única fonte de energia do transporte iônico epitelial e é responsável pela alcalinização do lúmen do intestino médio. A V-ATPase é expressa também no tubo de Malpighi, um desdobramento do intestino posterior do inseto que atua em equilíbrio hídri-co e desintoxicação de compostos estranhos de maneira análoga ao órgão renal de um mamífero. Em outra concretização, a V-ATPase pode ser Vha68-2, ou homólogo ou ortólogo desta (por exemplo, conforme encontra-da na SEQ ID NO: 821).
[00144] Em outra concretização, é selecionado um gene que está es-sencialmente envolvido no crescimento, desenvolvimento e reprodução de um inseto. Exemplos do gene incluem, entre outros, gene CHD3, gene da β-tubulina e um gene que codifica uma proteína supostamente envolvida em transporte. O gene CHD3 na Drosophila melanogaster codifica uma pro-teína com atividade sobre a DNA- helicase, dependente de ATP, a qual está envolvida em montagem/desmontagem de cromatina no núcleo. Foram en-contradas sequências semelhantes em diversos organismos, como Arabi-dopsis thaliana, Caenorhabditis elegans e Saccharomyces cerevisiae. A fa-mília de genes da beta-tubulina codifica proteínas associadas a microtúbu-los, constituintes do citoesqueleto celular. Foram encontradas sequências correlatas em diversos organismos, como C. elegans e Manduca sexta. Pro-teínas previstas como subunidades do complexo sortido endossômico, exi-gidas para transporte (ESCRT)-III (Babst et al., 2002), por exemplo, Dv49, são encontradas em diversos organismos, incluindo mamíferos, levedura e insetos, como D. virgifera. Outra proteína relacionada a transporte é a prote-ína β'- coatomer, abreviada como β'Cop, que codifica um produto envolvido em transporte retrógrado (Golgi para RE). Sequências semelhantes ou pre-vistas foram identificas em C. elegans e D. virgifera, por exemplo, Dv248 (SEQ ID NO).
[00145] Outros genes que podem ser utilizados como alvo na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham papel importante na viabilidade, crescimento, desenvolvimento, reprodução e pos-sibilidade de contaminação. Estes genes podem ser genes de manutenção de metabolismo, fatores de transcrição e específicos para insetos ou muta-ções de inativação gênica letais em Drosophila. Os genes-alvo de uso na presente invenção podem ser também aqueles de outros organismos, por exemplo, de nematódeos (por exemplo, C. elegans). Adicionalmente, as se-qüências de nucleotídeos de uso na presente invenção podem ser deriva-das também de genes de plantas, vírus, bactérias ou fungos, cujas funções tenham sido estabelecidas de acordo com literatura, e as sequências de nu-cleotídeos que compartilham semelhança substancial com os genes-alvo, no genoma de um inseto. De acordo com uma característica da presente invenção para controle de WCR, as sequências-alvo podem ser derivadas essencialmente do inseto visado da WCR. Alguns exemplos destas se-qüências, provenientes da biblioteca de cDNA de WCR, que codificam pro-teínas do D. virgifera, ou fragmentos destas, homólogos de proteínas co-nhecidas, podem ser encontradas na Listagem de Sequências. As molécu-las de ácido nucléico de homólogos que codificam proteínas conhecidas do D. virgifera são conhecidas (Andersen et al., Pedido de Patente U.S. Serial N° 10/205 189).
[00146] Para fins da presente invenção, as moléculas do dsRNA ou siRNA podem ser obtidas do CRW por amplificação de reação em cadeia de polimerase (PCR®) de sequências de gene-alvo de CRW, derivado da bibli-oteca de gDNA ou cDNA, ou partes desta, de larva alfinete de milho. As lar-vas WCR podem ser preparadas, empregando métodos conhecidos de qualquer versado na técnica, e o DNA/RNA pode ser extraído. Larvas com tamanhos variando de 1° instar a CRWs, completamente desenvolvida, po-dem ser utilizadas, nesta invenção, para extração de DNA/RNA. As bibliote-cas de DNA genômico ou de cDNA, geradas a partir de WCR, podem ser utilizadas na amplificação por PCR® para produção do RNA ou siRNA.
[00147] Os genes-alvo podem ser, então, amplificados por PCR® e se-qüenciados, empregando os métodos à disposição na técnica. Versados na técnica poderão modificar as condições da PCR® para assegurar que o me-lhor produto da PCR® seja formado. O produto confirmado da PCR® pode ser utilizado como modelo para transcrição in vitro, gerando RNA sentido e antissenso RNA com os promotores mínimos incluídos.
[00148] Os presentes inventores contemplam que sequências de ácido nucléico, identificadas e isoladas de qualquer espécie no reino de insetos, poderão ser utilizadas na presente invenção para controle de WCR e de outros insetos visados. Em uma característica da presente invenção, o ácido nucléico pode ser derivado de espécies de coleópteros. Especificamente, o ácido nucléico pode ser derivado de besouro crisomelídeo, pertencente do gênero Diabrotica (Coleoptera, Chrysomelidae), e, mais especificamente, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser derivadas de espécies do grupo virgifera. O mais específico é que as moléculas de ácido nucléico da presente invenção sejam derivadas do Diabrotica virgifera virgi-fera LeConte, normalmente referida como WCR. Os ácidos nucléicos isola-dos podem ser úteis, por exemplo, para identificar um gene-alvo e construir um vetor recombinante que produza os dsRNAs ou siRNAs estabilizados da presente invenção, para proteção de plantas contra infestações por insetos do tipo WCR.
[00149] Por conseguinte, em uma concretização, a presente invenção compreende sequências de nucleotídeos, isoladas e purificadas, de WCR ou Lygus que podem ser utilizadas como os agentes de controle de insetos. As sequências de nucleotídeos, isoladas e purificadas, podem compreender aquelas expostas na listagem de sequências.
[00150] Os ácidos nucléicos de WCR ou de outros insetos que podem ser utilizados na presente invenção podem compreender também moléculas de ácido nucléico de Unigenes e EST, isoladas e substancialmente purifi-cadas, ou moléculas de fragmentos de ácidos nucléicos destes. Moléculas de ácido nucléico de EST podem codificar partes significativas, ou de fato a maioria, dos polipeptídeos. Alternativamente, os fragmentos podem conter oligonucleotídeos menores com de aproximadamente 15 a aproximadamen-te 250 resíduos de nucleotídeos e, mais preferencialmente, de aproximadamente a aproximadamente 30 resíduos de nucleotídeos. Alternativamente, as moléculas de ácido nucléico para uso na presente invenção podem ser provenientes de bibliotecas de cDNA de WCR, ou de qualquer outro coleóp-tero-praga.
[00151] Moléculas de ácido nucléico, e fragmentos deste, de WCR ou de outras espécies de coleóptero-praga podem ser empregadas para obter outras moléculas de ácido nucléico de outras espécies, para serem utiliza-das, nesta invenção, para produzir as moléculas desejadas de dsRNA e de siRNA. Estas moléculas de ácido nucléico incluem moléculas de ácido nu-cléico que codificam a sequência codificadora completa de uma proteína e de promotores e sequências que flanqueiam estas moléculas. Ademais, es-tas moléculas de ácido nucléico incluem moléculas de ácido nucléico que codificam membros da família do gene. Estas moléculas podem ser obtidas prontamente, empregando as moléculas de ácido nucléico descritas acima, ou fragmentos deste, para seleção em, por exemplo, bibliotecas de cDNA ou gDNA de D. v. virgifera ou outros coleópteros, ou de Lygus hesperus. Méto-dos para criação destas bibliotecas são bem- conhecidos na técnica.
[00152] Conforme utilizada no presente, a frase "sequência codificado-ra", "sequência estrutural de nucleotídeos" ou "molécula estrutural de ácido nucléico" se refere a uma sequência de nucleotídeo que é traduzida em polipeptídeo, geralmente via mRNA, quando posta sob controle de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência codificadora são determinados por um códon de início de tradução, no terminal 5', e um códon de parada de tradução no terminal 3'. Uma sequência codificadora por in-cluir, entre outras, sequência de nucleotídeos de DNA genômico, DNA, cDNA, EST e sequências de nucleotídeos recombinantes.
[00153] O termo "DNA recombinante" ou "sequência de nucleotídeos recombinante" se refere a DNA que contenha uma modificação construída por manipulação via mutagênese, enzimas de restrição e similar.
[00154] A informação, referente às sequências da maioria dos genes ou do fenótipo resultante de mutação de genes especificados, pode ser limita-da para muitos dos insetos que são possíveis alvos de controle pela presen-te invenção. Por conseguinte, os presentes inventores contemplam que a seleção de genes apropriados de insetos-praga para uso na presente in-venção pode ser obtida pelo uso de informação disponível, resultante de estudo dos genes correspondentes, em modelo de organismo como de Dro-sophila, de algumas outras espécies de inseto, ou até mesmo de espécies de nematódeos, espécies de fungos, espécies de plantas, nas quais os ge-nes tenham sido caracterizados. Em alguns casos, será possível obter a se-qüência de um gene correspondente de um inseto-alvo por pesquisa em bancos de dados como o GenBank, empregando o nome do gene ou da sequência de, por exemplo, Drosophila, outro inseto, um nematódeo, um fungo ou uma planta dos quais o gene tenha sido clonado. Uma vez obtida a sequência, PCR® pode ser utilizada para amplificar um segmento devi-damente selecionado do gene no inseto a ser utilizado na presente inven-ção.
[00155] A fim de obter um segmento de DNA do gene correspondente em espécies de inseto, podem ser criado iniciadores por PCR®, com base na sequência encontrada em WCR ou outros insetos, dos quais o gene te-nha sido clonado. Os iniciadores são criados para amplificar um segmento de DNA de extensão suficiente para ser utilizado na presente invenção. O DNA (DNA genômico ou cDNA) é preparado a partir de espécies de insetos e os iniciadores da PCR® são utilizados para amplificar o segmento do DNA. As condições da amplificação são selecionadas de forma que esta ocorra mesmo se os iniciadores não combinarem exatamente com a se- qüência visada. Alternadamente, o gene (ou parte do mesmo) pode ser clo-nado a partir de uma biblioteca de gDNA ou de cDNA, preparada a partir de espécies de inseto-praga, empregando o gene do WCR ou de gene conhe-cido de outro inseto, como sonda. Técnicas para condução de PCR® e clo-nagem, a partir de bibliotecas, são conhecidas. Maiores detalhes do proces-so, pelo qual segmentos de DNA, de espécies de inseto-praga visadas, po-dem ser isolados com base na sequência de genes previamente clonados do WCR ou de outras espécies de insetos, são fornecidos nos Exemplos. Qualquer versado na técnica reconhecerá que uma variedade de técnicas pode ser utilizada para isolar segmentos de gene que correspondem a genes previamente isolados de outras espécies.
[00156] Se um inseto for o alvo, como praga, para presente invenção, estas pragas incluem, entre outras: da ordem de Lepidópteros, por exemplo, Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argilla-ceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp, Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Litho-collethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia Nubila-lis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypi-ella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni e Yponomeuta spp.; da ordem de Coleoptera, por exemplo,Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocne-ma tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhop-trus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophi-lus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. e Trogoderma spp.; da ordem Orthoptera, por exemplo, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta ssp. e Schistocerca spp.; da ordem Isoptera, por exemplo, Reticulitemes ssp; da ordem Psocoptera, por exemplo, Liposcelis spp.; da ordem Anoplura, por exemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphi-gus spp. e Phylloxera spp.; da ordem Mallophaga, por exemplo, Damalinea spp. e Trichodectes spp.; da ordem Thysanoptera, por exemplo, Franklinella spp., Hercinothrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci e Scirtothrips aurantii; da ordem Heteroptera, por exemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp., Triatoma spp., família da Miridae spp., como Lygus hesperus e Lygus lineoloris, família da Lygaeidae spp. como Blissus leucopterus e família da Pentatomidae spp.; da ordem Homoptera, por exemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperi-dum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphi-gus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla ssp., Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Tria- leurodes vaporariorum, Trioza erytreae e Unaspis citri; da ordem Hymenoptera, por exemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius sppp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp, Solenopsis spp. e Vespa ssp.; da ordem Diptera, por exemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glos-sina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca ssp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. e Tipula spp., da ordem Siphonaptera, por exemplo, Ceratophyllus spp. und Xenopsylla cheopis e da ordem Thysanura, por exemplo, Lepisma saccharina.
[00157] Foi constatado que a presente invenção é particularmente efeti-va quando o inseto-praga pertence a Diabrotica spp., e especialmente quando este é Diabrotica virgifera virgifera (larva alfinete do milho ocidental, WCR), Diabrotica barberi (larva alfinete do milho do Norte, NCR), Diabrotica virgifera zea (Mexican Corn Rootworm, MCR), Diabrotica balteata (Brazilian Corn Rootworm (BZR) ou Brazilian Corn Rootworm complex (BCR), consti-tuído por Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa) ou Diabrotica undecim- punctata howardi (larva alfinete do milho do Sul, SCR).
Exemplos
[00158] Os inventores desta invenção identificaram meios para o contro-le de infestação por coleóptero-praga pelo fornecimento de moléculas de ácido ribonucleico de fita dupla na dieta de pragas. Surpreendentemente, os inventores constataram que moléculas de ácido ribonucleico de duplo filamento, que atuam na ingestão pela praga, inibem uma função biológica na praga, resultando em um ou mais dos seguintes atributos: redução na alimentação pela praga, redução na viabilidade da praga, morte da praga, inibição da diferenciação e desenvolvimento da praga, ausência ou ca-pacidade reduzida para reprodução sexual pela praga, formação de múscu-lo, produção de hormônio juvenil, regulação de hormônio juvenil, regulação e transporte iônico, manutenção de potencial de membrana celular, biossín-tese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, produção de esperma, síntese de feromônio, sensibilidade a feromônio, formação de antena, for-mação de asa, formação de perna, desenvolvimento e diferenciação, forma-ção de ovo, maturação larval, produção de enzimas digestivas, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo energético, respiração, apoptose e qualquer componente de estrutura do citoesqueleto de células eucarióticas, como, por exemplo, actinas e tubulinas. Qualquer um ou qualquer combinação destes atributos pode resultar em inibição efetiva de infestação por praga e, no caso de praga de planta, inibição de infestação da planta. Por exemplo, quando utilizada em composição de dieta, contendo quantidade inibidora suficiente para a praga de uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico de fita dupla, fornecida topicamente para uma planta, como em tratamento de semente, aplicação em solo em torno da planta, ou quando produzida por uma planta a partir de molécula de DNA recombinante, presente nas células de uma planta, a infestação da planta por praga é inesperada e radicalmente reduzida. Os Exemplos aqui descritos abaixo ilustram a invenção quando aplicada a uma única praga. No entanto, o versado na técnica reconhecerá que os métodos, fórmulas e ideias, apresentados nos Exemplos, não pretendem restringir e podem ser aplicados a todas as espécies de coleópteros-praga que tenham como fonte de consumo alimentos que podem ser formulados de forma a conter uma quantidade suficiente de um agente inibidor da praga, consis-tindo em, pelo menos, uma ou mais moléculas de RNA de fita dupla, exemplificadas neste pedido, visando suprimir alguma característica essen-cial ou função na praga.
Exemplo 1 Identificação de sequências de nucleotídeos alvo para preparo do dsRNA útil para controle de larvas alfinete de milho.
[00159] Bibliotecas de cDNA da larva alfinete de milho (LIB149, LIB 150, LIB3027, LIB3373) foram criadas a partir de larvas completas, pupa e de se-ções dissecadas de intestino médio, tendo sido obtida informação referente a sequências de nucleotídeos (vide Andersen et al., Pedido de Patente U.S. Serial N° 10/205 189, depositado em 24 de julho de 2002, aqui incorporada, em sua totalidade, por referência neste pedido). Além disso, foram criadas bibliotecas de cDNA a partir de larvas completas em diferentes estágios de desenvolvimento e em diferentes tempos, em cada estágio de desenvolvi-mento, a fim de maximizar o número de sequências EST diferentes da es-pécie Diabrotica. As bibliotecas LIB5444 e LIB5462 foram criadas a partir de pools de mRNA, obtidos de larvas de larva alfinete do milho ocidental em primeiro (1 grama) e terceiro (2,9 gramas) instar. Os insetos colhidos foram rapidamente congelados por inserção em nitrogênio líquido. Os insetos fo-ram triturados em argamassa e almofariz e mantidos em -20°C, ou menos, por resfriamento em gelo seco e/ou com o acréscimo de nitrogênio líquido à argamassa até que o tecido fosse triturado e transformado em pó fino. O RNA foi extraído empregando o reagente TRIzol® (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Poli A+ RNA foi isolado do preparado de RNA total, empregando Oligo dT DYNABEADS (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. Foi criada uma biblioteca de cDNA, a partir do Poli A+ RNA, empregando o Sistema de Plasmídeo SuperScriptTM (Invitrogen). O cDNA foi fracionado, de acordo com tamanho, empregando cromatografia. A quarta e quinta fração foram coletadas e unidas no vetor pSPORT1 (Life Technologies Inc., Gaithersburg MD), entre os sítios de reconhecimento de restrição de endonucleases Sal1 e Not1, e transformados em células eletro-competentes DH10B de E. coli, por eletroporação. A biblioteca das larvas em primeiro ínstar produziu aproximadamente 420.000 unidades formadoras de colônias. A biblioteca de larvas em terceiro instar produziu aproximadamen-te 2,78 □ 106 unidades formadoras de colônia. As colônias das LIB149 e LIB150 foram lavadas e retiradas das placas, misturadas até uniformidade por vórtice rápido e reunidas em tampão Tris-EDTA. Metade da lavagem foi levada a glicerol a 10%, separada em alíquotas em criofrascos e armazena-das a -70°C. A outra metade foi utilizada para produzir DNA de plasmídeo, empregando uma coluna midi-prep de Quiagen de purificação, ou seu equivalente. O DNA purificado de plasmídeo foi separado em alíquotas que foram colocadas em tubos de microcentrifugação e armazenadas a 20°C.
[00160] As colônias de Diabrotica virgifera das bibliotecas de cDNA LIB5444 e LIB5462 foram amplificadas individualmente em meio de alta vis-cosidade. Aproximadamente 200.000 unidades formadoras de colônias, da LIB5444, e 600.000 unidades formadoras de colônia da LIB5462 foram mis-turadas em um prato de agitação, separadamente, em 500 ml de meio LB, contendo 0,3% de SeaPrep agarose® e 50 mg/l de carbenecilina a 37°C e, em seguida, resfriadas rapidamente em banho de água/gelo por 1 hora, permitindo uma suspensão uniforme das colônias de bactéria. As bibliote-cas inoculadas foram, em seguida, cultivadas a 30°C por 42 horas. Após a incubação, as células foram misturadas por 5 minutos em prato de agitação. O meio foi transferido, em seguida, para dois tubos de centrifugação de 250 ml. As células bacterianas foram transformadas em péletes em 10.000 x g por 10 minutos. O meio foi removido dos tubos e as células ressuspensas em 20 ml, no total, de meio LB com 50 mg/l de carbenecilina. Dimetil sulfóxi-do foi acrescentado a 10% para manter as células congeladas. Ambas as bibliotecas foram amplificadas até titulação final de 108 unidades formado-ras de colônia por mililitro. Amostras do cDNA de Diabrotica virgifera das bibliotecas LIB5444 e LIB5462 foram combinadas e ajustadas até concen-tração de DNA de aproximadamente 1,25 microgramas por microlitro em água estéril destilada e deionizada e separadas em alíquotas em vinte e cinco criofrascos, cada um deles contendo aproximadamente 8,75 micro- gramas de DNA. Estas amostras foram depositadas pelo(s) requeren-te(s)/inventores junto à American Type Culture Collection (ATCC), localiza-da em 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EUA ZIP 20110-2209, em 10 de junho de 2004 e identificadas como LIB5444/62. A ATCC forneceu ao Requerente um comprovante do depósito, designando o N° de Acesso de Depósito PTA-6072 da ATCC.
[00161] Foram preparadas bibliotecas de cDNA de alto peso molecular de larva alfinete de milho, ou seja LIB5496 e LIB5498, essencialmente con-forme descrito acima para produção de bibliotecas de cDNA de larva alfinete de milho. As bibliotecas LIB5496 e LIB5498 foram criadas, respectivamente, a partir de pools de mRNA, obtidos de larvas de larva alfinete do milho oci-dental em primeiro (1 grama) e segundo e terceiro (1 grama) instar. Resumi-damente, os insetos foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido. Os insetos congelados foram reduzidos a pó fino, por trituração em arga-massa e almofariz. Foi extraído RNA empregando o reagente TRIzol® (Invi- trogen), seguindo as instruções do fabricante. Poli A+ RNA foi isolado do preparado de RNA total, utilizando Oligo dT DYNABEADS (Invitrogen). Foi feita uma biblioteca de cDNA de alto peso molecular, a partir de 20 micro-gramas de Poli A+ RNA, empregando o Sistema de Plasmídeo SuperScrip-tTM (Invitrogen). O cDNA foi dividido em frações em gel de agarose a 1% em TAE, e cDNA, incluído no intervalo de 1 Kb a 10 Kb, foi coletado e ligado ao vetor pSPORT1 entre os sítios de restrição Sal1 e Not1 e transformado em células eletro-competentes DH10B de E. coli por eletroporação. A LIB5496 rendeu, no total, título de aproximadamente 3,5 □ 106 unidades formadoras de colônia, enquanto que a LIB5498, este título total foi de aproximadamen-te 1,0 □ 106 unidades formadoras de colônia. As colônias das bibliotecas LIB5496 e LIB5498 de cDNA de alto peso molecular da larva alfinete de mi-lho foram amplificadas, individualmente, em meio de alta viscosidade. Apro-ximadamente 600.000 unidades formadoras de colônia, da LIB5496 e LIB5498, foram misturadas em prato de agitação, separadamente, em 500 ml de meio LB, contendo 0,3% de SeaPrep agarose® e 50 mg/l de carbenecili-na a 37°C e, em seguida, resfriadas rapidamente em banho de água/gelo por 1 hora, permitindo suspensão uniforme das colônias de bactérias. As bibliotecas foram cultivadas em seguida a 30°C por 42 horas. Após a incu-bação, as células foram misturadas por 5 minutos em prato de agitação. O meio foi transferido, em seguida, para dois tubos de centrifugação de 250 ml. As células bacterianas foram transformadas em péletes em 10.000 x g por 10 minutos. O meio foi removido dos tubos e as células resuspensas em 20 ml, no total, de meio LB com 50 mg/l de carbenecilina. Dimetil sulfóxido foi acrescentado a 10% para manter as células congeladas. Ambas as bibli-otecas foram amplificadas até titulação final de 108 unidades formadoras de colônia por mililitro. Foi obtida informação sobre sequência de cDNA inseri-do a partir das bibliotecas de plasmídeo, específicas para espécie de larva alfinete de milho.
[00162] As bibliotecas de larva alfinete de Andersen et al., juntamente com sequências adicionais das bibliotecas LIB5444 e LIB5462, produziram inicialmente em torno de 18.415 sequências individualizadas de EST, con-sistindo em aproximadamente 1,0 □ 107 resíduos de nucleotídeos. O com-primento médio de uma sequência EST foi de aproximadamente 586 resí-duos de nucleotídeos. Estas sequências EST foram submetidas a algorit-mos bioinformáticos que resultaram na montagem de sequências contíguas, referidas neste pedido como sequências de UNIGENE, e sequências indivi-dualizadas EST que não podiam ser compiladas por sobreposição de iden-tidade com outras sequências EST, referidas neste pedido como singletons. As bibliotecas LIB5444 e LIB5462 foram seqüenciadas em seguida com mais profundidade, resultando em sequências EST individualizadas adicio-nais. Foram selecionadas sequências EST, obtidas de bibliotecas, ou sejam, LIB149, LIB150, LIB3027, LIB3373, LIB5444, LIB5462, LIB5496 e LIB5503, para investigação posterior em bioensaios de alimentação, conforme descri-tos abaixo, e as sequências correspondentes são fornecidas na listagem de sequências.
[00163] As sequências EST, isoladas de bibliotecas de cDNA de CRW, foram montadas, quando possível, em conjuntos UNIGENE e estas seqüên-cias montadas em Unigene estão incluídas na listagem de sequências. UNIGENE é um conglomerado, orientado por gene, formado da sobreposi-ção de sequências individualizadas EST, em regiões em que há identidade de sequência, para formar uma sequência maior. Pontius et al. (2003). Cada sequência de nucleotídeos, conforme expostas na listagem de sequências, foi analisada para identificação de presença de estruturas de leitura aberta. A informação sobre sequência de aminoácidos, deduzida de estruturas de leitura aberta, foi comparada com a informação disponível de sequências conhecidas de aminoácidos em bancos de dados públicos, a fim de ser de-duzida a extensão da identidade ou semelhança de sequências de aminoá-cidos em relação àquelas sequências de aminoácidos. A função biológica, se constante, associada a sequências conhecidas de aminoácidos, em bancos de dados públicos, foi anotada para as sequências de aminoácidos deduzidas a partir da informação sobre sequências de aminoácidos da bi-blioteca de cDNA. As anotações forneceram informação que sugeria a fun-ção de uma proteína que pode ser expressa a partir de um gene em particu-lar, que dá origem a uma sequência de cDNA em particular, porém sem re-sultado determinante. Com base na informação sugestiva anotada, certas sequências de cDNA foram caracterizadas como aquelas que codificavam uma proteína que possivelmente estava envolvida em alguma função bioló-gica, em células de larva alfinete de milho, que era essencial para vida ou necessária para assegurar saúde e vitalidade à célula, ou que possivelmen-te estaria envolvida na integridade celular, manutenção celular, capacidade reprodutora e funções semelhantes.
[00164] Sequências, selecionadas para investigação posterior, foram utilizadas para construção de moléculas de RNA de fita dupla, para incorporação em dieta de CRW. Foram criados pares de iniciadores por am-plificação térmica, com base em sequências inicias de cDNA e EST para obter sequências utilizadas em ensaios de alimentação. Pares de iniciado-res foram construídos, que sob a forma de par de sequências de nucleotí-deos, cada membro de um par de iniciador exibindo complementaridade per-feita, quer para uma sequência senso ou antissenso. Algumas se-qüências de par de iniciadores foram construídas de forma que cada mem-bro do par exibiu uma sequência contendo um promotor T7 de RNA polime-rase de fago, em sua extremidade 5'. De preferência, foi conduzida uma primeira reação de amplificação de alta fidelidade, empregando um primeiro par de iniciador sem um promotor T7 para gerar um primeiro amplicon, utili-zando DNA genômico de CRW, como modelo. De preferência, é utilizada uma sequência de cDNA ou mRNA, como o modelo para a síntese de uma molécula de dsRNA a ser utilizada na presente invenção, em virtude de se-qüências de genoma eucariótico serem reconhecidas na técnica como con-tendo sequências que não estão presentes na molécula madura de RNA. Uma amostra do primeiro amplicon gerado pela primeira reação de amplifi-cação de alta fidelidade foi então utilizada como modelo em uma segunda reação de amplificação térmica com um segundo par de iniciador, contendo a sequência do promotor T7, para que fosse produzido um segundo ampli-con que contivesse um promotor T7 em ou encaixado na extremidade 5' de cada fita do segundo amplicon. A sequência completa de nucleotí-deos do segundo amplicon foi obtida, em ambas as direções, e comparada à sequência de nucleotídeos, conforme relatada para o cDNA, e as divergên-cias entre as duas sequências, se existentes, foram anotadas. De modo ge-ral, sequências preparadas empregando DNA genômico, como modelo, fo-ram incompatíveis para uso posterior como moléculas de dsRNA a ser utili-zado para atingir níveis significativos de supressão, em virtude de variações nas sequências de genomas que não estavam presentes na sequência do mRNA ou cDNA.
[00165] Uma reação de transcrição in vitro continha tipicamente de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 microgramas de modelo de DNA linearizado, tampão de reação de polimerase T7, com 10X de concentração, ribonucleotídeos ATP, CTP, GTP e UTP, em concentração final de 50 a 100 mM cada, e 1 unidade da enzima RNA polimerase T7. A reação com RNA polimerase foi incubada em aproximadamente 37°C, dependendo da tempe-ratura ótima da RNA polimerase utilizada, de acordo com as instruções do fabricante, por um período de tempo que variou de diversos minutos a diver-sas horas. De modo geral, as reações foram conduzidas em aproximadamente 2 horas a aproximadamente 6 horas, para transcrição de sequências de modelo com até aproximadamente 400 nucleotídeos em extensão, e por até 20 horas para transcrição de sequências de modelo com mais de 400 nucleotídeos em extensão. O aquecimento da reação para 65°C por quinze minutos finaliza a transcrição de RNA. Produtos da transcrição do RNA fo-ram precipitados em etanol, lavador, secados no ar e ressuspensos em água livre de RNAse até concentração de aproximadamente 1 micrograma por microlitro. A maioria dos transcritos, que se aproveitou da estratégia de se opor ao promotor T7, descrita acima, produziu RNA de fita dupla na reação de transcrição in vitro, no entanto, um rendimento mais alto de RNA de fita dupla foi obtido pelo aquecimento do RNA purificado até 65°C e, em seguida, resfriamento lento até a temperatura ambiente para assegu-rar o anelamento apropriado de segmentos sentido e antissenso do RNA. O RNA de fita dupla produzido foi então incubado com DNAse I e RNAse a 37°C por uma hora para remover qualquer DNA ou RNA de fila-mento simples presente na mistura. Os produtos de RNA de fita dupla foram purificados em coluna, de acordo com as instruções do fabricante (Kit de RNAi MEGAscript® da AMBION) e ressuspensos em tampão Tris-HCl a 10 mM (pH 7,5) ou água sem RNAse até concentração entre 0,1 e 1,0 mi-crograma por microlitro.
[00166] As sequências de nucleotídeos seguintes foram derivadas pri-meiramente como sequências de cDNA, identificadas em biblioteca de cDNA de intestino médio de larva alfinete de milho (Andersen et al., ibid), e adaptadas para uso em construção de moléculas de RNA de fita dupla a serem utilizadas em testes de eficácia de inibição de função biológica em praga, pela inclusão das moléculas de RNA de fita dupla na dieta da praga.
A. Sequências homólogas de CHD3
[00167] Genes CHD foram identificados em inúmeros eucariotes, e as proteínas correspondentes são propostas para operarem como fatores re-modeladores de cromatina. O termo CHD é derivado dos três domínios com homologia de sequência, encontrados em proteínas CHD: um domínio cro-mo (modificador de organização de cromatina), um domínio de helica-se/ATPase relacionado com SNF2 e um domínio de ligação de DNA, cada qual supostamente conferindo uma atividade distinta relacionada com cro-matina. As proteínas CHD são separadas em duas categorias, com base na presença ou ausência de outro domínio com homologia de sequência, um domínio de dedo de zinco PHD, tipicamente associado à atividade relacio-nada com cromatina. As proteínas relacionadas com CHD3 possuem um domínio de dedo de zinco PHD, porém as proteínas relacionadas com CHD1 não possuem. Observações experimentais sugeriram que as proteí-nas CHD3 participariam na repressão de transcrição e, em algumas espécies, foi demonstrado como sendo componente de um complexo que con-tém histona desacetilase como subunidade. A desacetilação de histonas está correlacionada à inativação transcricional e, dessa forma, proteínas CHD3 foram envolvidas para atuarem como repressoras de transcrição em virtude de fazerem parte de um complexo da histona desacetilase (Ogas et al., 1999). Portanto, a supressão da síntese de proteína CHD3 pode ser um alvo útil para inibição mediada por RNA de fita dupla de coleópteros-pragas.
B. Sequências homólogas de beta-tubulina
[00168] As proteínas tubulina são componentes estruturais importantes de muitas estruturas em todas as células de eucariotes e, principalmente, na formação de microtúbulos. A inibição da formação de microtúbulos resulta em efeitos catastróficos, incluindo interferência com a formação de fusos mitóticos, bloqueio de divisão celular e similar. Por conseguinte, a supres-são da formação de proteína tubulina pode ser um alvo útil para inibição mediada por RNA de fita dupla.
C. Sequências homólogas da V-ATPase de 40 kDa
[00169] O metabolismo energético em organelas subcelulares, em sis-temas eucarióticos, é uma função essencial. As ATP sintases de vacúolos estão envolvidas na manutenção de níveis suficientes de ATP em seu inte-rior. Por conseguinte, ATP sintases de vacuole podem ser um alvo útil para inibição mediada por RNA de fita dupla.
D. Sequências homólogas de EF1A
[00170] Os fatores de alongamento de transcrição e de término de trans-crição são essenciais para o metabolismo e podem ser alvos vantajosos pa-ra inibição mediada por RNA de fita dupla.
E. Sequências homólogas de subunidade p28 de proteassomo 26S
[00171] O proteassomo 26S é uma protease com múltiplas subunidades dependente de ATP que está altamente preservada em todos os eucariotes. Ela possui uma função geral na remoção seletiva de várias proteínas de vida curta que são inicialmente ligadas covalentemente à ubiquitina e, em seguida, degradadas pelo complexo proteassomo 26X. A via da ubiquitina desempenha papel importante no controle do ciclo celular pela degradação específica de algumas proteínas reguladoras, incluindo ciclinas mitóticas e inibidores de cinases dependentes de ciclina, como a p27 de células de mamíferos. Portanto, a supressão da síntese de proteassomo 26S e supres-são da síntese de suas subunidades constituintes podem ser alvos de esco-lha para inibição mediada por RNA de fita dupla (Smith et al., 1997).
F. Sequências homólogas de epóxido hidrolase de hormônio juvenil
[00172] O hormônio juvenil de insetos controla e regula uma variedade de processos biológicos necessários dentro do ciclo de vida do inseto, inclu-indo, mas não necessariamente sem restrição, metamorfose, reprodução e diapausa. É necessário que as concentrações do hormônio juvenil (JH) atinjam um pico em ocasiões apropriadas, dentro da hemolinfa da forma lar-val de um inseto-praga, especialmente larvas de lepidópteros e coleópteros, e este deve ser, em seguida, degradado para finalizar os efeitos da resposta hormonal. Enzimas envolvidas na diminuição do hormônio juvenil são efe-tivas através de duas vias primárias de degradação metabólica. Uma via en- volve a esterase do hormônio etaboli (JHE), que hidrolisa o metil etab, for-necendo o ácido correspondente. A segunda via utiliza a etabol etabolis do hormônio etaboli (JHEH) para levar a cabo a hidrólise do etabol, resul-tando em formação do diol. A contribuição da JHE, na degradação do JH, é bem-entendida e foi constatado não variar entre as espécies lepidóptera e etabolism . A inibição da esterase do JH foi associada a alterações morfoló-gicas graves, incluindo, entre outras, deambulação larval, pupação atrasada e desenvolvimento de etabolism ies mal formados. Por outro lado, a contri-buição da JHEH, no etabolism do JH, é menos bem entendida e foi cons-tatado que varia entre as espécies, porém estudos recentes indicam evidên-cias que sugerem que a JHEH pode ser a via primária de etabolism do JH (Brandon J. Fetterolf, Doctoral Dissertation, Universidade do Estado da Carolina do Norte (10 de fevereiro de 2002) Synthesis and Analysis of Me-chanism Based Inhibitors of Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase from In-sect Trichoplusia ni). De qualquer modo, a desorganização de qualquer via de degradação do JH, empregando tecnologia de supressão gênica, poderia ser um alvo efetivo para inibição mediada por RNA de fita dupla.
G. Sequências homólogas da proteína do canal de cloreto, dependente de inchamento
[00173] Foi postulado que proteínas do canal de cloreto, dependentes de inchamento, desempenhariam um papel fundamental em regulação os-mótica de sistemas celulares de animais. Por conseguinte, uma sequência de nucleotídeos que exiba a capacidade de expressar uma sequência de aminoácidos que tenha homologia a proteínas do canal de cloreto, depen-dente de inchamento, poderiam ser um alvo útil para inibição por RNA em uma praga.
H. Sequências homólogas da proteína glicose-6-fosfato-1- desidrogenase
[00174] A proteína glicose-6-fosfato-1-desidrogenase (G6PD) cataliza a oxidação da glicose-6-fosfato para 6-fosfogluconato, ao mesmo tempo em que reduz a forma oxidativa do nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+) para NADPH. O NADPH é conhecido na técnica como co-fator exigido em muitas reações biossíntéticas eucarióticas, e é conhecido por manter a glutationa em sua forma reduzida. A glutationa reduzida atua co-mo seqüestrante de metabólito oxidativos perigosos em células de eucario-tes, e com a assistência da enzima glutationa peroxidase, converte o nocivo peróxido de hidrogênio em água (Beutler et al., 1991). Portanto, o G6PD po-de ser um alvo preferível para inibição mediada por RNA de fita dupla em coleóptero-praga.
I. Sequências homólogas da proteína ACT42A
[00175] A actina é uma proteína eucariótica generalizada e altamente conservada, necessária para motilidade celular e locomoção (Lovato et al., 2001). Algumas sequências identificadas de cDNA do CRW supostamente poderiam codificar actina ou proteínas com estrutura de sequências de ami-noácidos relacionadas a proteínas actina. Por conseguinte, genes que codi-ficam homólogos da actina, em uma célula de praga, podem ser alvos úteis para inibição mediada por RNA de fita dupla.
J. Sequências homólogas do fator 1 de ADP-ribosilação
[00176] Foi demonstrado que fatores de ADP-ribosilação eram funda-mentais para o funcionamento celular, visto desempenharem o papel inte-gral nos processos de reparo de dano a DNA, carcinogênese, morte celular e estabilidade genômica. Por conseguinte, seria útil ser capaz de desorga-nizar seletivamente a transcrição de fatores de ADP-ribosilação em espécies de coleópteros- praga, empregando inibição mediada por RNA de fita dupla.
K. Sequências homólogas da proteína do fator IIB de transcrição
[00177] Fatores de alongamento de transcrição e de término de transcri-ção, conforme indicado acima, são essenciais para o metabolismo e podem ser alvos vantajosos para inibição mediada por RNA de fita dupla para controle ou eliminação de infestação por coleóptero-praga.
L. Sequências homólogas de quitinase
[00178] A quitina é um β(1 ^ 4)homopolímero da N- acetilglucosamina e é encontrada em exoesqueletos de insetos. A quitina é formada a partir da UDP-N-acetilglucosamina, em uma reação catalizada pela quitina sintase. A quitina é um polissacarídeo estrutural homopolímero, e há muitas etapas enzimáticas envolvidas na construção desta estrutura altamente ramificada e com ligações cruzadas. A quitina confere forma, rigidez e suporte a inse-tos, criando um arcabouço, ao qual, órgãos internos, como músculos, são presos. A quitina precisa também ser degradada, em alguma medida, para mediar as etapas envolvidas no processo de troca de proteção externa de insetos. Por conseguinte, acredita-se que a inibição, mediada por RNA de fita dupla, de proteínas nessas vias seria útil como meio para controle de infestação por coleóptero-praga.
M. Sequências homólogas da enzima que conjuga a ubiquitina
[00179] A via da ubiquitina desempenha papel importante no controle do ciclo celular pela degradação específica de algumas proteínas regulado-ras, incluindo ciclinas mitóticas e inibidores de cinases dependentes de ci-clina, como a p27 de células de mamíferos. Dessa forma, genes, codificado-res de ubiquitina e de componentes associados, podem ser um alvo de es-colha para inibição mediada por RNA de fita dupla. (Smith et al., 1997). A via proteolítica dependente de ubiquitina é uma das vias mais im-portantes pelas quais proteínas intracelulares são destruídas seletivamente em eucariotes. A conjugação da ubiquitina a substratos protéicos é mediada por um arranjo notadamente diverso de enzimas. O alvo proteolítico pode ser regulado também em etapas entre a ubiquitinação do substrato e sua de-gradação para peptídeos pela protease 26S de múltiplas subunidades. A complexidade do sistema da ubiquitina sugere um papel central para turno-ver (utilização) protéico na regulação de células de eucariotes, e envolve outras proteínas na via, incluindo a enzima que ativa a ubiquitina, enzima de conjugação de ubiquitina, ubiquitina proteína ligase e componentes de subunidades do proteassomo 26S. Por conseguinte, acredita-se que a inibi-ção de proteínas, mediada por RNA de fita dupla, nesta via seria útil como meio para controle de infestação por coleóptero-praga.
N. Sequências homólogas da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
[00180] A via glicolítica é essencial na maioria dos organismos e está envolvida na produção de energia metabólica, resultante da degradação de glicose. Uma enzima importante no segundo estágio da via glicolítica é a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (G3PDH), a qual, na presença de NAD+ e fosfato inorgânico, cataliza a oxidação do 3-fosfo-gliceraldeído para 3-fosfoglicerol-fosfato, acompanhado de formação de NADH. O componente importante dessa reação é o armazenamento de energia, através da forma-ção de NADH. Genes que codificam enzimas associadas à via glicolítica e, especialmente, genes que codificam enzimas envolvidas nas etapas úteis na formação de reservas de energia podem ser alvos especialmente úteis para inibição mediada por RNA de fita dupla em espécies de coleóp-tero- praga.
O. Sequências homólogas de ubiquitina B
[00181] Conforme foi descrito acima, a via de degradação da proteína ubiquitina desempenha papel importante no controle do ciclo celular pela degradação específica de algumas proteínas reguladoras, incluindo ciclinas mitóticas e inibidores de cinases dependentes de ciclina, como a p27 de células de mamíferos. Dessa forma, genes, que codificam ubiquitina e com-ponentes associados, podem ser um alvo de escolha para inibição mediada por RNA de fita dupla (Smith et al., 1997).
P. Homólogos de esterase de hormônio juvenil
[00182] Conforme foi indicado acima, o hormônio juvenil de insetos con-trola e regula uma variedade de processos biológicos necessários no ciclo de vida do inseto, incluindo, mas sem necessariamente restrição, metamor-fose, reprodução e diapausa. A desorganização da síntese de JH ou de vias de degradação, empregando a tecnologia de supressão gênica, poderia ser um alvo efetivo para inibição mediada por RNA de fita dupla de pra-gas.
Q. Sequências homólogas da alfa tubulina
[00183] Células eucarióticas utilizam geralmente elementos estruturais citoesqueléticos, importantes não só como arcabouço mecânico, mas tam-bém para sustentar o formato da célula. Microfilamentos semiflexíveis tor-nam as células móveis, ajuda na divisão mitótica (citocinese) e, em animais vertebrados e invertebrados, além de serem responsáveis por contração muscular. Os microtúbulos relativamente rígidos, feitos de proteínas alfa e beta tubulina, desempenham papel importante, atuando como uma espécie de auto-estrada para transporte de vesículas e organelas e na separação de cromossomos durante mitose (cariocinese). Os filamentos intermediários flexíveis conferem, no mínimo, força adicional para toda a estrutura celular. O citoesqueleto é também conhecido como estando envolvido em sinaliza-ção através do citoplasma celular. Levando em consideração estas funções, acredita- se que qualquer desorganização do citoesqueleto, ou até mesmo alterações sutis de sua integridade, pode causar consequências patológicas a uma célula.
R. Sequências relacionadas a transporte
[00184] Conforme foi indicado acima, a seleção e transporte de várias moléculas em uma célula, incluindo para organelas apropriadas, bem como sua secreção, são funções fisiológicas importantes. Essas vias de seleção poderiam incluir aquelas em que se baseia o complexo de seleção endos-sômico endossômico, exigidas para transporte (ESCRT), complexos I-III, en-tre outros. Dessa forma, funções relacionadas a transporte de polipeptídeos e de outras moléculas podem também ser um alvo de escolha para inibição mediada por dsRNA.
Exemplo 2 Bioensaios de alimentação de insetos
[00185] Amostras de RNA de fita dupla RNA (dsRNA) foram submetidas a bioensaio com um número selecionado de pragas-alvo. O dsRNA foi preparado a partir de sequências identificadas de acordo com o Exemplo 1, empregando uma sequência contig completa, no caso de SEQ ID Nos: 1-6, ou sequência amplificada a partir da contig montada, empregando os pa-res de iniciador, conforme indicados na listagem de sequências. Foram aplicadas variações do dsRNA, sob a forma de revestimento para dieta artifi-cial de larva alfinete de milho, de acordo com o seguinte procedimento. Fo-ram obtidos ovos de Diabrotica virgifera virgifera (WCR), fornecidos pela Crop Characteristics, Inc., Farmington, Minnesota. Os ovos de WCR que não estavam em diapausa foram incubados no solo por aproximadamente 13 dias a 24°C, 60% de umidade relativa, em completa escuridão. No 13° dia, o solo contendo os ovos de WCR foi colocado em peneiras entre 30 e 60 mesh, sendo os ovos lavados e separados do solo, empregando uma mangueira de jardim de alta pressão. A superfície dos ovos foi desinfetada por imersão em LYSOL por três minutos, lavada três vezes com água estéril, uma vez com solução de formalina a 10% e, em seguida, lavada novamente mais três vezes com água estéril. Os ovos tratados dessa maneira foram dis-pensados em filtros de café estéreis e incubados, durante a noite, a 27°C, 60% de umidade relativa, em completa escuridão.
[00186] Para preparar o dsRNA, amplicons de sequências selecionadas foram clonados em vetor plasmídeo capaz de se replicar em E. coli, tendo sido recuperadas quantidades suficientes de DNA do plasmídeo para permi-tir a transcrição in vitro de RNA polimerase T7, provenientes dos promotores T7, encaixados de modo convergente em qualquer extremidade do fragmen-to clonado. RNA de fita dupla foi produzido e submetido a bioensaio; um segmento de RNA compreendendo a sequência, conforme indicada na listagem de sequências, o outro segmento de RNA sendo substancialmente o complemento reverso da sequência de nucleotídeos, uridinas apropriadamente posicionadas no lugar de timidinas. Uma amostra do RNA de fila-mento (dsRNA) foi tratada com DICER ou com RNAse III para produzir quantidades suficientes de pequeno RNA interferente RNA (siRNA). Amos-tras contendo siRNA ou dsRNA foram sobrepostas na dieta do CRW do bio-ensaio, conforme descrito acima, e foi permitido que as larvas se alimentas-sem, conforme abaixo.
[00187] Uma amostra de RNA de fita dupla foi acrescentada diretamente a cada cavidade contendo dieta do inseto, conforme indicado aci-ma, ou foi modificada antes de ser acrescentada à dieta. A modificação de RNA de fita dupla seguiu as instruções para RNAse III (AMBION CORPORATION, Austin, Texas) ou DICER (STRATAGENE, La Jolla, Cali-fornia), fornecidas pelo fabricante. A digestão, pela RNAse III, do RNA de fita dupla produziu vinte e um e vinte e dois dúplex de nucleotídeos, contendo extremidades 5' fosforiladas e extremidades 3' hidroxiladas, com ressaltos de 2-3 bases, semelhantes aos fragmentos de RNA pequeno inter-ferente com dúplex de ~21-26 pares de base (siRNA), produzidos pela en-zima dicer na via eucariótica, identificada por Hamilton et. al. (1999) e El- bashir et. al. (2001a). Essa coleção de dúplex de RNA curto interferente foi ainda purificada e uma amostra caracterizada por eletroforese em gel de poliacrilamida para determinar a integridade e eficiência da formação de dúplex. A pureza e quantidade da amostra foram, então, determinadas por espectrofotometria, em comprimento de onda de 250 nanômetros, e a amos-tra não utilizada foi retida, para uso posterior, em armazenamento a -20°C.
[00188] A dieta do inseto foi preparada essencialmente de acordo com Pleau et al. (2002), com as seguintes modificações: 9,4 gramas de ágar SERVA foram dispensados em 540 mililitros de água purificada e agitados até que o ágar fosse inteiramente distribuído. A mistura água/Ágar foi aque-cida até fervura para dissolução completa do Ágar e, em seguida, despejada em um misturador WARING. O misturador foi mantido em baixa velocidade, enquanto que 62,7 gramas da mistura BIO-SERV DIET (F9757), 3,75 gra-mas de raiz de milho liofilizado, 1,25 militro de corante verde de comida e 0,6 mililitros de formalina foram acrescentados à mistura quente de ágar. O pH da mistura foi, então, ajustado para 9,0, com o acréscimo de solução de es-toque de hidróxido de potássio a 10%. Os 600 mililitros aproximados de vo-lume da dieta líquida foram misturados continuamente em alta velocidade e mantidos em aproximadamente 48°C a aproximadamente 60°C, empregan-do uma barra esterilizada de agitação com revestimento magnético NALGE-NE em prato magnético quente de agitação, enquanto dispensados em alí-quotas de 200 microlitros em cada cavidade das placas de microtitulação de 96 cavidades de fundo redondo FALCON. Foi permitido que a dieta nas pla-cas solidificasse e secasse no ar, em capela biológica, por aproximadamen-te dez minutos.
[00189] Volumes de trinta (30) microlitros de amostras em teste, conten-do reagentes de controle ou RNA de fita dupla, em quantidades vari-adas foram sobrepostos à superfície da dieta do inseto em cada cavidade, utilizando um repetidor de micropipetagem. A dieta foi deixa na capela bio-lógica estéril por mais de meia hora depois de ser feita a aplicação das amostras em testes, permitindo a difusão de reagentes na dieta e para que a superfície da dieta secasse. Uma larva neonata de WCR foi colocada em cada cavidade com um pincel fino. As placas foram vedadas com MYLAR e ventiladas utilizando um grampo de inseto. Foram testadas de 12-72 larvas de inseto por dose, dependendo no desenho do ensaio. As placas de bio-ensaio foram incubadas a 27°C, 60% de umidade relativa e em completa escuridão por 12-14 dias. O número de larvas sobreviventes por dose foi registrado no timepoint de 12-14 dias. A massa larval foi determinada, utili-zando microbalança para cada larva sobrevivente. Os dados foram analisa-dos, utilizando o software estatístico JMP©4 (SAS Institute, 1995), e uma análise fatorial completa por ANOVA foi conduzida com teste de Dunnet para detecção de efeitos do tratamento, comparados ao controle não tratado (P<0,05). Foi efetuado teste de Tukey-Kramer post hoc para comparar todos os pares dos tratamentos (P<0,05). Os resultados dos ensaios de alimenta-ção de larvas de CRW exibiram inibição significativa de crescimento e mor-talidade, comparado a controles, conforme explicado abaixo.
Exemplo 3 Resultados de Bioensaios de Alimentação de Insetos
[00190] Foi preparada dieta artificial suficiente para cultivar larvas alfine-te de milho foi preparada, aplicando-se amostras de sequências de RNA de fita dupla, identificadas conforme descrito no Exemplo 1, empregando bioensaios, conduzidos conforme descrito no Exemplo 2. Foi permitido que as larvas alfinete de milho artificial se alimentassem da dieta por doze dias, e a mortalidade e atrofia foi monitorada em comparação a larvas alfinete de milho que se alimentaram somente de dietas de controle negativo e positivo. Os resultados dos estudos confirmaram níveis significativos (p<0,05) de atrofia e/ou mortalidade larval, utilizando dsRNAs contendo partes de se-qüências homólogas de uma variedade de classes diferentes de genes. As sequências e vetores com rendimento significativo de atrofia e/ou mortali-dade e as SEQ ID NO, correspondentes à sequência expressada como dsRNA, são fornecidas nas Tabelas 1-5 abaixo.Tabela 1: Constructos de dsRNA que demonstram efeito significativo de atrofia e/ou mortalidade em Bioensaios de Alimentação de Inseto com larva alfinete do milho do Sul ou larva alfinete do milho occidental Tabela 2: Constructos de dsRNA causadoras de níveis significativos de atrofia em Bioensaios de Alimentação com larvas de larva alfinete do milho ocidental (WCR). Tabela 3: Constructos de dsRNA causadoras de níveis significativos de mortalidade em Bioensaios de Alimentação com larvas de larva alfinete domilho ocidental (WCR). Tabela 4: Constructos de dsRNA causadoras de níveis significativos de atrofia emBioensaios de Alimentação com larvas de larva alfinete do milho do Sul (SCR). Tabela 5: Constructos de dsRNA causadoras de níveis significativos de mortalidade em Bioensaios de Alimentação com larvas de larva alfinete domilho do Sul (SCR)
Exemplo 4 Transformação e Bioensaios de planta transgênica
[00191] Resumidamente, a sequência que codifica um constructo de dsRNA, conforme descrito acima, é ligada, na extremidade 5', a uma se-qüência constituída por um promotor 35S, operacionalmente ligado a intron hsp70 de milho, e na extremidade 3' a uma sequência Nos3' de término de transcrição e poliadenilação. Esse cartucho de expressão é posicionado em direção descendente de um cartucho de seleção de glifosato. Estes cartu-chos ligados são, então, colocados em um vetor funcional de transformação de planta do tipo Agrobacterium tumefaciens, utilizado para transformar teci-do de milho tolerante a glifosato, e eventos selecionados e transferidos para o solo. As raízes da planta R0 são alimentadas com larvas de larva alfinete do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera). As raízes do milho transgêni-co são dispostas em placas de Petri com meio MS0D, contendo antibióticos e glifosato para seleção in vitro. Duas larvas de WCR são infestadas por ra-iz, em cada placa, com a ponta de um pincel fino de pintura. As placas são lacradas com Parafilme para impedir que as larvas escapem. Os ensaios são colocados em incubador Percival a 27°C, 60% de UR em completa es-curidão. A contaminação e qualidade larval são monitoradas. Depois de seis dias de alimentação em tecido da raiz, as larvas são transferidas para dieta de WCR em placa com 96 cavidades. As larvas são deixadas alimentando-se na dieta por oito dias, fazendo com que todo o ensaio dure, no total, quatorze dias. A massa e a sobrevivência das larvas são registradas para análise. É conduzida análise de uma via por ANOVA e teste de Dunnett, nos dados de massa larval, quanto à significância estatística, em comparação com controle negativo não- transformado. A atrofia de larvas de WCR é medida, após alimentação em dois eventos, e comparada ao crescimento de larvas alimentadas em plantas do controle negativo.
[00192] Plantas transgênicas de milho (R0) geradas são plantadas em vasos de 25,40 cm (10 polegadas), contendo solo Metromix, após atingir ta-manho apropriado. Quando as plantas atingem o estágio de crescimento V4, aproximadamente 1000 ovos de larva alfinete do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera) são infestados na área da raiz. Milho não-transgênico do mesmo genótipo é infestado em um estágio semelhante de crescimento, para servir como controle negativo. Os ovos são pré-incubados para que a incubação ocorra em 24 horas da infestação. É permitido que as larvas ali-mentem-se nos sistemas de raízes por 3 semanas. As plantas são removi-das do solo e lavadas para que as raízes possam ser avaliadas quanto alimentação de larvas. O dano causado às raízes é classificado, empregando uma Escala de Lesão de Nódulo (NIS), para pontuação do nível de danos, em que 0 indica ausência de dano, 1 indica que um nódulo de raiz é poda-do em 3,81 cm (1,5 polegada), 2 indica que 2 nódulos são podados, en-quanto que 3 indica que 3 nódulos são podados. Como as plantas que es-tão sendo utilizadas para avaliação são retiradas diretamente de cultura de tecidos, após transformação, e como os eventos de transformação são úni-cos, somente uma única planta é avaliada por evento, nesta ocasião. As plantas no ensaio que apresentam sinais ou sintomas de alimentação larval indicam que foi obtido êxito na infestação. Raízes de plantas de controle negativo são de modera a gravemente danificadas, em média, enquanto que raízes de plantas transgênicas fornecem controle substancial de ali-mentação larval, com aproximadamente 0,2 ou menos na Escala de Lesão de Nódulos.
Exemplo 5 Implementação de supressão de gene de insetos-praga, empregando um método de silenciamento mediado por ta-siRNA
[00193] Um método alternativo para silenciar genes em pragas de plan-tas usa a classe recentemente constatação de pequeno RNA interferente de atuação transversa (ta-siRNA) (Dalmay et al., 2000; Mourrain et al., 2000; Peragine et al, 2004; Vazquez et al, 2004). O ta- siRNA é derivado de trans-critos de RNA de fita simples, que são visados por mRNA que ocor-rem naturalmente dentro da célula. Métodos que usam microRNA para aci-onar o ta-siRNA para silenciar genes em plantas são descritos no Pedido de Patente Provisional US Serial N° 60/643 136 (Carrington et al. 2004), cujo conteúdo é aqui incorporado em sua totalidade por referência neste pedido. Pelo menos um miRNA específico da praga, expresso nas células epiteliais do intestino de larvas alfinete de milho, é identificado. Este miRNA específi-co da praga é, então, utilizado para identificar, pelo menos, uma sequência alvo de miRNA, expressa na célula. A sequência alvo correspondente é uma sequência curta, contendo não mais do que 21 nucleotídeos contíguos que, quando parte de um RNA é transcrito e entra em contacto com o seu miRNA correspondente, em um tipo de célula com via funcional de RNAi, leva a clivagem mediada por cortador do referido transcrito. Uma vez identi-ficadas sequências alvo de miRNA, pelo menos uma destas é fundida a uma segunda sequência que corresponde a uma parte de um gene da pra-ga, a ser silenciado utilizando este método. Por exemplo, a(s) sequência(s) alvo(s) de miRNA é fundida a qualquer sequência de SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 906, ou fragmento destas, como uma sequência do gene da ATPase vacuolar (V-ATPase) de larva alfinete de milho. A sequência alvo do miRNA pode ser posicionada na extremidade 5', a extremidade 3' ou ser encaixada no meio da sequência alvo. Pode ser preferível utilizar múltiplas sequências alvos de miRNA, correspondendo a múltiplos genes de miRNA, ou usar a mesma sequência alvo, várias vezes, na quimera da sequência alvo de miRNA e a sequência alvo do gene. A sequência do gene alvo pode ter qualquer comprimento, no mínimo com 21 bp.
[00194] A quimera da(s) sequência(s) alvo de miRNA e da sequência do gene alvo é expressa em células de plantas, utilizando qualquer número de promotor e outros elementos reguladores de transcrição apropriados, desde que a transcrição ocorra em tipos de células que possam ser fornecidas na dieta da praga, por exemplo, raízes de milho para controle de larva alfinete de milho.
[00195] Este método pode ter a vantagem adicional de fornecer molécu-las mais longas de RNA à praga-alvo. Tipicamente, dsRNAs produzido em plantas são rapidamente processados por Dicer em RNA curto, que pode não ser efetivo quando alimentado de modo exógeno a algumas pragas. Neste método, é produzido um transcrito de fita simples na célula da planta, que é absorvido pela praga e convertido em dsRNA, na célula da praga, onde é processado em seguida para ta-siRNA, capaz de silenciar um ou mais genes, após a transcrição, em uma ou mais pragas-alvo.
Exemplo 6 Método para fornecimento de sequência de DNA para silenciamento de ge-ne mediado por dsRNA
[00196] Este exemplo ilustra um método que fornece uma sequência de DNA para silenciamento de gene mediado por dsRNA. Mais especificamen-te, este exemplo descreve a seleção de um DNA melhorado, que pode ser utilizado em silenciamento de gene mediado por dsRNA, por (a) seleção de um gene-alvo de uma sequência inicial de DNA, incluindo mais de 21 nu-cleotídeos contíguos; (b) identificação de pelo menos uma sequência menor de DNA, derivada de regiões da sequência inicial de DNA, consistindo em regiões para as quais é previsto não gerar polipeptídeos indesejados e não exibir identidade com sequências conhecidas, como homólogos/ortólogos, e (c) seleção de uma sequência de DNA, para silenciamento de gene media-do por dsRNA, que inclua, pelo menos, a sequência menor de DNA. Poli-peptídeos indesejados incluem, entre outros, polipeptídeos homólogos de polipeptídeos alérgenos e polipeptídeos homólogos de toxinas polipeptídi-cas conhecidas.
[00197] Foi demonstrado que a V-ATPase do WCR funciona, em ensaios de alimen-tação de larva alfinete de milho, para testar o silenciamento mediado por dsRNA, como meio de controle de crescimento larval. Uma sequência de cDNA de um gene-alvo, como o gene da ATPase vacuolar (V-ATPase) de larva alfinete do milho ocidental (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera LeCon-te), é selecionada para ser utilizada como uma sequência inicial de DNA. Esta sequência inicial de DNA pode ser investigada para serem identifica-das regiões de cada fragmento contíguo, contando, no mínimo, com 21 nu- cleotídeos, que tenha um número de combinação inferior a 21 de 21 nu-cleotídeos contíguos de sequências conhecidas de vertebrados. É feita a identificação de segmentos da sequência, que tenham mais de aproxima-damente 100 nucleotídeos contíguos e que não atinjam esta marca de 21/21. Dessa forma, critérios, incluindo extensão de segmento, teor de GC, sequência, função prevista, com base em sequência ou função de um gene correspondente em modelo de organismo, além de estrutura secundária prevista (por exemplo, Elbashir, et al., 2001b), podem ser utilizados para se-lecionar e criar sequência(s) para uso. Combinações diferentes destes segmentos de sequência são combinadas para construir sequências quimé-ricas de DNA para expressão como RNA e uso em bioensaios de alimenta-ção de insetos, conforme descritos acima.
Exemplo 7 Resultados adicionais de Bioensaios de Alimentação de Insetos com se-qüências selecionadas de banco de dados de EST
[00198] Este exemplo ilustra sequências adicionais constatadas serem efetivas em causar atrofia e/ou mortalidade larval, quando ingeridas por lar-vas alfinete de milho, sob a forma de RNA de fita dupla. Métodos para cultura de larvas alfinete de milho, aplicação de dsRNA e bioensaios de in-setos são conforme foram descritos nos Exemplos 1-3. Os resultados dos estudos confirmaram níveis significativos (p<0,05) de latrofia e/ou mortali-dade larval, usando dsRNAs contendo partes de sequências homólogas de uma variedade de classes diferentes de genes. As sequências e vetores, que levaram à atrofia e/ou mortalidade significativa, e a SEQ ID NO correspondente para a sequência expressa como dsRNA são fornecidos na Tabe-la 6 abaixo. O pMON98503, exemplo de vetor binário, utilizado em transfor-mação de milho, contém os seguintes elementos entre os limites direito e esquerdo do T-DNA, para transformação em célula de planta: e35S - HSP70 - DV49 (orientação antissenso) - espaçador universal - DV49 (ori-entação sentido) - hsp17; ACT (promotor e intron) - sinalização de trânsito CTP2 - CP4 - NOS. O pMON98504, outro exemplo de vetor binário utilizado em transformação de milho, contém os seguintes elementos, entre os limites direito e esquerdo: e35S - HSP70 - C1 (orientação antissenso) - espaça-dor universal - C1 (orientação sentido) - hsp17; ACT (promotor e intron) - sinalização de trânsito CTP2 - CP4 - NOS.Tabela 6:Constructos adicionais de dsRNA, demonstrando efeito significativo sobre atrofia e mortalidade em Bioensaios de Alimentação com larva alfinete do milho do Sul ou larva alfinete do milho ocidental.
[00199] Os testes de eficácia foram conduzidos da forma a seguir, utili-zando progênie de planta de milho, transformadas com constructos selecio-nadas de controle de insetos: 1. Sete dias após plantio: incubados 10.000 ovos de WCR por evento (10 plantas por evento) a 25 °C, 60%UR em completa escuridão por sete dias. 2. Quatorze dias após infestação: as plantas são transplantadas de 4 vasos de turfa de 10,1 cm (4") para vasos de 20,3 cm (8"); amostras de ponta de raiz v4 podem ser coletadas para estudos de expressão gênica. 3. Quatorze dias após plantio: lavagem dos ovos de WCR, reti-rando-os do solo. Colocar os ovos e selo em tela de 60 mesh e colocar uma tela de trama 30 em cima da tela de 60 mesh para proteger os ovos da cor-rente de água. Lavar abundantemente com água morna, empregando bocal pulverizador até que o solo seja removido. 4. Suspender os ovos em solução de ágar Difco a 2% (p/v), 28 ml de solução por 1 ml de ovos. Os ovos são infestados no solo em aproxi-madamente 3 ou 4 alíquotas com, por exemplo, pipeta repetidora de Eppen-dorf, aproximadamente 1000 ovos por planta. São feitos buracos no solo com espátula antes da infestação e cobertos após a infestação. 5. Vinte e oito dias após plantio: amostras da ponta da raiz v8 são coletadas para estudos de expressão gênica. 6. Trinta e cinco dias após plantio: o ensaio é avaliado. As plan-tas são cortadas com poda em curva, deixando aproximadamente 6" de cau-le. Estacas da planta, contendo a informação do evento são furadas e pre-sas ao caule. É removido o máximo de solo quanto possível do sistema de raízes. O restante do solo é lavado e retirado com uma mangueira com pul-verizador. 7. As raízes são examinadas e classificadas quanto a dano cau-sado às raízes, empregando a escala NIS de Olsen (0-3) para dano causado por larva de WCR.
[00200] A Figura 1 e Figura 2 ilustram os resultados de controle de inse-tos, obtidos após o teste de plantas de milho F1 (derivadas de plantas trans-formadas com pMON98503 ou pMON98504) com WCR. Em testes de eficá-cia em câmara de crescimento, executados essencialmente conforme é descrito acima, pontuações de NIS, no patamar ou abaixo de dano econô-mico foram observados em progênie de eventos derivados por transforma-ção com pMON98503 ou pMON98504.
[00201] Sequências de toda extensão de EST do DNA foram montadas para genes selecionados, descritos nos Exemplos 3 e 7, exibindo atividade significativa contra larva alfinete do milho ocidental. Estas sequências EST são listadas na Tabela 7:Tabela 7: Sequências montadas EST para WCR alvos.
Exemplo 8 Criação e resultados de eficácia para sequências do Dv49 e Dv248
[00202] Partes das sequências montadas EST e adjacentes do Dv49 (SEQ ID NO: 818) e Dv248 (SEQ ID NO: 819) foram selecionadas para en-saios adicionais de bioatividade, com base em critérios que incluíam função prevista, fenótipo de mutantes knockout de regiões codificadoras correspon-dentes em outros organismos, extensão de segmento, teor de GC, seme-lhança com sequências conhecidas e estrutura secundária prevista (por exemplo, Elbashir, et al., 2001b). As sequências respectivas do Dv49 e Dv248 foram sintetizadas in vitro, com base em sua atividade prevista contra WCR, tanto individualmente como agrupada, conforme apresentado nas Figuras 3-4 e Tabela 8, e aplicadas a larvas de WCR.Tabela 8: Fragmentos de Dv49 e Dv248, avaliados quanto à eficácia, em WCR.
[00203] Os fragmentos F1-F3 correspondem a partes do transcrito Dv49 de extensão completa. Os fragmentos F4-F6 correspondem a partes do transcrito Dv48 ou de região do flanco. Os fragmentos F7- F13 são concatâ-meros de dois ou mais fragmentos F1-F6, conforme apresentado na Figura 4. O fragmento F13 (SEQ ID NO: 834) representa o concatâmero C38 (Dv49-Dv248).
[00204] Os dados de dose-resposta, para F1-F13, são apresentados nas Figuras 5-7. Conforme apresentado na Figura 5, a atividade (% de mortali-dade larval) dos fragmentos F4-F6, compreendendo sequências derivadas de Dv248 (Figura 4), foi significativamente melhor do que o controle quando alimentado a larvas de WCR em 0,1 ppm. O fragmento F6 exibiu atividade significativa quando também alimentado em 0,02 ppm. A atividade do frag-mento F5, na dose mais baixa, é possivelmente um artefato, uma vez que as larvas sobreviventes não exibiram atrofia.
[00205] Conforme apresentado na Figura 6, cada fragmento F7-F10 exi-be atividade estatisticamente significativa quando alimentado a larvas de WCR em 0,1 ppm. Os fragmentos F9 e F10 exibiram também atividade esta-tisticamente significativa quando alimentados a larvas de WCR em 0,02 ppm, sendo que o fragmento F10 exibiu também atividade estatisticamente significativa quando alimentado a larvas de WCR em 0,01 ppm. A atividade de F8, em 0,01 ppm, pode ser um artefato.
[00206] Conforme apresentado na Figura 7, os fragmentos F11-F13 exibem atividade estatisticamente significativa quando alimentados a larvas de WCR em 0,02 ppm ou acima. Adicionalmente, os fragmentos maiores (F12 e F13) exibem atividade em 0,005 ppm e acima.
Exemplo 9 Sequências adicionais de concatâmero ativo, derivadas do Concatâmero C6
[00207] Conforme apresentado na Tabela 9, porções do concatâmero C6 ativo (SEQ ID NO: 806), derivado de pMON98368, foram identificadas em bioensaios de dieta sobreposta (conduzidos conforme descritos, por exemplo no Exemplo 2), como inibindo o crescimento e/ou sobrevida de larva alfinete de milho (WCR). O concatâmero C6 de extensão completa contém 7 subfragmentos alvo de 70bp cada, conforme observado na Tabela 6 e Tabe-la 9.Tabela 9:Eficácia do concatâmero C6 de extensão completa e subporções selecionadas em bioensaio de dieta de larva alfinete de milho (SEQ ID NOs: 806, 847-873).
[00208] O concatâmero C7 de extensão completa, contém 8 subfrag-mentos alvo de 70 bp cada, conforme observado na Tabela 6. Da mesma forma, o concatâmero C12 de extensão completa contém 7 subfragmentos alvo, provenientes de Dv23-Dv13-Dv26-Dv18-Dv49- Dv22-Dv20, variando em extensão entre 53-80 bp, conforme observado na Tabela 6 e Tabela 10. Tabela 10: Composição de concatâmeros C12 de extensão completa e subporçõesselecionadas (SEQ ID NOs: 811, 887-892).
[00209] A Tabela 11 lista sequências adicionais para uso em outros co-leópteros-praga visados, incluindo Diabrotica sp. e outros Coccinellidae e Chrysomelidae. Tabela 11: Sequências adicionais de coleópteros visados.
[00210] Todas as composições e métodos expostos e reivindicados neste pedido podem ser feitos e executados sem experimentação indevida, à luz da presente exposição. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos das concretizações precedentes ilustrativas, será evidente para versados na técnica que variações, mudanças, modificações e alterações poderão ser aplicadas à composição, os métodos e nas etapas ou sequência das etapas dos métodos aqui descritos, sem distanciamento do verdadeiro conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes bioquímica e fisiologi-camente relacionados poderão ser substituídos pelos agentes aqui descri-tos, embora os mesmos resultados, ou semelhantes, seriam alcançados. Todos esses substitutos e modificações semelhantes e evidentes para ver-sados na técnica são considerados incluídos no espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definidos pelas reivindicações anexadas.
Referências
[00211] As referências a seguir, na medida em que forneçam exemplos de procedimentos e outros detalhes complementares àqueles expostos no presente, são especificamente aqui incorporadas por referência neste pedido: U.S. PATENT: 4,245,432; U.S. PATENT 4,272,417; U.S. PATENT 4,339,456; U.S. PATENT 4,372,080; U.S. PATENT 4,383,391; U.S. PATENT 4,465,017 ; U.S. PATENT 4,536,475; U.S. PATENT 4,634,587; U.S. PATENT 4,693,977; U.S. PATENT 4,735,015; U.S. PATENT 4,759,945; U.S. PATENT 4,876,197; U.S. PATENT 4,880,734; U.S. PATENT 4,886,937; U.S. PATENT 4,959,317; U.S. PATENT 5,080,925; U.S. PATENT 5,107,065; U.S. PATENT 5,107,787; U.S. PATENT 5,231,020; U.S. PATENT 5,283,184; U.S. PATENT 5,300,127; U.S. PATENT 5,302,523; U.S. PATENT 5,328,942; U.S. PATENT 5,384,253; U.S. PATENT 5,389,399; U.S. PATENT 5,464,765; U.S. PATENT 5,501,967; U.S. PATENT 5,527,695; U.S. PATENT 5,538,877; U.S. PATENT 5,538,880; U.S. PATENT 5,550,318; ; U.S. PATENT 5,554,445; U.S. PATENT 5,563,055; U.S. PATENT 5,580,544; U.S. PATENT 5,591,616; U.S. PATENT 5,593, 874; U.S. PATENT 5,622,003; U.S. PATENT 5,633,435; U.S. PATENT 5,661,103; U.S. PATENT 5,698,425; U.S. PATENT 5,712,135; U.S. PATENT 5,759,829; U.S. PATENT 5,780,708; U.S. PATENT 5,789,214; U.S. PATENT 5,791,084; U.S. PATENT 5,804,693; U.S. PATENT 5,834,447; U.S. PATENT 5,837,848; U.S. PATENT 5,849,320; U.S. PATENT 5,876,739; U.S. PATENT 5,882,713; U.S. PATENT 5,891,246; U.S. PATENT 5,918,413; U.S. PATENT 5,939,356; U.S. PATENT 6,118,047; U.S. PATENT 6,326,193; U.S. PATENT 6,489,542; U.S. PATENT 6,506,559; U.S. PATENT APPLIC. 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Claims (24)

1. Construção de polinucleotídeo isolada, caracterizada pelo fato de que compreende 21 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácidos nucléico de SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 822, SEQ ID NO:823, ou SEQ ID NO:824, operacionalmente ligados a um promotor heterólogo,sendo que a ingestão, por coleóptero praga de plantas de uma sequência de ribonucleotídeo de fita dupla compreendendo pelo menos uma fita complementar aos referidos nucleotídeos contíguos, inibe a proliferação da referida praga.
2. Construção de polinucleotídeo isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:820.
3. Construção de polinucleotídeo isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que está compreendida em um vetor de transformação de plantas.
4. Sequência de ribonucleotídeo de fita dupla, caracterizada pelo fato de que é produzida a partir da expressão de uma construção de polinucleotídeo como definida na reivindicação 1,sendo que a ingestão da referida sequência do ribonucleotídeo, por um coleóptero praga de plantas, inibe a proliferação da referida praga, e sendo que a sequência de ribonucleotídeo de fita dupla compreende pelo menos uma sequência que é complementar a 21 ou mais nucleotídeos contíguos da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:818.
5. Sequência do ribonucleotídeo de fita dupla, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo preparo de uma sequência recombinante de um polinucleotídeo, compreendendo uma primeira, uma segunda e uma terceira sequência de polinucleotídeos, sendo que a primeira sequência do polinucleotídeo compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1, sendo que a terceira sequência do polinucleotídeo está ligada à primeira sequência do polinucleotídeo pela segunda sequência do polinucleotídeo, e sendo que o terceiro polinucleotídeo é substancialmente o complemento reverso da primeira sequência do polinucleotídeo, de forma que a primeira e a terceira sequência do polinucleotídeo hibridizem, quando transcritas em um ácido ribonucléico, formam uma molécula de ribonucleotídeo de fita dupla estabilizada pela ligação da segunda sequência do ribonucleotídeo.
6. Sequência do ribonucleotídeo de fita dupla, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a ingestão da sequência do polinucleotídeo, pela praga, inibe a expressão de uma sequência de nucleotídeos substancialmente complementar à referida sequência do polinucleotídeo.
7. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que é transformado com o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1.
8. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é um microrganismo procariótico.
9. Método para controle de infestação por coleóptero praga, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento, na dieta de um coleóptero praga, de um agente compreendendo uma primeira sequência de polinucleotídeo cujo modo de atuação, ao ser ingerido pela praga, é o de inibir uma função biológica no interior da referida praga,sendo que a referida sequência do polinucleotídeo é complementar a 21 ou mais nucleotídeos contíguos da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:818, e é hibridizada a uma segunda sequência de polinucleotídeo complementar à referida primeira sequência de polinucleotídeo.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido coleóptero praga é um Diabrotica spp, selecionado do grupo que consiste em Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica virgifera zea, Diabrotica balteata, Diabrotica barberi, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa e Diabrotica undecimpunctata.
11. Método para controle de infestação por coleóptero praga, caracterizado pelo fato de que compreende:o fornecimento na dieta de um coleóptero praga de uma célula de planta que expressa uma sequência de polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1,sendo que o polipeptídeo é expresso para produzir um ácido ribonucléico de fita dupla que atue na ingestão, pela praga, de modo a inibir a expressão de uma sequência-alvo dentro da referida praga, resultando em alimentação diminuída da referida dieta, em relação a uma dieta desprovida da célula da planta.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a praga exibe redução da proliferação após a ingestão da célula.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a célula da planta compreende ainda uma sequência de polinucleotídeo que codifica um agente pesticida, selecionado do grupo que consiste em patatina, uma proteína inseticida produzida pelo Bacillus thuringiensis, proteína inseticida produzida pelo Xenorhabdus, proteína inseticida produzida pelo Bacillus laterosporus e uma proteína inseticida produzida pelo Bacillus sphaericus.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a referida proteína inseticida produzida pelo Bacillus thuringiensis é selecionada do grupo que consiste em Cry1, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, TIC901, TIC201, TIC407,TIC417, proteína inseticida binária CryET33 e CryET34, uma proteína inseticida binária CryET80 e CryET76, uma proteína inseticida binária TIC100 e TIC101, uma combinação das proteínas inseticidas ET29 ou ET37 com as proteínas inseticidas TIC810 ou TIC812 e uma proteína inseticida binária PS149B1.
15. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo codifica uma proteína, cuja função prevista é ser uma subunidade do complexo de organização endossômica, exigido para transporte (ESCRT)-III.
16. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o referido coleóptero praga é um Diabrotica spp., selecionado do grupo que consiste em Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica virgifera zea, Diabrotica balteata, Diabrotica barberi, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa e Diabrotica undecimpunctata.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o modo de atuação do polinucleotídeo, ao ser ingerido pela praga, é o de supressão de um gene que desempenhe uma função essencial para sobrevida do inseto, a referida função sendo uma subunidade do complexo de organização endossômica, exigido para transporte (ESCRT)-III.
18. Método para melhorar o rendimento de cultivo de plantas de cultivo, sujeitas à infestação por inseto praga, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) introduzir um polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1, na referida planta de grãos,(b) cultivar a planta de cultivo de modo a permitir a expressão do referido polinucleotídeo, sendo que a expressão do polinucleotídeo inibe a alimentação pelos insetos praga e a perda de rendimento, decorrente de infestação pela praga.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a expressão do polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime, pelo menos, um primeiro gene- alvo em um inseto praga que ingeriu uma porção da referida planta de cultivo, sendo que o gene-alvo é uma subunidade do complexo de organização endossômica, exigido para transporte (ESCRT)-III.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o inseto praga é uma larva de Diabrotica spp de milho, selecionada do grupo que consiste em Diabrotica undecimpunctata howardi (SCR), Diabrotica virgifera virgifera (WCR), Diabrotica barberi (NCR), Diabrotica virgifera zea (MCR), Diabrotica balteata (BZR), Diabrotica viridula (BZR) e Diabrotica speciosa (BZR).
21. Método para melhorar a tolerância a estiagem de um cultivo resultante de uma planta de cultivo, sujeita a infestação por inseto praga, caracterizado pelo fato de que compreendendo as etapas de:(a) introduzir um polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1, na referida planta de cultivo, (b) cultivar a planta de cultivo de modo a permitir a expressão do referido polinucleotídeo, sendo que a expressão do polinucleotídeo inibe a alimentação pelos insetos praga e a perda de tolerância à estiagem, decorrente de infestação pela praga.
22. Método para produção de um produto comercial, caracterizado pelo fato de que compreendendo a obtenção de uma planta compreendendo um polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1, ou parte da mesma, e o preparo de um produto comerciável a partir da planta ou parte da mesma.
23. Método para produção de alimento ou ração, caracterizado pelo fato de que compreende a obtenção de uma planta compreendendo um polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1, ou uma parte da mesma, e o preparo de alimento ou ração a partir da referida planta ou parte da mesma.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o alimento ou ração é definido como óleo, alimento, proteína, amido, farinha ou silagem.
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